Summary
Dit protocol presenteert het gebruik van CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) in adipocyten (AdipoSPH) als een alternatieve strategie voor adeno-geassocieerd virus (AAV) voor het onderzoeken van beige vetbiologie. In vivo injectie van AAV-dragend sgRNA gericht op het endogene Prdm16-gen is voldoende om de ontwikkeling van beige vet te induceren en het thermogene genprogramma te verbeteren.
Abstract
Geclusterde regelmatig interspaced short palindromic repeats (CRISPR) -technologie heeft een revolutie in de biologie teweeggebracht en recente hulpmiddelen zijn veel verder toegepast dan de oorspronkelijk beschreven genbewerking. Het CRISPR-activeringssysteem (CRISPRa) combineert het katalytisch inactieve Cas9 (dCas9)-eiwit met verschillende transcriptiemodules om endogene genexpressie te induceren. SunTag-p65-HSF1 (SPH) is een recent ontwikkelde CRISPRa-technologie die componenten van synergetische activeringsmediatoren (SAM's) combineert met de SunTag-activatoren. Dit systeem maakt de overexpressie van enkele of meerdere genen mogelijk door een aangepast single-guide RNA (sgRNA) te ontwerpen. In deze studie werd een eerder ontwikkelde SPH-muis gebruikt om een voorwaardelijke muis te genereren die SPH tot expressie brengt in adipocyten (adiponectine Cre-afstamming), genaamd AdipoSPH. Om een wit-naar-beige vet (bruining) fenotype te induceren, werd een adeno-geassocieerd virus (AAV) met sgRNA gericht op het endogene Prdm16-gen (een gevestigde transcriptiefactor gerelateerd aan de ontwikkeling van bruin en beige vet) geïnjecteerd in het inguinale witte vetweefsel (iWAT). Dit muismodel induceerde de expressie van endogene Prdm16 en activeerde het thermogene genprogramma. Bovendien verhoogde in vitro SPH-geïnduceerde Prdm16-overexpressie het zuurstofverbruik van beige adipocyten, waardoor de resultaten van een eerder Prdm16-transgeen muismodel werden gefenocopeerd. Dit protocol beschrijft dus een veelzijdig, kosteneffectief en tijdeffectief muismodel voor het onderzoeken van vetweefselbiologie.
Introduction
Beige (of brite) adipocyten zijn ontkoppelende eiwit 1 (UCP1) -tot expressie brengende en mitochondriaal-rijke adipocyten die zich bevinden in depots van wit vetweefsel (WAT). Beige vet komt voort uit een subset van adipocytenvoorlopers of rijpe witte adipocyten als reactie op blootstelling aan koude en andere stimuli 1,2. Beige adipocyten kunnen energie omzetten in warmte op een UCP1-afhankelijke of onafhankelijke manier3. Ongeacht de thermogene functie kan beige vet ook de metabole gezondheid verbeteren door andere middelen, zoals de afscheiding van adipokines en ontstekingsremmende en anti-fibrotische activiteiten. Studies bij muizen en mensen hebben aangetoond dat de inductie van beige vet de glucose van het hele lichaam en de lipidehomeostase verbetert3. Hoewel onze kennis van beige vetbiologie de afgelopen jaren snel is geëvolueerd, zijn de meeste metabole voordelen en gerelateerde mechanismen nog steeds niet volledig begrepen.
Geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) werden voor het eerst beschreven in eukaryote cellen als een hulpmiddel dat in staat is om een dubbelstrengsbreuk (DSB) te genereren op een specifieke plaats in het genoom door de nucleaseactiviteit van het Cas9-eiwit 4,5. Cas9 wordt geleid door een synthetisch single-guide RNA (sgRNA) om zich te richten op een specifiek genomisch gebied, wat leidt tot een DNA-DSB. Naast het gebruik van het nuclease Cas9 voor bewerkingsdoeleinden, is de CRISPR-Cas9-technologie geëvolueerd om te worden gebruikt als een sequentiespecifiek genregulatie-instrument6. De ontwikkeling van een katalytisch inactief Cas9-eiwit (dCas9) en de associatie van transcriptionele modules die de genexpressie kunnen verbeteren, heeft geleid tot CRISPR-activeringstools (CRISPRa). Er zijn verschillende CRISPRa-systemen ontstaan, zoals VP647,8, synergetische activeringsmediator (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 en SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, die de componenten van SAM- en SunTag-activatoren combineert. Onlangs is aangetoond dat de geïnduceerde expressie van neurogene genen in N2a-neuroblasten en primaire astrocyten hoger is met behulp van SPH in vergelijking met andere CRISPRa-systemen14, wat SPH aantoont als een veelbelovend CRISPRa-hulpmiddel.
