Summary
Denne protokol præsenterer brugen af CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) i adipocytter (AdipoSPH) som en alternativ strategi til adeno-associeret virus (AAV) til undersøgelse af beige fedtbiologi. In vivo-injektion af AAV-bærende sgRNA rettet mod det endogene Prdm16-gen er tilstrækkeligt til at inducere beige fedtudvikling og forbedre det termogene genprogram.
Abstract
Clustered regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) teknologi har medført en revolution i biologi, og nyere værktøjer er blevet anvendt langt ud over den oprindeligt beskrevne genredigering. CRISPR-aktiveringssystemet (CRISPRa) kombinerer det katalytisk inaktive Cas9 (dCas9) protein med forskellige transkriptionsmoduler for at inducere endogen genekspression. SunTag-p65-HSF1 (SPH) er en nyudviklet CRISPRa-teknologi, der kombinerer komponenter fra synergistiske aktiveringsmediatorer (SAM'er) med SunTag-aktivatorerne. Dette system tillader overekspression af enkelte eller flere gener ved at designe et tilpasset single-guide RNA (sgRNA). I denne undersøgelse blev en tidligere udviklet SPH-mus brugt til at generere en betinget mus, der udtrykker SPH i adipocytter (adiponectin Cre-afstamning), kaldet AdipoSPH. For at inducere en hvid-til-beige fedt (bruning) fænotype blev en adeno-associeret virus (AAV), der bærer sgRNA rettet mod det endogene Prdm16-gen (en veletableret transkriptionsfaktor relateret til brun og beige fedtudvikling) injiceret i det inguinale hvide fedtvæv (iWAT). Denne musemodel inducerede ekspression af endogene Prdm16 og aktiverede det termogene genprogram. Desuden forbedrede in vitro SPH-induceret Prdm16-overekspression iltforbruget af beige adipocytter, fænokopiering af resultaterne af en tidligere Prdm16 transgen musemodel. Således beskriver denne protokol en alsidig, omkostningseffektiv og tidseffektiv musemodel til undersøgelse af fedtvævsbiologi.
Introduction
Beige (eller brite) adipocytter afkobler protein 1 (UCP1)-ekspressive og mitokondrierige adipocytter, der befinder sig i hvide fedtvæv (WAT) depoter. Beige fedt fremkommer fra en delmængde af adipocytforfædre eller modne hvide adipocytter som reaktion på kuldeeksponering og andre stimuli 1,2. Beige adipocytter kan omdanne energi til varme på en UCP1-afhængig eller uafhængig måde3. Uanset dets termogene funktion kan beige fedt også forbedre metabolisk sundhed på andre måder, såsom udskillelse af adipokiner og antiinflammatoriske og antifibrotiske aktiviteter. Undersøgelser hos mus og mennesker har vist, at induktion af beige fedt forbedrer helkropsglukose og lipidhomeostase3. Men selvom vores viden om beige fedtbiologi har udviklet sig hurtigt i de senere år, er de fleste af dens metaboliske fordele og relaterede mekanismer stadig ikke fuldt ud forstået.
Grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) blev først beskrevet i eukaryote celler som et værktøj, der er i stand til at generere et dobbeltstrengsbrud (DSB) på et specifikt sted i genomet gennem nukleaseaktiviteten af Cas9-proteinet 4,5. Cas9 styres af et syntetisk single-guide RNA (sgRNA) til at målrette mod en specifik genomisk region, hvilket fører til en DNA DSB. Ud over at bruge nukleasen Cas9 til redigeringsformål har CRISPR-Cas9-teknologien udviklet sig til at blive brugt som et sekvensspecifikt genreguleringsværktøj6. Udviklingen af et katalytisk inaktivt Cas9-protein (dCas9) og foreningen af transkriptionsmoduler, der er i stand til at forbedre genekspression, har givet anledning til CRISPR-aktiveringsværktøjer (CRISPRa). Flere CRISPRa-systemer er dukket op, såsom VP647,8, synergistisk aktiveringsmediator (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 og SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, som kombinerer komponenterne i SAM- og SunTag-aktivatorer. Det er for nylig blevet påvist, at den inducerede ekspression af neurogene gener i N2a-neuroblaster og primære astrocytter er højere ved hjælp af SPH sammenlignet med andre CRISPRa-systemer14, hvilket viser SPH som et lovende CRISPRa-værktøj.
Her udnyttede vi en tidligere udviklet SPH-mus14 til at generere en betinget musemodel, der udtrykker SPH specifikt i adipocytter ved hjælp af adiponectin Cre-afstamningen (AdipoSPH). Ved hjælp af en adeno-associeret virus (AAV), der bærer gRNA'et rettet mod det endogene Prdm16-gen, blev brunfarvning (hvid til beige konvertering) af inguinal WAT (iWAT) induceret for at øge ekspressionen af det termogene genprogram. Desuden øgede in vitro Prdm16 overekspression iltforbruget. Derfor giver denne protokol en alsidig SPH-musemodel til at udforske mekanismerne for beige fedtudvikling i fedtvæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med University of Campinas Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (protokol CEUA #5810-1/2021).
