Summary
Este protocolo muestra detalles paso a paso de cómo extraer el primer molar mandibular en el ratón. Proporciona un método alternativo para los investigadores que se centran en la curación y regeneración de la mandíbula.
Abstract
Este estudio introduce el desarrollo de un modelo de extracción molar en la mandíbula murina para proporcionar un modelo practicable para estudiar la regeneración ósea alveolar y la osificación intramembranosa. Se utilizaron ratones C57/J6 para extraer el primer molar mandibular para establecer este modelo. Fueron sacrificados, y las mandíbulas bilaterales cosechadas, a 1 semana y 4 semanas después de la cirugía, respectivamente. Se realizó posterior recolección estereoscópica seriada, evaluación histológica y tinción de inmunofluorescencia para demostrar el éxito de la cirugía. Inmediatamente después de la cirugía, las imágenes estereoscópicas mostraban un zócalo de extracción vacío. La hematoxilina y la eosina (H&E) a la semana y la tinción de Masson a las 4 semanas después de la cirugía mostraron que el área de la raíz original estaba parcial y completamente llena de trabéculas óseas, respectivamente. La tinción de inmunofluorescencia mostró que, en comparación con el lado de la homeostasis, la expresión de Sp7 aumentó a 1 semana después de la cirugía, lo que sugiere osteogénesis vigorosa en la fosa alveolar. Todos estos resultados demostraron un modelo practicable de curación del alvéolo de extracción de dientes murinos. Los próximos estudios que revelan los mecanismos de curación de defectos de la mandíbula o curación de alvéolos podrían adoptar este método.
Introduction
La cicatrización del alvéolo después de la extracción dental es un escenario clínico común, que puede resultar en complicaciones impropias como hemorragia de alvéolo, alveolitis seca o incluso osteomielitis de la mandíbula bajo curación indeseable 1,2,3. Estas comorbilidades pueden perjudicar la calidad de vida de los pacientes y, lo que es peor, dificultar vitalmente la rehabilitación protésica debido a la pérdida ósea masiva4. A pesar de que las etapas de curación del alvéolo han sido dilucidadas, son inadecuadas para dirigir la atención clínica posterior a la cirugía de extracción dental cuando se encuentran con diversos desafíos pronósticos4.
Se han realizado múltiples estudios basados en modelos animales para obtener una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes en el proceso de curación del alvéolo y evitar las situaciones anteriores. Sp7 es un regulador maestro en la diferenciación de osteoblastos, desempeñando un papel vital en el desarrollo del esqueleto, la hemostasia ósea y la regeneración ósea 5,6. Los modelos racionales de curación de alvéolos podrían mostrar la redundancia de Sp7 postraumático en la regeneración ósea. Además, a diferencia de la cicatrización de la fractura de huesos largos, un solo proceso osteogénico, la osificación intramembranosa, implica el proceso de curación del alvéolo de extracción7. Esto hace que el modelo de extracción de dientes animales sea óptimo para estudiar terapias basadas en implantes, ya que la osteointegración de implantes obedece a la misma regla osteogénica8.
Durante décadas, el modelo de extracción dental se ha realizado en ratas, conejos y perros, ya que estas especies tienen dientes grandes que son convenientes para operar en 9,10,11. Sin embargo, dadas las florecientes demandas de modificación genética y como un fondo genético más adaptativo a los humanos, los ratones se utilizan cada vez más para establecer un modelo de extracción dental. A partir de entonces, los investigadores podrían desentrañar el papel de una población celular específica en el proceso de curación del alvéolo utilizando ratones modificados con genoma en lugar de observar fenotipos solo12. Entre los modelos de alvéolo de extracción de dientes murinos, estudios previos han demostrado el establecimiento y proceso de curación de los alvéolos murinos de extracción de dientes maxilares e incisivos13,14,15,16. Sin embargo, el patrón de curación del pronóstico, y los puntos de tiempo detective y observativos, pueden diferir entre los protocolos. Esto apela a un criterio universal para que los estudiosos establezcan un modelo murino de curación de alvéolos.
Este estudio tuvo como objetivo constituir un modelo practicable de curación de alvéolo murino para los problemas anteriores. Los molares de la mandíbula en ratones tienen rasgos morfológicos distintivos en comparación con los molares e incisivos maxilares, lo que aporta ventajas y desventajas únicas. Como los modelos que se centran en la mandíbula murina están actualmente basados en el vacío, este protocolo trató de proporcionar un método logrado para extraer el primer molar mandibular en ratones. Esperamos que este protocolo ilumine a los investigadores básicos con nuevas ideas para descubrir los mecanismos subyacentes de la curación de la cavidad e indicar la atención clínica.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales en este estudio fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de la Escuela de Estomatología de China Occidental de la Universidad de Sichuan (WCHSIRB-D-2017-041). Para el presente estudio se utilizaron ratones adultos C57BL/6, obtenidos de una fuente comercial (ver Tabla de materiales).