Hier maakten we gebruik van een eerder ontwikkelde SPH-muis14 om een voorwaardelijk muismodel te genereren dat SPH specifiek in adipocyten tot expressie brengt met behulp van de adiponectine Cre-afstamming (AdipoSPH). Met behulp van een adeno-geassocieerd virus (AAV) dat het gRNA draagt dat zich richt op het endogene Prdm16-gen, werd bruining (witte naar beige conversie) van inguinale WAT (iWAT) geïnduceerd om de expressie van het thermogene genprogramma te verhogen. Bovendien verhoogde in vitro Prdm16-overexpressie het zuurstofverbruik. Daarom biedt dit protocol een veelzijdig SPH-muismodel voor het verkennen van de mechanismen van beige vetontwikkeling in vetweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met de University of Campinas Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (protocol CEUA #5810-1/2021).
1. Moleculair klonen
- Ontwerp van single guide RNA's (sgRNA's)
- Ontwerp sgRNA's voor CRISPR-activering met CHOPCHOP, verkrijgbaar bij https://chopchop.cbu.uib.no/, of een ander geschikt hulpmiddel. Gebruik de volgende parameters om sgRNA te ontwerpen dat gericht is op het Prdm16-gen: Target: Prdm16; In: Mus musculus; Gebruik: Crispr/Cas9; Voor: Activering.
OPMERKING: Ontwerp sgRNA's voor elke regio van belang verspreid over een 200 bp upstream transcriptie start site (TSS) regio. Het sgRNA gericht op Prdm16 dat in deze studie wordt gebruikt, bindt bijvoorbeeld 154 bp stroomopwaarts van TSS. - Voeg overhangen toe aan het sgRNA om overeen te komen met de SacI-restrictieplaats in de vectorbackbone pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry (zie materiaaltabel). Inclusief: 5'- (N20)AGCT-3' (N = nucleotiden). De sequentie gericht op het Prdm16-gen is bijvoorbeeld 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3', en met overhangen is 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGAGGAGCT-3'.
- Verkrijg de 3' sgRNA reverse complement sequence met behulp van de tool die beschikbaar is op https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html. De 3' sgRNA-sequentie gericht op het Prdm16-gen is bijvoorbeeld 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'.
- Ontwerp sgRNA's voor CRISPR-activering met CHOPCHOP, verkrijgbaar bij https://chopchop.cbu.uib.no/, of een ander geschikt hulpmiddel. Gebruik de volgende parameters om sgRNA te ontwerpen dat gericht is op het Prdm16-gen: Target: Prdm16; In: Mus musculus; Gebruik: Crispr/Cas9; Voor: Activering.
- Gloeien van enkelstrengs complementaire oligonucleotiden
- Voeg 1 μL van elk 5' en 3' enkelstrengs oligonucleotide (voorraadconcentratie: 100 μM), 1 μL T4-ligasebuffer, 0,5 μL T4-polynucleotidekinase (PNK) (1 × 104 eenheden/ml) en 6,5 μl H2O toe aan een eindreactievolume van 10 μL. Gloei de complementaire enkelstrengs oligonucleotiden met behulp van een thermocycler onder de volgende omstandigheden: 37 °C gedurende 30 minuten en 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door een hellingssnelheid van 5 °C/min.
OPMERKING: Het PNK-enzym wordt geleverd met PNK-buffer en bevat niet genoeg ATP dat nodig is voor de fosforyleringsreactie (zie materiaaltabel). Om de reactie te vereenvoudigen, gebruikt u de T4 ligasebuffer (in plaats van PNK-buffer). T4-ligasebuffer levert de juiste hoeveelheid (1 mM ATP) fosfaat voor de fosforyleringsreactie. Het PNK-enzym levert 5' eindfosforylering van oligonucleotiden voor de daaropvolgende ligatiereactie.
- Voeg 1 μL van elk 5' en 3' enkelstrengs oligonucleotide (voorraadconcentratie: 100 μM), 1 μL T4-ligasebuffer, 0,5 μL T4-polynucleotidekinase (PNK) (1 × 104 eenheden/ml) en 6,5 μl H2O toe aan een eindreactievolume van 10 μL. Gloei de complementaire enkelstrengs oligonucleotiden met behulp van een thermocycler onder de volgende omstandigheden: 37 °C gedurende 30 minuten en 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door een hellingssnelheid van 5 °C/min.
- Ligatie van gegloeide sgRNA oligonucleotiden
- Voeg 25 ng plasmide pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry toe aan 2 μL gegloeide sgRNA oligonucleotiden, 1 μL SacI-enzym, 2 μL 10x T4 DNA-ligasebuffer, 1 μL T4 DNA-ligase (1-3 u/μL) (zie Materiaaltabel) en H2O tot een eindreactievolume van 10 μL.
- Voer ligatie uit door het reactiemengsel te incuberen met behulp van een thermocycler onder de volgende omstandigheden: 15 cycli van 37 °C gedurende 5 minuten en 25 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door vasthouden bij 4 °C.
- Transformatie gevolgd door koloniepolymerasekettingreactie (PCR)
- Transformeer de bevoegde E. coli DH10B-cellen (zie materiaaltabel) met 4 μl van het ligatieproduct met behulp van een hitteschok (42 °C gedurende 45 s) en verspreid over een agarplaat met 100 μg/ml ampicilline.
