Summary
Este protocolo demonstra passo-a-passo detalhes de como extrair o primeiro molar inferior no camundongo. Ele fornece um método alternativo para pesquisadores com foco na cicatrização e regeneração dos ossos maxilares.
Abstract
Este estudo introduz o desenvolvimento de um modelo de extração molar na mandíbula murina para fornecer um modelo viável para o estudo da regeneração óssea alveolar e ossificação intramembranosa. Camundongos C57/J6 foram utilizados para extrair o primeiro molar inferior para estabelecer este modelo. Eles foram sacrificados e as mandíbulas bilaterais retiradas em 1 e 4 semanas pós-cirurgia, respectivamente. Subsequente coleta estereoscópica seriada, avaliação histológica e coloração por imunofluorescência foram realizadas para demonstrar o sucesso da cirurgia. Imediatamente após a cirurgia, as imagens estereoscópicas mostraram um alvéolo de extração vazio. A hematoxilina e a eosina (H&E) em 1 semana e a coloração de Masson em 4 semanas de pós-operatório mostraram que a área da raiz original estava parcial e totalmente preenchida por trabéculas ósseas, respectivamente. A coloração por imunofluorescência mostrou que, em comparação com o lado da homeostase, a expressão de Sp7 aumentou com 1 semana de pós-operatório, sugerindo osteogênese vigorosa na fossa alveolar. Todos esses resultados demonstraram um modelo praticável de cicatrização de alvéolos para extração dentária murina. Estudos futuros revelando os mecanismos de cicatrização de defeitos maxilares ou cicatrização de alvéolos poderão adotar esse método.
Introduction
A cicatrização do alvéolo após exodontia é um cenário clínico comum, que pode resultar em complicações inconsequentes, como hemorragia alveolar, alveolite seca ou mesmo osteomielite mandibular sob cicatrização indesejável 1,2,3. Essas comorbidades podem comprometer a qualidade de vida dos pacientes e, pior ainda, desafiar vitalmente a reabilitação protética devido à perda ósseamaciça4. Embora os estágios de cicatrização do alvéolo tenham sido elucidados, eles são inadequados para direcionar o cuidado clínico pós-cirurgia de exodontia quando se deparam com vários desafios prognósticos4.
Múltiplos estudos baseados em modelos animais têm sido conduzidos para obter uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes no processo de cicatrização do alvéolo e evitar as situações acima. A Sp7 é um regulador mestre na diferenciação osteoblástica, desempenhando um papel vital no desenvolvimento do esqueleto, hemostasia ósseae regeneração óssea5,6. Modelos racionais de cicatrização de alvéolos poderiam mostrar a redundância da Sp7 pós-traumática na regeneração óssea. Além disso, diferentemente da consolidação da fratura de ossos longos, apenas um único processo osteogênico, a ossificação intramembranosa, envolve o processo de cicatrização do alvéolo deextração7. Isso torna o modelo de extração dentária animal ideal para o estudo de terapias baseadas em implantes, uma vez que a osseointegração de implantes obedece àmesma regra osteogênica8.
Há décadas, o modelo de exodontia vem sendo realizado em ratos, coelhos e cães, uma vez que essas espécies possuem dentes grandes e convenientes para operar 9,10,11. No entanto, dadas as crescentes demandas por modificação genética e como um fundo genético mais adaptativo aos seres humanos, camundongos estão sendo cada vez mais usados para estabelecer um modelo de extração dentária. A partir daí, os pesquisadores puderam desvendar o papel de uma população celular específica no processo de cicatrização usando camundongos modificados pelo genoma, em vez de observar fenótipos apenas12. Entre os modelos de alvéolos para extração dentária murina, estudos prévios demonstraram o estabelecimento e o processo de cicatrização de alvéolos de extração de dentes maxilares e incisivosmurinos 13,14,15,16. No entanto, o padrão de cicatrização do prognóstico e os momentos de detecção e observação podem diferir entre os protocolos. Isso apela para um critério universal para que os estudiosos estabeleçam um modelo de cura de alvéolos murinos.
Este estudo teve como objetivo constituir um modelo prático de cicatrização de alvéolos murinos para as questões acima. Molares mandibulares em camundongos apresentam características morfológicas distintas em relação aos molares superiores e incisivos, trazendo vantagens e desvantagens únicas. Como os modelos com foco na mandíbula murina são atualmente baseados em vácuo, este protocolo tentou fornecer um método realizado para extrair o primeiro molar inferior em camundongos. Esperamos que este protocolo ilumine os pesquisadores básicos com novas ideias para descobrir os mecanismos subjacentes da cicatrização da cavidade e indicar cuidados clínicos.