1. Molekylær kloning
- Design af single guide RNA'er (sgRNA'er)
- Design sgRNA'er til CRISPR-aktivering ved hjælp af CHOPCHOP, tilgængelig på https://chopchop.cbu.uib.no/, eller ethvert andet passende værktøj. Brug følgende parametre til at designe sgRNA rettet mod Prdm16-genet: Mål: Prdm16; I: Mus musculus; Brug af: Crispr/Cas9; For: Aktivering.
BEMÆRK: Design sgRNA'er for hver region af interesse spredt over en 200 bp opstrøms transkriptionsstartsted (TSS) region. For eksempel binder sgRNA-målretningen Prdm16, der anvendes i denne undersøgelse, 154 bp opstrøms for TSS. - Tilføj udhæng til sgRNA'et for at matche SacI-begrænsningsstedet i vektorrygraden pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry (se materialetabel). Omfatter: 5'- (N20)AGCT-3' (N = nukleotider). For eksempel er sekvensen rettet mod Prdm16-genet 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3', og med udhæng er 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'.
- Få 3' sgRNA omvendt komplementsekvens ved hjælp af det værktøj, der er tilgængeligt på https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html. For eksempel er 3'-sgRNA-sekvensen rettet mod Prdm16-genet 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'.
- Design sgRNA'er til CRISPR-aktivering ved hjælp af CHOPCHOP, tilgængelig på https://chopchop.cbu.uib.no/, eller ethvert andet passende værktøj. Brug følgende parametre til at designe sgRNA rettet mod Prdm16-genet: Mål: Prdm16; I: Mus musculus; Brug af: Crispr/Cas9; For: Aktivering.
- Udglødning af enkeltstrengede komplementære oligonukleotider
- Der tilsættes 1 μL af hvert 5' og 3' enkeltstrenget oligonukleotid (stamkoncentration: 100 μM), 1 μL T4-ligasebuffer, 0,5 μL T4-polynukleotidkinase (PNK) (1 × 104 enheder/ml) og 6,5 μLH2Otil et slutreaktionsvolumen på 10 μL. Anneal de komplementære enkeltstrengede oligonukleotider ved hjælp af en termocyklist under følgende betingelser: 37 °C i 30 minutter og 95 °C i 5 minutter, efterfulgt af en nedtrapningshastighed på 5 °C/min.
BEMÆRK: PNK-enzymet leveres med PNK-buffer og indeholder ikke nok ATP, der kræves til phosphoryleringsreaktionen (se materialetabel). For at forenkle reaktionen skal du bruge T4-ligasebufferen (i stedet for PNK-buffer). T4-ligasebuffer tilvejebringer den passende mængde (1 mM ATP) phosphat til phosphoryleringsreaktionen. PNK-enzymet tilvejebringer 5' slutphosphorylering af oligonukleotider til den efterfølgende ligeringsreaktion.
- Der tilsættes 1 μL af hvert 5' og 3' enkeltstrenget oligonukleotid (stamkoncentration: 100 μM), 1 μL T4-ligasebuffer, 0,5 μL T4-polynukleotidkinase (PNK) (1 × 104 enheder/ml) og 6,5 μLH2Otil et slutreaktionsvolumen på 10 μL. Anneal de komplementære enkeltstrengede oligonukleotider ved hjælp af en termocyklist under følgende betingelser: 37 °C i 30 minutter og 95 °C i 5 minutter, efterfulgt af en nedtrapningshastighed på 5 °C/min.
- Ligering af udglødede sgRNA-oligonukleotider
- Tilsæt 25 ng plasmid pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry til 2 μL udglødede sgRNA-oligonukleotider, 1 μL SacI-enzym, 2 μL 10x T4 DNA-ligasebuffer, 1 μL T4 DNA-ligase (1-3 u / μL) (se materialetabel) ogH2Otil et slutreaktionsvolumen på 10 μL.
- Der udføres ligering ved at inkubere reaktionsblandingen ved hjælp af en termocyklist under følgende betingelser: 15 cyklusser på 37 °C i 5 minutter og 25 °C i 5 minutter efterfulgt af fastholdelse ved 4 °C.
- Transformation efterfulgt af kolonipolymerasekædereaktion (PCR)
- De kompetente E. coli DH10B-celler (se materialetabellen) omdannes med 4 μL ligeringsprodukt ved hjælp af varmechok (42 °C i 45 s) og spredes på en agarplade indeholdende 100 μg/ml ampicillin.