- Bevestig getransformeerde kolonies per kolonie-PCR met behulp van de PCR-mastermix (zie Materiaaltabel). Kies de kolonie en meng met 5 μL mastermix, 0,1 μL universele primer (voorraadconcentratie: 100 μM), 0,1 μL sgRNA reverse primer (voorraadconcentratie: 100 μM) (tabel 1) en 5 μL H 2 O. Voer de PCR uit met behulp van een thermocycler onder de volgende omstandigheden: initiële denaturatie (94 °C gedurende2min), gevolgd door 35 cycli van denaturatie (94 °C gedurende 20 s), gloeien (60 °C gedurende 30 s), extensie (72 °C gedurende 30 s) en een laatste rekstap (72 °C gedurende 5 minuten). Los het DNA op met behulp van agarose (1,5%) gelelektroforese in 0,5x TAE-buffer bij 90 V gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Positieve klonen geven een band van ~280 bp. - Dien positieve monsters in voor Sanger-sequencing met behulp van universele primer (tabel 1, aanvullend bestand 1).
- Plasmide zuivering
- Zuiver het plasmide van een positieve kloon met behulp van een plasmidezuiveringskit (zie materiaaltabel), volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Zuiver het plasmide met behulp van anionenuitwisselingshars of een andere kit die geschikt is voor gebruik bij celtransfectie. - Incubeer de positieve kloon (12 uur bij 37 °C met schudden bij 200 tpm) met behulp van een standaard bacterieel groeimedium dat 100 μg/ml ampicilline bevat.
- Centrifugeer de bacteriële cellen bij 6.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Volg de volgende stappen volgens de instructies van de kit van de fabrikant.
- Zuiver het plasmide van een positieve kloon met behulp van een plasmidezuiveringskit (zie materiaaltabel), volgens de instructies van de fabrikant.
2. AAV-verpakking
OPMERKING: AAV-verpakking werd uitgevoerd volgens eerdere publicaties15,16 met kleine wijzigingen.
- Plaat 293T cellen (zie tabel van materialen) in een 175 cm2 kolf (zaaien 5 × 106 cellen per kolf) met behulp van 25 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (P/S). Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 en 95% vochtigheid totdat de cellen 50%-70% samenvloeiing bereiken.
- Meng 14 μL polyethylenimine (1 μg/μL) met 1 ml 150 mM NaCl. Meng de drie plasmiden die nodig zijn voor AAV-productie in een molaire verhouding van 1:1:1 (d.w.z. 17,7 μg pAdDeltaF6, 7,9 μg AAV2/8 (zie materiaaltabel) en 5,9 μg gekloond sgRNA uit stap 1 in 1 ml 150 mM NaCl. Breng het polyethyleenimine:NaCl-mengsel druppelsgewijs over in de buis met het DNA (mengsel van plasmiden) en incubeer gedurende 20 minuten bij 25 °C.
OPMERKING: pAdDeltaF6 is een Helper-plasmide en pCapsid pAAV2/8 is een verpakkingsplasmide dat replicatie- (Rep) en capsid-genen (cap) tot expressie brengt. Beide plasmiden zijn nodig om AAV te produceren. - Vervang vóór transfectie het celgroeimedium door 18 ml DMEM met 1% FBS en L-alanyl-L-glutamine (0,5 g/l). Voeg 2 ml van het polyethyleenimine:DNA-mengsel toe aan elke kweekkolf en incubeer de cellen in een CO 2-incubator (37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid).
- Voeg na 5 uur 5 ml DMEM toe, aangevuld met 10% FBS en L-alanyl-L-glutamine (0,5 g / L).
- Maak na 3 dagen incubatie de cellen los van de kweekkolf met behulp van een celschraper. Verzamel de 293T-cellen uit 10 (175 cm2) celkweekkolven in conische buisjes van 50 ml en voeg DMEM (zie materiaaltabel) toe tot 30 ml.
- Voeg 3 ml chloroform toe aan elke conische buis van 50 ml die de 293T-cellen bevat en meng met behulp van een vortexmixer op hoge snelheid gedurende 5 minuten. Resuspendeer de cellen door 7,6 ml 5 M NaCl en vortex kort toe te voegen. Centrifugeer bij 3.000 × g en 4 °C gedurende 5 minuten.
- Breng de waterige fase over in een nieuwe conische buis en voeg 9,4 ml 50% (v / v) polyethyleenglycol (PEG) 8000 toe. Meng met een vortexmixer op hoge snelheid gedurende 10 s en zet de monsters gedurende 1 uur op ijs.
- Centrifugeer bij 3.000 × g bij 4 °C gedurende 30 min. Verwijder het supernatant en laat de pellet 10 minuten drogen.
- Voeg 1,4 ml HEPES (50 mM, pH 8) toe en meng gedurende 5 minuten met behulp van een vortexmixer op hoge snelheid. Voeg 3,5 μl 1 M MgCl2, 14 μl DNase I (20 eenheden/μl) en 1,4 μl RNase A (10 μg/μl) toe. Incubeer gedurende 20 minuten in een waterbad van 37 °C en breng de monsters vervolgens over in nieuwe buizen van 1,5 ml (700 μl in elke buis).
