Summary
Cet article décrit deux méthodes de phénotypage sans l’utilisation de peelings épidermiques pour caractériser les gènes contrôlant le développement stomatique. La première méthode montre comment analyser un phénotype stomatique à l’aide d’un épiderme végétal coloré au bleu de toluidine O. La deuxième méthode décrit comment identifier les ligands stomatiques et surveiller leurs activités biologiques.
Abstract
Les stomates sont de petits pores à la surface des plantes terrestres qui sont impliqués dans les échanges gazeux et la libération de vapeur d’eau, et leur fonction est essentielle à la productivité et à la survie des plantes. En tant que tel, la compréhension des mécanismes par lesquels les stomates se développent et se modèlent a une valeur agronomique énorme. Cet article décrit deux méthodes phénotypiques utilisant des cotylédons d’Arabidopsis qui peuvent être utilisées pour caractériser les gènes contrôlant le développement stomatique et la structuration. Les procédures d’analyse des phénotypes stomatiques à l’aide de cotylédons colorés au bleu de toluidine sont présentées en premier. Cette méthode est rapide et fiable et ne nécessite pas l’utilisation de peelings épidermiques, qui sont largement utilisés pour les analyses phénotypiques mais nécessitent une formation spécialisée. En raison de la présence de multiples résidus de cystéine, l’identification et la génération de peptides EPF bioactifs qui jouent un rôle dans le développement stomatique ont été difficiles. Ainsi, présenté en second est une procédure utilisée pour identifier les ligands stomatiques et surveiller leur activité biologique par des essais biologiques. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle produit des données reproductibles relativement facilement tout en réduisant la quantité de solution peptidique et le temps nécessaire pour caractériser le rôle des peptides dans le contrôle de la structuration et du développement stomatiques. Dans l’ensemble, ces protocoles bien conçus améliorent l’efficacité de l’étude des régulateurs stomatiques potentiels, y compris les peptides sécrétoires riches en cystéine, qui nécessitent des structures très complexes pour leur activité.
Introduction
Une structuration et une différenciation appropriées des stomates des plantes sont essentielles à leur fonction dans deux processus biologiques fondamentaux, la photosynthèse et la transpiration, et sont renforcées par les voies de signalisation des peptides EPF. Chez Arabidopsis, trois peptides riches en cystéine sécrétés, EPF1, EPF2 et STOMAGEN/EPFL9, contrôlent différents aspects du développement stomatique et sont perçus par les composants récepteurs de surface cellulaire, y compris les kinases des récepteurs de la famille ERECTA (ER, ERL1 et ERL2), les SERK et TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Cette reconnaissance conduit alors à la régulation négative des facteurs de transcription qui favorisent la différenciation stomatique par un processus dépendant du MAPK11. La découverte de ces gènes stomatiques centraux est principalement réalisée par le criblage phénotypique de mutants présentant des défauts épidermiques. Cet article présente des méthodes de phénotypage relativement simples et efficaces pour visualiser les stomates et autres cellules épidermiques, qui sont nécessaires pour identifier et caractériser les gènes potentiels contrôlant la structuration et la différenciation stomatiques.
L’observation des détails de l’épiderme de la plante a généralement été réalisée en utilisant des peelings épidermiques avec ou sans coloration avec un colorant tel que le bleu de toluidine O (TBO) ou la safranine12,13,14. Cependant, le principal défi de ces méthodes est qu’elles nécessitent une formation spécialisée pour peler l’épiderme foliaire sans déchirer les tissus et pour observer et analyser attentivement les données de motifs tout en évitant les images prises à partir de différentes parties de la feuille. Les traitements chimiques visant à nettoyer les échantillons de tissus avec des réactifs tels que les solutions d’élimination à base d’hydrate de chloral ont également été largement utilisés pour diverses gammes de matières biologiques 8,15; Ces traitements génèrent beaucoup d’informations phénotypiques en fournissant des images de haute qualité, mais nécessitent également l’utilisation de produits chimiques dangereux (par exemple, le formaldéhyde, l’hydrate de chloral). Cet article présente d’abord une méthode de phénotypage relativement simple et pratique qui produit des images suffisantes pour l’analyse quantitative, mais ne nécessite pas l’utilisation de produits chimiques dangereux et de pelures de feuilles épidermiques pour la préparation de l’échantillon. Un épiderme de cotylédon coloré au TBO est également idéal pour l’étude du développement stomatique car l’absence de trichomes et le gradient de développement plus petit chez les cotylédons permettent une interprétation simple et traitable des phénotypes épidermiques.