- Bekræft transformerede kolonier ved koloni-PCR ved hjælp af PCR-masterblandingen (se materialetabel). Vælg kolonien og bland med 5 μL masterblanding, 0,1 μL universalprimer (stamkoncentration: 100 μM), 0,1 μL sgRNA omvendt primer (stamkoncentration: 100 μM) (tabel 1) og 5 μLH2O. Kør PCR ved hjælp af en termocykler under følgende betingelser: indledende denaturering (94 °C i 2 min) efterfulgt af 35 cyklusser med denaturering (94 °C i 20 s), udglødning (60 °C i 30 s), forlængelse (72 °C i 30 s) og et sidste forlængelsestrin (72 °C i 5 minutter). Opløs DNA'et ved hjælp af agarose (1,5%) gelelektroforese i 0,5x TAE-buffer ved 90 V i 30 minutter.
BEMÆRK: Positive kloner giver et bånd på ~ 280 bp. - Indsend positive prøver til Sanger-sekventering ved hjælp af universel primer (tabel 1, supplerende fil 1).
- Oprensning af plasmid
- Rens plasmidet fra en positiv klon ved hjælp af et plasmidrensningssæt (se materialetabellen) ved at følge producentens anvisninger.
BEMÆRK: Rens plasmidet ved hjælp af anionbytterharpiks eller et andet sæt, der er egnet til brug i celletransfektion. - Den positive klon inkuberes (12 timer ved 37 °C med omrystning ved 200 omdr./min.) ved hjælp af et standard bakterievækstmedium indeholdende 100 μg/ml ampicillin.
- Centrifuger bakteriecellerne ved 6.000 × g i 10 minutter ved 4 °C. Følg de næste trin i henhold til producentens kitinstruktioner.
- Rens plasmidet fra en positiv klon ved hjælp af et plasmidrensningssæt (se materialetabellen) ved at følge producentens anvisninger.
2. AAV-emballage
BEMÆRK: AAV-emballering blev udført i henhold til tidligere publikationer15,16 med mindre ændringer.
- Plade 293T-celler (se materialetabel) i en 175 cm2 kolbe (såning 5 × 106 celler pr. kolbe) med 25 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (P/S). Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% fugtighed, indtil cellerne når 50% -70% sammenløb.
- 14 μL polyethylenimin (1 μg/μL) blandes med 1 ml 150 mM NaCl. Bland de tre plasmider, der kræves til AAV-produktion, i et molært forhold på 1:1:1 (dvs. 17,7 μg pAdDeltaF6, 7,9 μg AAV2/8 (se materialetabel) og 5,9 μg klonet sgRNA fra trin 1 i 1 ml 150 mM NaCl. Polyethylenamin:NaCl-blandingen overføres dråbe for dråbe til røret indeholdende DNA'et (blanding af plasmider) og inkuberes i 20 minutter ved 25 °C.
BEMÆRK: pAdDeltaF6 er et Helper-plasmid, og pCapsid pAAV2/8 er et emballageplasmid, der udtrykker replikations- (Rep) og Capsid (cap) gener. Begge plasmider er nødvendige for at producere AAV. - Før transfektion udskiftes cellevækstmediet med 18 ml DMEM indeholdende 1% FBS og L-alanyl-L-glutamin (0,5 g / L). Der tilsættes 2 ml polyethylenamin:DNA-blanding til hver dyrkningskolbe, og cellerne inkuberes i en CO 2 -inkubator (37 °C, 5 % CO2, 95 % fugtighed).
- Efter 5 timer tilsættes 5 ml DMEM suppleret med 10% FBS og L-alanyl-L-glutamin (0,5 g / L).
- Efter 3 dages inkubation løsnes cellerne fra kulturkolben ved hjælp af en celleskraber. Opsaml 293T-cellerne fra 10 (175 cm2) cellekulturkolber i 50 ml koniske rør, og tilsæt DMEM (se materialetabel) op til 30 ml.
- Tilsæt 3 ml chloroform til hvert 50 ml konisk rør indeholdende 293T-cellerne og bland ved hjælp af en hvirvelblander ved høj hastighed i 5 minutter. Resuspender cellerne ved kort at tilsætte 7,6 ml 5 M NaCl og hvirvelstrøm. Der centrifugeres ved 3.000 × g og 4 °C i 5 minutter.
- Den vandige fase overføres til et nyt konisk rør, og der tilsættes 9,4 ml 50% (v/v) polyethylenglycol (PEG) 8000. Bland med en hvirvelblander ved høj hastighed i 10 s og læg prøverne på is i 1 time.
- Der centrifugeres ved 3.000 × g ved 4 °C i 30 min. Supernatanten fjernes og pelletten tørres i 10 min.