- Voeg 700 μL chloroform toe aan elke buis van 1,5 ml en meng met behulp van een vortexmixer op hoge snelheid gedurende 10 s. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 3.000 × g bij 4 °C en breng de waterige fase over in een nieuwe buis. Herhaal deze stap 3x.
- Verdamp de chloroform gedurende 30 minuten in een bioveiligheidskast. Breng vervolgens 300 μL van de waterige fase over in een ultracentrifugatiebuis van 0,5 ml (zie materiaaltabel). Draai het filter op 14.000 × g bij 25 °C gedurende 5 min. Verwijder de doorstroming en draai het filter opnieuw totdat het volledige volume door het filter is gegaan.
- Was het filter door 300 μL van Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) toe te voegen en meng de oplossingen door pipetteren. Centrifugeer het filter gedurende 5 minuten bij 14.000 × g bij 25 °C. Herhaal deze wasstap 4x.
- Centrifugeer het filter gedurende 8 minuten bij 14.000 × g bij 25 °C. Plaats het filter ondersteboven in een nieuwe buis en draai gedurende 2 minuten bij 1.000 × g bij 25 °C.
3. Titratie van de AAV door qPCR
- Maak een standaardcurve voor AAV-titratie en bepaal de AAV-titer volgens de oorspronkelijke studie van Fripont et al.15.
4. In vivo injectie van AAV in het inguinale witte vetweefsel (iWAT)
- Scheid de chirurgische hulpmiddelen en benodigdheden die nodig zijn voor een operatie en steriliseer ze zoals aanbevolen voor elk specifiek materiaal.
- Verdoof de muis met 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine door intraperitoneale injectie. Bevestig de anesthesie door krachtige druk uit te oefenen op de poot en staart en te controleren op een reflex. Breng zalf aan op de ogen van de muis om droogheid van de ogen tijdens de operatie te voorkomen.
- Plaats de verdoofde muis in rugligging en scheer een klein gebied op de flanken, proximaal aan de heupgewrichten voor iWAT-injecties, met een scheerapparaat. Breng ontharingscrème gedurende 5 minuten aan. Verwijder resterende crème met water om huidverbranding te voorkomen.
- Desinfecteer de huid met behulp van drie afwisselende rondes van het aanbrengen van antiseptische oplossing (povidon-jodium) op de huid met een schoon gaas en 70% alcohol. Gooi het gaas na elk gebruik weg.
- Voer een laatste toepassing van een antiseptische oplossing op de huid uit. Maak vervolgens een incisie van 1-2 cm met een gesteriliseerde schaar in het proximale gebied van de gewrichten en houd de huid open met een tang om het vetdepot bloot te leggen. De WAT is aan beide zijden aan de huid bevestigd en strekt zich uit van het begin op de rug en naar beneden naar de testis.
OPMERKING: Gebruik gordijnen om besmetting tijdens een operatie of hechtingsprocedures te voorkomen. - Trek met een tang, door de incisie, het vetdepot voorzichtig omhoog om ervoor te zorgen dat de injectie op de juiste locatie en diepte is.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u het weefsel niet van de oorspronkelijke locatie verwijdert. - Vul de microliterspuit (dikte: 33; puntstijl: 4; hoek: 12; lengte: 10) (zie materiaaltabel) met 2,5 μl (5,6 × 1010 virale genomen [VG]/μL) van de AAV (die het sgRNA bevat dat gericht is op het endogene Prdm16-gen). Steek de naald voorzichtig in een hoek van 30°-45° in de iWAT. Herhaal de injectie 5x op verschillende locaties van het weefsel om het hele iWAT-vetkussen homogeen te infecteren. Een totaal volume van 15 μL wordt aanbevolen om de iWAT te infecteren.
OPMERKING: De diepte van het inbrengen van de spuit is afhankelijk van de dikte van de afzetting van het vetkussen. Gebruik de no-touch techniek om de injectie op te stellen. - Sluit de geschoren huidincisie met behulp van 4/0 monofilament hechtingen. Plaats de muis op een warmtekussen totdat het bewustzijn is herwonnen. Controleer het dier elke 10-15 minuten totdat het volledig herstelt. Nadat het dier weer bij bewustzijn is gekomen, observeert u de locomotorische profilering, die lineair moet zijn en geen tekenen van angst of pijn moet hebben.
- Voer postoperatieve pijnbestrijding uit binnen 48 uur na de operatie door tramadolhydrochloride (5 mg/kg) intraperitoneaal toe te dienen gedurende 3 dagen (2x/dag).
