Summary
Este protocolo apresenta o uso do CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) em adipócitos (AdipoSPH) como uma estratégia alternativa ao vírus adenoassociado (AAV) para investigar a biologia da gordura bege. A injeção in vivo de sgRNA carreador de AAV visando o gene endógeno Prdm16 é suficiente para induzir o desenvolvimento de gordura bege e melhorar o programa do gene termogênico.
Abstract
A tecnologia de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) provocou uma revolução na biologia, e ferramentas recentes foram aplicadas muito além da edição genética originalmente descrita. O sistema de ativação CRISPR (CRISPRa) combina a proteína Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) com módulos de transcrição distintos para induzir a expressão gênica endógena. SunTag-p65-HSF1 (SPH) é uma tecnologia CRISPRa recentemente desenvolvida que combina componentes de mediadores de ativação sinérgica (SAMs) com os ativadores SunTag. Este sistema permite a superexpressão de genes únicos ou múltiplos através do desenho de um RNA guia único personalizado (sgRNA). Neste estudo, um camundongo com HPS previamente desenvolvido foi usado para gerar um camundongo condicional expressando HPS em adipócitos (linhagem Cre de adiponectina), denominado AdipoSPH. Para induzir um fenótipo de gordura branca a bege (escurecimento), um vírus adenoassociado (AAV) carregando sgRNA visando o gene endógeno Prdm16 (um fator de transcrição bem estabelecido relacionado ao desenvolvimento de gordura marrom e bege) foi injetado no tecido adiposo branco inguinal (iWAT). Este modelo de camundongo induziu a expressão de Prdm16 endógeno e ativou o programa de genes termogênicos. Além disso, a superexpressão in vitro de Prdm16 induzida por SPH aumentou o consumo de oxigênio dos adipócitos bege, fenocopiando os resultados de um modelo anterior de camundongos transgênicos Prdm16. Assim, este protocolo descreve um modelo versátil, custo-efetivo e tempo-efetivo em camundongos para investigar a biologia do tecido adiposo.
Introduction
Os adipócitos beges (ou britos) são adipócitos que expressam a proteína 1 desacopladora (UCP1) e ricos em mitocôndrias que residem dentro dos depósitos de tecido adiposo branco (TAB). A gordura bege emerge de um subgrupo de progenitores de adipócitos ou adipócitos brancos maduros em resposta à exposição ao frio e a outros estímulos 1,2. Os adipócitos beges podem converter energia em calor de forma dependente ou independente de UCP13. Independentemente de sua função termogênica, a gordura bege também pode melhorar a saúde metabólica por outros meios, como a secreção de adipocinas e atividades anti-inflamatórias e antifibróticas. Estudos em camundongos e humanos têm demonstrado que a indução de gordura bege melhora a glicemia corporal total e a homeostase lipídica3. No entanto, embora nosso conhecimento da biologia da gordura bege tenha evoluído rapidamente nos últimos anos, a maioria de seus benefícios metabólicos e mecanismos relacionados ainda não são totalmente compreendidos.
Repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) foram descritas pela primeira vez em células eucarióticas como uma ferramenta capaz de gerar uma quebra de fita dupla (DSB) em um local específico do genoma através da atividade nuclease da proteína Cas9 4,5. Cas9 é guiado por um RNA guia único sintético (sgRNA) para atingir uma região genômica específica, levando a um DSB de DNA. Além de usar a nuclease Cas9 para fins de edição, a tecnologia CRISPR-Cas9 evoluiu para ser usada como uma ferramenta de regulação gênica específica de sequência6. O desenvolvimento de uma proteína Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) e a associação de módulos transcricionais capazes de aumentar a expressão gênica deram origem a ferramentas de ativação de CRISPR (CRISPRa). Vários sistemas CRISPRa têm surgido, como VP647,8, mediador de ativação sinérgica (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 e SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, que combina os componentes dos ativadores SAM e SunTag. Recentemente, foi demonstrado que a expressão induzida de genes neurogênicos em neuroblastos N2a e astrócitos primários é maior usando HPS em comparação com outros sistemas CRISPRa14, demonstrando a HPS como uma ferramenta CRISPRa promissora.
Aqui, aproveitamos um camundongo SPH14 previamente desenvolvido para gerar um modelo condicional de camundongo expressando HPS especificamente em adipócitos usando a linhagem de adiponectina Cre (AdipoSPH). Usando um vírus adenoassociado (AAV) carregando o gRNA visando o gene endógeno Prdm16, o escurecimento (conversão branca para bege) do WAT inguinal (iWAT) foi induzido para aumentar a expressão do programa de genes termogênicos. Além disso, a superexpressão in vitro de Prdm16 aumentou o consumo de oxigênio. Portanto, este protocolo fornece um modelo versátil de camundongos com HPS para explorar os mecanismos de desenvolvimento de gordura bege no tecido adiposo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Os estudos em animais foram realizados de acordo com o Guia de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório da Universidade Estadual de Campinas (protocolo CEUA #5810-1/2021).