Les peptides EPF stomatiques appartiennent au groupe des peptides riches en cystéine spécifiques aux plantes qui ont des tailles matures relativement grandes et des liaisons disulfures intramoléculaires entre les résidus de cystéine conservés. Un repliement conformationnel correct est essentiel pour leur fonction biologique, mais les peptides riches en cystéine, qui sont produits par synthèse chimique ou par un système de recombinaison hétérologue, peuvent être inactifs et sont un mélange de peptides correctement repliés et dépliés 3,7,16. Ainsi, le criblage des peptides bioactifs qui jouent un rôle dans le contrôle du développement stomatique a été une tâche très difficile. Ce manuscrit décrit en outre un essai biologique pour une meilleure identification et caractérisation des peptides stomatiques bioactifs. Dans cette méthode, les plantules d’Arabidopsis sont cultivées dans une plaque multipuits contenant des milieux avec et sans peptides potentiels pendant 6-7 jours. Ensuite, l’épiderme cotylédon est visualisé à l’aide d’un microscope confocal. En général, pour visualiser clairement l’activité biologique des peptides potentiels dans le développement stomatique, les génotypes qui produisent plus ou moins de cellules de lignée stomatiques, tels que le mutant epf2, qui produit plus de cellules épidermiques, et la lignée STOMAGEN-ami, qui confère une densité cellulaire épidermique réduite 2,4,5, sont utilisés en plus du contrôle Arabidopsis de type sauvage (Col-0) pour les essais biologiques.
Dans l’ensemble, les deux protocoles présentés ici peuvent être utilisés pour l’évaluation rapide et efficace de divers phénotypes épidermiques et pour le criblage de petits peptides et hormones qui jouent un rôle dans le contrôle de la structuration et du développement stomatiques.
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Protocol
1. Coloration des cotylédons d’Arabidopsis avec TBO
- Stérilisation des semences et conditions de croissance
- Stériliser ~30 graines d’Arabidopsis par génotype dans un tube microcentrifuge en ajoutant 1 mL d’une solution de stérilisation des graines (33 % d’eau de Javel commerciale, 0,1 % de Triton X-100) et bercer doucement pendant 10 à 12 minutes à température ambiante (RT).
REMARQUE : Stériliser ~30 graines de l’accession Columbia (Col-0) d’Arabidopsis de type sauvage et/ou ~60 graines de plantes transgéniques portant un gène chimiquement inductible (p. ex., Est::EPF27) pour utiliser des semis transgéniques cultivés sur 1/2 plaques de Murashige et de Skoog (MS) (2,16 g/L contenant 0,8 % de gélose [p/v]) sans inducteur (p. ex. β-estradiol) comme témoins (figure 1 et figure 2). - Retirez la solution de stérilisation, lavez les graines quatre fois avec 1 mL d’eau stérile dans une hotte à flux laminaire et remettez-les en suspension dans ~200 μL de gélose stérile à 0,1%.
- Semez ~30 graines par génotype sur des plaques de gélose 1/2 MS ou 1/2 plaques de gélose MS contenant un inducteur (p. ex., 10 μM β-estradiol) pour l’induction chimique du transgène (p. ex., Est::EPF27) à l’aide d’une pipette, et scellez avec du ruban microporeux.
REMARQUE: Les graines doivent être réparties uniformément sur l’assiette pour éviter de les placer à proximité, car cela empêcherait les plantules de pousser uniformément. - Stratifier les graines en plaçant les plaques à 4 °C sans lumière pendant 3 à 5 jours pour synchroniser la germination.