OPMERKING: Let op tekenen van nood en ongemak en controleer de water- en voedselinname. Geef preventief een effectieve dosis pijnstiller, bij voorkeur voor of aan het begin van de operatie. - Houd de muis in een kooi met vrije toegang tot voedsel en water tijdens de genezingsperiode. Ga na de genezingsperiode verder met het euthanaseren van de muis. In deze studie werd euthanasie uitgevoerd door een overdosis injecteerbare anesthetica (intraperitoneaal) van 3x de inducerende dosis (300-360 mg/kg ketaminehydrochloride + 30-40 mg/kg xylazinehydrochloride) gevolgd door onthoofding.
OPMERKING: Het wordt sterk aanbevolen om de dieren in individuele kooien te houden totdat ze volledig hersteld zijn van de anesthesie.
5. In vitro differentiatie van stromale vasculaire cellen (SVF's) in beige adipocyten
- Voer isolatie en plating uit van primaire SVF's uit de iWAT van AdipoSPH-muizen volgens Aune et al.17. Zaad-SVF's afgeleid van AdipoSPH-muizen iWAT in een 6-well-plaat met volledig medium (DMEM met 3,1 g / L glucose, 0,5 g / L L-alanyl-L-glutamine, 10% FBS en 2,5% P / S) gedurende 1-2 uur.
OPMERKING: De SVF-fractie bevat een mengsel van verschillende celtypen. In deze stap is het niet mogelijk om het aantal gezaaide voorlopercellen te definiëren die aanleiding geven tot adipocyten. - Zuig het medium op, was de put 2x met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (1x PBS) en vervang door vers compleet medium. Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid totdat de cellen 70%-80% confluentie bereiken.
- Induceer differentiatie (dag 0) door de cellen te behandelen met het inductiemedium (tabel 2).
OPMERKING: De medicijncocktail van het inductiemedium is nodig om de beige adipocytendifferentiatie te verbeteren en voor expressie van het thermogene genprogramma17. - Vervang na 2 dagen (dag 2) het inductiemedium door het onderhoudsmedium (tabel 2).
- Vervang na 2 dagen (dag 4) het onderhoudsmedium gedurende 2 tot 3 dagen door vers onderhoudsmedium (tabel 2).
- Vervang het onderhoudsmedium elke 48 uur totdat de preadipocyten volledig zijn gedifferentieerd in adipocyten (meestal 6 dagen na de toevoeging van het inductiemedium). Volwassen adipocyten kunnen worden waargenomen met behulp van lichtmicroscopie, omdat de gedifferentieerde cellen lijken te zijn geladen met lipidedruppels.
6. In vitro AAV-infectie van SVF's
OPMERKING: SVF's afgeleid van AdipoSPH-muizen iWAT werden geïnfecteerd met AAV-dragende sgRNA-Prdm16 zoals eerder beschreven door Wang et al.18 met een paar wijzigingen.
- Laat de cellen groeien op een 6-well kweekplaat met volledig medium totdat de cellen 70% -80% samenvloeiing bereiken, zoals eerder beschreven in stappen 5.1-5.3.
- Meng 5,6 × 1010 VG/μL AAV-dragend sgRNA-Prdm16 met 2 ml volledig medium en hexadimethrinebromide (8 μg/ml) (zie materiaaltabel). Transduceer de cellen door het volledige medium te vervangen en het volledige medium met AAV toe te voegen. Incubeer de getransduceerde cellen gedurende 12 uur bij 37 °C, 95% vochtigheid en 5% CO2.
- Splits en zaai de cellen zoals beschreven in stap 5 voor celproliferatie en differentiatie in beige adipocyten.
OPMERKING: Voor de zuurstofverbruikstest, zaad 4,0 × 104 cellen (vanaf stap 6.2) per put met inductiemedium in een 24-well celkweekplaat. De volgende stappen van celproliferatie en differentiatie worden uitgevoerd zoals beschreven in stap 5. De zuurstofverbruikstest wordt uitgevoerd wanneer de cellen 80% -100% samenvloeiing bereiken en volledig gedifferentieerd zijn, zoals eerder gemeld19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AdipoSPH-muizen werden ontwikkeld door SPH- en Adipoq-Cre-muizenstammen te fokken. Beide muizenstammen hadden een hybride C57BL6J-DBA/2J-achtergrond (volgens de commerciële leverancier; zie Materiaaltabel). De SPH-muizenlijn werd oorspronkelijk beschreven door Zhou et al.14.