1. Clonagem molecular
- Planejamento de RNAs guia único (sgRNAs)
- Projete sgRNAs para ativação CRISPR usando CHOPCHOP, disponível em https://chopchop.cbu.uib.no/, ou qualquer outra ferramenta adequada. Use os seguintes parâmetros para projetar o sgRNA visando o gene Prdm16: Alvo: Prdm16; In: Mus musculus; Utilizando: Crispr/Cas9; Para: Ativação.
NOTA: Projetar sgRNAs para cada região de interesse espalhada por uma região de 200 pb de início de transcrição (TSS) upstream. Por exemplo, o sgRNA direcionado a Prdm16 usado neste estudo liga 154 pb a montante de TSS. - Adicione saliências ao sgRNA para corresponder ao local de restrição SacI no backbone vetorial pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry (consulte Tabela de Materiais). Incluem: 5'- (N20)AGCT-3' (N = nucleotídeos). Por exemplo, a sequência que tem como alvo o gene Prdm16 é 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3', e com saliências é 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'.
- Obter a sequência de complemento reverso de 3' sgRNA usando a ferramenta disponível em https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html. Por exemplo, a sequência 3' sgRNA visando o gene Prdm16 é 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'.
- Projete sgRNAs para ativação CRISPR usando CHOPCHOP, disponível em https://chopchop.cbu.uib.no/, ou qualquer outra ferramenta adequada. Use os seguintes parâmetros para projetar o sgRNA visando o gene Prdm16: Alvo: Prdm16; In: Mus musculus; Utilizando: Crispr/Cas9; Para: Ativação.
- Recozimento de oligonucleotídeos complementares de fita simples
- Adicionar 1 μL de cada oligonucleotídeo de fita simples de 5' e 3' (concentração de estoque: 100 μM), 1 μL de tampão ligase T4, 0,5 μL de polinucleotídeo quinase T4 (PNK) (1 × 104 unidades/mL) e 6,5 μL de H2O a um volume final de reação de 10 μL. Recozer os oligonucleotídeos complementares de fita simples usando um termociclador nas seguintes condições: 37 °C por 30 min e 95 °C por 5 min, seguidos por uma taxa de rampa de 5 °C/min.
NOTA: A enzima PNK é fornecida com tampão PNK e não contém ATP suficiente necessário para a reação de fosforilação (ver Tabela de Materiais). Para simplificar a reação, use o buffer de ligase T4 (em vez do buffer PNK). O tampão ligase T4 fornece a quantidade apropriada (1 mM ATP) de fosfato para a reação de fosforilação. A enzima PNK fornece fosforilação final de 5' de oligonucleotídeos para a reação de ligadura subsequente.
- Adicionar 1 μL de cada oligonucleotídeo de fita simples de 5' e 3' (concentração de estoque: 100 μM), 1 μL de tampão ligase T4, 0,5 μL de polinucleotídeo quinase T4 (PNK) (1 × 104 unidades/mL) e 6,5 μL de H2O a um volume final de reação de 10 μL. Recozer os oligonucleotídeos complementares de fita simples usando um termociclador nas seguintes condições: 37 °C por 30 min e 95 °C por 5 min, seguidos por uma taxa de rampa de 5 °C/min.
- Ligadura de oligonucleotídeos de sgRNA recozidos
- Adicionar 25 ng de plasmídeo pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry a 2 μL de oligonucleotídeos de sgRNA recozidos, 1 μL de enzima SacI, 2 μL de tampão 10x T4 DNA ligase, 1 μL de T4 DNA ligase (1-3 u/μL) (ver Tabela de Materiais) e H2O a um volume final de reação de 10 μL.
- Efectuar a ligadura incubando a mistura reacional utilizando um termociclador nas seguintes condições: 15 ciclos de 37 °C durante 5 min e 25 °C durante 5 min, seguidos de fixação a 4 °C.
- Transformação seguida de reação em cadeia da polimerase de colônia (PCR)
- Transformar as células competentes de E. coli DH10B (ver Tabela de Materiais) com 4 μL do produto da ligadura usando choque térmico (42 °C por 45 s) e espalhar em uma placa de ágar contendo 100 μg/mL de ampicilina.