- Après stratification, incuber les plaques dans une chambre de croissance à 22 °C sous 120 μmol·m−2·s−1 lumière avec une photopériode de 16 h de lumière et 8 h d’obscurité pendant 10 jours.
- Stériliser ~30 graines d’Arabidopsis par génotype dans un tube microcentrifuge en ajoutant 1 mL d’une solution de stérilisation des graines (33 % d’eau de Javel commerciale, 0,1 % de Triton X-100) et bercer doucement pendant 10 à 12 minutes à température ambiante (RT).
- Échantillonnage et coloration TBO des cotylédons d’Arabidopsis
- 10 jours après la germination, sélectionner et découper soigneusement l’un des cotylédons des plantules individuelles qui poussent uniformément avec les autres plantules dans l’assiette pour limiter la variabilité.
NOTE: Les cotylédons sont échantillonnés à partir de plantules âgées de 10 jours parce qu’ils n’ont pas de trichomes et de cellules épidermiques immatures, ce qui simplifie l’interprétation des phénotypes épidermiques. - Placer chaque cotylédon dans un tube à microcentrifugation contenant 1 mL d’une solution de fixation (éthanol 9:1 pour acide acétique) à l’aide d’une pince, et laisser l’échantillon dans la solution de fixation pendant la nuit, au moins et à température ambiante.
REMARQUE: Les échantillons peuvent ensuite être stockés jusqu’à quelques années dans cet état. L’image Figure 2E a été prise à partir d’un échantillon de cotylédon qui a été stocké dans une solution de fixation pendant plus de 3 ans. Il est important de conserver le cotylédon dans une solution de fixation immédiatement après la coupe et de ne pas placer plus de cinq cotylédons dans chaque tube microcentrifuge pour une préparation homogène de l’échantillon par la suite. - Retirer la solution fixatrice et ajouter 1 mL d’éthanol à 70 %. Après avoir retourné le tube plusieurs fois, laissez le tube contenant les échantillons à TA pendant ~ 30 min.
- Répétez l’étape 1.2.3 en utilisant 1 mL d’éthanol à 50 %, puis 20 % d’éthanol.
- Remplacez le 1 mL d’éthanol à 20 % par 1 mL d’eau distillée, puis laissez le tube contenant les échantillons de cotylédon pendant ~30 minutes après avoir retourné le tube plusieurs fois.
NOTE: Les échantillons peuvent rester dans de l’eau distillée pendant plus de 24 heures, mais cela n’est pas recommandé pour obtenir des images de bonne qualité (images bien colorées pour différents types de cellules épidermiques) pour une analyse quantitative. - Retirez toute l’eau distillée du tube. Ensuite, ajouter immédiatement ~200 μL de solution de coloration TBO (0,5% TBO dansH2O, filtré) pendant ~2 min.
REMARQUE: Assurez-vous que chaque échantillon de cotylédon est exposé uniformément à la solution de TBO en agitant doucement les tubes pendant l’incubation. Pour éviter la surcoloration avec TBO (le moment de la coloration est essentiel et peut être variable pour chaque génotype), ne traitez pas plus de six tubes contenant des échantillons à la fois. - Retirez la solution de coloration TBO aussi soigneusement que possible, puis lavez immédiatement les échantillons plusieurs fois en ajoutant 1 mL d’eau distillée fraîche.
- 10 jours après la germination, sélectionner et découper soigneusement l’un des cotylédons des plantules individuelles qui poussent uniformément avec les autres plantules dans l’assiette pour limiter la variabilité.
- Imagerie et analyse de données
- Prenez une lame de microscope et ajoutez une goutte de glycérol à 15% (~ 50 μL). Placez le cotylédon avec la face abaxiale vers le haut dans 15% de glycérol sur la lame à l’aide d’une pince fine. Ensuite, couvrez-le délicatement avec une lamelle de couverture afin que les bulles d’air formées puissent être éliminées de l’échantillon.
