Summary
Detta protokoll presenterar användningen av CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) i adipocyter (AdipoSPH) som en alternativ strategi till adenoassocierat virus (AAV) för att undersöka beige fettbiologi. In vivo-injektion av AAV-bärande sgRNA riktad mot den endogena Prdm16-genen är tillräcklig för att inducera beige fettutveckling och förbättra det termogena genprogrammet.
Abstract
Clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR) -teknik har lett till en revolution inom biologin, och nya verktyg har tillämpats långt bortom den ursprungligen beskrivna genredigeringen. CRISPR-aktiveringssystemet (CRISPRa) kombinerar det katalytiskt inaktiva Cas9 (dCas9) proteinet med distinkta transkriptionsmoduler för att inducera endogent genuttryck. SunTag-p65-HSF1 (SPH) är en nyutvecklad CRISPRa-teknik som kombinerar komponenter från synergistiska aktiveringsmediatorer (SAM) med SunTag-aktivatorerna. Detta system möjliggör överuttryck av enstaka eller flera gener genom att designa ett anpassat enkelstyrt RNA (sgRNA). I denna studie användes en tidigare utvecklad SPH-mus för att generera en villkorlig mus som uttrycker SPH i adipocyter (adiponectin Cre-härstamning), benämnd AdipoSPH. För att inducera en vit-till-beige fettfenotyp injicerades ett adenoassocierat virus (AAV) som bär sgRNA riktat mot den endogena Prdm16-genen (en väletablerad transkriptionsfaktor relaterad till brun och beige fettutveckling) i den inguinala vita fettvävnaden (iWAT). Denna musmodell inducerade uttrycket av endogent Prdm16 och aktiverade det termogena genprogrammet. Dessutom förbättrade SPH-inducerat Prdm16-överuttryck in vitro syreförbrukningen av beige adipocyter, vilket fenokopierade resultaten från en tidigare Prdm16-transgen musmodell. Således beskriver detta protokoll en mångsidig, kostnadseffektiv och tidseffektiv musmodell för att undersöka fettvävnadsbiologi.
Introduction
Beige (eller brite) adipocyter är frikopplingsprotein 1 (UCP1) -uttryckande och mitokondriella rika adipocyter som finns i vita fettvävnad (WAT) depåer. Beige fett kommer från en undergrupp av adipocytprogenitorer eller mogna vita adipocyter som svar på kall exponering och andra stimuli 1,2. Beige adipocyter kan omvandla energi till värme på ett UCP1-beroende eller oberoende sätt3. Oavsett dess termogena funktion kan beigefett också förbättra metabolisk hälsa på andra sätt, såsom utsöndring av adipokiner och antiinflammatoriska och antifibrotiska aktiviteter. Studier på möss och människor har visat att induktion av beige fett förbättrar hela kroppen glukos och lipid homeostas3. Men även om vår kunskap om beige fettbiologi har utvecklats snabbt de senaste åren, är de flesta av dess metaboliska fördelar och relaterade mekanismer fortfarande inte helt förstådda.
Klustrade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar (CRISPR) beskrevs först i eukaryota celler som ett verktyg som kan generera en dubbelsträngbrytning (DSB) på en specifik plats i genomet genom nukleasaktiviteten hos Cas9-proteinet 4,5. Cas9 styrs av ett syntetiskt enkelstyrt RNA (sgRNA) för att rikta in sig på en specifik genomisk region, vilket leder till en DNA DSB. Förutom att använda nukleaset Cas9 för redigeringsändamål har CRISPR-Cas9-tekniken utvecklats till att användas som ett sekvensspecifikt genregleringsverktyg6. Utvecklingen av ett katalytiskt inaktivt Cas9-protein (dCas9) och associeringen av transkriptionsmoduler som kan förbättra genuttrycket har gett upphov till CRISPR-aktiveringsverktyg (CRISPRa). Flera CRISPRa-system har uppstått, såsom VP647,8, synergistisk aktiveringsmediator (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 och SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, som kombinerar komponenterna i SAM- och SunTag-aktivatorer. Det har nyligen visats att det inducerade uttrycket av neurogena gener i N2a-neuroblaster och primära astrocyter är högre med SPH jämfört med andra CRISPRa-system14, vilket visar SPH som ett lovande CRISPRa-verktyg.