- Tilsæt 1,4 ml HEPES (50 mM, pH 8) og bland i 5 minutter ved hjælp af en hvirvelblander ved høj hastighed. Der tilsættes 3,5 μL 1 MMgCl2, 14 μL DNase I (20 enheder/μL) og 1,4 μL RNase A (10 μg/μL). Der inkuberes i et 37 °C vandbad i 20 minutter, og prøverne overføres derefter til nye 1,5 ml rør (700 μL i hvert rør).
- Tilsæt 700 μL chloroform til hvert 1,5 ml rør og bland ved hjælp af en hvirvelblander ved høj hastighed i 10 sekunder. Der centrifugeres ved 3.000 × g ved 4 °C i 5 minutter, og den vandige fase overføres til et nyt glas. Gentag dette trin 3x.
- Inddamp kloroformen i 30 minutter i et biosikkerhedsskab. Derefter overføres 300 μL af den vandige fase til et 0,5 ml ultracentrifugeringsrør (se materialetabel). Drej filteret ved 14.000 × g ved 25 °C i 5 min. Fjern gennemstrømningen, og drej filteret igen, indtil hele lydstyrken er passeret gennem filteret.
- Filteret vaskes ved at tilsætte 300 μL Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS), og opløsningerne blandes ved pipettering. Centrifuger filteret i 5 minutter ved 14.000 × g ved 25 °C. Gentag dette vasketrin 4x.
- Centrifuger filteret i 8 minutter ved 14.000 × g ved 25 °C. Filteret anbringes på hovedet i et nyt rør, og centrifugeres i 2 minutter ved 1.000 × g ved 25 °C.
3. Titrering af AAV ved qPCR
- Forbered en standardkurve for AAV-titrering og bestem AAV-titeren i henhold til den oprindelige undersøgelse af Fripont et al.15.
4. In vivo injektion af AAV i det inguinale hvide fedtvæv (iWAT)
- Adskil de kirurgiske værktøjer og forsyninger, der er nødvendige til kirurgi, og steriliser dem som anbefalet for hvert specifikt materiale.
- Bedøv musen med 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin ved intraperitoneal injektion. Bekræft anæstesi ved at anvende kraftigt tryk på poten og halen og kontrollere for en refleks. Påfør salve på musens øjne for at undgå øjentørhed under operationen.
- Placer den bedøvede mus i liggende stilling, og barber et lille område på siderne, proksimalt til hofteleddet til iWAT-injektioner, med en barbermaskine. Påfør hårfjerningscreme i 5 min. Fjern resterende creme med vand for at undgå hudforbrænding.
- Desinficere huden ved hjælp af tre skiftende runder med påføring af antiseptisk opløsning (povidon-jod) på huden med en ren gasbind og 70% alkohol. Kassér gasbindet efter hver brug.
- Udfør en endelig påføring af en antiseptisk opløsning på huden. Lav derefter et snit på 1-2 cm med steriliseret saks i leddets proksimale område, og hold huden åben ved hjælp af tang for at udsætte fedtdepotet. WAT kan findes fastgjort til huden på begge sider, der strækker sig fra begyndelsen på ryggen og ned mod testiklerne.
BEMÆRK: Brug gardiner for at undgå kontaminering under operation eller suturprocedurer. - Brug pincet til at trække fedtdepotet forsigtigt opad gennem snittet for at sikre, at injektionen er på det rigtige sted og dybde.
BEMÆRK: Pas på ikke at fjerne vævet fra dets oprindelige placering. - Fyld mikrolitersprøjten (måler: 33; punkttype: 4; vinkel: 12; længde: 10) (se materialetabel) med 2,5 μL (5,6 × 1010 virale genomer [VG]/μL) af AAV (indeholdende sgRNA'et rettet mod det endogene Prdm16-gen). Indsæt forsigtigt nålen i en vinkel på 30°-45° i iWAT. Gentag injektionen 5x forskellige steder i vævet for homogent at inficere hele iWAT fedtpuden. Et samlet volumen på 15 μL anbefales til at inficere iWAT.
BEMÆRK: Dybden af indsættelsen af sprøjten afhænger af tykkelsen af fedtpudeaflejringen. Brug no-touch-teknikken til at trække injektionen op. - Luk det barberede hudsnit ved hjælp af 4/0 monofilamentsuturer. Placer musen på en varmepude, indtil bevidstheden er genvundet. Overvåg dyret hvert 10-15 minut, indtil det er helt genoprettet. Når dyret genvinder bevidstheden, skal du observere den lokomotoriske profilering, som skal være lineær og ikke have tegn på nød eller smerte.
- Udfør postoperativ smertekontrol inden for 48 timer efter operationen ved administration af tramadolhydrochlorid (5 mg / kg) intraperitonealt i 3 dage (2x / dag).