1. Preparación prequirúrgica
- Preparación del instrumento
- Prepare varias agujas de jeringas desechables (26G, 25G, 23G; consulte la Tabla de materiales) para usarlas como elevadores. Incline la cabeza de la aguja aproximadamente 20°-40°, como se muestra en la Figura 1.
- Prepare pinzas oftálmicas dentadas como fórceps. Asegúrese de que se ajuste al tamaño de los molares de los ratones y pueda agarrar los molares firmemente. El tamaño ideal de pinza se muestra en la Figura 1A, B3.
- Obtenga una banda elástica (que se puede arrancar de un guante de látex médico) para usar como abridor bucal, una tabla de espuma o tablero de corcho como plataforma quirúrgica, un faro para iluminar el área quirúrgica y una almohadilla térmica para el renacimiento postoperatorio. Rompa una bola de algodón seca en trozos pequeños y aplíquela al sitio quirúrgico si se produce sangrado durante el procedimiento.
- Preparación de la anestesia
- El ratón puede ser anestesiado por cualquier protocolo anestésico adecuado que logre la anestesia general confirmada a través del método de "pinzamiento del dedo del pie". Después de la anestesia, aplique ungüento veterinario en los ojos del ratón.
NOTA: El protocolo anestésico general preferido podría ser: inducción y mantenimiento con xilazina (10 mg/kg) y ketamina (100 mg/kg) por vía intraperitoneal (IP);
Para este estudio, se utilizó isoflurano y pentobarbital sódico al 1% (50 mg/kg, IP) para la inducción y mantenimiento de la anestesia con dosis adicionales según sea necesario.
- El ratón puede ser anestesiado por cualquier protocolo anestésico adecuado que logre la anestesia general confirmada a través del método de "pinzamiento del dedo del pie". Después de la anestesia, aplique ungüento veterinario en los ojos del ratón.
- Preparación para la desinfección y esterilización
- Desinfecte la plataforma de operación y la parte superior al aire libre con un pulverizador de etanol al 75%. Antes de cada procedimiento con ratón, se recomienda el uso de un nuevo juego de agujas desechables.
NOTA: Las pinzas dentadas son reutilizables y se pueden esterilizar utilizando cualquier método preferido, como la esterilización por vapor.
- Desinfecte la plataforma de operación y la parte superior al aire libre con un pulverizador de etanol al 75%. Antes de cada procedimiento con ratón, se recomienda el uso de un nuevo juego de agujas desechables.
2. Proceso quirúrgico
- Fijación del ratón y su mandíbula
- Ate el ratón a una plataforma quirúrgica en posición supina con cinta adhesiva. Fije dos agujas de 26 G en línea con el plano orbital de la oreja y otras dos agujas de 26 G a gusto debajo de la mandíbula.
- Aplique la banda elástica alrededor de las agujas y cruce los incisivos para mantener la boca abierta. Tire ligeramente de la lengua y fíjela debajo de la banda elástica opuesta al lado quirúrgico, para evitar que obstruya el campo de visión (Figura 1C).
- Eliminación de la resistencia distal
- Sostenga el molar con pinzas mesialmente, fuerce una aguja de 23 G en el hueso alveolar bucal de la raíz distal y produzca un intervalo.
NOTA: Este paso debe tomarse con gran precaución, ya que una aguja que está incrustada demasiado profundo probablemente romperá la raíz. - A continuación, cambie a una aguja de 25 G para continuar expandiendo el intervalo y progrese delicadamente hacia el área periapical mientras gira lentamente la aguja hacia adelante y lingualmente (con la posición anatómica del ratón) para presionar la raíz fuera de la fosa alveolar.
- Sostenga el molar con pinzas mesialmente, fuerce una aguja de 23 G en el hueso alveolar bucal de la raíz distal y produzca un intervalo.
- Eliminación de la resistencia mesial
- Cuando haya suficiente espacio, use una aguja de 23 G para insertar en el tenedor de la raíz y levante el molar oclusalmente. Después de sostener el molar con fuerza, tome otra aguja de 23 G y fuércela a entrar en la membrana periodontal mesial lingual para crear un intervalo.