Här utnyttjade vi en tidigare utvecklad SPH-mus14 för att generera en villkorlig musmodell som uttrycker SPH specifikt i adipocyter med hjälp av adiponektin Cre-linjen (AdipoSPH). Med hjälp av ett adenoassocierat virus (AAV) som bär gRNA som riktar sig mot den endogena Prdm16-genen, inducerades brunfärgning (vit till beige omvandling) av inguinal WAT (iWAT) för att öka uttrycket av det termogena genprogrammet. Dessutom ökade in vitro Prdm16 överuttryck syreförbrukningen. Därför tillhandahåller detta protokoll en mångsidig SPH-musmodell för att utforska mekanismerna för beige fettutveckling i fettvävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurstudier utfördes i enlighet med University of Campinas Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (protokoll CEUA #5810-1/2021).
1. Molekylär kloning
- Design av enkelstyrda RNA (sgRNA)
- Designa sgRNA för CRISPR-aktivering med CHOPCHOP, tillgänglig på https://chopchop.cbu.uib.no/, eller något annat lämpligt verktyg. Använd följande parametrar för att designa sgRNA som riktar sig mot Prdm16-genen: Mål: Prdm16; I: Mus musculus; Användning: Crispr/Cas9; För: Aktivering.
OBS: Designa sgRNA för varje region av intresse fördelat över en 200 bp uppströms transkriptionsstartplats (TSS) region. Till exempel binder sgRNA som riktar sig mot Prdm16 som används i denna studie 154 bp uppströms TSS. - Lägg till överhäng till sgRNA för att matcha SacI-restriktionsstället i vektorns ryggrad pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry (se materialtabell). Inkludera: 5'- (N20)AGCT-3' (N = nukleotider). Till exempel är sekvensen som riktar sig mot Prdm16-genen 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3', och med överhäng är 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'.
- Hämta 3'-sgRNA-omvänd komplementsekvens med hjälp av verktyget som finns tillgängligt på https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html. Till exempel är 3'sgRNA-sekvensen riktad mot Prdm16-genen 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'.
- Designa sgRNA för CRISPR-aktivering med CHOPCHOP, tillgänglig på https://chopchop.cbu.uib.no/, eller något annat lämpligt verktyg. Använd följande parametrar för att designa sgRNA som riktar sig mot Prdm16-genen: Mål: Prdm16; I: Mus musculus; Användning: Crispr/Cas9; För: Aktivering.
- Glödgning av enkelsträngade komplementära oligonukleotider
- Tillsätt 1 μl av varje 5'- och 3'-oligonukleotid (lagerkoncentration: 100 μM), 1 μl T4-ligasbuffert, 0,5 μl T4-polynukleotidkinas (PNK) (1 × 104 enheter/ml) och 6,5 μlH2Otill en slutlig reaktionsvolym på 10 μl. Anneal de komplementära enkelsträngade oligonukleotiderna med användning av en termocykler under följande betingelser: 37 °C i 30 min och 95 °C i 5 minuter, följt av en nedrampningshastighet på 5 °C/min.
OBS: PNK-enzymet levereras med PNK-buffert och innehåller inte tillräckligt med ATP som krävs för fosforyleringsreaktionen (se materialtabell). För att förenkla reaktionen, använd T4-ligasbufferten (istället för PNK-buffert). T4-ligasbuffert ger lämplig mängd (1 mM ATP) fosfat för fosforyleringsreaktionen. PNK-enzymet tillhandahåller 5'-ändfosforylering av oligonukleotider för den efterföljande ligeringsreaktionen.
- Tillsätt 1 μl av varje 5'- och 3'-oligonukleotid (lagerkoncentration: 100 μM), 1 μl T4-ligasbuffert, 0,5 μl T4-polynukleotidkinas (PNK) (1 × 104 enheter/ml) och 6,5 μlH2Otill en slutlig reaktionsvolym på 10 μl. Anneal de komplementära enkelsträngade oligonukleotiderna med användning av en termocykler under följande betingelser: 37 °C i 30 min och 95 °C i 5 minuter, följt av en nedrampningshastighet på 5 °C/min.
- Ligering av glödgade sgRNA-oligonukleotider
- Tillsätt 25 ng plasmid pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry till 2 μL glödgade sgRNA-oligonukleotider, 1 μL SacI-enzym, 2 μL 10x T4 DNA-ligasbuffert, 1 μL T4-DNA-ligas (1-3 u/μL) (se materialtabell) ochH2Otill en slutlig reaktionsvolym på 10 μL.
- Utför ligering genom att inkubera reaktionsblandningen med hjälp av en termocykler under följande betingelser: 15 cykler vid 37 °C i 5 minuter och 25 °C i 5 minuter, följt av hållare vid 4 °C.
- Transformation följt av kolonipolymeraskedjereaktion (PCR)
- Omvandla de kompetenta E. coli DH10B-cellerna (se materialtabell) med 4 μl ligeringsprodukt med värmechock (42 °C i 45 sekunder) och sprid på en agarplatta innehållande 100 μg/ml ampicillin.
