Summary
该协议演示了如何提取小鼠下颌第一磨牙的分步细节。它为专注于颚骨愈合和再生的研究人员提供了一种替代方法。
Abstract
本研究介绍了鼠下颌骨磨牙拔除模型的发展，为研究牙槽骨再生和膜内骨化提供实用的模型。使用C57 / J6小鼠提取下颌第一磨牙以建立该模型。他们分别在手术后1周和4周被安乐死，并收获双侧下颌骨。随后进行连续立体采集、组织学评估和免疫荧光染色，以证明手术成功。手术后，立体图像立即显示一个空的提取窝。手术后1周的苏木精和伊红（H&E）和术后4周的Masson染色显示，原始根部的区域分别部分和完全充满骨小梁。免疫荧光染色显示，与稳态侧相比，术后1周Sp7表达增加，提示牙槽窝成骨剧烈。所有这些结果都证明了一种可行的鼠牙拔牙槽愈合模型。即将进行的揭示颚骨缺陷愈合或牙槽愈合机制的研究可以采用这种方法。
Introduction
拔牙后的牙槽愈合是一种常见的临床情况，在不期望的愈合下，这可能导致不适当的并发症，例如牙槽出血、干槽症，甚至颌骨骨髓炎1，2，3。这些合并症可能会损害患者的生活质量，更糟糕的是，由于大量骨质流失，对假体康复构成重大挑战4。虽然牙槽愈合阶段已经阐明，但在遇到各种预后挑战时，它们不足以指导拔牙手术后的临床护理4。
已经进行了多项基于动物模型的研究，以更好地了解插座愈合过程中的潜在机制并避免上述情况。Sp7是成骨细胞分化的主要调节剂，在骨骼发育、骨止血和骨再生中起着至关重要的作用5，6。合理的牙槽愈合模型可以显示Sp7创伤后在骨再生中的冗余。此外，与长骨骨折愈合不同，只有一个单一的成骨过程，即膜内骨化，涉及拔牙窝7的愈合过程。这使得动物拔牙模型成为研究基于种植体的疗法的最佳选择，因为种植体骨整合遵循相同的成骨规则8。
几十年来，拔牙模型已经在大鼠、兔子和狗身上进行，因为这些物种的大牙齿便于在9、10、11 上操作。然而，鉴于对转基因的蓬勃发展的需求以及作为人类更具适应性的遗传背景，小鼠越来越多地被用来建立拔牙模型。然后，研究人员可以使用基因组修饰的小鼠来揭示特定细胞群在插座愈合过程中的作用，而不是仅观察表型12。在鼠牙拔牙窝模型中，已有研究证明了鼠上颌牙和门牙拔牙窝的建立和愈合过程13，14，15，16。然而，预后的愈合模式以及检测和观察时间点可能因方案而异。这为学者建立鼠窝愈合模型提供了一个普遍标准。
本研究旨在为上述问题构建一个切实可行的鼠窝愈合模型。小鼠的下颌磨牙与上颌磨牙和门牙相比具有独特的形态特征，具有独特的优缺点。由于专注于小鼠下颌骨的模型目前是基于真空的，因此该协议试图提供一种完成的方法来提取小鼠的下颌第一磨牙。我们希望该协议能够启发基础研究人员新的想法，以揭示插座愈合的潜在机制并指示临床护理。
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Protocol
本研究中的所有动物手术均由四川大学华西口腔医学院伦理委员会审核批准（WCHSIRB-D-2017-041）。从商业来源获得的成年C57BL / 6小鼠（见 材料表）用于本研究。
1.术前准备
- 仪器准备
- 准备各种一次性注射器针头（26G，25G，23G;见 材料表）用作电梯。将针头弯曲约20°-40°，如图 1所示。
- 准备带齿的眼科镊子作为镊子。确保它适合小鼠臼齿的大小，并且可以牢牢抓住臼齿。理想的镊子尺寸如图 1A、B3所示。
- 获得一根橡皮筋（可以从医用乳胶手套上撕下）用作开口器，泡沫板或软木板作为手术平台，前照亮手术区域的头灯以及用于术后恢复的加热垫。将干燥的棉球撕成小块，如果在手术过程中出血，则将其涂抹在手术部位。
- 麻醉准备
- 小鼠可以通过任何合适的麻醉方案进行麻醉，该方案通过“脚趾捏”方法确认实现全身麻醉。麻醉后，在小鼠的眼睛上涂抹兽药膏。
注意：首选的全身麻醉方案可以是：用甲苯噻嗪（10mg / kg）和氯胺酮（100mg / kg）腹膜内（IP）诱导和维持;
在这项研究中，异氟醚和1%戊巴比妥钠（50mg / kg，IP）用于麻醉诱导和维持，并根据需要增加剂量。