BEMÆRK: Hold øje med tegn på nød og ubehag og overvåg vand- og fødeindtagelse. Giv en effektiv dosis smertestillende middel på en forebyggende måde, helst før eller i begyndelsen af operationen. - Hold musen i et bur med fri adgang til mad og vand i helingsperioden. Efter helingsperioden skal du fortsætte med at euthanisere musen. I denne undersøgelse blev eutanasi udført ved en overdosis injicerbare anæstetika (intraperitoneal) fra 3x den inducerende dosis (300-360 mg / kg ketaminhydrochlorid + 30-40 mg / kg xylazinhydrochlorid) efterfulgt af halshugning.
BEMÆRK: Det anbefales kraftigt at holde dyrene opstaldet i individuelle bure, indtil de er helt kommet sig efter anæstesi.
5. In vitro differentiering af stromale vaskulære celler (SVF'er) i beige adipocytter
- Udfør isolering og plettering af primære SVF'er fra iWAT hos AdipoSPH-mus i henhold til Aune et al.17. Frø SVF'er afledt af AdipoSPH-mus iWAT i en 6-brønds plade indeholdende komplet medium (DMEM indeholdende 3,1 g / L glucose, 0,5 g / L L-alanyl-L-glutamin, 10% FBS og 2,5% P / S) i 1-2 timer.
BEMÆRK: SVF-fraktionen indeholder en blanding af forskellige celletyper. På dette trin er det ikke muligt at definere antallet af frøede stamceller, der giver anledning til adipocytter. - Opsug mediet, vask brønden 2x ved hjælp af fosfatbufret saltvand (1x PBS), og erstat med frisk komplet medium. Inkuber cellerne ved 37 ° C, 5% CO2, 95% fugtighed, indtil cellerne når 70% -80% sammenløb.
- Inducer differentiering (dag 0) ved at behandle cellerne med induktionsmediet (tabel 2).
BEMÆRK: Induktionsmediets lægemiddelcocktail er nødvendig for at forbedre beige adipocytdifferentiering og til ekspression af det termogene genprogram17. - Efter 2 dage (dag 2) udskiftes induktionsmediet med vedligeholdelsesmediet (tabel 2).
- Efter 2 dage (dag 4) udskiftes vedligeholdelsesmediet med et nyt vedligeholdelsesmedium (tabel 2) i 2 til 3 dage.
- Skift vedligeholdelsesmediet hver 48. time, indtil preadipocytterne er fuldt differentieret til adipocytter (typisk 6 dage efter tilsætning af induktionsmedium). Modne adipocytter kan observeres ved hjælp af lysmikroskopi, da de differentierede celler synes at være fyldt med lipiddråber.
6. In vitro AAV-infektion af SVF'er
BEMÆRK: SVF'er afledt af AdipoSPH-mus iWAT blev inficeret med AAV-bærende sgRNA-Prdm16 som tidligere beskrevet af Wang et al.18 med nogle få ændringer.
- Cellerne dyrkes på en 6-brønds dyrkningsplade med komplet medium, indtil cellerne når 70% -80% sammenløb, som tidligere beskrevet i trin 5.1-5.3.
- Bland 5,6 × 1010 VG/μL AAV-bærende sgRNA-Prdm16 med 2 ml komplet medium og hexadimethanbromid (8 μg/ml) (se materialetabel). Transducer cellerne ved at erstatte det komplette medium og tilføje det komplette medium, der indeholder AAV. De transducerede celler inkuberes i 12 timer ved 37 °C, 95 % fugtighed og 5 % CO2.
- Opdel og frø cellerne som beskrevet i trin 5 for celleproliferation og differentiering i beige adipocytter.
BEMÆRK: Til iltforbrugsanalysen frø 4,0 × 104 celler (fra trin 6.2) pr. brønd med induktionsmedium i en 24-brønds cellekulturplade. De efterfølgende trin af celleproliferation og differentiering udføres som beskrevet i trin 5. Oxygenforbrugsanalysen udføres, når cellerne når 80% -100% sammenløb og er fuldt differentierede, som tidligere rapporteret19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AdipoSPH-mus blev udviklet ved avl af SPH- og Adipoq-Cre-musestammer. Begge musestammer var i en hybrid C57BL6J-DBA/2J baggrund (ifølge den kommercielle leverandør; se materialetabel). SPH-musens afstamning blev oprindeligt beskrevet af Zhou et al.14.