- Confirme colônias transformadas por PCR de colônia usando a mistura mestre de PCR (consulte Tabela de Materiais). Escolher a colônia e misturar com 5 μL de mistura mestre, 0,1 μL de primer universal (concentração estoque: 100 μM), 0,1 μL de primer reverso sgRNA (concentração estoque: 100 μM) (Tabela 1) e 5 μL de H 2 O. Execute a PCR usando um termociclador nas seguintes condições: desnaturação inicial (94 °C por2min), seguido por 35 ciclos de desnaturação (94 °C por 20 s), recozimento (60 °C por 30 s), extensão (72 °C por 30 s) e uma etapa final de alongamento (72 °C por 5 min). Resolver o DNA usando eletroforese em gel de agarose (1,5%) em tampão TAE 0,5x a 90 V por 30 min.
NOTA: Clones positivos dão uma banda de ~280 pb. - Enviar amostras positivas para o sequenciamento de Sanger usando primer universal (Tabela 1, Arquivo Suplementar 1).
- Purificação de plasmídeos
- Purificar o plasmídeo de um clone positivo usando um kit de purificação de plasmídios (ver Tabela de Materiais), seguindo as instruções do fabricante.
NOTA: Purificar o plasmídeo usando resina de troca iônica ou outro kit adequado para uso em transfecção celular. - Incubar o clone positivo (12 h a 37 °C com agitação a 200 rpm) utilizando um meio de crescimento bacteriano padrão contendo 100 μg/mL de ampicilina.
- Centrifugar as células bacterianas a 6.000 × g por 10 min a 4 °C. Siga os próximos passos de acordo com as instruções do kit do fabricante.
- Purificar o plasmídeo de um clone positivo usando um kit de purificação de plasmídios (ver Tabela de Materiais), seguindo as instruções do fabricante.
2. Embalagem AAV
OBS: O acondicionamento do AAV foi realizado de acordo com publicações anteriores15,16 com pequenas modificações.
- Células de placa 293T (ver Tabela de Materiais) em um frasco de175 cm 2 (semeadura de 5 × 106 células por frasco) usando 25 mL de meio de Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina (P/S). Incubar a 37 °C, 5% CO2 e 95% de umidade até que as células atinjam 50%-70% de confluência.
- Misturar 14 μL de polietilenimina (1 μg/μL) com 1 mL de NaCl 150 mM. Misturar os três plasmídeos necessários para a produção de AAV em uma razão molar de 1:1:1 (ou seja, 17,7 μg de pAdDeltaF6, 7,9 μg de AAV2/8 (ver Tabela de Materiais) e 5,9 μg de sgRNA clonado da etapa 1 em 1 mL de NaCl 150 mM. Transferir a mistura de polietilenimina:NaCl gota a gota para o tubo contendo o DNA (mistura de plasmídeos) e incubar por 20 min a 25 °C.
NOTA: pAdDeltaF6 é um plasmídeo auxiliar e pCapsid pAAV2/8 é um plasmídeo de empacotamento que expressa os genes Replicação (Rep) e Capsídeo (cap). Ambos os plasmídeos são necessários para produzir AAV. - Antes da transfecção, substituir o meio de crescimento celular por 18 mL de DMEM contendo FBS a 1% e L-alanil-L-glutamina (0,5 g/L). Adicionar 2 mL da mistura polietilenimina:DNA a cada frasco de cultura e incubar as células em uma incubadora de CO 2 (37 °C, 5% CO2, 95% de umidade).
- Após 5 h, adicionar 5 mL de DMEM suplementado com FBS a 10% e L-alanil-L-glutamina (0,5g/L).
- Após 3 dias de incubação, retirar as células do frasco de cultura com raspador celular. Recolher as células 293T de 10 (175 cm2) frascos de cultura celular em tubos cónicos de 50 ml e adicionar DMEM (ver Tabela de Materiais) até 30 ml.
- Adicionar 3 mL de clorofórmio a cada tubo cônico de 50 mL contendo as células 293T e misturar com um misturador de vórtices em alta velocidade por 5 min. Ressuspender as células adicionando 7,6 mL de NaCl 5 M e vórtice brevemente. Centrifugar a 3.000 × g e 4 °C por 5 min.
- Transferir a fase aquosa para um novo tubo cônico e adicionar 9,4 mL de polietilenoglicol (PEG) 8000 a 50% (v/v). Misture com um misturador de vórtice em alta velocidade por 10 s e coloque as amostras no gelo por 1 h.
- Centrifugar a 3.000 × g a 4 °C por 30 min. Retire o sobrenadante e deixe o pellet secar por 10 min.
- Adicionar 1,4 mL de HEPES (50 mM, pH 8) e misturar por 5 min usando um misturador vortex em alta velocidade. Adicionar 3,5 μL de 1 M MgCl2, 14 μL de DNase I (20 unidades/μL) e 1,4 μL de RNase A (10 μg/μL). Incubar em banho-maria a 37 °C durante 20 minutos e, em seguida, transferir as amostras para novos tubos de 1,5 ml (700 μL em cada tubo).