- Bekräfta transformerade kolonier med koloni-PCR med PCR-masterblandningen (se materialtabell). Välj kolonin och blanda med 5 μl mastermix, 0,1 μl universalprimer (lagerkoncentration: 100 μM), 0,1 μl sgRNA omvänd primer (lagerkoncentration: 100 μM) (tabell 1) och 5 μlH2O. Kör PCR med en termocykler under följande betingelser: Ursprunglig denaturering (94 °C i 2 min). följt av 35 denatureringscykler (94 °C för 20 s), glödgning (60 °C för 30 s), förlängning (72 °C för 30 s) och ett slutligt töjningssteg (72 °C för 5 minuter). Lös DNA med agaros (1,5%) gelelektrofores i 0,5x TAE-buffert vid 90 V i 30 minuter.
OBS: Positiva kloner ger ett band på ~ 280 bp. - Skicka in positiva prover för Sanger-sekvensering med universell primer (tabell 1, kompletterande fil 1).
- Plasmidrening
- Rena plasmiden från en positiv klon med hjälp av en plasmidreningssats (se Materialförteckning) enligt tillverkarens anvisningar.
OBS: Rena plasmiden med anjonbytarharts eller annan sats som är lämplig för användning vid celltransfektion. - Inkubera den positiva klonen (12 timmar vid 37 °C med skakning vid 200 varv/min) med ett standardiserat tillväxtmedium för bakterier som innehåller 100 μg/ml ampicillin.
- Centrifugera bakteriecellerna vid 6 000 × g i 10 minuter vid 4 °C. Följ nästa steg enligt tillverkarens kitinstruktioner.
- Rena plasmiden från en positiv klon med hjälp av en plasmidreningssats (se Materialförteckning) enligt tillverkarens anvisningar.
2. AAV-förpackning
OBS: AAV-paketering utfördes enligt tidigare publikationer15,16 med mindre ändringar.
- Platta 293T-celler (se materialtabell) i en 175 cm2-kolv (sådd 5 × 106 celler per kolv) med 25 ml Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin (P / S). Inkubera vid 37 °C, 5%CO2 och 95% luftfuktighet tills cellerna når 50% -70% sammanflöde.
- Blanda 14 μl polyetylenimin (1 μg/μl) med 1 ml 150 mM NaCl. Blanda de tre plasmider som krävs för AAV-produktion i ett molförhållande 1:1:1 (dvs. 17,7 μg pAdDeltaF6, 7,9 μg AAV2/8 (se materialförteckning) och 5,9 μg klonat sgRNA från steg 1 i 1 ml 150 mM NaCl. Överför blandningen av polyetylenimin:NaCl droppe för droppe till röret som innehåller DNA (blandning av plasmider) och inkubera i 20 minuter vid 25 °C.
OBS: pAdDeltaF6 är en hjälparplasmid och pCapsid pAAV2/8 är en förpackningsplasmid som uttrycker replikations- (Rep) och kapsidgener (cap). Båda plasmiderna är nödvändiga för att producera AAV. - Före transfektion, ersätt celltillväxtmediet med 18 ml DMEM innehållande 1% FBS och L-alanyl-L-glutamin (0,5 g / L). Tillsätt 2 ml polyetylenimin:DNA-blandning till varje odlingskolv och inkubera cellerna i en CO2-inkubator (37 °C, 5 %CO2, 95 % luftfuktighet).
- Efter 5 timmar, tillsätt 5 ml DMEM kompletterat med 10% FBS och L-alanyl-L-glutamin (0,5 g / L).
- Efter 3 dagars inkubation, lossa cellerna från odlingskolven med en cellskrapa. Samla upp 293T-cellerna från 10 (175 cm2) cellodlingskolvar i 50 ml koniska rör och tillsätt DMEM (se materialtabell) upp till 30 ml.
- Tillsätt 3 ml kloroform till varje 50 ml koniskt rör som innehåller 293T-cellerna och blanda med en virvelblandare med hög hastighet i 5 minuter. Resuspendera cellerna genom att tillsätta 7,6 ml 5 M NaCl och virvel kort. Centrifugera vid 3 000 × g och 4 °C i 5 minuter.
- Överför vattenfasen till ett nytt koniskt rör och tillsätt 9,4 ml 50% (v / v) polyetylenglykol (PEG) 8000. Blanda med en virvelblandare med hög hastighet i 10 s och lägg proverna på is i 1 timme.
- Centrifugera vid 3 000 × g vid 4 °C i 30 minuter. Ta bort supernatanten och låt pelleten torka i 10 minuter.