- Imagez la face abaxiale de l’épiderme du cotylédon à l’aide d’un microscope à fond clair (Figure 1 et Figure 2), puis examinez le phénotype épidermique en comptant le nombre de stomates et d’autres types de cellules épidermiques.
- Pour chaque génotype, calculer le phénotype épidermique à l’aide des formules suivantes décrites par Jangra et coll.17 :
Indice stomatique (%) = (Nombre de stomates/Nombre total de cellules épidermiques) × 100
Densité stomatique (mm−2) = Nombre de stomates/surface (mm2)
REMARQUE : Imager au moins huit cotylédons (N = 8) pour chaque génotype, et documenter le phénotype épidermique de chaque génotype en le comparant au phénotype de la plante de type sauvage et/ou des plantes transgéniques exprimant un transgène chimiquement inductible cultivé sans inducteur.
2. Bioessais pour les peptides stomatiques
REMARQUE : La procédure pour les essais biologiques est illustrée à la figure 3.
- Stérilisation des semences et conditions de croissance
- Stériliser ~25 graines pour chaque traitement comme ci-dessus, et semer environ la moitié des graines sur chacune des deux plaques de gélose 1/2 MS dans une hotte à flux laminaire.
REMARQUE : Utiliser le génotype avec des cellules épidermiques hautes et/ou basses (p. ex., epf22) au lieu d’utiliser un fond de type sauvage (p. ex., Col-0) pour détecter facilement les activités biologiques des peptides sur la structuration et la différenciation des cellules épidermiques (Figure 4). - Stratifier les graines pendant 3 jours à 4 °C dans l’obscurité.
- Sortir chacune des deux plaques à ~10 h d’intervalle, et incuber les graines sur des plaques à 22 °C sous 120 μmol·m−2·s−1 lumière avec une photopériode de 16 h de lumière et 8 h d’obscurité pendant 1 jour.
- Stériliser ~25 graines pour chaque traitement comme ci-dessus, et semer environ la moitié des graines sur chacune des deux plaques de gélose 1/2 MS dans une hotte à flux laminaire.
- Traitement peptidique et imagerie
- Dans une hotte à flux laminaire, transplanter soigneusement 10 à 12 plantules d’Arabidopsis âgées d’un jour de chacune des deux plaques préparées dans une plaque de 24 puits contenant 1,5 ml de milieu liquide 1/2 MS dans chaque puits (~20 plantules par puits).
REMARQUE: Le moment du traitement peptidique pour les plantules est essentiel aux résultats phénotypiques du traitement peptidique, alors préparez les graines sur deux plaques distinctes pour obtenir deux stades de développement différents des plantules pour le traitement. - Ajouter soit un tampon seul (50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) ou deux concentrations différentes du peptide (généralement, 1 μM et 2,5 μM peptide dans 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) à chaque puits contenant ~20 plantules d’Arabidopsis d’un jour germées sur des plaques de gélose 1/2 MS.
REMARQUE: Retirez les aliquotes de la solution peptidique d’un congélateur et conservez-les à TA pendant quelques minutes avant le traitement. Les peptides conservés dans un congélateur à −80 °C sont stables pendant quelques années, mais les cycles de congélation-dégel doivent être évités en stockant la solution peptidique dans de petites aliquotes. - Après avoir mélangé délicatement les plantules avec un tampon seul ou une solution peptidique à l’aide d’une pipette, scellez la plaque avec du ruban microporeux. Incuber la plaque d’essai dans des conditions de longue journée (photopériode de 16 h, 120 μmol·m−2·s−1 lumière) pendant 5-7 jours à 22 °C.
REMARQUE: Empêcher les plantules de pousser trop près les unes des autres pour permettre à chaque plantule d’avoir une exposition uniforme à la solution peptidique. Tournez doucement la plaque pendant 2-3 h avant d’incuber la plaque dans une chambre de croissance pour augmenter l’aération. - Transférer chaque plantule du puits contenant soit du tampon seul, soit du peptide sur une lame de couverture, et disséquer le cotylédon de la plantule. Placez la face abaxiale du cotylédon à l’aide d’une pince et coupez-la en petits morceaux.