- Adicionar 700 μL de clorofórmio a cada tubo de 1,5 ml e misturar com um misturador de vórtices a alta velocidade durante 10 s. Centrifugar a 3.000 × g a 4 °C por 5 min e transferir a fase aquosa para um novo tubo. Repita esta etapa 3x.
- Evaporar o clorofórmio por 30 min em um gabinete de biossegurança. Em seguida, transfira 300 μL da fase aquosa para um tubo de ultracentrifugação de 0,5 mL (ver Tabela de Materiais). Gire o filtro a 14.000 × g a 25 °C por 5 min. Remova o fluxo e gire o filtro novamente até que todo o volume tenha passado pelo filtro.
- Lave o filtro adicionando 300 μL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco e misture as soluções por pipetagem. Centrifugar o filtro durante 5 min a 14.000 × g a 25 °C. Repita este passo de lavagem 4x.
- Centrifugar o filtro durante 8 min a 14.000 × g a 25 °C. Coloque o filtro de cabeça para baixo em um tubo novo e gire por 2 min a 1.000 × g a 25 °C.
3. Titulação do AAV por qPCR
- Elaborar uma curva padrão para titulação de AAV e determinar o título de AAV de acordo com o estudo original de Fripont et al.15.
4. Injeção in vivo de AAV no tecido adiposo branco inguinal (TABi)
- Separe as ferramentas cirúrgicas e os insumos necessários para a cirurgia e esterilize-os conforme recomendado para cada material específico.
- Anestesiar o camundongo com 100 mg/kg de quetamina e 10 mg/kg de xilazina por injeção intraperitoneal. Confirme a anestesia aplicando pressão vigorosa na pata e na cauda e verificando se há reflexo. Aplique pomada nos olhos do rato para evitar o ressecamento ocular durante a cirurgia.
- Coloque o rato anestesiado na posição supina e raspe uma pequena área nos flancos, proximal às articulações do quadril para injeções de iWAT, com um barbeador. Aplique o creme depilatório por 5 min. Retire o creme residual com água para evitar queimaduras na pele.
- Desinfetar a pele usando três rodadas alternadas de aplicação de solução antisséptica (iodopovidona) sobre a pele com uma gaze limpa e álcool a 70%. Descarte a gaze após cada uso.
- Realizar uma aplicação final de uma solução antisséptica sobre a pele. Em seguida, faça uma incisão de 1 a 2 cm com tesoura esterilizada na área proximal das articulações e mantenha a pele aberta usando pinças para expor o depósito de gordura. O WAT pode ser encontrado aderido à pele em ambos os lados, estendendo-se desde o início nas costas e para baixo em direção ao testículo.
OBS: Utilizar campos para evitar contaminação durante cirurgias ou procedimentos de sutura. - Usando pinças, através da incisão, puxe suavemente o depósito de gordura para cima para garantir que a injeção esteja no local e profundidade corretos.
NOTA: Tenha cuidado para não remover o tecido de seu local original. - Preencher a seringa de microlitros (calibre: 33; estilo do ponto: 4; ângulo: 12; comprimento: 10) (ver Tabela de Materiais) com 2,5 μL (5,6 × 1010 genomas virais [VG]/μL) do AAV (contendo o sgRNA direcionado ao gene endógeno Prdm16). Introduza cuidadosamente a agulha num ângulo de 30°-45° no iWAT. Repita a injeção 5x em diferentes locais do tecido para infectar homogeneamente todo o coxim gorduroso iWAT. Um volume total de 15 μL é recomendado para infectar o iWAT.
NOTA: A profundidade de inserção da seringa depende da espessura do depósito da almofada de gordura. Use a técnica sem toque para elaborar a injeção. - Fechar a incisão da pele raspada com pontos monofilamentares 4/0. Coloque o mouse em uma almofada térmica até que a consciência seja recuperada. Monitore o animal a cada 10-15 min até que ele se recupere totalmente. Após o animal recuperar a consciência, observe o perfil locomotor, que deve ser linear e não apresentar sinais de angústia ou dor.
- Realizar o controle da dor pós-operatória em até 48 h após a cirurgia, administrando cloridrato de tramadol (5 mg/kg) por via intraperitoneal por 3 dias (2x/dia).
OBS: Fique atento aos sinais de angústia e desconforto e monitore a ingestão de água e alimentos. Administrar uma dose eficaz de analgésico de forma preventiva, de preferência antes ou no início da cirurgia. - Mantenha o rato numa gaiola com livre acesso a comida e água durante o período de cicatrização. Após o período de cicatrização, proceda à eutanásia do rato. Neste estudo, a eutanásia foi realizada por uma superdose de anestésicos injetáveis (intraperitoneal) a partir de 3x a dose indutora (300-360 mg/kg cloridrato de ketamina + 30-40 mg/kg cloridrato de xilazina) seguida de decapitação.