- Tillsätt 1,4 ml HEPES (50 mM, pH 8) och blanda i 5 minuter med en virvelblandare med hög hastighet. Tillsätt 3,5 μl 1 MMgCl2, 14 μl DNas I (20 enheter/μl) och 1,4 μl RNas A (10 μg/μl). Inkubera i ett 37 °C vattenbad i 20 minuter och överför sedan proverna till nya 1,5 ml rör (700 μl i varje rör).
- Tillsätt 700 μL kloroform till varje 1,5 ml rör och blanda med en virvelblandare med hög hastighet i 10 sekunder. Centrifugera vid 3 000 × g vid 4 °C i 5 minuter och överför vattenfasen till ett nytt rör. Upprepa detta steg 3x.
- Indunsta kloroformen i 30 minuter i ett biosäkerhetsskåp. Överför sedan 300 μL av vattenfasen till ett 0,5 ml ultracentrifugeringsrör (se materialtabell). Snurra filtret vid 14 000 × g vid 25 °C i 5 minuter. Ta bort genomströmningen och snurra filtret igen tills hela volymen har passerat genom filtret.
- Tvätta filtret genom att tillsätta 300 μL av Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) och blanda lösningarna genom pipettering. Centrifugera filtret i 5 minuter vid 14 000 × g vid 25 °C. Upprepa detta tvättsteg 4x.
- Centrifugera filtret i 8 minuter vid 14 000 × g vid 25 °C. Placera filtret upp och ner i ett nytt rör och snurra i 2 minuter vid 1 000 × g vid 25 °C.
3. Titrering av AAV med qPCR
- Förbered en standardkurva för AAV-titrering och bestäm AAV-titern enligt den ursprungliga studien av Fripont et al.15.
4. In vivo-injektion av AAV i den inguinala vita fettvävnaden (iWAT)
- Separera de kirurgiska verktyg och förnödenheter som behövs för operation och sterilisera dem enligt rekommendationer för varje specifikt material.
- Bedöva musen med 100 mg/kg ketamin och 10 mg/kg xylazin genom intraperitoneal injektion. Bekräfta anestesi genom att applicera kraftigt tryck på tassen och svansen och kontrollera om det finns en reflex. Applicera salva på musens ögon för att undvika ögontorrhet under operationen.
- Placera den bedövade musen i ryggläge och raka ett litet område på flankerna, proximalt till höftlederna för iWAT -injektioner, med en rakapparat. Applicera hårborttagningskräm i 5 min. Ta bort kvarvarande kräm med vatten för att undvika hudbränna.
- Desinficera huden med tre alternerande omgångar för applicering av antiseptisk lösning (povidon-jod) på huden med en ren gasbindning och 70% alkohol. Kassera gasbindningen efter varje användning.
- Utför en slutlig applicering av en antiseptisk lösning på huden. Gör sedan ett snitt på 1-2 cm med steriliserad sax i det proximala området i lederna och håll huden öppen med pincett för att exponera fettdepån. WAT kan hittas fäst vid huden på båda sidor, sträcker sig från början på baksidan och ner mot testiklarna.
OBS: Använd draperier för att undvika kontaminering under operation eller suturprocedurer. - Använd pincett, genom snittet, dra försiktigt fettdepån uppåt för att säkerställa att injektionen är på rätt plats och djup.
OBS: Var försiktig så att du inte tar bort vävnaden från dess ursprungliga plats. - Fyll mikrolitersprutan (mätare: 33; punktformat: 4; vinkel: 12; längd: 10) (se materialtabell) med 2,5 μL (5,6 × 1010 virala genom [VG]/μL) av AAV (innehållande sgRNA som riktar sig mot den endogena Prdm16-genen). För försiktigt in nålen i 30°-45° vinkel i iWAT. Upprepa injektionen 5x på olika platser i vävnaden för att homogent infektera hela iWAT fettkudden. En total volym på 15 μL rekommenderas för att infektera iWAT.
OBS: Sprutans införingsdjup beror på tjockleken på fettkuddeavlagringen. Använd beröringsfri teknik för att förbereda injektionen. - Stäng det rakade hudsnittet med 4/0 monofilamentsuturer. Placera musen på en värmedyna tills medvetandet återfått. Övervaka djuret var 10-15 minuter tills det återhämtar sig helt. När djuret återfår medvetandet, observera den lokomotoriska profileringen, som ska vara linjär och inte ha några tecken på nöd eller smärta.
- Utför postoperativ smärtkontroll inom 48 timmar efter operationen genom att administrera tramadolhydroklorid (5 mg/kg) intraperitonealt i 3 dagar (2x/dag).
