Summary
Detta dokument beskriver två fenotypningsmetoder utan användning av epidermal peeling för att karakterisera generna som styr stomatal utveckling. Den första metoden visar hur man analyserar en stomatal fenotyp med användning av en toluidinblå O-färgad växtepidermis. Den andra metoden beskriver hur man identifierar stomatalligander och övervakar deras biologiska aktiviteter.
Abstract
Stomata är små porer på ytan av markväxter som är involverade i gasutbyte och utsläpp av vattenånga, och deras funktion är avgörande för växtproduktivitet och överlevnad. Som sådan har förståelse för mekanismerna genom vilka stomata utvecklas och mönster enormt agronomiskt värde. Denna artikel beskriver två fenotypiska metoder med Arabidopsis cotyledons som kan användas för att karakterisera generna som styr stomatal utveckling och mönstring. Först presenteras procedurer för analys av stomatalfenotyperna med användning av toluidinblå O-färgade cotyledoner. Denna metod är snabb och tillförlitlig och kräver inte användning av epidermal peeling, som ofta används för fenotypiska analyser men kräver specialutbildning. På grund av närvaron av flera cysteinrester har identifieringen och genereringen av bioaktiva EPF-peptider som har en roll i stomatal utveckling varit utmanande. Således presenteras andra är ett förfarande som används för att identifiera stomatalligander och övervaka deras biologiska aktivitet genom bioanalyser. Den största fördelen med denna metod är att den producerar reproducerbara data relativt enkelt samtidigt som mängden peptidlösning minskar och den tid som krävs för att karakterisera peptidernas roll för att kontrollera stomatalmönster och utveckling. Sammantaget förbättrar dessa väl utformade protokoll effektiviteten för att studera de potentiella stomatalregulatorerna, inklusive cysteinrika sekretoriska peptider, som kräver mycket komplexa strukturer för deras aktivitet.
Introduction
Korrekt mönstring och differentiering av växtstomatan är avgörande för deras funktion i två grundläggande biologiska processer, fotosyntes och transpiration, och verkställs av EPF-peptidsignalvägar. I Arabidopsis kontrollerar tre utsöndrade cysteinrika peptider, EPF1, EPF2 och STOMEN / EPFL9, olika aspekter av stomatal utveckling och uppfattas av cellytereceptorkomponenter, inklusive ERECTA-familjens receptorkinaser (ER, ERL1 och ERL2), SERKs och TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Detta erkännande leder sedan till nedreglering av transkriptionsfaktorerna som främjar stomatal differentiering genom en MAPK-beroende process11. Upptäckten av dessa kärnstomatalgener uppnås främst genom fenotypisk screening av mutanter som uppvisar epidermala defekter. Denna artikel presenterar relativt enkla och effektiva fenotypningsmetoder för visualisering av stomata och andra epidermala celler, som krävs för att identifiera och karakterisera de potentiella generna som styr stomatalmönster och differentiering.
Observationen av detaljerna i växtens epidermis har vanligtvis uppnåtts genom att använda epidermala skal med eller utan färgning med ett färgämne såsom toluidinblått O (TBO) eller safranin12,13,14. Den största utmaningen med dessa metoder är dock att de kräver specialiserad träning för att skala bladepidermis utan att riva vävnaderna och att noggrant observera och analysera mönsterdata samtidigt som man undviker bilderna från olika delar av bladet. Kemiska behandlingar för att rensa vävnadsproverna med reagenser såsom klorhydratbaserade clearinglösningar har också använts i stor utsträckning för ett brett spektrum av biologiska material 8,15; Dessa behandlingar genererar en hel del fenotypisk information genom att tillhandahålla högkvalitativa bilder men kräver också användning av farliga kemikalier (t.ex. formaldehyd, klorhydrat). Detta dokument presenterar först en relativt enkel och bekväm fenotypningsmetod som ger bilder som är tillräckliga för kvantitativ analys men kräver inte användning av farliga kemikalier och epidermala bladskal för provberedningen. En TBO-färgad cotyledon-epidermis är också idealisk för studier av stomatal utveckling eftersom bristen på trikomer och den mindre utvecklingsgradienten i cotyledoner möjliggör en enkel och lätthanterlig tolkning av epidermala fenotyper.