NOTA: É altamente recomendável manter os animais alojados em gaiolas individuais até que estejam totalmente recuperados da anestesia.
5. Diferenciação in vitro de células vasculares estromais (SVFs) em adipócitos beges
- Realizar isolamento e plaqueamento de SVFs primárias do iWAT de camundongos AdipoSPH de acordo com Aune et al.17. SVFs de sementes derivadas de camundongos AdipoSPH iWAT em uma placa de 6 poços contendo meio completo (DMEM contendo 3,1 g/L de glicose, 0,5 g/L de L-alanil-L-glutamina, 10% de SFB e 2,5% de P/S) por 1-2 h.
Observação : A fração SVF contém uma mistura de diferentes tipos de células. Nesta etapa, não é possível definir o número de células progenitoras semeadas que dão origem aos adipócitos. - Aspirar o meio, lavar o poço 2x com solução salina tamponada com fosfato (1x PBS) e substituir por meio fresco completo. Incubar as células a 37 °C, 5% CO2, 95% de umidade até que as células atinjam 70%-80% de confluência.
- Induzir a diferenciação (dia 0) tratando as células com o meio de indução (Tabela 2).
OBS: O coquetel de fármacos do meio de indução é necessário para aumentar a diferenciação dos adipócitos beges e para a expressão do programa de genes termogênicos17. - Após 2 dias (dia 2), substituir o meio de indução pelo meio de manutenção (Tabela 2).
- Após 2 dias (dia 4), substituir o meio de manutenção por meio de manutenção fresco (Tabela 2) por 2 a 3 dias.
- Troque o meio de manutenção a cada 48 h até que os pré-adipócitos estejam completamente diferenciados em adipócitos (tipicamente 6 dias após a adição do meio de indução). Adpócitos maduros podem ser observados usando microscopia de luz, pois as células diferenciadas parecem estar carregadas de gotículas lipídicas.
6. Infecção in vitro por AAV de SVFs
NOTA: SVFs derivadas de camundongos AdipoSPH iWAT foram infectadas com sgRNA-Prdm16 portadores de AAV, conforme descrito anteriormente por Wang et al.18 com algumas modificações.
- Cultivar as células em uma placa de cultura de 6 poços com meio completo até que as células atinjam 70%-80% de confluência, conforme descrito anteriormente nas etapas 5.1-5.3.
- Misturar 5,6 × 1010 VG/μL de sgRNA-Prdm16 carreador de AAV com 2 ml de meio completo e brometo de hexadimetrina (8 μg/ml) (ver Tabela de Materiais). Transduzir as células substituindo o meio completo e adicionando o meio completo contendo AAV. Incubar as células transduzidas por 12 h a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2.
- Dividir e semear as células conforme descrito na etapa 5 para proliferação e diferenciação celular em adipócitos bege.
NOTA: Para o ensaio de consumo de oxigênio, sementes 4,0 × 104 células (a partir da etapa 6.2) por poço com meio de indução em placa de cultura celular de 24 poços. As etapas subsequentes de proliferação e diferenciação celular são realizadas conforme descrito na etapa 5. O ensaio do consumo de oxigênio é realizado quando as células atingem 80%-100% de confluência e estão totalmente diferenciadas, como relatado anteriormente19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Camundongos AdipoSPH foram desenvolvidos a partir da criação de linhagens de camundongos SPH e Adipoq-Cre. Ambas as linhagens de camundongos estavam em um fundo híbrido C57BL6J-DBA/2J (de acordo com o fornecedor comercial; ver Tabela de Materiais). A linhagem de camundongos SPH foi originalmente descrita por Zhou et al.14.
Desenvolvimento de adipócitos bege in vivo através da superexpressão de Prdm16 mediada por AdipoSPH16
Para avaliar a capacidade do modelo descrito neste estudo em desenvolver adipócitos beges in vivo, o AAV carreador do gene sgRNA direcionado ao gene Prdm16 foi injetado no iWAT de camundongos AdipoSPH. O Prdm16 é um fator de transcrição bem estabelecido que determina o desenvolvimento e a função dos adipócitos beges20,21. É importante mencionar que aqui escolhemos um sgRNA previamente testado e validado visando o gene endógeno Prdm1614. AAV carregando um sgRNA vazio foi usado como controle. Aos 10 dias após a injeção do AAV, o iWAT foi colhido para análise histológica e de expressão gênica (Figura 1A). Como esperado, imagens de imunofluorescência do iWAT de camundongos AdipoSPH demonstraram a expressão de dCas9 nos grupos controle e Prdm16 (Figura 1B). Além disso, a expressão de mCherry confirmou o sucesso da infecção por AAV do iWAT nos grupos controle e Prdm16 (Figura 1B). A expressão de Prdm16 induzida por SPH induziu claramente um acúmulo generalizado de adipócitos beges multiloculares em iWAT (Figura 1B). Além disso, a PCR quantitativa (qPCR) revelou um aumento da expressão de Prdm16 e do programa de genes termogênicos (Ucp1, Cox8b, Ppargc1a e Cidea) no grupo Prdm16 em comparação com o controle (Figura 1C).
