Summary
Este protocolo presenta el uso de CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) en adipocitos (AdipoSPH) como una estrategia alternativa al virus adenoasociado (AAV) para investigar la biología de la grasa beige. La inyección in vivo de ARNg portador de AAV dirigida al gen endógeno Prdm16 es suficiente para inducir el desarrollo de grasa beige y mejorar el programa de genes termogénicos.
Abstract
La tecnología de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) ha provocado una revolución en la biología, y las herramientas recientes se han aplicado mucho más allá de la edición de genes descrita originalmente. El sistema de activación CRISPR (CRISPRa) combina la proteína Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) con distintos módulos de transcripción para inducir la expresión génica endógena. SunTag-p65-HSF1 (SPH) es una tecnología CRISPRa recientemente desarrollada que combina componentes de mediadores de activación sinérgicos (SAM) con los activadores SunTag. Este sistema permite la sobreexpresión de genes únicos o múltiples mediante el diseño de un ARN guía única personalizado (sgRNA). En este estudio, se utilizó un ratón SPH previamente desarrollado para generar un ratón condicional que expresa SPH en adipocitos (linaje adiponectina Cre), llamado AdipoSPH. Para inducir un fenotipo de grasa blanca a beige (pardeamiento), se inyectó un virus adenoasociado (AAV) portador de sgRNA dirigido al gen endógeno Prdm16 (un factor de transcripción bien establecido relacionado con el desarrollo de grasa marrón y beige) en el tejido adiposo blanco inguinal (iWAT). Este modelo de ratón indujo la expresión endógena de Prdm16 y activó el programa del gen termogénico. Además, la sobreexpresión de Prdm16 inducida por SPH in vitro aumentó el consumo de oxígeno de los adipocitos beige, fenocopiando los resultados de un modelo previo de ratón transgénico Prdm16. Por lo tanto, este protocolo describe un modelo de ratón versátil, rentable y rentable para investigar la biología del tejido adiposo.
Introduction
Los adipocitos beige (o brite) son adipocitos ricos en mitocondrias que expresan la proteína 1 (UCP1) y que residen dentro de los depósitos de tejido adiposo blanco (WAT). La grasa beige emerge de un subconjunto de progenitores adipocitos o adipocitos blancos maduros en respuesta a la exposición al frío y otros estímulos 1,2. Los adipocitos beige pueden convertir la energía en calor de una manera dependiente de UCP1 o independiente3. Independientemente de su función termogénica, la grasa beige también puede mejorar la salud metabólica por otros medios, como la secreción de adipoquinas y actividades antiinflamatorias y antifibróticas. Los estudios en ratones y humanos han demostrado que la inducción de grasa beige mejora la homeostasis de la glucosa y los lípidos de todo el cuerpo3. Sin embargo, aunque nuestro conocimiento de la biología de la grasa beige ha evolucionado rápidamente en los últimos años, la mayoría de sus beneficios metabólicos y mecanismos relacionados aún no se comprenden completamente.
Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) se describieron por primera vez en células eucariotas como una herramienta capaz de generar una ruptura de doble cadena (DSB) en un sitio específico del genoma a través de la actividad nucleasa de la proteína Cas9 4,5. Cas9 es guiado por un ARN sintético de guía única (sgRNA) para dirigirse a una región genómica específica, lo que lleva a un ADN DSB. Además de utilizar la nucleasa Cas9 con fines de edición, la tecnología CRISPR-Cas9 ha evolucionado para ser utilizada como una herramienta de regulación génica específica de secuencia6. El desarrollo de una proteína Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) y la asociación de módulos transcripcionales capaces de mejorar la expresión génica ha dado lugar a herramientas de activación CRISPR (CRISPRa). Han surgido varios sistemas CRISPRa, como VP647,8, mediador de activación sinérgica (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 y SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, que combina los componentes de los activadores SAM y SunTag. Recientemente se ha demostrado que la expresión inducida de genes neurogénicos en neuroblastos N2a y astrocitos primarios es mayor utilizando SPH en comparación con otros sistemas CRISPRa14, demostrando SPH como una herramienta CRISPRa prometedora.
Aquí, aprovechamos un ratón SPH14 previamente desarrollado para generar un modelo de ratón condicional que expresa SPH específicamente en adipocitos utilizando el linaje de adiponectina Cre (AdipoSPH). Usando un virus adenoasociado (AAV) portador del ARNg dirigido al gen endógeno Prdm16, se indujo el pardeamiento (conversión de blanco a beige) de WAT inguinal (iWAT) para aumentar la expresión del programa de genes termogénicos. Además, la sobreexpresión in vitro de Prdm16 mejoró el consumo de oxígeno. Por lo tanto, este protocolo proporciona un modelo versátil de ratón SPH para explorar los mecanismos del desarrollo de grasa beige dentro del tejido adiposo.