In vivo beige adipocytenontwikkeling door AdipoSPH-gemedieerde Prdm16-overexpressie
Om de capaciteit van het in deze studie beschreven model om beige adipocyten in vivo te ontwikkelen te evalueren, werd de AAV met het sgRNA-gericht Prdm16-gen geïnjecteerd in de iWAT van AdipoSPH-muizen. Prdm16 is een gevestigde transcriptiefactor die de ontwikkeling en functie van beige adipocyten bepaalt20,21. Het is belangrijk om te vermelden dat we hier een eerder getest en gevalideerd sgRNA hebben gekozen dat zich richt op het endogene Prdm16-gen14. AAV met een leeg sgRNA werd gebruikt als controle. 10 dagen na AAV-injectie werd iWAT geoogst voor histologische en genexpressieanalyses (figuur 1A). Zoals verwacht toonden immunofluorescentiebeelden van iWAT van AdipoSPH-muizen de expressie van dCas9 in zowel de controle- als de Prdm16-groep (figuur 1B). Bovendien bevestigde mCherry-expressie het succes van AAV-infectie van iWAT in zowel de controle- als de Prdm16-groep (figuur 1B). SPH-geïnduceerde Prdm16-expressie veroorzaakte duidelijk een wijdverspreide accumulatie van multiloculaire beige adipocyten in iWAT (figuur 1B). Bovendien toonde kwantitatieve PCR (qPCR) een verhoogde expressie van Prdm16 en het thermogene genprogramma (Ucp1, Cox8b, Ppargc1a en Cidea) in de Prdm16-groep in vergelijking met de controle (figuur 1C).
Bevordering van de ontwikkeling van beige adipocyten en verbetering van het zuurstofverbruik in vitro door AdipoSPH-gemedieerde Prdm16-overexpressie
Vervolgens werd de geschiktheid van dit model voor het bestuderen van beige adipocytenbiologie in vitro onderzocht. Hiertoe werden preadipocyten afgeleid van de iWAT van AdipoSPH-muizen getransduceerd met AAV die de sgRNA-sequentie droeg die gericht was op Prdm16. Zeven dagen na differentiatie werden beige adipocyten gebruikt voor de analyse van genexpressie en zuurstofverbruik (figuur 2A). Leeg sgRNA werd gebruikt als controle. Het is vermeldenswaard dat de verwijdering van STOP-codon door CRE-recombinase en activering van SPH-machines onder controle stond van de adiponectinepromotor / -versterker, wat resulteerde in de activering van het endogene Prdm16-gen in volwassen adipocyten. Genexpressieanalyse bevestigde de verhoogde expressie van het endogene Prdm16-gen en thermogene genen in de Prdm16-overexpressiegroep in vergelijking met de controlegroep (figuur 2B). Om te bevestigen dat de SPH-geïnduceerde beige adipocyten functioneel thermogeen waren, werd een respirometrietest met hoge resolutie uitgevoerd op de primaire adipocyten. De analyse en interpretatie van respirometriegegevens werd uitgevoerd zoals onlangs beschreven22. SPH-geïnduceerde Prdm16-expressie resulteerde in een hoger basaal en maximaal zuurstofverbruik dan dat in controlecellen (figuur 2C). Belangrijk is dat de gegevens wezen op een verbeterde ontkoppelde ademhaling (oligomycine-ongevoelig) in de Prdm16-groep in vergelijking met die in de controlegroep (figuur 2C, tabel 3). Alles bij elkaar genomen toonden deze resultaten aan dat SPH-geïnduceerde expressie van endogene Prdm16 het bruinende fenotype samenvat en het zuurstofverbruik verbetert dat wordt waargenomen bij conventionele Prdm16 Tg-muizen.
Figuur 1: Beige vetontwikkeling door injectie van adeno-geassocieerd virus (AAV) gericht op endogene Prdm16-gen in inguinaal wit vetweefsel (iWAT) van AdipoSPH-muizen. (A) Schematische illustratie van het in vivo beige adipocyt experimentele ontwerp (gemaakt met behulp van Biorender.com). (B) Histologische (hematoxyline en eosine [H&E] kleuring) afbeeldingen van iWAT. Schaalbalk = 50 μm. (C) Kwantitatieve PCR (qPCR) van Prdm16 en thermogene genen (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α en Cidea; n = 3). De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01 voor Prdm16 versus controle (CTR) door ongepaarde Student t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: SPH-geïnduceerde beige adipocytendifferentiatie door Prdm16-overexpressie. (A) Schematische illustratie van het in vitro beige adipocytenexperimentele ontwerp (gemaakt met behulp van Biorender.com). (B) Relatieve genexpressie van Prdm16 en thermogene genen (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α en Cidea; n = 3). (C) Zuurstofverbruik (OCR), n = 6. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001 voor Prdm16 versus controle (CTR) door (B) ongepaarde student's t-test en (C) tweeweg herhaalde metingen ANOVA, gevolgd door Tukey's test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Sanger-sequencing van Prdm16-sgRNA. (A) Schematische illustratie die de uitlijning van enkelstrengs complementaire Prdm16-oligonucleotiden aantoont. (B) Sanger sequencing van Prdm16 sgRNA met behulp van universele primer. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| Gen | Soort | Voorwaarts | Omkeren | |||||
| Genexpressie | Prdm16 | muis | CAGCACGGTGAAGCCATTC | GCGTGCATCCGCTTGTG | ||||
| Ucp1 | muis | TCTCAGCCGGCTTAATGACTG | GGCTTGCATTCTGACCTTCAC | |||||
| Ppargc1a | muis | AGCCGTGACCACTGACAACGAG | GCTGCATGGTTCTGAGTGCTAAG | |||||
| Stuurman8b | muis | GAACCATGAAGCCAACGACT | GCGAAGTTCACAGTGGTTCC | |||||
| Cidea | muis | ATCACAACTGGCCTGGTTACG | TACTACCCGGTGTCCATTTCT | |||||
| 36B4 | muis | TCCAGGCTTTGGGCATCA | CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA | |||||
| Moleculair klonen | sgRNA Prdm16 sequentie | muis | CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG | CCCCTTTTCAGCGCAGCCTCG | ||||
| universele primer | muis | GAGGGCCTATTTCCC ATGATTCCTTCATAT |
||||||
Tabel 1: In het onderzoek gebruikte primersequenties.