- 小鼠可以通过任何合适的麻醉方案进行麻醉，该方案通过“脚趾捏”方法确认实现全身麻醉。麻醉后，在小鼠的眼睛上涂抹兽药膏。
- 消毒灭菌准备
- 用75%乙醇喷雾器对操作平台和露天头顶进行消毒。在每次小鼠手术之前，建议使用一套新的一次性针头。
注意：齿镊可重复使用，可以使用任何首选方法（例如蒸汽灭菌）进行灭菌。
- 用75%乙醇喷雾器对操作平台和露天头顶进行消毒。在每次小鼠手术之前，建议使用一套新的一次性针头。
2. 手术过程
- 固定鼠标及其下颌骨
- 使用胶带将鼠标以仰卧位绑在手术平台上。将两根 26 G 针头与眶耳平面对齐，另外两根 26 G 针头在下颌骨下方轻松。
- 在针头周围缠上橡皮筋，穿过门牙以保持嘴巴张开。稍微拉出舌头并将其固定在手术侧对面的橡皮筋下，以防止其阻塞视野（图1C）。
- 消除远端阻力
- 用镊子中夹住臼齿，将 23 G 针刺入远端根部的颊牙槽骨，并形成间隔。
注意：必须非常小心地采取此步骤，因为嵌入太深的针可能会折断根部。 - 接下来，换成 25 G 针继续扩大间隔，并小心翼翼地向根尖周区域前进，同时缓慢地向前和舌侧旋转针头（使用小鼠解剖位置）以将根部压出牙槽窝。
- 用镊子中夹住臼齿，将 23 G 针刺入远端根部的颊牙槽骨，并形成间隔。
- 消除内脏阻力
- 当有足够的空间时，使用 23 G 针插入根叉并咬合提起磨牙。紧紧握住臼齿后，再取一根 23 G 针，用力将其插入舌内侧牙周膜以形成间隔。
- 然后，用 25 G 针代替，慢慢向前和向颊部旋转。如果一些潜在的障碍阻碍了臼齿的脱位，请使用 26 G 针刺穿根尖，然后重复操作。
- 最终提取
- 拔牙，在拔牙时，确保牙冠高高地高于咬合面，并且可以清楚地看到两个完整的牙根。
注意：牙齿脱位（脱位）被认为是手术中最痛苦和最痛苦的时刻。在牙齿脱臼之前，应使用脚趾捏试验重新评估麻醉深度，因此，如有必要，应给予中等剂量的麻醉剂。
- 拔牙，在拔牙时，确保牙冠高高地高于咬合面，并且可以清楚地看到两个完整的牙根。
- 术后护理
- 拔牙后，涂上干棉止血，重新定位舌头，皮下注射卡洛芬（5mg / kg），并将小鼠放在恒温加热垫上，直到从麻醉中恢复。
3. 小鼠下颌骨和拔出窝的成像
- 样品的制备
- 通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。使用眼科剪刀剪断附着在下颌骨和颧弓上的骨骼肌。从喉咙沿下颌骨下缘切到上升分支，然后切到髁突的背面，然后将下颌骨向下拉并沿下门牙中线切开。这样，两个单独的下颌骨就被收获了。
- 按照标准程序进行固定、脱矿和脱水17.嵌入17时，确保咬合平面与暗盒的边缘平行（参见 材料表）。将下颌骨固定在暗盒底部，下边缘翘起（图2）。
注意：本协议提供下颌骨区域的矢状面。
- 将样品固定在切片机上
- 调节切片机中的标本夹，使髁突和冠侧突出5°-20°，以获得牙冠牙髓与根浆的集成图像（图2）。
- 准备章节
注意：髁突始终是第一个要切除的解剖结构。当它消失时，可以将摩尔区域切成几片。- 将切片机范围移至5μm，每八片收集一次，并在最后一片中寻找牙本质。如果冠牙本质首次出现时没有任何根尖牙本质，请调整标本夹以使根部区域突出，反之亦然。
- 收集部分
注意：切割角度是合适的，直到牙本质在冠部和顶端区域均等。- 沿着这个方向切割，并在显微镜下观察切片，直到牙髓出现在牙冠和牙根中。当石蜡样品17的表面上出现模糊的臼齿轮廓时收集切片。
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Representative Results
为了阐明该方法的实际应用，提取两只健康C57BL / 6小鼠（3个月大，均为雌性）的右下颌第一磨牙，并分别随访1周和4周。未受损的左下颌骨被用作健康对照。 图1A 显示了手术器具的具体特征，包括26-23 G针和带齿眼科镊子。26 G 针被精确移除并弯曲。25 G 针在针点处弯曲约 25°。23 G 针是手术的关键，在针点处分别弯曲约 25° 和 35°（图 1B1，B2）。镊子有一个1毫米长的牙齿，适合鼠臼齿的形状（图1B3）。 图1C 显示了手术前小鼠的状态。关键点是头部周围四个别针的位置，并将舌头固定在左侧的橡皮筋下。