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Protocol
Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Campinas (protocolo CEUA #5810-1/2021).
1. Clonación molecular
- Diseño de ARN guía única (sgRNAs)
- Diseñar sgRNAs para la activación de CRISPR utilizando CHOPCHOP, disponibles en https://chopchop.cbu.uib.no/, o cualquier otra herramienta adecuada. Utilice los siguientes parámetros para diseñar sgRNA dirigidos al gen Prdm16: Diana: Prdm16; En: Mus musculus; Utilizando: Crispr/Cas9; Para: Activación.
NOTA: Diseñe sgRNAs para cada región de interés repartidas en una región de sitio de inicio de transcripción (TSS) ascendente de 200 pb. Por ejemplo, el sgRNA dirigido a Prdm16 utilizado en este estudio se une a 154 pb aguas arriba de TSS. - Agregue voladizos al sgRNA para que coincida con el sitio de restricción de SacI en la columna vertebral del vector pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry (consulte la Tabla de materiales). Incluye: 5'- (N20)AGCT-3' (N = nucleótidos). Por ejemplo, la secuencia dirigida al gen Prdm16 es 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3', y con voladizos es 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'.
- Obtenga la secuencia inversa del complemento 3' sgRNA utilizando la herramienta disponible en https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html. Por ejemplo, la secuencia 3' sgRNA dirigida al gen Prdm16 es 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'.
- Diseñar sgRNAs para la activación de CRISPR utilizando CHOPCHOP, disponibles en https://chopchop.cbu.uib.no/, o cualquier otra herramienta adecuada. Utilice los siguientes parámetros para diseñar sgRNA dirigidos al gen Prdm16: Diana: Prdm16; En: Mus musculus; Utilizando: Crispr/Cas9; Para: Activación.
- Recocido de oligonucleótidos complementarios monocatenarios
- Añadir 1 μL de cada oligonucleótido monocatenario de 5' y 3' (concentración madre: 100 μM), 1 μL de tampón ligasa T4, 0,5 μL de polinucleótido quinasa T4 (PNK) (1 × 104 unidades/ml) y 6,5 μL deH2Oa un volumen de reacción final de 10 μL. Analice los oligonucleótidos monocatenarios complementarios utilizando un termociclador en las siguientes condiciones: 37 °C durante 30 min y 95 °C durante 5 min, seguido de una velocidad de descenso de 5 °C/min.
NOTA: La enzima PNK se suministra con tampón PNK y no contiene suficiente ATP requerido para la reacción de fosforilación (ver Tabla de materiales). Para simplificar la reacción, use el tampón ligasa T4 (en lugar del tampón PNK). El tampón de la ligasa T4 proporciona la cantidad adecuada (1 mM de ATP) de fosfato para la reacción de fosforilación. La enzima PNK proporciona una fosforilación final 5' de oligonucleótidos para la posterior reacción de ligadura.
- Añadir 1 μL de cada oligonucleótido monocatenario de 5' y 3' (concentración madre: 100 μM), 1 μL de tampón ligasa T4, 0,5 μL de polinucleótido quinasa T4 (PNK) (1 × 104 unidades/ml) y 6,5 μL deH2Oa un volumen de reacción final de 10 μL. Analice los oligonucleótidos monocatenarios complementarios utilizando un termociclador en las siguientes condiciones: 37 °C durante 30 min y 95 °C durante 5 min, seguido de una velocidad de descenso de 5 °C/min.
- Ligadura de oligonucleótidos de ARNg recocidos
- Añadir 25 ng de plásmido pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry a 2 μL de oligonucleótidos de ARNg recocido, 1 μL de enzima SacI, 2 μL de tampón de ADN ligasa T4x T4, 1 μL de ADN ligasa T4 (1-3 u/μL) (ver Tabla de materiales) yH2Oa un volumen de reacción final de 10 μL.
- Realizar la ligadura incubando la mezcla de reacción utilizando un termociclador en las siguientes condiciones: 15 ciclos de 37 °C durante 5 min y 25 °C durante 5 min, seguidos de mantener a 4 °C.
- Transformación seguida de reacción en cadena de la polimerasa de colonias (PCR)
- Transformar las células competentes de E. coli DH10B (ver Tabla de materiales) con 4 μL del producto de ligadura mediante choque térmico (42 °C durante 45 s) y extender sobre una placa de agar que contenga 100 μg/ml de ampicilina.