OBS: Titta på tecken på nöd och obehag och övervaka vatten- och matintag. Ge en effektiv dos smärtstillande medel på ett förebyggande sätt, helst före eller i början av operationen. - Håll musen i en bur med fri tillgång till mat och vatten under läkningsperioden. Efter läkningsperioden, fortsätt att avliva musen. I denna studie utfördes eutanasi genom en överdos av injicerbara anestetika (intraperitoneal) från 3x den inducerande dosen (300-360 mg/kg ketaminhydroklorid + 30-40 mg/kg xylazinhydroklorid) följt av halshuggning.
OBS: Det rekommenderas starkt att hålla djuren inrymda i enskilda burar tills de är helt återställda från anestesi.
5. In vitro-differentiering av stroma-kärlceller (SVF) till beige adipocyter
- Utför isolering och plätering av primära SVF från iWAT hos AdipoSPH-möss enligt Aune et al.17. Frö-SVF härrörande från AdipoPH-möss iWAT i en 6-brunnsplatta innehållande komplett medium (DMEM innehållande 3,1 g / L glukos, 0,5 g / L L-alanyl-L-glutamin, 10% FBS och 2,5% P / S) i 1-2 timmar.
OBS: SVF-fraktionen innehåller en blandning av olika celltyper. Vid detta steg är det inte möjligt att definiera antalet seedade stamceller som ger upphov till adipocyter. - Aspirera mediet, tvätta brunnen 2x med fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS) och ersätt med färskt komplett medium. Inkubera cellerna vid 37 °C, 5%CO2, 95% luftfuktighet tills cellerna når 70% -80% sammanflöde.
- Inducera differentiering (dag 0) genom att behandla cellerna med induktionsmediet (tabell 2).
OBS: Induktionsmediets läkemedelscocktail är nödvändig för att förbättra beige adipocytdifferentiering och för uttryck av det termogena genprogrammet17. - Efter 2 dagar (dag 2), byt ut induktionsmediet mot underhållsmediet (tabell 2).
- Efter 2 dagar (dag 4), byt ut underhållsmediet mot nytt underhållsmedium (tabell 2) i 2 till 3 dagar.
- Byt underhållsmedium var 48: e timme tills preadipocyterna är helt differentierade till adipocyter (vanligtvis 6 dagar efter tillsats av induktionsmedium). Mogna adipocyter kan observeras med hjälp av ljusmikroskopi, eftersom de differentierade cellerna verkar vara laddade med lipiddroppar.
6. AAV-infektion in vitro hos SVF
OBS: SVF härrörande från AdipoPH-möss iWAT infekterades med AAV-bärande sgRNA-Prdm16 som tidigare beskrivits av Wang et al.18 med några modifieringar.
- Odla cellerna på en 6-brunns odlingsplatta med komplett medium tills cellerna når 70% -80% sammanflöde, som tidigare beskrivits i steg 5.1-5.3.
- Blanda 5,6 × 1010 VG/μL AAV-bärande sgRNA-Prdm16 med 2 ml komplett medium och hexadimetrinbromid (8 μg/ml) (se Materialförteckning). Transducera cellerna genom att ersätta hela mediet och tillsätta hela mediet innehållande AAV. Inkubera de transducerade cellerna i 12 timmar vid 37 °C, 95 % luftfuktighet och 5 %CO2.
- Dela och frö cellerna enligt beskrivningen i steg 5 för cellproliferation och differentiering till beige adipocyter.
OBS: För syreförbrukningsanalysen, frö 4.0 × 104 celler (från steg 6.2) per brunn med induktionsmedium i en 24-brunns cellodlingsplatta. De efterföljande stegen för cellproliferation och differentiering utförs enligt beskrivningen i steg 5. Syreförbrukningsanalysen utförs när cellerna når 80% -100% sammanflöde och är helt differentierade, som tidigare rapporterats19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AdipoSPH möss utvecklades genom uppfödning av SPH och Adipoq-Cre musstammar. Båda musstammarna var i en hybrid C57BL6J-DBA / 2J-bakgrund (enligt den kommersiella leverantören; se materialförteckning). SPH-muslinjen beskrevs ursprungligen av Zhou et al.14.