- Prenez une autre lame de microscope propre et placez-y une goutte de solution d’iodure de propidium (~25 μL, 2 mg/mL dansH2O).
- Placer l’un des petits morceaux de cotylédon dans une goutte de solution d’iodure de propidium à l’aide d’une pince et placer délicatement le couvercle. Appliquer une solution supplémentaire d’iodure de propidium sur le bord de la lamelle de couverture pour éliminer les bulles d’air qui se sont formées.
- Imagez la face abaxiale du cotylédon à l’aide d’un microscope confocal et comparez les images avec les images des plantules cultivées dans un milieu 1/2 MS contenant uniquement un tampon.
NOTE: Les images présentées à la figure 4 ont été prises à partir de plantules de type sauvage Col-0 ou epf22,5 qui ont été traitées avec un tampon uniquement (Figure 4A, B) ou deux lots de solution peptidique EPF2 (Figure 4C-F) et ont été stockées à -80 °C pendant 1 an.
- Dans une hotte à flux laminaire, transplanter soigneusement 10 à 12 plantules d’Arabidopsis âgées d’un jour de chacune des deux plaques préparées dans une plaque de 24 puits contenant 1,5 ml de milieu liquide 1/2 MS dans chaque puits (~20 plantules par puits).
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Representative Results
Diverses plantes et mutants stomatiques transgéniques connus pour avoir une densité stomatique et un regroupement inférieurs ou supérieurs (epf2 2,5, epf1 epf2 2,5, tmm12, une lignée 4 silencieuse STOMAGEN, et des lignées transgéniques portant la surexpression estradiol-inductible Est::EPF1 ou Est::EPF2 construction7 ) ont été utilisés pour démontrer l’efficacité des deux analyses phénotypiques présentées ici, qui visaient à identifier et à caractériser les gènes qui jouent un rôle dans le développement et la structuration stomatique. Afin de produire des images épidermiques de haute qualité sans avoir besoin de peelings épidermiques pour quantifier les différents types de cellules épidermiques à analyser, il est essentiel de préajuster le temps de coloration de l’échantillon avec TBO pour chaque génotype, car chacun peut avoir des phénotypes épidermiques différents par rapport à celui du témoin de type sauvage (Col-0) (Figure 1A et Figure 2A). D’après l’expérience, les génotypes avec moins de stomates nécessitent des temps de coloration plus longs avec le TBO (Figure 1B et Figure 2D,E), tandis que les génotypes avec plus de stomates et de clusters nécessitent des temps de coloration plus courts (Figure 1C et Figure 2B,C). Comme des quantités variables de peptides correctement repliés dans la solution peptidique totale peuvent masquer l’activité biologique des peptides dans le développement stomatique, il est recommandé d’utiliser des concentrations totales supplémentaires plus élevées de la solution peptidique (par exemple, 2,5 μM EPF2), ainsi que des génotypes qui ont moins ou plus de phénotypes stomatiques (par exemple, epf2), pour les essais biologiques. L’activité des peptides EPF2, qui jouent un rôle dans l’inhibition de l’initiation stomatique, a été facilement détectée en utilisant des mutants EPF2 avec plus de cellules épidermiques que Col-0, même si certains lots des peptides EPF2 préparés contenaient de plus petites quantités des formes bioactives du peptide (par exemple, solution peptidique EPF2 lot 1 dans la figure 4).