Promoção do desenvolvimento de adipócitos beges e aumento do consumo de oxigênio in vitro pela superexpressão de Prdm16 mediada por AdipoSPH16
Em seguida, investigou-se a adequação deste modelo para o estudo in vitro da biologia dos adipócitos bege. Para tanto, pré-adipócitos derivados do iWAT de camundongos AdipoSPH foram transduzidos com AAV carregando a sequência de sgRNA visando Prdm16. Aos sete dias após a diferenciação, adipócitos beges foram utilizados para análise da expressão gênica e do consumo de oxigênio (Figura 2A). O sgRNA vazio foi usado como controle. Vale ressaltar que a remoção do códon STOP pela CRE recombinase e ativação da maquinaria SPH esteve sob o controle do promotor/potencializador de adiponectina, resultando na ativação do gene endógeno Prdm16 em adipócitos maduros. A análise da expressão gênica confirmou o aumento da expressão do gene Prdm16 endógeno e dos genes termogênicos no grupo de superexpressão de Prdm16 em relação ao controle (Figura 2B). Para confirmar que os adipócitos beges induzidos por SPH eram funcionalmente termogênicos, um ensaio de respirometria de alta resolução foi realizado nos adipócitos primários. A análise e interpretação dos dados da respirometria foi realizada conforme descrito recentemente22. A expressão de Prdm16 induzida por SPH resultou em maior consumo basal e máximo de oxigênio do que nas células controle (Figura 2C). É importante ressaltar que os dados indicaram aumento da respiração desacoplado (insensível à oligomicina) no grupo Prdm16 em comparação com o grupo controle (Figura 2C, Tabela 3). Em conjunto, esses resultados revelaram que a expressão de Prdm16 endógeno induzida por SPH recapitula o fenótipo de escurecimento e aumenta as taxas de consumo de oxigênio observadas em camundongos Prdm16 Tg convencionais.
Figura 1: Desenvolvimento de gordura bege por injeção de vírus adenoassociado (AAV) visando o gene Prdm16 endógeno no tecido adiposo branco inguinal (iWAT) de camundongos AdipoSPH. (A) Ilustração esquemática do desenho experimental de adipócitos bege in vivo (criado usando Biorender.com). (B) Imagens histológicas (coloração hematoxilina e eosina [H&E]) do iWAT. Barra de escala = 50 μm. (C) PCR quantitativo (qPCR) de Prdm16 e genes termogênicos (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α e Cidea; n = 3). Os dados são apresentados como média ± EPM.*p < 0,05; **p < 0,01 para Prdm16 versus controle (CTR) pelo teste t de Student não pareado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diferenciação de adipócitos bege induzida por SPH pela superexpressão de Prdm16. (A) Ilustração esquemática do desenho experimental in vitro de adipócitos beges (criado usando Biorender.com). (B) Expressão gênica relativa de Prdm16 e genes termogênicos (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α e Cidea; n = 3). (C) Taxa de consumo de oxigênio (OCR), n = 6. Os dados são apresentados como média ± EPM.*p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001 para Prdm16 versus controle (CTR) pelo (B) teste t de Student não pareado e (C) ANOVA de medidas repetidas two-way, seguido pelo teste de Tukey. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Sequenciamento de Sanger do sgRNA Prdm16. (A) Ilustração esquemática demonstrando o alinhamento de oligonucleotídeos Prdm16 complementares de fita simples. (B) Sequenciamento de Sanger do sgRNA Prdm16 usando primer universal. Clique aqui para baixar este arquivo.
| Gene | Espécie | Encaminhar | Inverter | |||||
| Expressão gênica | Prdm16 | rato | CAGCACGGTGAAGCCATTC | GCGTGCATCCGCTTGTG | ||||
| UCP1 | rato | TCTCAGCCGGCTTAATGACTG | GGCTTGCATTCTGACCTTCAC | |||||
| Ppargc1a | rato | AGCCGTGACCACTGACAACGAG | GCTGCATGGTTCTGAGTGCTAAG | |||||
| Cox8b | rato | GAACCATGAAGCCAACGACT | GCGAAGTTCACAGTGGTTCC | |||||
| Cidea | rato | ATCACAACTGGCCTGGTTACG | TACTACCCGGTGTCCATTTCT | |||||
| 36B4 | rato | TCCAGGCTTTGGGCATCA | CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA | |||||
| Clonagem molecular | Sequência de sgRNA Prdm16 | rato | CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG | CCCCTTTTCAGCGCAGCTCG | ||||
| cartilha universal | rato | GAGGGCCTATTTCCC ATGATTCCTTCATAT |
||||||
Tabela 1: Sequências de primers utilizadas no estudo.