In vivo beige adipocytudvikling gennem AdipoSPH-medieret Prdm16-overekspression
For at evaluere kapaciteten af modellen beskrevet i denne undersøgelse til at udvikle beige adipocytter in vivo, blev AAV'en, der bærer sgRNA-målretningen Prdm16-genet, injiceret i iWAT hos AdipoSPH-mus. Prdm16 er en veletableret transkriptionsfaktor, der bestemmer beige adipocytudvikling og funktion20,21. Det er vigtigt at nævne, at vi her valgte et tidligere testet og valideret sgRNA rettet mod det endogene Prdm16-gen14. AAV med et tomt sgRNA blev brugt som kontrol. 10 dage efter AAV-injektion blev iWAT høstet til histologiske og genekspressionsanalyser (figur 1A). Som forventet viste immunfluorescensbilleder af iWAT fra AdipoSPH-mus ekspressionen af dCas9 i både kontrol- og Prdm16-gruppen (figur 1B). Derudover bekræftede mCherry-ekspression succesen med AAV-infektion af iWAT i både kontrol- og Prdm16-grupperne (figur 1B). SPH-induceret Prdm16-ekspression inducerede klart en udbredt ophobning af multilokulære beige adipocytter i iWAT (figur 1B). Desuden afslørede kvantitativ PCR (qPCR) en øget ekspression af Prdm16 og det termogene genprogram (Ucp1, Cox8b, Ppargc1a og Cidea) i Prdm16-gruppen sammenlignet med kontrollen (figur 1C).
Fremme af beige adipocytudvikling og forbedring af iltforbruget in vitro ved AdipoSPH-medieret Prdm16-overekspression
Dernæst blev egnetheden af denne model til at studere beige adipocytbiologi in vitro undersøgt. Til dette formål blev preadipocytter afledt af iWAT fra AdipoSPH-mus transduceret med AAV, der bærer sgRNA-sekvensen rettet mod Prdm16. Syv dage efter differentiering blev beige adipocytter anvendt til analyse af genekspression og iltforbrug (figur 2A). Tomt sgRNA blev brugt som kontrol. Det er værd at bemærke, at fjernelsen af STOP-codon ved CRE rekombinase, og aktivering af SPH-maskiner var under kontrol af adiponectinpromotoren/-forstærkeren, hvilket resulterede i aktivering af det endogene Prdm16-gen i modne adipocytter. Genekspressionsanalyse bekræftede den øgede ekspression af det endogene Prdm16-gen og termogene gener i Prdm16-overekspressionsgruppen sammenlignet med kontrolgruppen (figur 2B). For at bekræfte, at de SPH-inducerede beige adipocytter var funktionelt termogene, blev der udført et respirometriassay med høj opløsning på de primære adipocytter. Respirometri dataanalyse og fortolkning blev udført som for nylig beskrevet22. SPH-induceret Prdm16-ekspression resulterede i højere basalt og maksimalt iltforbrug end i kontrolceller (figur 2C). Det er vigtigt, at dataene indikerede øget ukoblet respiration (oligomycin-ufølsom) i Prdm16-gruppen sammenlignet med den i kontrolgruppen (figur 2C, tabel 3). Samlet set afslørede disse resultater, at SPH-induceret ekspression af endogen Prdm16 rekapitulerer bruningsfænotypen og forbedrer iltforbrugshastighederne observeret hos konventionelle Prdm16 Tg-mus.
Figur 1: Beige fedtudvikling ved injektion af adeno-associeret virus (AAV) rettet mod endogent Prdm16-gen i lyskehvidt fedtvæv (iWAT) hos AdipoSPH-mus. (A) Skematisk illustration af in vivo beige adipocyt eksperimentelt design (skabt ved hjælp af Biorender.com). (B) Histologiske (hæmatoxylin og eosin [H&E] farvning) billeder af iWAT. Skalabjælke = 50 μm. (C) Kvantitativ PCR (qPCR) af Prdm16 og termogene gener (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α og Cidea; n = 3). Data præsenteres som gennemsnit ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01 for Prdm16 versus kontrol (CTR) ved uparret elevs t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: SPH-induceret beige adipocytdifferentiering ved Prdm16-overekspression. (A) Skematisk illustration af in vitro beige adipocyt eksperimentelt design (skabt ved hjælp af Biorender.com). (B) Relativ genekspression af Prdm16 og termogene gener (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α og Cidea; n = 3). (C) Oxygenforbrug (OCR), n = 6. Data præsenteres som gennemsnit ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001 for Prdm16 versus kontrol (CTR) ved (B) uparret elevs t-test og (C) tovejs gentagne mål ANOVA, efterfulgt af Tukeys test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Sanger-sekventering af Prdm16 sgRNA. A) Skematisk illustration, der viser justeringen af enkeltstrengede komplementære Prdm16-oligonukleotider. (B) Sanger-sekventering af Prdm16 sgRNA ved hjælp af universel primer. Klik her for at downloade denne fil.