Figure 1 : Effet du temps d’incubation avec TBO sur les génotypes présentant différents phénotypes épidermiques. Images de cotylédons abaxiaux provenant de plantules âgées de 10 jours de trois génotypes d’Arabidopsis: (A) de type sauvage (Col-0), (B) une lignée silencieuse STOMAGEN (STOMAGEN-ami) et (C) des mutants epf1 epf2. Col-0 représente le contrôle d’Arabidopsis de type sauvage, et la lignée STOMAGEN-silencieuse et les mutants epf1 epf2 représentent les génotypes avec un nombre faible et élevé de stomates, respectivement. Les images ont été prises à l’aide d’un microscope inversé avec une lentille d’objectif 20x (champ de vision de 0,35 mm2). La qualité des images était variable, bien que tous les échantillons de cotylédons des différents génotypes aient été colorés avec TBO (0,5% TBO dansH2O) pendant la même durée (2 min) avant l’imagerie. Par conséquent, pour obtenir des images bien colorées pour l’analyse, il est important de prédéterminer le temps de coloration TBO adéquat pour chaque génotype. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images de l’épiderme colorées au TBO sans l’utilisation de peelings épidermiques pour l’analyse quantitative. Des images représentatives de l’épiderme de cotylédons provenant de plantules âgées de 10 jours de lignées transgéniques (A) de type sauvage (Col-0), (B) tmm et (C,D) portant une construction de surexpression EPF2 inductible par l’œstradiol (Est::EPF2) ou (E) EPF1 (Est::EPF1) peuvent être utilisées pour l’analyse quantitative du phénotype épidermique. Un cotylédon dans une solution de fixation pendant plus de 3 ans a été utilisé pour prendre l’image présentée en (E). Les images ont été prises à l’aide d’un microscope inversé avec une lentille d’objectif 20x (champ de vision de 0,35 mm2). Les cellules ont été soulignées par coloration TBO, et la moitié de la largeur des images en taille réelle est présentée pour l’affichage. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Procédure pour les essais biologiques. (A) Les graines sont semées sur deux plaques de gélose 1/2 MS et retirées à intervalles de 10 heures. (B) Les plantules d’Arabidopsis âgées de 1 jour sont transplantées dans des plaques de 24 puits contenant 1/2 milieu MS avec des concentrations peptidiques fictives ou différentes. (C) Après 5-7 jours, les plantules sont prêtes pour l’imagerie afin de déterminer l’activité biologique des peptides dans le développement stomatique et la structuration. (D) Une tranche de cotylédon est placée dans une goutte de solution d’iodure de propidium sur une lame de microscope pour l’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Microscopie confocale de l’épiderme abaxial des cotylédons d’Arabidopsis après traitement peptidique. Images confocales représentatives de (A) épiderme de cotylédon de type sauvage et (B) d’épiderme de cotylédon epf2 cultivé pendant 6-7 jours dans une solution tampon et d’un épiderme de cotylédon (C-F) epf2 cultivé avec deux lots différents de peptides EPF2. Les images ont été prises à l’aide d’un microscope confocal utilisant une lentille d’objectif 40x (excitation de 561 nm et filtre d’émission passe-long de 561 nm) pour capturer la coloration à l’iodure de propidium et visualiser les contours des cellules. Chaque solution peptidique EPF2 préparée contient différentes quantités de formes correctement repliées (bioactives) et mal repliées (inactives) des peptides. Par conséquent, pour le criblage initial des peptides ayant un rôle potentiel dans le développement stomatique, il est recommandé d’utiliser deux concentrations différentes des solutions peptidiques totales comme indiqué pour les essais biologiques. Barre d’échelle = 30 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les deux méthodes d’analyse phénotypique pour identifier et caractériser les gènes contrôlant la structuration et la différenciation stomatiques présentées ici sont des tests pratiques et fiables puisque les protocoles ne nécessitent pas l’utilisation de peelings épidermiques et d’équipement spécialisé (qui prennent beaucoup de temps et nécessitent une formation spéciale pour la préparation des échantillons) mais produisent des images de haute qualité pour l’analyse quantitative des phénotypes épidermiques.