- Confirme las colonias transformadas por PCR de colonias utilizando la mezcla maestra de PCR (consulte la Tabla de materiales). Recoger la colonia y mezclar con 5 μL de mezcla maestra, 0,1 μL de cebador universal (concentración madre: 100 μM), 0,1 μL de cebador inverso de sgRNA (concentración madre: 100 μM) (Tabla 1) y 5 μL deH2O. Ejecutar la PCR con un termociclador en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial (94 °C durante 2 min), seguido de 35 ciclos de desnaturalización (94 °C durante 20 s), recocido (60 °C durante 30 s), extensión (72 °C durante 30 s) y una etapa final de elongación (72 °C durante 5 min). Resolver el ADN mediante electroforesis en gel de agarosa (1,5%) en tampón TAE 0,5x a 90 V durante 30 min.
NOTA: Los clones positivos dan una banda de ~280 pb. - Enviar muestras positivas para la secuenciación de Sanger utilizando cebador universal (Tabla 1, Archivo Suplementario 1).
- Purificación de plásmidos
- Purificar el plásmido de un clon positivo usando un kit de purificación de plásmidos (ver Tabla de materiales), siguiendo las instrucciones del fabricante.
NOTA: Purificar el plásmido utilizando resina de intercambio aniónico u otro kit adecuado para su uso en la transfección celular. - Incubar el clon positivo (12 h a 37 °C con agitación a 200 rpm) utilizando un medio de crecimiento bacteriano estándar que contenga 100 μg/ml de ampicilina.
- Centrifugar las células bacterianas a 6.000 × g durante 10 min a 4 °C. Siga los siguientes pasos de acuerdo con las instrucciones del kit del fabricante.
- Purificar el plásmido de un clon positivo usando un kit de purificación de plásmidos (ver Tabla de materiales), siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Embalaje AAV
NOTA: El envasado AAV se realizó de acuerdo con publicaciones anteriores15,16 con modificaciones menores.
- Placas de células 293T (ver tabla de materiales) en un matraz de 175 cm2 (siembra de 5 × 106 células por matraz) utilizando 25 ml de medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S). Incubar a 37 °C, 5% deCO2 y 95% de humedad hasta que las células alcancen el 50% -70% de confluencia.
- Mezclar 14 μL de polietilenimina (1 μg/μL) con 1 mL de NaCl 150 mM. Mezclar los tres plásmidos necesarios para la producción de AAV en una relación molar 1:1:1 (es decir, 17,7 μg de pAdDeltaF6, 7,9 μg de AAV2/8 (ver Tabla de materiales) y 5,9 μg de sgRNA clonado del paso 1 en 1 ml de NaCl de 150 mM. Transfiera la mezcla de polietilenimina:NaCl gota a gota al tubo que contiene el ADN (mezcla de plásmidos) e incube durante 20 min a 25 °C.
NOTA: pAdDeltaF6 es un plásmido auxiliar y pCapsid pAAV2/8 es un plásmido de empaquetamiento que expresa los genes de replicación (Rep) y cápside (cap). Ambos plásmidos son necesarios para producir AAV. - Antes de la transfección, reemplace el medio de crecimiento celular con 18 ml de DMEM que contenga 1% de FBS y L-alanil-L-glutamina (0,5 g / L). Añadir 2 ml de la mezcla de polietilenimina:ADN a cada matraz de cultivo e incubar las células en una incubadora deCO2 (37 °C, 5% CO2, 95% de humedad).
- Después de 5 h, añadir 5 ml de DMEM suplementado con 10% FBS y L-alanil-L-glutamina (0,5 g/L).
- Después de 3 días de incubación, separar las células del matraz de cultivo con un raspador celular. Recoja las células 293T de 10 (175 cm2) matraces de cultivo celular en tubos cónicos de 50 ml y agregue DMEM (consulte la Tabla de materiales) hasta 30 ml.
- Agregue 3 ml de cloroformo a cada tubo cónico de 50 ml que contenga las células 293T y mezcle usando un mezclador de vórtice a alta velocidad durante 5 min. Resuspender las células añadiendo 7,6 mL de NaCl 5 M y vórtice brevemente. Centrifugar a 3.000 × g y 4 °C durante 5 min.
- Transfiera la fase acuosa a un nuevo tubo cónico y agregue 9.4 ml de polietilenglicol (PEG) al 50% (v / v) 8000. Mezclar con un mezclador de vórtices a alta velocidad durante 10 s y poner las muestras en hielo durante 1 h.
- Centrifugar a 3.000 × g a 4 °C durante 30 min. Retire el sobrenadante y deje que el pellet se seque durante 10 minutos.