图3A 显示了右下颌第一磨牙的位置和形态。 图3B 表示拔牙后立即充满凝块的牙槽。在1周和2周时，对小鼠实施安乐死，下颌骨脱矿质，嵌入石蜡17中，切成薄片。 图 4A 显示了插座在 1 周时的愈合过程。形成了一些海绵状的小梁骨，但凝块仍然存在。在2周的愈合过程中（图4B），窝完全充满海绵骨，这意味着再生大致完成。免疫荧光（IF）染色也证实了组织病理学染色的结果。 在图5中，Sp7在骨髓细胞中广泛表达，特别是在边缘，即骨形成前沿。在体内平衡状态下，小梁骨一致且汇合，骨髓细胞块像岛屿一样散布。然而，在手术后1周，许多表达Sp7的细胞充满了提取窝，周围散布着新形成的小梁骨。术后4周，病情逆转，再次转为大面积融合的小梁骨，表达Sp7的细胞活性下降到接近体内平衡状态的水平。
图1：手术器具和手术准备小鼠的物体图像 。 （A）手术器具主要由26、25和23G针和齿镊组成。（B） 针在 20°-40° （B1，2） 的针点处弯曲。镊子的牙齿大小必须约为 1 毫米 （B3）。 请点击此处查看此图的大图。
图2：从拔牙到切片的过程流程图。该图像显示了从拔牙到切片的流程示意图。根据方案提取右下颌第一磨牙，然后对小鼠实施安乐死，收获下颌骨。收获后，将下颌骨浸泡在4%POM中24小时，然后重新浸泡在10%EDTA中;液体每天更新14天。接下来，将样品脱水并按照通用方案包埋在石蜡中。颊侧或舌侧必须面朝下，因为矢状面切片应该被切开。最后，将样品固定在试样夹上时，髁突和冠侧必须突出 5°-20°。缩写：POM = 多聚甲醛;EDTA = 乙二胺四乙酸。请点击此处查看此图的大图。
图3：小鼠下颌第一磨牙和拔牙窝的立体图像。 （A）右下颌第一磨牙的立体图像，由黄色箭头表示。（B）手术后第一右下颌磨牙的拔牙窝，用黄色箭头表示。请点击此处查看此图的大图。
图4：H&E染色。 在手术后（A）1周和（B）4周对提取窝进行H&E染色。黄色箭头表示下颌第二磨牙靠近第一磨牙拔牙窝愈合。虚线矩形线表示愈合的第一磨牙拔牙窝区域。比例尺：500 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：通过 IF 染色 检测 Sp7。 该图像分别显示了手术后1周和4周在稳态状态（健康对照）下小鼠下颌骨骨髓细胞和周围小梁骨中Sp7表达的分布。白色虚线勾勒出小梁骨的估计比例。黄色箭头表示典型的表达Sp7的细胞。比例尺：50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
鼠窝愈合模型是揭示骨愈合和再生潜在机制的重要方法，最终解决临床挑战。现有的研究已经证明了门牙拔除模型和上颌磨牙拔除模型的可能性，而研究尚未使用下颌第一磨牙模型13，17，18。然而，门牙对啮齿动物的生活至关重要，它们的损伤可能是致命的。此外，由于上颌骨中的骨骼比下颌骨更松质，因此在愈合过程中，潜在机制可能存在一些差异。因此，有必要建立可行的下颌第一磨牙拔除模型。
拔牙最重要的考虑因素是避免牙根断裂19.鼠臼齿小而脆弱，下颌骨中的残余根无法拔除。然而，在该协议中，整个手术都存在根本断裂的风险。因此，紧紧握住磨牙并严格控制力至关重要。具体来说，在消除远端阻力时，需要注意不要揉搓牙冠;在消除内侧阻力时，需要小心，以免针从根叉中涌出;当使用针头渲染间隔时，重要的是要记住间隔应该在根和牙槽过程之间，因此不应施加太大的旋转力，因为这会导致根部断裂的高风险。