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Protocol
Todos os procedimentos em animais neste estudo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética da Escola de Estomatologia da China Ocidental, Universidade de Sichuan (WCHSIRB-D-2017-041). Camundongos adultos C57BL/6, obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais), foram utilizados para o presente estudo.
1. Preparo pré-cirúrgico
- Preparação do instrumento
- Prepare várias agulhas de seringas descartáveis (26G, 25G, 23G; ver Tabela de Materiais) para serem usadas como elevadores. Flexionar a cabeça da agulha aproximadamente 20°-40°, como mostra a Figura 1.
- Prepare pinças oftálmicas dentadas como pinças. Certifique-se de que ele se encaixa no tamanho dos molares dos ratos e pode agarrar os molares com firmeza. O tamanho ideal da pinça é mostrado na Figura 1A, B3.
- Obter um elástico (que pode ser arrancado de uma luva médica de látex) para ser usado como abridor de boca, uma placa de espuma ou cortiça como plataforma cirúrgica, um farol para iluminar a área cirúrgica e uma almofada de aquecimento para revitalização pós-operatória. Rasgue uma bola de algodão seca em pequenos pedaços e aplique-a no local cirúrgico se ocorrer sangramento durante o procedimento.
- Preparo anestésico
- O camundongo pode ser anestesiado por qualquer protocolo anestésico adequado que obtenha anestesia geral confirmada através do método de "pinça dos dedos". Após a anestesia, aplique pomada veterinária nos olhos do rato.
LEGENDA: O protocolo anestésico geral preferido poderia ser: indução e manutenção com xilazina (10 mg/kg) e cetamina (100 mg/kg) por via intraperitoneal (IP);
Para este estudo, isoflurano e pentobarbital sódico a 1% (50 mg/kg, IP) foram usados para indução e manutenção da anestesia com doses adicionais, conforme necessário.
- O camundongo pode ser anestesiado por qualquer protocolo anestésico adequado que obtenha anestesia geral confirmada através do método de "pinça dos dedos". Após a anestesia, aplique pomada veterinária nos olhos do rato.
- Preparo para Desinfecção e Esterilização
- Desinfete a plataforma de operação e a cobertura aérea ao ar livre com um pulverizador de etanol a 75%. Antes de cada procedimento com camundongo, recomenda-se o uso de um novo conjunto de agulhas descartáveis.
NOTA: As pinças dentadas são reutilizáveis e podem ser esterilizadas usando qualquer método preferido, como esterilização a vapor.
- Desinfete a plataforma de operação e a cobertura aérea ao ar livre com um pulverizador de etanol a 75%. Antes de cada procedimento com camundongo, recomenda-se o uso de um novo conjunto de agulhas descartáveis.
2. Processo cirúrgico
- Fixação do rato e sua mandíbula
- Amarre o rato a uma plataforma cirúrgica em decúbito dorsal com fita adesiva. Fixar duas agulhas de 26 G alinhadas com o plano orbital da orelha e outras duas agulhas de 26 G à vontade abaixo da mandíbula.
- Aplique o elástico ao redor das agulhas e atravesse os incisivos para manter a boca aberta. Puxe levemente a língua para fora e fixe-a sob o elástico oposto ao lado cirúrgico, para evitar que obstrua o campo de visão (Figura 1C).
- Eliminando a resistência distal
- Segure o molar com uma pinça mesialmente, force uma agulha 23 G no osso alveolar bucal da raiz distal e feche um intervalo.
NOTA: Este passo deve ser tomado com muita cautela, pois uma agulha que está embutida muito profunda provavelmente quebrará a raiz. - Em seguida, mude para uma agulha 25G para continuar a expandir o intervalo e progrida delicadamente em direção à área periapical enquanto gira lentamente a agulha para frente e lingualmente (com a posição anatômica do mouse) para pressionar a raiz para fora da fossa alveolar.
- Segure o molar com uma pinça mesialmente, force uma agulha 23 G no osso alveolar bucal da raiz distal e feche um intervalo.
- Eliminando a resistência mesial
- Quando houver espaço suficiente, use uma agulha 23 G para inserir no garfo radicular e levantar o molar oclusalmente. Depois de segurar o molar com força, pegue outra agulha 23 G e force-a na membrana periodontal mesial lingual para criar um intervalo.