| Gemiddeld | Compositie | |||
| Compleet medium | Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met L-Glutamine | |||
| 10% foetaal runderserum (FBS) | ||||
| 2,5% penicilline/streptomycine | ||||
| Inductiemedium | Compleet medium | |||
| Indomethacine, eindconcentratie 125 μM (0,125 M voorraad ethanol). OPMERKING: Indomethacine moet gedurende 10 seconden worden verhit tot 90 °C om te worden opgelost. | ||||
| Insuline, eindconcentratie 20 nM (1 mM voorraad, Voeg 1 μL HCl toe om op te lossen (5,73 mg/ml). Bewaar de voorraad bij -20 °C. | ||||
| Dexamethason, eindconcentratie 2 μg/ml (2 mg/ml ethanol) | ||||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), eindconcentratie 500 μM (0,25 M voorraad in 0,5 M KOH) | ||||
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3), eindconcentratie 1 nM (10 μM voorraad, oplossen van T3 in 1 M HCl en EtOH 1:4 op voorraad). | ||||
| Rosiglitazon, eindconcentratie 1 μg/ml (1 mg/ml voorraad ethanol) | ||||
| Onderhoudsmedium | Compleet medium | |||
| Insuline, eindconcentratie 20 nM (1 mM voorraad). Voeg 1 μL HCl toe om op te lossen (5,73 mg/ml). | ||||
| Rosiglitazon, eindconcentratie 1 μg/ml (1 mg/ml voorraad ethanol) | ||||
Tabel 2: Samenstelling van de in het onderzoek gebruikte media.
| Parameters | CTR | Prdm 16 | p-waarde | ||
| Geen mitochondriaal zuurstofverbruik (pMollen/min/μg eiwit) | 8,19 ± 1,40 | 10,80 ± 1,83 | 0.01 | ||
| Basale ademhaling (pMollen/min/μg eiwit) | 28,82 ± 5,20 | 52,58 ± 13,73 | 0.001 | ||
| Maximale ademhaling (pMollen/min/μg eiwit) | 63,81 ± 9,80 | 122,94 ± 22,31 | < 0,001 | ||
| Reserve ademhalingscapaciteit (pMollen/min/μg eiwit) | 34,98 ± 11,09 | 70,36 ± 26,06 | 0.006 | ||
| Oligo ongevoelig (pMollen/min/μg eiwit) | 8,27 ± 2,29 | 15,85 ± 5,48 | 0.005 | ||
| Oligogevoelig (pMollen/min/μg eiwit) | 20,54 ± 5,68 | 36,72 ± 14,79 | 0.016 | ||
| Efficiëntie van de koppeling | 71,28 ± 1,51 | 69,84 ± 3,05 | 0.163 | ||
| Cel RCR | 7,70 ± 1,46 | 7,75 ± 2,43 | 0.485 | ||
Tabel 3: Respiratoire parameters van SPH-geïnduceerde beige adipocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een van de meest bruikbare niet-bewerkende toepassingen van CRISPR-technologie is de ondervraging van de genfunctie door de activering van endogene genen met behulp van CRISPRa-systemen6. SPH is een krachtige CRISPRa die oorspronkelijk werd beschreven om de omzetting van astrocyten in actieve neuronen te induceren door zich te richten op verschillende neurogene genen14. In deze studie werd aangetoond dat AdipoSPH een geschikt hulpmiddel is voor het onderzoeken van de biologie van beige vet door de expressie van endogene Prdm16 in adipocyten te activeren. SPH-geïnduceerde Prdm16-overexpressie in adipocyten leidt tot activering van het thermogene genprogramma en induceert het bruiningsfenotype, fenocopie van een eerdere transgene (Tg) Prdm16-muizen model23. Prdm16 werd in deze studie gekozen als het doelwit voor het induceren van beige adipocyten op basis van de centrale rol van deze transcriptiefactor bij het reguleren van bruine en beige vetdifferentiatie, evenals de regulatie van het thermogene genprogramma (bijvoorbeeld het verbeteren van Ucp1-expressie) in gedifferentieerde adipocyten. Niettemin maakt het huidige model overexpressie van elk endogene gen mogelijk naar goeddunken van de onderzoekers en het doel van de studie.