- Añadir 1,4 ml de HEPES (50 mM, pH 8) y mezclar durante 5 min con un mezclador de vórtice a alta velocidad. Añadir 3,5 μL de 1 M MgCl2, 14 μL de DNasa I (20 unidades/μL) y 1,4 μL de RNasa A (10 μg/μL). Incubar en un baño de agua a 37 °C durante 20 min, y luego transferir las muestras a nuevos tubos de 1,5 ml (700 μL en cada tubo).
- Añadir 700 μL de cloroformo a cada tubo de 1,5 ml y mezclar con un mezclador de vórtice a alta velocidad durante 10 s. Centrifugar a 3.000 × g a 4 °C durante 5 min y transferir la fase acuosa a un nuevo tubo. Repita este paso 3 veces.
- Evaporar el cloroformo durante 30 minutos en un gabinete de bioseguridad. Luego, transfiera 300 μL de la fase acuosa a un tubo de ultracentrifugación de 0,5 ml (consulte la Tabla de materiales). Girar el filtro a 14.000 × g a 25 °C durante 5 min. Retire el flujo y gire el filtro de nuevo hasta que todo el volumen haya pasado a través del filtro.
- Lave el filtro añadiendo 300 μL de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco y mezcle las soluciones con pipeteo. Centrifugar el filtro durante 5 min a 14.000 × g a 25 °C. Repita este paso de lavado 4x.
- Centrifugar el filtro durante 8 min a 14.000 × g a 25 °C. Coloque el filtro boca abajo en un tubo nuevo y gire durante 2 minutos a 1.000 × g a 25 °C.
3. Titulación del VAA por qPCR
- Preparar una curva estándar para la titulación de AAV y determinar el título de AAV de acuerdo con el estudio original de Fripont et al.15.
4. Inyección in vivo de AAV en el tejido adiposo blanco inguinal (iWAT)
- Separe las herramientas quirúrgicas y los suministros necesarios para la cirugía y esterilícelos según lo recomendado para cada material específico.
- Anestesiar al ratón con 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina mediante inyección intraperitoneal. Confirme la anestesia aplicando una presión vigorosa sobre la pata y la cola y verificando si hay un reflejo. Aplique ungüento en los ojos del ratón para evitar la sequedad ocular durante la cirugía.
- Coloque el ratón anestesiado en posición supina y afeite un área pequeña en los flancos, proximal a las articulaciones de la cadera para inyecciones iWAT, con una afeitadora. Aplicar crema depilatoria durante 5 min. Retire la crema residual con agua para evitar quemaduras en la piel.
- Desinfecte la piel usando tres rondas alternas de aplicación de solución antiséptica (povidona yodada) sobre la piel con una gasa limpia y alcohol al 70%. Deseche la gasa después de cada uso.
- Realizar una aplicación final de una solución antiséptica sobre la piel. Luego, haga una incisión de 1-2 cm con tijeras esterilizadas en el área proximal de las articulaciones y mantenga la piel abierta con fórceps para exponer el depósito de grasa. El WAT se puede encontrar adherido a la piel en ambos lados, extendiéndose desde el principio en la espalda y hacia abajo hacia el testículo.
NOTA: Use cortinas para evitar la contaminación durante la cirugía o los procedimientos de sutura. - Usando fórceps, a través de la incisión, tire suavemente del depósito de grasa hacia arriba para asegurarse de que la inyección esté en la ubicación y profundidad correctas.
NOTA: Tenga cuidado de no retirar el tejido de su ubicación original. - Llene la jeringa de microlitros (calibre: 33; estilo de punto: 4; ángulo: 12; longitud: 10) (consulte la Tabla de materiales) con 2,5 μL (5,6 × 1010 genomas virales [VG]/μL) del AAV (que contiene el sgRNA dirigido al gen endógeno Prdm16). Inserte con cuidado la aguja en un ángulo de 30°-45° en el iWAT. Repita la inyección 5 veces en diferentes ubicaciones del tejido para infectar homogéneamente toda la almohadilla de grasa iWAT. Se recomienda un volumen total de 15 μL para infectar el iWAT.
NOTA: La profundidad de inserción de la jeringa depende del grosor del depósito de la almohadilla de grasa. Utilice la técnica sin contacto para elaborar la inyección. - Cierre la incisión de la piel afeitada con suturas de monofilamento 4/0. Coloque el ratón en una almohadilla térmica hasta que recupere la conciencia. Controle al animal cada 10-15 minutos hasta que se recupere por completo. Después de que el animal recupere la conciencia, observe el perfil locomotor, que debe ser lineal y no tener signos de angustia o dolor.
- Realizar el control del dolor postoperatorio dentro de las 48 h después de la cirugía mediante la administración de clorhidrato de tramadol (5 mg / kg) por vía intraperitoneal durante 3 días (2 veces / día).