| Média | Composição | |||
| Meio completo | Meio Águia Modificado de Dulbecco (DMEM) com L-Glutamina | |||
| 10% de soro fetal bovino (SFB) | ||||
| 2,5% de penicilina/estreptomicina | ||||
| Meio de indução | Meio completo | |||
| Indometacina, concentração final 125 μM (0,125 M estoque em etanol). NOTA: A indometacina deve ser aquecida a 90 °C durante 10 segundos para ser dissolvida. | ||||
| Insulina, concentração final 20 nM (estoque de 1 mM, adicionar 1 μL de HCl para solubilizar (5,73 mg/mL). Conservar o stock a -20 °C. | ||||
| Dexametasona, concentração final 2 μg/mL (estoque de 2 mg/mL em etanol) | ||||
| 3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX), concentração final 500 μM (0,25 M stock em 0,5 M KOH ) | ||||
| 3,3',5-Triiodo-L-tireonina (T3), concentração final de 1 nM (estoque de 10 μM, dissolver T3 em HCl 1 M e EtOH 1:4 para estocar). | ||||
| Rosiglitazona, concentração final 1 μg/mL (estoque de 1 mg/mL em etanol) | ||||
| Meio de manutenção | Meio completo | |||
| Insulina, concentração final 20 nM (estoque de 1 mM). Adicionar 1 μL de HCl para solubilizar (5,73 mg/mL). | ||||
| Rosiglitazona, concentração final 1 μg/mL (estoque de 1 mg/mL em etanol) | ||||
Tabela 2: Composição dos meios utilizados no estudo.
| Parâmetros | CTR | PRDM16 | p-valor | ||
| Sem consumo de oxigênio mitocondrial (pMoles/min/μg de proteína) | 8.19 ± 1.40 | 10,80 ± 1,83 | 0.01 | ||
| Respiração basal (pMoles/min/μg de proteína) | 28,82 ± 5,20 | 52,58 ± 13,73 | 0.001 | ||
| Respiração máxima (pMoles/min/μg de proteína) | 63,81 ± 9,80 | 122,94 ± 22,31 | < 0,001 | ||
| Capacidade respiratória ociosa (pMoles/min/μg de proteína) | 34,98 ± 11,09 | 70.36 ± 26.06 | 0.006 | ||
| Oligo insensível (proteína pMoles/min/μg) | 8.27 ± 2.29 | 15,85 ± 5,48 | 0.005 | ||
| Oligo sensível (pMoles/min/μg proteína) | 20,54 ± 5,68 | 36,72 ± 14,79 | 0.016 | ||
| Eficiência de acoplamento | 71,28 ± 1,51 | 69,84 ± 3,05 | 0.163 | ||
| RCR de células | 7,70 ± 1,46 | 7,75 ± 2,43 | 0.485 | ||
Tabela 3: Parâmetros respiratórios dos adipócitos beges induzidos por HPS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uma das aplicações mais úteis de não-edição da tecnologia CRISPR é a interrogação da função gênica através da ativação de genes endógenos utilizando sistemas CRISPRa6. A HPS é uma poderosa CRISPRa que foi originalmente descrita para induzir a conversão de astrócitos em neurônios ativos, tendo como alvo vários genes neurogênicos14. Neste estudo, o AdipoSPH demonstrou ser uma ferramenta adequada para investigar a biologia da gordura bege ativando a expressão de Prdm16 endógeno em adipócitos. A superexpressão de Prdm16 induzida por SPH em adipócitos leva à ativação do programa de genes termogênicos e induz o fenótipo de escurecimento, fenocopiando um modelo anterior de camundongos transgênicos (Tg) Prdm1623. Prdm16 foi escolhido neste estudo como alvo para indução de adipócitos beges com base no papel central desse fator de transcrição na regulação da diferenciação de gordura marrom e bege, bem como na regulação do programa de genes termogênicos (por exemplo, aumentando a expressão de Ucp1) em adipócitos diferenciados. No entanto, o modelo atual permite a superexpressão de qualquer gene endógeno a critério dos pesquisadores e do objetivo do estudo.