Une limite de cette technique pour l’analyse phénotypique à l’aide de cotylédons d’Arabidopsis colorés au TBO est que l’obtention d’images de haute qualité avec contraste visuel pour différents types de cellules épidermiques dépend du temps de coloration et des caractéristiques uniques du tissu, qui peuvent être à la fois dépendantes de l’espèce et du génotype (Figure 1)18 . D’autres méthodes de phénotypage pour observer les cellules épidermiques à l’aide de peelings épidermiques présentent les mêmes défis, et elles nécessitent également plus de temps et une formation spéciale. Les difficultés à obtenir des images de l’épiderme correctement colorées et suffisantes pour l’analyse des données peuvent être évitées en colorant les cotylédons de génotypes avec moins de stomates pendant de plus longues périodes et les échantillons de génotypes avec plus de stomates pendant des périodes plus courtes. Le temps de coloration pour chaque génotype peut également être ajusté en vérifiant d’abord seulement quelques échantillons afin d’optimiser le temps de coloration pour les génotypes ayant des phénotypes épidermiques similaires.
L’obtention d’une quantité suffisante de peptides bioactifs bien repliés, en particulier de peptides riches en cystéine (qui sont des ligands ayant diverses fonctions dans le contrôle du développement des plantes, y compris la structuration stomatique), a été un défi 1,2,3,4,5,6,19,20,21,22,23 . En outre, même si des peptides bioactifs sont générés, le criblage de peptides qui ont des fonctions potentielles dans des processus biologiques spécifiques est une autre tâche difficile car les peptides bioactifs produits sont souvent un mélange de peptides bien repliés, actifs et inactifs. Cet article présente une méthode d’essai biologique efficace pour découvrir et caractériser des peptides stomatiques potentiels. Cette méthode a permis d’identifier divers peptides importants qui contrôlent différents aspects du développement stomatique chez Arabidopsis, ainsi que chez l’herbe Brachypodium 3,4,7,17. Cependant, la principale limitation de cette technique est la variabilité des réponses phénotypiques, qui se produit très probablement en raison de l’utilisation de plantules avec des stades de développement légèrement différents et des solutions peptidiques contenant différentes quantités de peptides bioactifs. Les premières tentatives de cette méthode impliquaient le placement de graines de type sauvage directement dans les puits d’une plaque contenant une solution peptidique après stratification. Sans l’utilisation de génotypes qui ont plus ou moins de cellules épidermiques (p. ex. epf2 2, Figure 4) et des plantules d’Arabidopsis âgées de 1 jour germées sur des plaques de gélose MS 1/2, un nombre plus faible de plantules sont capables de croître et de montrer des réponses phénotypiques claires après l’application de peptides. Dans ce protocole, le problème de variabilité a été résolu en utilisant ~20 plantules d’Arabidopsis âgées d’un jour avec deux stades de développement différents et en utilisant deux concentrations différentes de solution peptidique (1 μM et 2,5 μM).
Les phénotypes épidermiques des échantillons traités au peptide peuvent également être analysés par la première méthode d’analyse phénotypique présentée à l’aide d’échantillons colorés au TBO. Cette méthode permet une analyse phénotypique quantitative relativement facile car une zone relativement grande de chaque échantillon peut être analysée. De plus, cette méthode offre une flexibilité dans la préparation des échantillons après la récolte des échantillons préparés dans les mêmes conditions pour l’imagerie. Cependant, les images prises par cette méthode ne sont généralement pas de la plus haute qualité. D’autre part, l’imagerie confocale après coloration à l’iodure de propidium donne des images de meilleure qualité avec des détails épidermiques. Cependant, cette méthode ne permet de se concentrer que sur une petite zone de tissu pour l’analyse. De plus, seul un certain nombre de tissus vivants préparés peuvent être analysés à la fois.
En conclusion, l’analyse phénotypique présentée ici peut être utilisée pour l’examen rapide et efficace des gènes potentiels contrôlant la structuration et la différenciation stomatiques, améliorant ainsi la compréhension des mécanismes du développement stomatique et de la fonction peptidique. En outre, ce protocole d’essai biologique peut être utilisé pour identifier d’autres petites molécules qui jouent un rôle dans la structuration des tissus épidermiques et comme méthode de criblage initial pour déterminer la structure de peptides bioactifs bien repliés.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée dans le cadre du Programme de découverte du Conseil de recherches en ressources naturelles et en génie du Canada (CRSNG) et de l’Université Concordia. K.B. est soutenu par la National Overseas Scholarship de l’Inde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
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