- Em seguida, substitua por uma agulha de 25 G e gire lentamente para frente e bucalmente. Se algum obstáculo subjacente impedir a luxação do molar, use uma agulha 26 G para penetrar no ápice da raiz e repita as operações.
- Extração final
- Extrair o dente e, durante a extração, certifique-se de que a coroa se eleva acima do plano oclusal e que duas raízes intactas possam ser claramente vistas.
OBS: A luxação (luxação) do dente é considerada o momento mais doloroso e angustiante do procedimento. Antes da luxação do dente, a profundidade anestésica deve ser reavaliada pelo teste da pinça dos dedos dos pés e, consequentemente, uma dose moderada de um agente anestésico deve ser administrada, se necessário.
- Extrair o dente e, durante a extração, certifique-se de que a coroa se eleva acima do plano oclusal e que duas raízes intactas possam ser claramente vistas.
- Cuidados pós-operatórios
- Após a extração do dente, aplicar algodão seco para estancar o sangramento, reposicionar a língua, administrar carprofeno (5 mg/kg) por via subcutânea e colocar o camundongo em uma almofada de aquecimento em temperatura constante até a recuperação da anestesia.
3. Imagem da mandíbula do camundongo e do alvéolo de extração
- Preparação das amostras
- Eutanásia do camundongo por luxação cervical. Use tesoura oftálmica para cortar os músculos do esqueleto presos à mandíbula e ao arco zigomático. Corte da garganta ao longo da borda inferior da mandíbula até o ramo ascendente e, em seguida, para a parte posterior do côndilo e, em seguida, puxe a mandíbula para baixo e corte ao longo da linha média do incisivo inferior. Dessa forma, as duas mandíbulas separadas são colhidas.
- Realizar fixação, desmineralização e desidratação seguindo o procedimento padrão17. Ao incorporar17, certifique-se de que o plano oclusal esteja paralelo à borda do (consulte Tabela de Materiais). Fixar a mandíbula na parte inferior do, com sua borda inferior torneada (Figura 2).
OBS: Este protocolo oferece o plano sagital da região mandibular.
- Fixação da amostra no micrótomo
- Regular a pinça do corpo de prova no micrótomo para projetar o côndilo e o lado da coroa 5°-20° mais, para obter uma imagem integrada da polpa da coroa concomitante com a polpa da raiz (Figura 2).
- Preparando as seções
OBS: O côndilo é sempre a primeira estrutura anatômica a ser cortada. Quando desaparece, a área molar pode então ser cortada em várias fatias.- Mude o intervalo do micrótomo para 5 μm, colete a cada oito cortes e procure dentina na última fatia. Se a dentina da coroa aparecer pela primeira vez sem qualquer dentina apical radicular, ajuste a pinça do espécime para fazer a área da raiz se projetar, e vice-versa.
- Coletando as seções
NOTA: O ângulo de corte é adequado até que a dentina seja igualmente atingida na coroa e na área apical.- Corte nessa direção e observe as fatias ao microscópio até que a polpa dentária apareça tanto na coroa quanto nas raízes. Coletar os cortes quando aparecer um contorno obscuro de molares na superfície da amostra de parafina17.
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Representative Results
Para elucidar o uso prático desse método, o primeiro molar inferior direito de dois camundongos C57BL/6 saudáveis (3 meses de idade, ambos fêmeas) foi extraído e acompanhado por 1 semana e 4 semanas, respectivamente. As mandíbulas esquerdas não danificadas foram usadas como controles saudáveis. A Figura 1A mostra as características específicas do aparelho cirúrgico, incluindo agulhas 26-23 G e um tweezer oftálmico dentado. A agulha 26 G é removida e dobrada. A agulha de 25 G é dobrada a aproximadamente 25° no ponto. As agulhas 23G são o eixo da cirurgia e são dobradas a aproximadamente 25° e 35°, respectivamente, no ponto de identificação (Figura 1B1,B2). As pinças possuem um dente de 1 mm de comprimento que se ajusta ao formato dos molares murinos (Figura 1B3). A Figura 1C mostra o estado do camundongo antes da cirurgia. Os pontos-chave são a localização dos quatro pinos ao redor da cabeça e a fixação da língua sob o elástico à esquerda.