In vivo beige adipocytutveckling genom AdipoSPH-medierad Prdm16 överuttryck
För att utvärdera kapaciteten hos modellen som beskrivs i denna studie att utveckla beige adipocyter in vivo, injicerades AAV som bär sgRNA-målande Prdm16-genen i iWAT hos AdipoSPH-möss. Prdm16 är en väletablerad transkriptionsfaktor som bestämmer beige adipocytutveckling och funktion20,21. Det är viktigt att nämna att vi här valde ett tidigare testat och validerat sgRNA riktat mot den endogena Prdm16-genen14. AAV som bär ett tomt sgRNA användes som en kontroll. 10 dagar efter AAV-injektion skördades iWAT för histologiska analyser och genuttrycksanalyser (figur 1A). Som förväntat visade immunofluorescensbilder av iWAT från AdipoPH-möss uttrycket av dCas9 i både kontroll- och Prdm16-grupperna (figur 1B). Dessutom bekräftade mCherry-uttrycket framgången för AAV-infektion av iWAT i både kontroll- och Prdm16-grupperna (figur 1B). SPH-inducerat Prdm16-uttryck inducerade tydligt en utbredd ackumulering av multilokulära beige adipocyter i iWAT (figur 1B). Dessutom avslöjade kvantitativ PCR (qPCR) ett ökat uttryck av Prdm16 och det termogena genprogrammet (Ucp1, Cox8b, Ppargc1a och Cidea) i Prdm16-gruppen jämfört med kontrollen (figur 1C).
Främjande av beige adipocytutveckling och förbättring av syreförbrukning in vitro genom AdipoSPH-medierad Prdm16 överuttryck
Därefter undersöktes lämpligheten av denna modell för att studera beige adipocytbiologi in vitro . För detta ändamål transducerades preadipocyter härledda från iWAT hos AdipoPH-möss med AAV som bär sgRNA-sekvensen riktad mot Prdm16. Sju dagar efter differentiering användes beige adipocyter för analys av genuttryck och syreförbrukning (figur 2A). Tomt sgRNA användes som kontroll. Det är värt att notera att avlägsnandet av STOP-kodon genom CRE-rekombinas och aktivering av SPH-maskiner kontrollerades av adiponektinpromotorn/förstärkaren, vilket resulterade i aktivering av den endogena Prdm16-genen i mogna adipocyter. Genuttrycksanalys bekräftade det ökade uttrycket av den endogena Prdm16-genen och termogena gener i Prdm16-överuttrycksgruppen jämfört med kontrollen (figur 2B). För att bekräfta att de SPH-inducerade beige adipocyterna var funktionellt termogena utfördes en högupplöst respirometrianalys på de primära adipocyterna. Respirometridataanalysen och tolkningen utfördes som nyligen beskrivits22. SPH-inducerat Prdm16-uttryck resulterade i högre basal och maximal syreförbrukning än i kontrollceller (figur 2C). Viktigt är att data indikerade förbättrad okopplad andning (oligomycin-okänslig) i Prdm16-gruppen jämfört med den i kontrollgruppen (figur 2C, tabell 3). Sammantaget avslöjade dessa resultat att SPH-inducerat uttryck av endogent Prdm16 rekapitulerar brunningsfenotypen och förbättrar syreförbrukningshastigheterna som observerats hos konventionella Prdm16 Tg-möss.
Figur 1: Utveckling av beige fett genom injektion av adenoassocierat virus (AAV) riktat mot endogen Prdm16-gen i inguinal vit fettvävnad (iWAT) hos AdipoPH-möss. (A) Schematisk illustration av den experimentella designen av beige adipocyter in vivo (skapad med hjälp av Biorender.com). (B) Histologiska (hematoxylin och eosin [H&E] färgning) bilder av iWAT. Skalstapel = 50 μm. (C) Kvantitativ PCR (qPCR) av Prdm16 och termogena gener (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α och Cidea; n = 3). Data presenteras som medelvärde ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01 för Prdm16 kontra kontroll (CTR) med oparad Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: SPH-inducerad beige adipocytdifferentiering genom Prdm16-överuttryck. (A) Schematisk illustration av den experimentella designen in vitro beige adipocyt (skapad med hjälp av Biorender.com). (B) Relativt genuttryck av Prdm16 och termogena gener (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α och Cidea; n = 3). (C) Syreförbrukningshastighet (OCR), n = 6. Data presenteras som medelvärde ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001 för Prdm16 kontra kontroll (CTR) av (B) oparad Students t-test och (C) tvåvägs upprepade åtgärder ANOVA, följt av Tukeys test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Sanger-sekvensering av Prdm16 sgRNA. (A) Schematisk illustration som visar inriktningen av enkelsträngade komplementära Prdm16-oligonukleotider. (B) Sanger-sekvensering av Prdm16 sgRNA med universell primer. Klicka här för att ladda ner den här filen.