Modelos transgênicos tradicionais que investigam a biologia do tecido adiposo dependem do desenvolvimento de roedores geneticamente modificados superexpressando um transgene sob o controle de um promotor/potencializador restrito a adipócitos (por exemplo, Fabp4 ou adiponectina)24. Embora a tecnologia atual tenha acelerado o ritmo de desenvolvimento desses modelos, os custos e o tempo para desenvolvê-los ainda são um problema comum vivenciado pela comunidade científica. Em contraste, o AdipoSPH é um modelo mais barato e versátil para abordagens de ganho de função do que os camundongos Tg tradicionais. Além disso, o AdipoSPH é adequado para estudar o RNA longo não codificante e isoformas transcritas, que não são particularmente adequadas para modelos de camundongos Tg.
A AdipoSPH também apresenta várias vantagens na investigação da biologia do tecido adiposo em comparação com a simples administração de AAV, uma abordagem alternativa atual para experimentos de ganho de função25. Primeiro, o AAV entregue ao tecido adiposo promove a superexpressão introduzindo várias cópias de um transgene. Em contraste, a ativação de genes endógenos pelo SPH representa um mecanismo de ação mais natural. Em segundo lugar, os transgenes entregues pelo AAV (usando promotores constitutivos) normalmente resultam em sua superexpressão em "qualquer tipo de célula" dentro do microambiente do tecido adiposo. Em contraste, a expressão de genes endógenos induzida pelo AdipoSPH é restrita aos adipócitos. Terceiro, o tamanho da embalagem (~4,5kb) é uma limitação típica da AAV para alguns transgenes26. No entanto, o sgRNA portador de AAV requer uma estratégia de clonagem simples e fácil para 20 nucleotídeos personalizados. Finalmente, a administração de AAV tipicamente atinge a circulação sistêmica e infecta outros tecidos e órgãos. Embora alguns AAVs contenham microRNAs para atenuar a expressão de transgenes em tecidos específicos, como fígado e coração25, essa estratégia não pode prevenir a infecção por AAV em outros tecidos e órgãos. Em contraste, a expressão de genes endógenos induzida pelo AdipoSPH é limitada aos adipócitos, mesmo considerando algum extravasamento de AAV para a circulação sistêmica. Assim, o AdipoSPH também é um modelo adequado para a administração sistêmica de sgRNA carreador de AAV e para a investigação da regulação da homeostase energética do corpo inteiro no tecido adiposo.
Embora o modelo de AdipoSPH ofereça algumas vantagens, ele apresenta limitações que são importantes de serem consideradas. AAV é atualmente a plataforma mais comum para entrega in vivo de sgRNA. No entanto, alguns desafios na fabricação de AAV e questões imunológicas permanecem sem solução26,27. Além disso, diferentes quantidades e distribuições de AAV injetado em todo o tecido adiposo resultam em variabilidade intra e intertecidual da expressão gênica. Consideramos que a clonagem do vetor de sgRNA, a produção de AAV e a administração homogênea de AAV no iWAT são etapas críticas para o sucesso deste protocolo. Finalmente, diferentes sgRNAs ativam distintamente a expressão de genes endógenos no sistema SPH14. A principal recomendação é projetar e testar de três a cinco sequências de sgRNA dentro de 200 pb a montante do sítio de início da transcrição (TSS) do gene de interesse. Portanto, definir a melhor sequência de sgRNA para um gene alvo normalmente requer ensaios in vitro trabalhosos antes de experimentos in vivo.
A AdipoSPH também é um modelo atraente para investigar outros aspectos da biologia do tecido adiposo. Por exemplo, os adipócitos promovem a secreção de numerosas adipocinas28,29; No entanto, os efeitos de corpo inteiro da maioria dessas moléculas permanecem pouco compreendidos. O AdipoSPH é um modelo adequado para abordar essa questão, superexpressando genes endógenos únicos ou múltiplos em adipócitos maduros e investigando seus efeitos locais ou sistêmicos. Assim, o AdipoSPH é uma ferramenta única para o estudo da biologia e fisiologia do tecido adiposo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem o apoio recebido do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, para a geração de camundongos AdipoSPH, do Laboratório de Inmmunometabolismo e Sinalização Celular e do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Fotônica Aplicada à Biologia Celular (INFABIC) por todo o suporte experimental. Agradecemos o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
References
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Cohen, P., Kajimura, S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
- Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
- Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction. Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103 (2020).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
- Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes. STAR Protocols. 1 (3), 100118 (2020).
- Cohen, P., et al. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch. Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).
- Harms, M., Seale, P. Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential. Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).
- Seale, P., et al. Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).
- Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. Understanding adipose tissue development from transgenic animal models. Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
- Deshmukh, A. S., et al. Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine. Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).
- Sponton, C. H., et al. The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication. EMBO reports. 21 (9), 49828 (2020).