| Gen | Art | Fremad | Omvendt | |||||
| Genekspression | Prdm16 | mus | CAGCACGGTGAAGCCATTC | GCGTGCATCCGCTTGTG | ||||
| UCP1 | mus | TCTCAGCCGGCTTAATGACTG | GGCTTGCATTCTGACCTTCAC | |||||
| Ppargc1a | mus | AGCCGTGACCACTGACAACGAG | GCTGCATGGTTCTGAGTGCTAAG | |||||
| Cox8b | mus | GAACCATGAAGCCAACGACT | GCGAAGTTCACAGTGGTTCC | |||||
| Cidea | mus | ATCACAACTGGCCTGGTTACG | TACTACCCGGTGTCCATTTCT | |||||
| 36B4 | mus | TCCAGGCTTTGGGCATCA | CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA | |||||
| Molekylær kloning | sgRNA Prdm16 sekvens | mus | CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG | CCCCTTTTCAGCGCAGCTCG | ||||
| universel primer | mus | GAGGGCCTATTTCCC ATGATTCCTTCATAT |
||||||
Tabel 1: Primersekvenser anvendt i undersøgelsen.
| Medium | Sammensætning | |||
| Komplet medium | Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) med L-glutamin | |||
| 10% af føtalt bovin serum (FBS) | ||||
| 2,5% penicillin/streptomycin | ||||
| Induktionsmedium | Komplet medium | |||
| Indomethacin, slutkoncentration 125 μM (0,125 M lager i ethanol). BEMÆRK: Indomethacin skal opvarmes til 90 ° C i 10 sekunder for at blive opløst. | ||||
| Insulin, slutkoncentration 20 nM (1 mM stamme, tilsæt 1 μL HCl for at opløse (5,73 mg/ml). Opbevar lagerbeholdningen ved -20 °C. | ||||
| Dexamethason, slutkoncentration 2 μg/ml (2 mg/ml lager i ethanol) | ||||
| 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), slutkoncentration 500 μM (0,25 M lager i 0,5 M KOH) | ||||
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronin (T3), slutkoncentration 1 nM (10 μM stamme, T3 opløses i 1 M HCl og EtOH 1:4 på lager). | ||||
| Rosiglitazon i slutkoncentration 1 μg/ml (1 mg/ml lager i ethanol) | ||||
| Vedligeholdelsesmedium | Komplet medium | |||
| Insulin, slutkoncentration 20 nM (1 mM lager). Der tilsættes 1 μL HCl for at opløse (5,73 mg/ml). | ||||
| Rosiglitazon i slutkoncentration 1 μg/ml (1 mg/ml lager i ethanol) | ||||
Tabel 2: Sammensætning af medier anvendt i undersøgelsen.
| Parametre | CTR | PRDM16 | p-værdi | ||
| Intet mitokondrielt iltforbrug (pMoles/min/μg protein) | 8.19 ± 1.40 | 10.80 ± 1.83 | 0.01 | ||
| Basal respiration (pMoles/min/μg protein) | 28.82 ± 5.20 | 52,58 ± 13,73 | 0.001 | ||
| Maksimal respiration (pMoles/min/μg protein) | 63,81 ± 9,80 | 122,94 ± 22,31 | < 0,001 | ||
| Ekstra respirationskapacitet (pMoles/min/μg protein) | 34.98 ± 11.09 | 70.36 ± 26.06 | 0.006 | ||
| Oligo ufølsom (pMoles/min/μg protein) | 8.27 ± 2.29 | 15.85 ± 5.48 | 0.005 | ||
| Oligofølsom (pMoles/min/μg protein) | 20.54 ± 5.68 | 36.72 ± 14.79 | 0.016 | ||
| Kobling effektivitet | 71,28 ± 1,51 | 69,84 ± 3,05 | 0.163 | ||
| Celle RCR | 7,70 ± 1,46 | 7,75 ± 2,43 | 0.485 | ||
Tabel 3: Respiratoriske parametre for SPH-inducerede beige adipocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En af de mest nyttige ikke-redigeringsanvendelser af CRISPR-teknologi er forhør af genfunktion gennem aktivering af endogene gener ved hjælp af CRISPRa-systemer6. SPH er en kraftfuld CRISPRa, der oprindeligt blev beskrevet for at inducere omdannelsen af astrocytter til aktive neuroner ved at målrette mod flere neurogene gener14. I denne undersøgelse blev AdipoSPH påvist at være et egnet værktøj til at undersøge beige fedtbiologi ved at aktivere ekspressionen af endogent Prdm16 i adipocytter. SPH-induceret Prdm16-overekspression i adipocytter fører til aktivering af det termogene genprogram og inducerer browning-fænotypen, fænokopiering af en tidligere transgen (Tg) Prdm16-mus model23. Prdm16 blev valgt i denne undersøgelse som målet for inducering af beige adipocytter baseret på den centrale rolle af denne transkriptionsfaktor i reguleringen af brun og beige fedtdifferentiering samt reguleringen af det termogene genprogram (fx forbedring af Ucp1-ekspression) i differentierede adipocytter. Ikke desto mindre giver den nuværende model mulighed for overekspression af ethvert endogent gen efter forskernes skøn og formålet med undersøgelsen.