| Gen | Art | Framåt | Omvända | |||||
| Genuttryck | PRDM16 | mus | CAGCACGGTGAAGCCATTC | GCGTGCATCCGCTTGTG | ||||
| Ucp1 | mus | TCTCAGCCGGCTTAATGACTG | GGCTTGCATTCTGACCTTCAC | |||||
| Ppargc1a | mus | AGCCGTGACCACTGACAACGAG | GCTGCATGGTTGAGTGCTAAG | |||||
| Cox8b | mus | GAACCATGAAGCCAACGACT | GCGAAGTTCACAGTGGTTCC | |||||
| Cidea | mus | ATCACAACTGGCCTGGTTACG | TACTACCCGGTGTCCATTTCT | |||||
| 36B4 | mus | TCCAGGCTTTGGGCATCA | CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA | |||||
| Molekylär kloning | sgRNA Prdm16-sekvens | mus | CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG | CCCCTTTTCAGCGCAGCTCG | ||||
| universell primer | mus | GAGGGCCTATTTCCC ATGATTCCTTCATAT |
||||||
Tabell 1: Primersekvenser som använts i studien.
| Medium | Sammansättning | |||
| Komplett medium | Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) med L-glutamin | |||
| 10% av fetalt bovint serum (FBS) | ||||
| 2,5% penicillin/streptomycin | ||||
| Induktionsmedium | Komplett medium | |||
| Indometacin, slutlig koncentration 125 μM (0,125 M stam i etanol). OBS: Indometacin måste upphettas till 90 °C i 10 sekunder för att lösas upp. | ||||
| Insulin, slutlig koncentration 20 nM (1 mM lager, tillsätt 1 μl HCl till löslighet (5,73 mg/ml). Förvara lagret vid -20 °C. | ||||
| Dexametason, slutkoncentration 2 μg/ml (2 mg/ml stam i etanol) | ||||
| 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX), slutkoncentration 500 μM (0,25 M lager i 0,5 M KOH ) | ||||
| 3,3',5-Trijod-L-tyronin (T3), slutlig koncentration 1 nM (10 μM lager, lös T3 i 1 M HCl och EtOH 1:4 till lager). | ||||
| Rosiglitazon, slutlig koncentration 1 μg/ml (1 mg/ml lager i etanol) | ||||
| Underhåll medium | Komplett medium | |||
| Insulin, slutlig koncentration 20 nM (1 mM lager). Tillsätt 1 μl HCl till löslighet (5,73 mg/ml). | ||||
| Rosiglitazon, slutlig koncentration 1 μg/ml (1 mg/ml lager i etanol) | ||||
Tabell 2: Sammansättning av medier som använts i studien.
| Parametrar | CTR | PRDM16 | p-värde | ||
| Ingen mitokondriell syreförbrukning (pMoles/min/μg protein) | 8.19 ± 1.40 | 10,80 ± 1,83 | 0.01 | ||
| Basal andning (pMoles/min/μg protein) | 28.82 ± 5.20 | 52,58 ± 13,73 | 0.001 | ||
| Maximal andning (pMoles/min/μg protein) | 63,81 ± 9,80 | 122,94 ± 22,31 | < 0,001 | ||
| Reservandningskapacitet (pMoles/min/μg protein) | 34,98 ± 11,09 | 70.36 ± 26.06 | 0.006 | ||
| Oligo okänslig (pMoles/min/μg protein) | 8.27 ± 2.29 | 15.85 ± 5.48 | 0.005 | ||
| Oligokänslig (pMoles/min/μg protein) | 20.54 ± 5.68 | 36.72 ± 14.79 | 0.016 | ||
| Kopplingens effektivitet | 71.28 ± 1.51 | 69,84 ± 3,05 | 0.163 | ||
| RCR för celler | 7.70 ± 1.46 | 7.75 ± 2.43 | 0.485 | ||
Tabell 3: Respiratoriska parametrar för SPH-inducerade beige adipocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En av de mest användbara icke-redigeringstillämpningarna av CRISPR-tekniken är frågan om genfunktion genom aktivering av endogena gener med hjälp av CRISPRa-system6. SPH är en kraftfull CRISPRa som ursprungligen beskrevs för att inducera omvandlingen av astrocyter till aktiva neuroner genom att rikta in sig på flera neurogena gener14. I denna studie visade sig AdipoSPH vara ett lämpligt verktyg för att undersöka beige fettbiologi genom att aktivera uttrycket av endogent Prdm16 i adipocyter. SPH-inducerat Prdm16-överuttryck i adipocyter leder till aktivering av det termogena genprogrammet och inducerar brunningsfenotypen, fenokopiering av en tidigare transgen (Tg) Prdm16-mössmodell23. Prdm16 valdes i denna studie som mål för att inducera beige adipocyter baserat på den centrala rollen för denna transkriptionsfaktor för att reglera brun och beige fettdifferentiering, liksom regleringen av det termogena genprogrammet (t.ex. förbättra Ucp1-uttryck) i differentierade adipocyter. Ändå tillåter den nuvarande modellen överuttryck av någon endogen gen enligt forskarnas bedömning och syftet med studien.