A Figura 3A mostra a posição e a morfologia do primeiro molar inferior direito. A Figura 3B indica o alvéolo dentário imediatamente preenchido com coágulo pós-extração. Com 1 semana e 2 semanas, os camundongos foram eutanasiados e as mandíbulas foram desmineralizadas, incluídas em parafina17 e seccionadas em cortes. A Figura 4A mostra o processo de cicatrização do alvéolo em 1 semana. Alguns ossos trabeculares semelhantes a esponjas foram formados, mas o coágulo permaneceu. No processo de cicatrização com 2 semanas (Figura 4B), o alvéolo foi totalmente preenchido com ossos esponjosos, o que significa que a regeneração foi aproximadamente completa. A coloração por imunofluorescência (IF) também corroborou os resultados da coloração histopatológica. Na Figura 5, a Sp7 estava amplamente expressa nas células da medula óssea, principalmente na margem, que é a frente formadora de osso. No estado de homeostase, os ossos trabeculares eram consistentes e confluentes, com blocos de células da medula óssea polvilhados como ilhas. No entanto, 1 semana após a cirurgia, numerosas células que expressam Sp7 preencheram o alvéolo de extração, com osso trabecular recém-formado espalhado ao redor. Em 4 semanas após a cirurgia, a condição reverteu e voltou a ser osso trabecular amplamente fundido novamente, e a atividade das células que expressam Sp7 declinou para um nível próximo ao estado de homeostase.
Figura 1: Imagens de objetos de aparelhos cirúrgicos e camundongos preparados para cirurgia. (A) Os aparelhos cirúrgicos consistiram principalmente de agulhas de 26, 25 e 23 G e um tweezer dentado. (B) As agulhas foram dobradas no ponto de corte a 20°-40° (B1,2). O dente da pinça deve ter aproximadamente 1 mm de tamanho (B3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxograma do procedimento desde a exodontia até o corte. Esta imagem exibe um fluxo esquemático da extração dentária para a secção. O primeiro molar inferior direito foi extraído de acordo com o protocolo, em seguida o camundongo foi sacrificado e a mandíbula foi colhida. Após a colheita, a mandíbula foi embebida em POM 4% por 24 h, depois embebida novamente em EDTA 10%; O líquido foi renovado todos os dias durante 14 dias. Em seguida, as amostras foram desidratadas e incluídas em parafina seguindo um protocolo universal. O lado vestibular ou lingual deve estar voltado para baixo, pois os cortes no plano sagital devem ser seccionados. Finalmente, ao fixar a amostra na braçadeira do corpo-de-prova, os lados do côndilo e da coroa devem estar 5°-20° salientes. Abreviações: POM = paraformaldeído; EDTA = ácido etilenodiaminotetra-acético. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens estereoscópicas do primeiro molar inferior de camundongos e do alvéolo de extração . (A) Imagem estereoscópica do primeiro molar inferior direito, indicada pela seta amarela. (B) O alvéolo de extração do primeiro molar inferior direito pós-operatório, indicado pela seta amarela. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Coloração H&E. Coloração H&E do alvéolo de extração em (A) 1 semana e (B) 4 semanas pós-operatório. As setas amarelas indicam o segundo molar inferior próximo à cicatrização do alvéolo de extração do primeiro molar. A linha retangular tracejada indica a área do alvéolo de extração do primeiro molar em cicatrização. Barras de escala: 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Detecção de Sp7 pela coloração de FI. Esta imagem mostra a distribuição da expressão de Sp7 nas células da medula óssea da mandíbula de camundongos e no osso trabecular circundante sob um estado de homeostase (controle saudável), 1 semana e 4 semanas após a cirurgia, respectivamente. A linha tracejada branca contornava a escala estimada do osso trabecular. As setas amarelas indicavam as células típicas que expressavam Sp7. Barras de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O modelo de cicatrização de alvéolos murinos é um método importante para desvendar os mecanismos subjacentes na cicatrização e regeneração óssea, resolvendo desafios clínicos. Estudos existentes demonstraram a possibilidade do modelo de extração de incisivos e do modelo de extração de molares superiores, enquanto estudos não utilizaram o modelo de primeiro molar inferior13,17,18. No entanto, os incisivos são cruciais para a vida dos roedores, e seu comprometimento pode ser fatal. Além disso, como o osso da maxila é mais esponjoso que a mandíbula, pode haver alguma dissimilaridade nos mecanismos subjacentes durante o processo de cicatrização. Assim, é necessário estabelecer um modelo viável de extração de primeiros molares inferiores.