拔除鼠下颌第一磨牙是艰巨的，需要足够的训练才能掌握。在手术过程中，可能会发生包括但不限于以下情况的紧急情况：（1）由于下颌骨和舌头的活动性，拔牙器械容易滑倒并刺伤软组织，这可能导致轻度至重度出血。在这种情况下，可以将干净的干棉球放入嘴中，松开橡皮筋，让它自发闭合一段时间。不建议加压止血，因为这可能会导致更广泛的撕裂伤和出血。（2）操作者经常面临牙槽骨板保留或磨牙根保留的二元选择，因为第一磨牙与下颌骨紧密连接。为了减轻这种粘合力，操作员可以折断舌骨或颊骨板;否则，插座中凶猛的旋转力会导致根部断裂。是否选择保存骨板取决于研究目标。（3）拔除下颌第一磨牙可能比上颌第一磨牙或门牙更具创伤性。我们建议仔细观察，直到手术后小鼠醒来。（4）下颌第二磨牙内根因颊区手术室有限而脆弱;有时，甚至第二磨牙的牙冠也会被破坏。因为第二磨牙的缺失并不影响第一磨牙拔牙窝愈合的观察，所以这次事故可以忽略不计。（5）在拔牙过程中密切监测小鼠的麻醉深度，因为这对人类和啮齿动物来说都是一个痛苦的过程。根据需要施用麻醉剂以维持手术麻醉平面，直到提取完成。此外，橡皮筋长时间的压力可能导致舌头缺氧，其特征是膜苍白。在这种情况下，必须立即停止操作，并移除仪器，让鼠标有时间恢复。
综上所述，不熟练的操作人员可能会无意中对小鼠造成意外伤害，如第1点所列。为了确保所有实验动物的安全和福祉，强烈建议在掌握这项技能并在实际小鼠身上执行活体程序之前，对小鼠尸体进行充分的练习。
尽管该协议为专注于颚骨愈合和再生的研究人员提供了一种替代方法，但它有几个缺点。（1）下颌骨不能固定，具有广泛的灵活性。因此，电梯很难在牙槽骨上保持稳定作用点，造成一些紧急情况。（2）成年雄性小鼠下颌骨增强，因此消除内侧阻力可能很困难。（3）本协议不适用于左下颌第一磨牙拔除术。
总之，尽管该协议已经证明了提取鼠下颌第一磨牙的细节，但操作者仍然需要大量的练习和谨慎才能成功进行手术。
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Disclosures
本文包含所有原始数据和图像。作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金81825005（L.Y.）、82201045（F.Y.）和82100982（F.L.）以及四川省科技计划2021JDRC0144（F.L.），2022JDRC0130（F.Y.）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23/25/26 G needle | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB1-074(IV) | |
| C57/B6J | Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China | C57/B6J | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | Cat#C1005 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST Scientific | 80106-1100-16 | |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Biosharp | BL700B | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-22-10 | |
| Masson’s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Pentobarbital Sodium | Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd | 2018042001 | |
| Rabbit polyclonal | anti-Sp7 | Abcam Cat# ab22552 | |
| Tweezers | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB2-115 |
References
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