- Luego, sustituya con una aguja de 25 G y gire lentamente hacia adelante y por vía bucal. Si algunos obstáculos subyacentes impiden la luxación del molar, use una aguja de 26 G para penetrar el ápice de la raíz y repita las operaciones.
- Extracción final
- Extraiga el diente y, durante la extracción, asegúrese de que la corona se eleve por encima del plano oclusal y que se puedan ver claramente dos raíces intactas.
NOTA: La luxación (dislocación) del diente se considera el momento más doloroso y angustiante del procedimiento. Antes de dislocar el diente, la profundidad anestésica debe reevaluarse mediante la prueba de pellizco del dedo del pie y, en consecuencia, se debe administrar una dosis moderada de un agente anestésico si es necesario.
- Extraiga el diente y, durante la extracción, asegúrese de que la corona se eleve por encima del plano oclusal y que se puedan ver claramente dos raíces intactas.
- Cuidados postoperatorios
- Después de extraer el diente, aplique algodón seco para detener el sangrado, reposicione la lengua, administre carprofeno (5 mg / kg) por vía subcutánea y coloque el mouse en una almohadilla térmica a temperatura constante hasta la recuperación de la anestesia.
3. Imágenes de la mandíbula del ratón y el zócalo de extracción
- Preparación de las muestras
- Eutanasia al ratón por luxación cervical. Use tijeras oftálmicas para cortar los músculos del esqueleto unidos a la mandíbula y al arco cigomático. Corte desde la garganta a lo largo del borde inferior de la mandíbula hasta la rama ascendente y luego hasta la parte posterior del cóndilo, y luego tire de la mandíbula hacia abajo y corte a lo largo de la línea media del incisivo inferior. De esta manera, se cosechan las dos mandíbulas separadas.
- Realizar la fijación, desmineralización y deshidratación siguiendo el procedimiento estándar17. Al incrustar17, asegúrese de que el plano oclusal esté paralelo al borde del casete (consulte la Tabla de materiales). Fije la mandíbula en la parte inferior del casete, con su borde inferior ladeado (Figura 2).
NOTA: Este protocolo ofrece el plano sagital del área de la mandíbula.
- Fijación de la muestra en el micrótomo
- Regular la pinza de la muestra en el micrótomo para que sobresalga el cóndilo y el lado de la corona 5°-20° más, para lograr una imagen integrada de la pulpa de la corona concomitante con la pulpa de la raíz (Figura 2).
- Preparación de las secciones
NOTA: El cóndilo es siempre la primera estructura anatómica en ser cortada. Cuando se desvanece, el área molar se puede cortar en varias rodajas.- Cambie el rango de microtomo a 5 μm, recoja cada ocho rebanadas y busque dentina en la última rebanada. Si la dentina de la corona aparece por primera vez sin dentina apical de la raíz, ajuste la pinza de la muestra para que el área de la raíz sobresalga, y viceversa.
- Recopilación de las secciones
NOTA: El ángulo de corte es apropiado hasta que la dentina se alcanza por igual tanto en la corona como en el área apical.- Corte en esta dirección y observe las rodajas bajo el microscopio hasta que aparezca la pulpa dental tanto en la corona como en las raíces. Recoger las secciones cuando aparezca un contorno oscuro de molares en la superficie de la muestra de parafina17.
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Representative Results
Para dilucidar el uso práctico de este método, se extrajo el primer molar mandibular derecho de dos ratones sanos C57BL/6 (3 meses de edad, ambas hembras) y se les siguió durante 1 semana y 4 semanas, respectivamente. Las mandíbulas izquierdas no dañadas se utilizaron como controles sanos. La Figura 1A muestra las características específicas del aparato quirúrgico, incluyendo agujas 26-23 G y una pinza oftálmica dentada. La aguja de 26 G se retira y dobla. La aguja de 25 G se dobla aproximadamente a 25° en el punto preciso. Las agujas de 23 G son el eje de la cirugía y se doblan aproximadamente a 25° y 35°, respectivamente, en el punto (Figura 1B1, B2). Las pinzas tienen un diente de 1 mm de largo que se ajusta a la forma de los molares murinos (Figura 1B3). La Figura 1C muestra el estado del ratón antes de la cirugía. Los puntos clave son la ubicación de los cuatro clavijas alrededor de la cabeza y la fijación de la lengua debajo de la banda elástica a la izquierda.