NOTA: Esté atento a los signos de angustia y malestar y controle la ingesta de agua y alimentos. Administre una dosis efectiva de analgésico de manera preventiva, preferiblemente antes o al comienzo de la cirugía. - Mantenga al ratón en una jaula con acceso gratuito a alimentos y agua durante el período de curación. Después del período de curación, proceda a la eutanasia del ratón. En este estudio, la eutanasia se realizó por una sobredosis de anestésicos inyectables (intraperitoneales) de 3 veces la dosis inductora (300-360 mg / kg de clorhidrato de ketamina + 30-40 mg / kg de clorhidrato de xilazina) seguido de decapitación.
NOTA: Se recomienda encarecidamente mantener a los animales alojados en jaulas individuales hasta que estén completamente recuperados de la anestesia.
5. Diferenciación in vitro de células vasculares estromales (SVF) en adipocitos beige
- Realizar el aislamiento y recubrimiento de SVFs primarios del iWAT de ratones AdipoSPH según Aune et al.17. SVF de semillas derivadas de ratones AdipoSPH iWAT en una placa de 6 pocillos que contiene medio completo (DMEM que contiene 3.1 g / L de glucosa, 0.5 g / L de L-alanil-L-glutamina, 10% FBS y 2.5% P / S) durante 1-2 h.
NOTA: La fracción SVF contiene una mezcla de diferentes tipos de células. En este paso, no es posible definir el número de células progenitoras sembradas que dan lugar a los adipocitos. - Aspire el medio, lave el pozo 2 veces con solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) y reemplácelo con un medio fresco completo. Incubar las células a 37 °C, 5% CO2, 95% de humedad hasta que las células alcancen 70% -80% de confluencia.
- Inducir la diferenciación (día 0) mediante el tratamiento de las células con el medio de inducción (Tabla 2).
NOTA: El cóctel farmacológico del medio de inducción es necesario para mejorar la diferenciación de los adipocitos beige y para la expresión del programa génico termogénico17. - Después de 2 días (día 2), reemplace el medio de inducción con el medio de mantenimiento (Tabla 2).
- Después de 2 días (día 4), reemplace el medio de mantenimiento con un nuevo medio de mantenimiento (Tabla 2) durante 2 a 3 días.
- Cambie el medio de mantenimiento cada 48 h hasta que los preadipocitos estén completamente diferenciados en adipocitos (típicamente 6 días después de la adición del medio de inducción). Los adipocitos maduros se pueden observar mediante microscopía óptica, ya que las células diferenciadas parecen estar cargadas de gotas de lípidos.
6. Infección in vitro por AAV de SVF
NOTA: Los SVF derivados de ratones AdipoSPH iWAT fueron infectados con sgRNA-Prdm16 portadores de AAV como se describió previamente por Wang et al.18 con algunas modificaciones.
- Cultivar las células en una placa de cultivo de 6 pocillos con medio completo hasta que las células alcancen una confluencia del 70%-80%, como se describió anteriormente en los pasos 5.1-5.3.
- Mezclar 5,6 ×10 10 VG/μL de sgRNA-Prdm16 portador de AAV con 2 ml de medio completo y bromuro de hexadimetrina (8 μg/ml) (ver Tabla de materiales). Transducir las células reemplazando el medio completo y agregando el medio completo que contiene AAV. Incubar las células transducidas durante 12 h a 37 °C, 95% de humedad y 5% deCO2.
- Dividir y sembrar las células como se describe en el paso 5 para la proliferación celular y la diferenciación en adipocitos beige.
NOTA: Para el ensayo de consumo de oxígeno, semilla 4.0 × 104 células (del paso 6.2) por pocillo con medio de inducción en una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Los pasos posteriores de proliferación y diferenciación celular se realizan como se describe en el paso 5. El ensayo de consumo de oxígeno se realiza cuando las células alcanzan la confluencia del 80%-100% y están completamente diferenciadas, como se informó anteriormente19.
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Representative Results
Los ratones AdipoSPH se desarrollaron mediante la cría de cepas de ratones SPH y Adipoq-Cre. Ambas cepas de ratón tenían un fondo híbrido C57BL6J-DBA/2J (según el proveedor comercial; ver Tabla de materiales). El linaje del ratón SPH fue descrito originalmente por Zhou et al.14.