Traditionelle transgene modeller, der undersøger fedtvævsbiologi, er afhængige af udviklingen af genetisk modificerede gnavere, der overudtrykker et transgen under kontrol af en promotor/forstærker, der er begrænset til adipocytter (f.eks. Fabp4 eller adiponectin)24. Selvom den nuværende teknologi har fremskyndet tempoet i udviklingen af disse modeller, er omkostningerne og tiden til at udvikle dem stadig et almindeligt problem, som det videnskabelige samfund oplever. I modsætning hertil er AdipoSPH en billigere og mere alsidig model til gain-of-function-tilgange end traditionelle Tg-mus. Desuden er AdipoSPH velegnet til at studere lange ikke-kodende RNA- og transkriptisoformer, som ikke er særlig velegnede til Tg-musemodeller.
AdipoSPH giver også flere fordele ved at undersøge fedtvævsbiologi sammenlignet med simpel administration af AAV, en nuværende alternativ tilgang til gain-of-function-eksperimenter25. For det første fremmer AAV leveret til fedtvæv overekspression ved at indføre flere kopier af et transgen. I modsætning hertil repræsenterer SPH-aktiveringen af endogene gener en mere naturlig virkningsmekanisme. For det andet resulterer transgener leveret af AAV (ved hjælp af konstitutive promotorer) normalt i deres overekspression i "enhver celletype" inden for fedtvævets mikromiljø. I modsætning hertil er AdipoSPH-induceret ekspression af endogene gener begrænset til adipocytter. For det tredje er emballagestørrelsen (~ 4.5kb) en typisk begrænsning af AAV for nogle transgener26. AAV-bærende sgRNA kræver imidlertid en enkel og nem kloningsstrategi for tilpassede 20 nukleotider. Endelig når AAV-administration typisk systemisk cirkulation og inficerer andre væv og organer. Selvom nogle AAV'er indeholder mikroRNA'er for at afbøde ekspressionen af transgener i bestemte væv, såsom lever og hjerte25, kan denne strategi ikke forhindre AAV-infektion i andre væv og organer. I modsætning hertil er AdipoSPH-induceret ekspression af endogene gener begrænset til adipocytter, selv i betragtning af en vis lækage af AAV i systemisk cirkulation. Således er AdipoSPH også en egnet model til systemisk administration af AAV-bærende sgRNA og undersøgelse af fedtvævsregulering af helkropsenergihomeostase.
Selvom AdipoSPH-modellen giver nogle fordele, har den begrænsninger, der er vigtige at overveje. AAV er i øjeblikket den mest almindelige platform for in vivo levering af sgRNA. Nogle udfordringer inden for AAV-fremstilling og immunologiske problemer forbliver dog uløste26,27. Desuden resulterer forskellige mængder og fordelinger af injiceret AAV i hele fedtvæv i intra- og intervævsvariabilitet af genekspression. Vi mener, at sgRNA-vektorkloning, AAV-produktion og homogen administration af AAV i iWAT er kritiske trin for denne protokols succes. Endelig aktiverer forskellige sgRNA'er markant ekspressionen af endogene gener i SPH-systemet14. Hovedanbefalingen er at designe og teste tre til fem sgRNA-sekvenser inden for 200 bp opstrøms for transkriptionsstartstedet (TSS) for genet af interesse. Derfor kræver definition af den bedste sgRNA-sekvens for et målgen typisk besværlige in vitro-assays forud for in vivo-eksperimenter.
AdipoSPH er også en attraktiv model til at undersøge andre aspekter af fedtvævsbiologi. For eksempel fremmer adipocytter udskillelsen af adskillige adipokiner28,29; Imidlertid forbliver helkropsvirkningerne af de fleste af disse molekyler dårligt forstået. AdipoSPH er en egnet model til at løse dette problem ved at overudtrykke enkelte eller flere endogene gener i modne adipocytter og undersøge deres lokale eller systemiske virkninger. Således er AdipoSPH et unikt værktøj til at studere fedtvævets biologi og fysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker støtten fra Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, til generering af AdipoSPH-mus, Inmmunometabolism and Cell Signaling Laboratory og National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology (INFABIC) for al eksperimentel støtte. Vi takker den økonomiske støtte fra Sao Paulo Research Foundation (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
References
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Cohen, P., Kajimura, S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
- Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
- Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction. Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103 (2020).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
- Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes. STAR Protocols. 1 (3), 100118 (2020).
- Cohen, P., et al. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch. Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).
- Harms, M., Seale, P. Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential. Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).
- Seale, P., et al. Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).
- Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. Understanding adipose tissue development from transgenic animal models. Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
- Deshmukh, A. S., et al. Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine. Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).
- Sponton, C. H., et al. The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication. EMBO reports. 21 (9), 49828 (2020).