La figura 3A muestra la posición y morfología del primer molar mandibular derecho. La Figura 3B indica el alvéolo dental inmediatamente lleno de coágulo después de la extracción. A la semana y 2 semanas, los ratones fueron sacrificados, y las mandíbulas fueron desmineralizadas, incrustadas en parafina17, y seccionadas en rodajas. La figura 4A muestra el proceso de cicatrización del alvéolo a 1 semana. Se formaron algunos huesos trabeculares similares a esponjas, pero el coágulo permaneció. En el proceso de curación a las 2 semanas (Figura 4B), el alvéolo estaba completamente lleno de huesos de esponja, lo que significa que la regeneración se completó aproximadamente. La tinción de inmunofluorescencia (IF) también corroboró los resultados de la tinción histopatológica. En la Figura 5, el Sp7 se expresó ampliamente en las células de la médula ósea, especialmente en el margen, que es el frente formador de hueso. Bajo el estado de homeostasis, los huesos trabeculares eran consistentes y confluentes, con bloques de células de médula ósea salpicados como islas. Sin embargo, a 1 semana después de la cirugía, numerosas células que expresan Sp7 llenaron el alvéolo de extracción, con hueso trabecular recién formado rociado alrededor. A las 4 semanas después de la cirugía, la condición se revirtió y se convirtió en hueso trabecular fusionado en gran medida nuevamente, y la actividad de las células que expresan Sp7 disminuyó a un nivel cercano al estado de homeostasis.
Figura 1: Las imágenes de objetos de aparatos quirúrgicos y ratones preparados para cirugía. (A) Los aparatos quirúrgicos consistían principalmente en agujas de 26, 25 y 23 G y una pinza dentada. (B) Las agujas se doblaron en el punto exacto a 20°-40° (B1,2). El diente de las pinzas debe tener un tamaño aproximado de 1 mm (B3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El diagrama de flujo del procedimiento desde la extracción del diente hasta la sección. Esta imagen muestra un flujo esquemático desde la extracción del diente hasta la sección. El primer molar mandibular derecho se extrajo de acuerdo con el protocolo, luego se sacrificó al ratón y se cosechó la mandíbula. Tras la cosecha, la mandíbula se empapó en 4% POM durante 24 h, luego se volvió a remojar en EDTA al 10%; El líquido se renovó todos los días durante 14 días. A continuación, las muestras se deshidrataron e incrustaron en parafina siguiendo un protocolo universal. El lado bucal o lingual debe estar boca abajo, ya que se supone que las rebanadas del plano sagital deben estar seccionadas. Finalmente, al fijar la muestra en la abrazadera de la muestra, los lados del cóndilo y la corona deben sobresalir entre 5° y 20°. Abreviaturas: POM = paraformaldehído; EDTA = ácido etilendiamina tetraacético. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes estereoscópicas del primer molar mandibular del ratón y del zócalo de extracción. (A) Imagen estereoscópica del primer molar mandibular derecho, indicada por la flecha amarilla. (B) El alvéolo de extracción del primer molar mandibular derecho después de la cirugía, indicado por la flecha amarilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Tinción H&E. Tinción H&E del alvéolo de extracción a (A) 1 semana y (B) 4 semanas después de la cirugía. Las flechas amarillas indican el segundo molar mandibular en la proximidad de la primera cavidad de extracción molar en curación. La línea rectangular discontinua indica el área del alvéolo de extracción del primer molar en curación. Barras de escala: 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Detección de Sp7 mediante tinción IF. Esta imagen muestra la distribución de la expresión de Sp7 en las células de la médula ósea de la mandíbula del ratón y el hueso trabecular circundante bajo un estado de homeostasis (control sano), 1 semana y 4 semanas después de la cirugía, respectivamente. La línea discontinua blanca contorneaba la escala estimada del hueso trabecular. Las flechas amarillas indicaban las típicas celdas que expresan Sp7. Barras de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El modelo de curación de la cavidad murina es un método importante para desentrañar los mecanismos subyacentes en la curación y regeneración ósea, resolviendo en última instancia los desafíos clínicos. Estudios existentes han demostrado la posibilidad del modelo de extracción incisiva y del modelo de extracción de molar maxilar, mientras que los estudios no han utilizado el modelo de primer molar mandibular13,17,18. Sin embargo, los incisivos son cruciales para la vida de los roedores, y su deterioro puede ser fatal. Además, como el hueso en el maxilar es más esponjoso que la mandíbula, puede haber cierta diferencia en los mecanismos subyacentes durante el proceso de curación. Por lo tanto, es necesario establecer un modelo de extracción mandibular del primer molar factible.