Desarrollo de adipocitos beige in vivo a través de la sobreexpresión de Prdm16 mediada por AdipoSPH
Para evaluar la capacidad del modelo descrito en este estudio para desarrollar adipocitos beige in vivo, se inyectó el AAV portador del gen sgRNA dirigido a Prdm16 en el iWAT de ratones AdipoSPH. Prdm16 es un factor de transcripción bien establecido que determina el desarrollo y la función del adipocito beige20,21. Es importante mencionar que aquí elegimos un sgRNA previamente probado y validado dirigido al gen endógeno Prdm1614. Se utilizó como control AAV portador de un sgRNA vacío. A los 10 días después de la inyección de AAV, se recolectó iWAT para análisis histológicos y de expresión génica (Figura 1A). Como era de esperar, las imágenes de inmunofluorescencia de iWAT de ratones AdipoSPH demostraron la expresión de dCas9 tanto en el grupo control como en el de Prdm16 (Figura 1B). Además, la expresión de mCherry confirmó el éxito de la infección por AAV de iWAT tanto en el grupo control como en el grupo Prdm16 (Figura 1B). La expresión de Prdm16 inducida por SPH indujo claramente una acumulación generalizada de adipocitos beige multiloculares en iWAT (Figura 1B). Además, la PCR cuantitativa (qPCR) reveló una mayor expresión de Prdm16 y del programa de genes termogénicos (Ucp1, Cox8b, Ppargc1a y Cidea) en el grupo Prdm16 en comparación con el control (Figura 1C).
Promoción del desarrollo de adipocitos beige y mejora del consumo de oxígeno in vitro mediante la sobreexpresión de Prdm16 mediada por AdipoSPH
A continuación, se investigó la idoneidad de este modelo para estudiar la biología de los adipocitos beige in vitro . Con este fin, los preadipocitos derivados del iWAT de ratones AdipoSPH se transducieron con AAV que lleva la secuencia sgRNA dirigida a Prdm16. A los siete días después de la diferenciación, se utilizaron adipocitos beige para el análisis de la expresión génica y el consumo de oxígeno (Figura 2A). Se utilizó sgRNA vacío como control. Vale la pena señalar que la eliminación del codón STOP por la recombinasa CRE y la activación de la maquinaria SPH estaba bajo el control del promotor / potenciador de la adiponectina, lo que resultó en la activación del gen endógeno Prdm16 en adipocitos maduros. El análisis de expresión génica confirmó el aumento de la expresión del gen endógeno Prdm16 y los genes termogénicos en el grupo de sobreexpresión de Prdm16 en comparación con el control (Figura 2B). Para confirmar que los adipocitos beige inducidos por SPH eran funcionalmente termogénicos, se realizó un ensayo de respirometría de alta resolución en los adipocitos primarios. El análisis e interpretación de los datos de respirometría se realizó como se describió recientemente22. La expresión de Prdm16 inducida por SPH resultó en un mayor consumo de oxígeno basal y máximo que en las células de control (Figura 2C). Es importante destacar que los datos indicaron una mejor respiración desacoplada (insensible a la oligomicina) en el grupo de Prdm16 en comparación con la del grupo de control (Figura 2C, Tabla 3). Tomados en conjunto, estos resultados revelaron que la expresión inducida por SPH de Prdm16 endógeno recapitula el fenotipo de pardeamiento y mejora las tasas de consumo de oxígeno observadas en ratones Prdm16 Tg convencionales.
Figura 1: Desarrollo de grasa beige mediante inyección del virus adenoasociado (AAV) dirigido al gen endógeno Prdm16 en tejido adiposo blanco inguinal (iWAT) de ratones AdipoSPH. (A) Ilustración esquemática del diseño experimental de adipocito beige in vivo (creado con Biorender.com). (B) Imágenes histológicas (tinción de hematoxilina y eosina [H&E]) de iWAT. Barra de escala = 50 μm. (C) PCR cuantitativa (qPCR) de genes Prdm16 y termogénicos (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α y Cidea; n = 3). Los datos se presentan como media ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01 para Prdm16 versus control (CTR) por la prueba t de Student no pareada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diferenciación de adipocito beige inducida por SPH por sobreexpresión de Prdm16. (A) Ilustración esquemática del diseño experimental de adipocito beige in vitro (creado utilizando Biorender.com). (B) Expresión génica relativa de Prdm16 y genes termogénicos (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α y Cidea; n = 3). (C) Tasa de consumo de oxígeno (OCR), n = 6. Los datos se presentan como media ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001 para Prdm16 versus control (CTR) por (B) prueba t de Student no pareada y (C) ANOVA de medidas repetidas bidireccionales, seguido de la prueba de Tukey. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Secuenciación de Sanger de Prdm16 sgRNA. (A) Ilustración esquemática que demuestra la alineación de oligonucleótidos Prdm16 complementarios monocatenarios. (B) Secuenciación de Sanger de Prdm16 sgRNA utilizando cebador universal. Haga clic aquí para descargar este archivo.