Stomatal EPF-peptider tillhör gruppen växtspecifika, cysteinrika peptider som har relativt stora mogna storlekar och intramolekylära disulfidbindningar mellan konserverade cysteinrester. Korrekt konformationsveckning är avgörande för deras biologiska funktion, men cysteinrika peptider, som produceras genom antingen kemisk syntes eller ett heterologt rekombinationssystem, kan vara inaktiva och är en blandning av både korrekt veckade och oveckade peptider 3,7,16. Således har screening av bioaktiva peptider som har en roll för att kontrollera stomatal utveckling varit en mycket utmanande uppgift. Detta manuskript beskriver dessutom en bioassay för bättre identifiering och karakterisering av bioaktiva stomatalpeptider. I denna metod odlas Arabidopsisplantor i en flerbrunnsplatta innehållande media med och utan potentiella peptider i 6-7 dagar. Därefter visualiseras cotyledon-epidermis med hjälp av ett konfokalmikroskop. I allmänhet, för att tydligt visualisera den biologiska aktiviteten hos potentiella peptider i stomatal utveckling, används genotyperna som producerar mer och / eller mindre stomatala linjeceller, såsom epf2-mutanten, som producerar fler epidermala celler, och STOMAGEN-ami-linjen, som ger minskad epidermal celldensitet 2,4,5, förutom vildtypskontrollen Arabidopsis (Col-0) för bioanalyserna.
Sammantaget kan de två protokollen som presenteras här användas för snabb och effektiv bedömning av olika epidermala fenotyper och för screening av små peptider och hormoner som har en roll i att kontrollera stomatal mönstring och utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Färgning av Arabidopsis-kotyledoner med TBO
- Frösterilisering och tillväxtförhållanden
- Sterilisera ~ 30 Arabidopsisfrön per genotyp i ett mikrocentrifugrör genom att tillsätta 1 ml av en frösteriliseringslösning (33% kommersiell blekmedel, 0,1% Triton X-100) och skaka försiktigt i 10-12 minuter vid rumstemperatur (RT).
OBS: Sterilisera ~ 30 frön av vildtyp Arabidopsis anslutning Columbia (Col-0) och / eller ~ 60 frön av transgena växter som bär en kemiskt inducerbar gen (t.ex. Est:: EPF27) för att använda transgena plantor odlade på 1/2 Murashige och Skoog (MS) plattor (2,16 g / L innehållande 0,8% agar [w / v]) utan inducerare (t.ex. β-östradiol) som kontroller (figur 1 och figur 2). - Ta bort steriliseringslösningen, tvätta fröna fyra gånger med 1 ml sterilt vatten i en laminär flödeshuv och återsuspendera dem i ~ 200 μL steril 0,1% agar.
- Så ~30 frön per genotyp på 1/2 MS-agarplattor eller 1/2 MS-agarplattor innehållande en inducerare (t.ex. 10 μM β-östradiol) för kemisk induktion av transgenen (t.ex. Est::EPF27) med hjälp av en pipett och försegla med mikroportejp.
OBS: Fröna måste fördelas jämnt på plattan för att undvika att placera dem i närheten, eftersom detta förhindrar att plantorna växer jämnt. - Stratifiera fröna genom att placera plattorna vid 4 °C utan ljus i 3-5 dagar för att synkronisera groningen.
- Efter stratifiering inkuberas plattorna i en tillväxtkammare vid 22 °C under 120 μmol·m−2·s−1 ljus med en fotoperiod på 16 timmar ljus och 8 timmar mörkt i 10 dagar.
- Sterilisera ~ 30 Arabidopsisfrön per genotyp i ett mikrocentrifugrör genom att tillsätta 1 ml av en frösteriliseringslösning (33% kommersiell blekmedel, 0,1% Triton X-100) och skaka försiktigt i 10-12 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Provtagning och TBO-färgning av Arabidopsis cotyledons
- Vid 10 dagar efter spiring, välj noggrant och klipp ut en av kotyledonerna från de enskilda plantorna som växer jämnt med andra plantor på plattan för att begränsa variationen.