A consideração mais importante na extração dentária é evitar quebras radiculares19. Os molares murinos são pequenos e vulneráveis, e as raízes residuais na mandíbula não podem ser extraídas. Nesse protocolo, no entanto, o risco de quebra de raízes existe durante toda a cirurgia. Assim, é fundamental segurar o molar com firmeza e controlar rigorosamente a força. Para ser específico, ao eliminar a resistência distal, é preciso ter cuidado para não apertar a coroa; ao eliminar a resistência mesial, é preciso ter cautela para que a agulha não surja do garfo radicular; Ao utilizar agulhas para renderizar intervalos, é importante lembrar que os intervalos são supostamente entre a raiz e o processo alveolar, portanto, não se deve aplicar muita força rotacional, pois isso pode levar a um alto risco de quebra da raiz.
A extração do primeiro molar mandibular murino é árdua e necessita de treinamento suficiente para dominar. Durante a operação, podem ocorrer emergências, incluindo, mas não se limitando a: (1) os instrumentos de extração dentária tendem a deslizar e esfaquear os tecidos moles devido à mobilidade da mandíbula e da língua, o que pode causar sangramento leve a grave. Neste caso, pode-se depositar uma bola de algodão seca e limpa na boca, soltar o elástico e deixá-lo fechar espontaneamente por um tempo. A compressão para parar o sangramento não é sugerida, pois isso pode causar lacerações e sangramentos mais amplos. (2) Os operadores são frequentemente confrontados com uma escolha binária na reserva da placa óssea alveolar ou na reserva da raiz molar, uma vez que os primeiros molares estão firmemente unidos à mandíbula. Para aliviar essa força de ligação, o operador poderia quebrar a placa óssea lingual ou bucal; caso contrário, uma força de rotação feroz no soquete leva à quebra da(s) raiz(es). A escolha ou não pela preservação da placa óssea depende do objetivo da pesquisa. (3) A extração do primeiro molar inferior pode ser mais traumática do que o primeiro molar superior ou o incisivo. Sugerimos observar com escrutínio até que o rato desperte após a cirurgia. (4) A raiz mesial do segundo molar inferior é vulnerável devido à limitação da sala de operação na área bucal; Às vezes, até mesmo a coroa do segundo molar pode ser destruída. Como a ausência do segundo molar não afeta a observação da cicatrização do alvéolo de extração do primeiro molar, esse acidente pode ser ignorado. (5) Monitorar de perto a profundidade da anestesia do camundongo durante a extração dentária, pois este é um procedimento doloroso tanto para humanos quanto para roedores. Administrar agentes anestésicos conforme necessário para manter um plano cirúrgico de anestesia até que a extração seja completa. Além disso, a pressão prolongada do elástico pode causar privação de oxigênio na língua, caracterizada por membranas pálidas. Nesses casos, as operações devem ser interrompidas imediatamente, com os instrumentos removidos, permitindo que o mouse recupere tempo.
No seu conjunto, os operadores não qualificados podem, inadvertidamente, infligir lesões não intencionais aos ratinhos, tal como indicado no ponto 1. A fim de garantir a segurança e o bem-estar de todos os animais de laboratório, é fortemente recomendado que uma ampla prática seja conduzida em cadáveres murinos antes de dominar essa habilidade e realizar procedimentos ao vivo em camundongos reais.
Embora este protocolo forneça um método alternativo para pesquisadores com foco na cicatrização e regeneração dos ossos maxilares, ele tem várias desvantagens. (1) A mandíbula não pode ser fixa e tem ampla flexibilidade. Como resultado, os elevadores são difíceis de manter um ponto de ação constante no osso alveolar, causando algumas emergências. (2) Camundongos machos adultos têm ossos da mandíbula intensificados, de modo que eliminar a resistência mesial pode ser difícil. (3) Este protocolo não se aplica à extração do primeiro molar inferior esquerdo.
Em conclusão, embora este protocolo tenha demonstrado os detalhes da extração do primeiro molar mandibular murino, os operadores ainda precisam de muita prática e cautela para realizar uma cirurgia com sucesso.
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Disclosures
Todos os dados e imagens originais estão incluídos neste artigo. Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China 81825005 (L.Y.), 82201045 (F.Y.) e 82100982 (F.L.), e pelo Programa de Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan 2021JDRC0144 (F.L.), 2022JDRC0130 (F.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23/25/26 G needle | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB1-074(IV) | |
| C57/B6J | Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China | C57/B6J | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | Cat#C1005 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST Scientific | 80106-1100-16 | |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Biosharp | BL700B | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-22-10 | |
| Masson’s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Pentobarbital Sodium | Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd | 2018042001 | |
| Rabbit polyclonal | anti-Sp7 | Abcam Cat# ab22552 | |
| Tweezers | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB2-115 |
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