| Gen | Especie | Adelante | Marcha atrás | |||||
| Expresión génica | Prdm16 | ratón | CAGCACGGTGAAGCCATTC | GCGTGCATCCGCTTGTG | ||||
| Ucp1 | ratón | TCTCAGCCGGCTTAATGACTG | GGCTTGCATTCTGACCTTCAC | |||||
| Ppargc1a | ratón | AGCCGTGACCACTGACAACGAG | GCTGCATGGTTCTGAGTGCTAAG | |||||
| Cox8b | ratón | GAACCATGAAGCCAACGACT | GCGAAGTTCACAGTGGTTCC | |||||
| Cidea | ratón | ATCACAACTGGCCTGGTTACG | TACTACCCGGTGTCCATTTCT | |||||
| 36B4 | ratón | TCCAGGCTTTGGGCATCA | CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA | |||||
| Clonación molecular | secuencia sgRNA Prdm16 | ratón | CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG | CCCCTTTTCAGCGCAGCTCG | ||||
| Imprimación universal | ratón | GAGGGCCTATTTCCC ATGATTCCTTCATAT |
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Tabla 1: Secuencias de cebadores utilizadas en el estudio.
| Medio | Composición | |||
| Medio completo | Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco con L-Glutamina | |||
| 10% de suero bovino fetal (FBS) | ||||
| 2.5% de penicilina/estreptomicina | ||||
| Medio de inducción | Medio completo | |||
| Indometacina, concentración final 125 μM (stock de 0,125 M en etanol). NOTA: La indometacina debe calentarse a 90 °C durante 10 segundos para disolverse. | ||||
| Insulina, concentración final 20 nM (stock de 1 mM, añadir 1 μL de HCl para solubilizar (5,73 mg/ml). Almacenar el stock a -20 °C. | ||||
| Dexametasona, concentración final 2 μg/ml (2 mg/ml en etanol) | ||||
| 3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX), concentración final 500 μM (0,25 M stock en 0,5 M KOH) | ||||
| 3,3',5-Triyodo-L-tironina (T3), concentración final 1 nM (stock de 10 μM, disolver T3 en HCl 1 M y EtOH 1:4 a stock). | ||||
| Rosiglitazona, concentración final 1 μg/ml (stock de 1 mg/ml en etanol) | ||||
| Medio de mantenimiento | Medio completo | |||
| Insulina, concentración final 20 nM (stock de 1 mM). Añadir 1 μL de HCl para solubilizar (5,73 mg/ml). | ||||
| Rosiglitazona, concentración final 1 μg/ml (stock de 1 mg/ml en etanol) | ||||
Tabla 2: Composición de los medios utilizados en el estudio.
| Parámetros | CTR | PRDM16 | valor p | ||
| Sin consumo de oxígeno mitocondrial (proteína pMoles/min/μg) | 8,19 ± 1,40 | 10,80 ± 1,83 | 0.01 | ||
| Respiración basal (proteína pMoles/min/μg) | 28,82 ± 5,20 | 52,58 ± 13,73 | 0.001 | ||
| Respiración máxima (proteína pMoles/min/μg) | 63,81 ± 9,80 | 122,94 ± 22,31 | < 0,001 | ||
| Capacidad respiratoria sobrante (proteína pMoles/min/μg) | 34,98 ± 11,09 | 70,36 ± 26,06 | 0.006 | ||
| Oligo insensible (proteína pMoles/min/μg) | 8,27 ± 2,29 | 15,85 ± 5,48 | 0.005 | ||
| Oligosensible (proteína pMoles/min/μg) | 20,54 ± 5,68 | 36,72 ± 14,79 | 0.016 | ||
| Eficiencia de acoplamiento | 71,28 ± 1,51 | 69,84 ± 3,05 | 0.163 | ||
| RCR celular | 7,70 ± 1,46 | 7,75 ± 2,43 | 0.485 | ||
Tabla 3: Parámetros respiratorios de los adipocitos beige inducidos por SPH.
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Discussion
Una de las aplicaciones no editativas más útiles de la tecnología CRISPR es la interrogación de la función génica mediante la activación de genes endógenos utilizando sistemas CRISPRa6. SPH es un potente CRISPRa que fue descrito originalmente para inducir la conversión de astrocitos en neuronas activas al dirigirse a varios genes neurogénicos14. En este estudio, AdipoSPH demostró ser una herramienta adecuada para investigar la biología de la grasa beige mediante la activación de la expresión endógena de Prdm16 en los adipocitos. La sobreexpresión de Prdm16 inducida por SPH en adipocitos conduce a la activación del programa del gen termogénico e induce el fenotipo de pardeamiento, fenocopiando un modelo23 de ratones Prdm16 transgénicos (Tg) previos. Prdm16 fue elegido en este estudio como el objetivo para inducir adipocitos beige basado en el papel central de este factor de transcripción en la regulación de la diferenciación de grasa marrón y beige, así como la regulación del programa de genes termogénicos (por ejemplo, mejorar la expresión de Ucp1) en adipocitos diferenciados. Sin embargo, el modelo actual permite la sobreexpresión de cualquier gen endógeno a discreción de los investigadores y el objetivo del estudio.