Traditionella transgena modeller som undersöker fettvävnadsbiologi bygger på utveckling av genetiskt modifierade gnagare som överuttrycker en transgen under kontroll av en promotor/förstärkare som är begränsad till adipocyter (t.ex. Fabp4 eller adiponektin)24. Även om den nuvarande tekniken har påskyndat utvecklingen av dessa modeller är kostnaderna och tiden för att utveckla dem fortfarande ett vanligt problem som det vetenskapliga samfundet upplever. Däremot är AdipoSPH en billigare och mer mångsidig modell för gain-of-function-metoder än traditionella Tg-möss. Dessutom är AdipoSPH väl lämpad för att studera långa icke-kodande RNA- och transkriptisoformer, som inte är särskilt lämpliga för Tg-musmodeller.
AdipoSPH presenterar också flera fördelar vid undersökning av fettvävnadsbiologi jämfört med enkel administrering av AAV, ett nuvarande alternativt tillvägagångssätt för gain-of-function-experiment25. För det första främjar AAV som levereras till fettvävnad överuttryck genom att införa flera kopior av en transgen. Däremot representerar SPH-aktiveringen av endogena gener en mer naturlig verkningsmekanism. För det andra resulterar transgener som levereras av AAV (med hjälp av konstitutiva promotorer) normalt i deras överuttryck i "vilken celltyp som helst" inom fettvävnadens mikromiljö. Däremot är AdipoSPH-inducerat uttryck av endogena gener begränsat till adipocyter. För det tredje är förpackningsstorleken (~ 4.5kb) en typisk begränsning av AAV för vissa transgener26. AAV-bärande sgRNA kräver dock en enkel och enkel kloningsstrategi för anpassade 20 nukleotider. Slutligen når AAV-administrering vanligtvis systemisk cirkulation och infekterar andra vävnader och organ. Även om vissa AAV innehåller mikroRNA för att mildra uttrycket av transgener i vissa vävnader, såsom lever och hjärta25, kan denna strategi inte förhindra AAV-infektion i andra vävnader och organ. Däremot är AdipoSPH-inducerat uttryck av endogena gener begränsat till adipocyter, även med tanke på ett visst läckage av AAV till systemisk cirkulation. Således är AdipoSPH också en lämplig modell för systemisk administrering av AAV-bärande sgRNA och undersökning av fettvävnadsreglering av helkroppsenergihomeostas.
Även om AdipoSPH-modellen erbjuder vissa fördelar, har den begränsningar som är viktiga att tänka på. AAV är för närvarande den vanligaste plattformen för in vivo-leverans av sgRNA. Vissa utmaningar inom AAV-tillverkning och immunologiska frågor förblir dock olösta26,27. Dessutom resulterar olika mängder och fördelningar av injicerad AAV genom fettvävnad i intra- och intervävnadsvariabilitet av genuttryck. Vi anser att kloning av sgRNA-vektorer, AAV-produktion och homogen administrering av AAV i iWAT är kritiska steg för framgången med detta protokoll. Slutligen aktiverar olika sgRNA distinkt uttrycket av endogena gener i SPH-systemet14. Huvudrekommendationen är att designa och testa tre till fem sgRNA-sekvenser inom 200 bp uppströms transkriptionsstartstället (TSS) för genen av intresse. Därför kräver definitionen av den bästa sgRNA-sekvensen för en målgen vanligtvis mödosamma in vitro-analyser före in vivo-experiment.
AdipoSPH är också en attraktiv modell för att undersöka andra aspekter av fettvävnadsbiologi. Till exempel främjar adipocyter utsöndringen av många adipokiner28,29; Helkroppseffekterna av de flesta av dessa molekyler är dock fortfarande dåligt förstådda. AdipoSPH är en lämplig modell för att ta itu med detta problem genom att överuttrycka enstaka eller flera endogena gener i mogna adipocyter och undersöka deras lokala eller systemiska effekter. Således är AdipoSPH ett unikt verktyg för att studera fettvävnadens biologi och fysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar stödet från Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, för generering av AdipoSPH-möss, Inmmunometabolism och Cell Signaling Laboratory och National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology (INFABIC) för allt experimentellt stöd. Vi tackar det ekonomiska stödet från Sao Paulo Research Foundation (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
References
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Cohen, P., Kajimura, S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
- Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
- Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction. Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103 (2020).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
- Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes. STAR Protocols. 1 (3), 100118 (2020).
- Cohen, P., et al. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch. Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).
- Harms, M., Seale, P. Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential. Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).
- Seale, P., et al. Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).
- Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. Understanding adipose tissue development from transgenic animal models. Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
- Deshmukh, A. S., et al. Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine. Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).
- Sponton, C. H., et al. The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication. EMBO reports. 21 (9), 49828 (2020).