La consideración más importante en la extracción dental es evitar roturas de raíces19. Los molares murinos son pequeños y vulnerables, y las raíces de residuos en la mandíbula no se pueden extraer. En este protocolo, sin embargo, el riesgo de romper la raíz existe durante toda la cirugía. Por lo tanto, es fundamental mantener el molar firmemente y controlar rigurosamente la fuerza. Para ser específicos, al eliminar la resistencia distal, uno debe tener cuidado de no arrugar la corona; al eliminar la resistencia mesial, uno debe tener cuidado para que la aguja no surja de la horquilla de la raíz; Cuando se usan agujas para representar intervalos, es importante recordar que se supone que los intervalos entre la raíz y el proceso alveolar, por lo tanto, no se debe aplicar mucha fuerza de rotación, ya que esto puede conducir a un alto riesgo de ruptura de la raíz.
La extracción del primer molar mandibular murino es ardua y necesita suficiente entrenamiento para dominar. Durante la operación, pueden ocurrir emergencias que incluyen, entre otras, las siguientes: (1) los instrumentos de extracción dental tienden a deslizarse y apuñalar los tejidos blandos debido a la movilidad de la mandíbula y la lengua, lo que puede causar sangrado leve a severo. En este caso, uno puede depositar una bola de algodón limpia y seca en la boca, liberar la banda elástica y dejar que se cierre espontáneamente por un tiempo. No se sugiere la compresión para detener el sangrado, ya que esto puede causar laceraciones y sangrado más amplios. (2) Los operadores a menudo se enfrentan a una elección binaria en la reserva de la placa ósea alveolar o la reserva de la raíz molar, ya que los primeros molares están estrechamente unidos con la mandíbula. Para aliviar esta fuerza de unión, el operador podría romper la placa ósea lingual o bucal; De lo contrario, una fuerza de rotación feroz en el zócalo conduce a que se rompan las raíces. Si uno elige preservar la placa ósea depende del objetivo de la investigación. (3) La extracción del primer molar mandibular puede ser más traumática que el primer molar maxilar o el incisivo. Sugerimos observar con escrutinio hasta que el ratón se despierte después de la cirugía. (4) La raíz mesial del segundo molar mandibular es vulnerable debido a la limitada sala de operaciones en el área bucal; A veces, incluso la corona del segundo molar puede ser destruida. Debido a que la ausencia del segundo molar no afecta la observación de la primera cicatrización del alvéolo de extracción molar, este accidente puede ser ignorado. (5) Controle de cerca la profundidad de la anestesia del ratón durante la extracción del diente, ya que este es un procedimiento doloroso tanto para humanos como para roedores. Administre agentes anestésicos según sea necesario para mantener un plano quirúrgico de anestesia hasta que se complete la extracción. Además, la presión prolongada de la banda elástica puede causar privación de oxígeno en la lengua, caracterizada por membranas pálidas. Las operaciones deben detenerse inmediatamente en tales casos, con instrumentos retirados, permitiendo que el ratón se recupere.
En conjunto, los operadores no cualificados pueden infligir inadvertidamente lesiones no intencionadas a los ratones, como se indica en el punto 1. Con el fin de garantizar la seguridad y el bienestar de todos los animales de laboratorio, se recomienda encarecidamente que se realice una amplia práctica en cadáveres murinos antes de dominar esta habilidad y realizar procedimientos vivos en ratones reales.
Aunque este protocolo proporciona un método alternativo para los investigadores que se centran en la curación y regeneración de la mandíbula, tiene varios inconvenientes. (1) La mandíbula no se puede fijar y tiene una amplia flexibilidad. Como resultado, los ascensores son difíciles de mantener un punto de acción constante en el hueso alveolar, causando algunas emergencias. (2) Los ratones machos adultos han intensificado los huesos de la mandíbula, por lo que eliminar la resistencia mesial puede ser difícil. (3) Este protocolo no se aplica a la extracción del primer molar mandibular izquierdo.
En conclusión, aunque este protocolo ha demostrado los detalles de la extracción del primer molar mandibular murino, los operadores aún necesitan mucha práctica y precaución para realizar una cirugía exitosa.
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Disclosures
Todos los datos e imágenes originales se incluyen en este documento. Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China 81825005 (L.Y.), 82201045 (F.Y.) y 82100982 (F.L.), y del Programa de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Sichuan 2021JDRC0144 (F.L.), 2022JDRC0130 (F.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23/25/26 G needle | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB1-074(IV) | |
| C57/B6J | Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China | C57/B6J | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | Cat#C1005 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST Scientific | 80106-1100-16 | |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Biosharp | BL700B | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-22-10 | |
| Masson’s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Pentobarbital Sodium | Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd | 2018042001 | |
| Rabbit polyclonal | anti-Sp7 | Abcam Cat# ab22552 | |
| Tweezers | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB2-115 |
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