Los modelos transgénicos tradicionales que investigan la biología del tejido adiposo se basan en el desarrollo de roedores modificados genéticamente que sobreexpresan un transgén bajo el control de un promotor/potenciador restringido a los adipocitos (por ejemplo, Fabp4 o adiponectina)24. Aunque la tecnología actual ha acelerado el ritmo de desarrollo de estos modelos, los costos y el tiempo para desarrollarlos siguen siendo un problema común experimentado por la comunidad científica. Por el contrario, AdipoSPH es un modelo más barato y versátil para los enfoques de ganancia de función que los ratones Tg tradicionales. Además, AdipoSPH es muy adecuado para estudiar isoformas largas de ARN no codificante y transcripción, que no son particularmente adecuadas para modelos de ratones Tg.
AdipoSPH también presenta varias ventajas en la investigación de la biología del tejido adiposo en comparación con la administración simple de AAV, un enfoque alternativo actual para experimentos de ganancia de función25. En primer lugar, la VAA administrada al tejido adiposo promueve la sobreexpresión al introducir varias copias de un transgén. En contraste, la activación SPH de genes endógenos representa un mecanismo de acción más natural. En segundo lugar, los transgenes entregados por AAV (utilizando promotores constitutivos) normalmente resultan en su sobreexpresión en "cualquier tipo de célula" dentro del microambiente del tejido adiposo. Por el contrario, la expresión inducida por AdipoSPH de genes endógenos está restringida a los adipocitos. En tercer lugar, el tamaño del empaquetado (~4.5kb) es una limitación típica de AAV para algunos transgenes26. Sin embargo, el ARNg portador de AAV requiere una estrategia de clonación simple y fácil para 20 nucleótidos personalizados. Finalmente, la administración de AAV generalmente alcanza la circulación sistémica e infecta otros tejidos y órganos. Aunque algunos AAV contienen microARN para mitigar la expresión de transgenes en tejidos particulares, como el hígado y el corazón25, esta estrategia no puede prevenir la infección por AAV en otros tejidos y órganos. En contraste, la expresión inducida por AdipoSPH de genes endógenos se limita a los adipocitos, incluso considerando alguna fuga de AAV en la circulación sistémica. Por lo tanto, AdipoSPH también es un modelo adecuado para la administración sistémica de ARNg portador de AAV y la investigación de la regulación del tejido adiposo de la homeostasis energética de todo el cuerpo.
Aunque el modelo AdipoSPH ofrece algunas ventajas, tiene limitaciones que es importante considerar. AAV es actualmente la plataforma más común para la entrega in vivo de sgRNA. Sin embargo, algunos desafíos en la fabricación de AAV y problemas inmunológicos siguen sin resolverse26,27. Además, diferentes cantidades y distribuciones de AAV inyectado en todo el tejido adiposo dan como resultado la variabilidad intra e intertisular de la expresión génica. Consideramos que la clonación de vectores sgRNA, la producción de AAV y la administración homogénea de AAV en el iWAT son pasos críticos para el éxito de este protocolo. Finalmente, diferentes sgRNAs activan distintivamente la expresión de genes endógenos en el sistema SPH14. La recomendación principal es diseñar y probar de tres a cinco secuencias de sgRNA dentro de 200 pb aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción (TSS) del gen de interés. Por lo tanto, definir la mejor secuencia de sgRNA para un gen objetivo generalmente requiere laboriosos ensayos in vitro antes de los experimentos in vivo.
AdipoSPH es también un modelo atractivo para investigar otros aspectos de la biología del tejido adiposo. Por ejemplo, los adipocitos promueven la secreción de numerosas adipocinas28,29; Sin embargo, los efectos de todo el cuerpo de la mayoría de estas moléculas siguen siendo poco conocidos. AdipoSPH es un modelo adecuado para abordar este problema mediante la sobreexpresión de genes endógenos únicos o múltiples en adipocitos maduros e investigando sus efectos locales o sistémicos. Por lo tanto, AdipoSPH es una herramienta única para estudiar la biología y fisiología del tejido adiposo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen el apoyo recibido del Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, para la generación de ratones AdipoSPH, el Laboratorio de Inmmunometabolismo y Señalización Celular, y el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología sobre Fotónica Aplicada a la Biología Celular (INFABIC) por todo el apoyo experimental. Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
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