Traditionele transgene modellen die de biologie van vetweefsel onderzoeken, zijn gebaseerd op de ontwikkeling van genetisch gemodificeerde knaagdieren die een transgen overexpresseren onder controle van een promotor/versterker die beperkt is tot adipocyten (bijvoorbeeld Fabp4 of adiponectine)24. Hoewel de huidige technologie het tempo van de ontwikkeling van deze modellen heeft versneld, zijn de kosten en tijd om ze te ontwikkelen nog steeds een veel voorkomend probleem dat door de wetenschappelijke gemeenschap wordt ervaren. AdipoSPH is daarentegen een goedkoper en veelzijdiger model voor gain-of-function-benaderingen dan traditionele Tg-muizen. Bovendien is AdipoSPH zeer geschikt voor het bestuderen van lange niet-coderende RNA- en transcriptisovormen, die niet bijzonder geschikt zijn voor Tg-muizenmodellen.
AdipoSPH biedt ook verschillende voordelen bij het onderzoeken van vetweefselbiologie in vergelijking met de eenvoudige toediening van AAV, een huidige alternatieve benadering voor gain-of-function-experimenten25. Ten eerste bevordert AAV die aan vetweefsel wordt geleverd overexpressie door verschillende kopieën van een transgen te introduceren. Daarentegen vertegenwoordigt de SPH-activering van endogene genen een natuurlijker werkingsmechanisme. Ten tweede resulteren transgenen die door AAV worden geleverd (met behulp van constitutieve promotors) normaal gesproken in hun overexpressie in "elk celtype" in de micro-omgeving van het vetweefsel. Daarentegen is AdipoSPH-geïnduceerde expressie van endogene genen beperkt tot adipocyten. Ten derde is de verpakkingsgrootte (~ 4,5 kb) een typische beperking van AAV voor sommige transgenen26. AAV-dragend sgRNA vereist echter een eenvoudige en gemakkelijke kloonstrategie voor aangepaste 20 nucleotiden. Ten slotte bereikt AAV-toediening meestal de systemische circulatie en infecteert andere weefsels en organen. Hoewel sommige AAV's microRNA's bevatten om de expressie van transgenen in bepaalde weefsels, zoals de lever en het hartte verminderen 25, kan deze strategie AAV-infectie in andere weefsels en organen niet voorkomen. Daarentegen is AdipoSPH-geïnduceerde expressie van endogene genen beperkt tot adipocyten, zelfs gezien enige lekkage van AAV in de systemische circulatie. AdipoSPH is dus ook een geschikt model voor de systemische toediening van AAV-dragend sgRNA en het onderzoek naar vetweefselregulatie van energiehomeostase van het hele lichaam.
Hoewel het AdipoPH-model enkele voordelen biedt, heeft het beperkingen die belangrijk zijn om te overwegen. AAV is momenteel het meest gebruikte platform voor in vivo toediening van sgRNA. Sommige uitdagingen in AAV-productie en immunologische problemen blijven echter onopgelost26,27. Bovendien resulteren verschillende hoeveelheden en verdelingen van geïnjecteerde AAV door het vetweefsel in intra- en interweefselvariabiliteit van genexpressie. Wij zijn van mening dat het klonen van sgRNA-vectoren, AAV-productie en de homogene toediening van AAV in de iWAT cruciale stappen zijn voor het succes van dit protocol. Ten slotte activeren verschillende sgRNA's onderscheidend de expressie van endogene genen in het SPH-systeem14. De belangrijkste aanbeveling is om drie tot vijf sgRNA-sequenties te ontwerpen en te testen binnen 200 bp stroomopwaarts van de transcriptiestartplaats (TSS) van het gen van belang. Daarom vereist het definiëren van de beste sgRNA-sequentie voor een doelgen meestal moeizame in vitro assays voorafgaand aan in vivo experimenten.
AdipoSPH is ook een aantrekkelijk model voor het onderzoeken van andere aspecten van vetweefselbiologie. Adipocyten bevorderen bijvoorbeeld de secretie van talrijke adipokines28,29; De effecten van het hele lichaam van de meeste van deze moleculen blijven echter slecht begrepen. AdipoSPH is een geschikt model om dit probleem aan te pakken door enkele of meerdere endogene genen in volwassen adipocyten tot overexpressie te brengen en hun lokale of systemische effecten te onderzoeken. AdipoSPH is dus een uniek hulpmiddel voor het bestuderen van de biologie en fysiologie van vetweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken de steun van Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, voor de generatie van AdipoSPH-muizen, het Inmmunometabolism and Cell Signaling Laboratory en het National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology (INFABIC) voor alle experimentele ondersteuning. We danken de financiële steun van Sao Paulo Research Foundation (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
References
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Cohen, P., Kajimura, S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
- Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
- Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction. Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103 (2020).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
- Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes. STAR Protocols. 1 (3), 100118 (2020).
- Cohen, P., et al. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch. Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).
- Harms, M., Seale, P. Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential. Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).
- Seale, P., et al. Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).
- Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. Understanding adipose tissue development from transgenic animal models. Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
- Deshmukh, A. S., et al. Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine. Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).
- Sponton, C. H., et al. The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication. EMBO reports. 21 (9), 49828 (2020).