OBS: Cotyledoner provtas från 10 dagar gamla plantor eftersom de inte har trikomer och omogna epidermisceller, vilket förenklar tolkningen av epidermala fenotyper. - Placera varje kotyledon i ett mikrocentrifugrör innehållande 1 ml fixeringslösning (9:1 etanol till ättiksyra) med pincett och lämna provet i fixeringslösningen över natten, åtminstone och vid rumstemperatur.
OBS: Proverna kan sedan lagras i upp till ett par år i detta tillstånd. Bilden Figur 2E togs från ett cotyledonprov som lagrades i fixeringslösning i över 3 år. Det är viktigt att förvara hjärtbladen i en fixeringslösning omedelbart efter skärning och att placera högst fem kotyledoner i varje mikrocentrifugrör för homogen provberedning senare. - Ta bort fixeringslösningen och tillsätt 1 ml 70% etanol. Efter att ha inverterat röret ett par gånger, lämna röret som innehåller proverna vid RT i ~ 30 minuter.
- Upprepa steg 1.2.3 med 1 ml 50% etanol och sedan 20% etanol.
- Byt ut 1 ml 20% etanol med 1 ml destillerat vatten och lämna sedan röret som innehåller cotyledonproverna i ~ 30 minuter efter att röret har vänts några gånger.
OBS: Proverna kan stanna i destillerat vatten i mer än 24 timmar, men detta rekommenderas inte för att få bilder av god kvalitet (välfärgade bilder för olika epidermala celltyper) för kvantitativ analys. - Ta bort allt destillerat vatten från röret. Tillsätt sedan omedelbart ~ 200 μL TBO-färgningslösning (0,5% TBO iH2O, filtrerad) i ~ 2 minuter.
OBS: Se till att varje cotyledonprov är jämnt exponerat för TBO-lösning genom att försiktigt snärta rören under inkubationen. För att förhindra överfärgning med TBO (tidpunkten för färgningen är avgörande och kan variera för varje genotyp), bearbeta inte mer än sex rör som innehåller prover åt gången. - Ta bort TBO-färgningslösningen så noggrant som möjligt och tvätta sedan omedelbart proverna ett par gånger genom att tillsätta 1 ml färskt destillerat vatten.
- Vid 10 dagar efter spiring, välj noggrant och klipp ut en av kotyledonerna från de enskilda plantorna som växer jämnt med andra plantor på plattan för att begränsa variationen.
- Bildbehandling och dataanalys
- Ta ett mikroskopglas och tillsätt en droppe 15% glycerol (~ 50 μL). Placera cotyledonen med den abaxiella sidan upp i 15% glycerol på glaset med fina pincett. Täck den sedan försiktigt med ett täckglas så att eventuella luftbubblor som bildas kan avlägsnas från provet.
- Avbildning av den abaxiella sidan av cotyledonepidermis med hjälp av ett ljusfältmikroskop (figur 1 och figur 2) och undersök sedan den epidermala fenotypen genom att räkna antalet stomata och andra epidermala celltyper.
- För varje genotyp beräknas den epidermala fenotypen med hjälp av följande formler som beskrivs av Jangra et al.17:
Stomatalindex (%) = (Antal klyvöppningar/Totalt antal epidermala celler) × 100
Stomatal densitet (mm−2) = Antal klyvöppningar/areor (mm2)
OBS: Avbildning minst åtta kotyledoner (N = 8) för varje genotyp och dokumentera den epidermala fenotypen för varje genotyp genom att jämföra den med fenotypen för vildtypsväxten och / eller transgena växter som uttrycker en kemiskt inducerbar transgen odlad utan inducerare.
2. Bioassays för stomatalpeptider
OBS: Förfarandet för bioassays visas i figur 3.
- Frösterilisering och tillväxtförhållanden
- Sterilisera ~ 25 frön för varje behandling enligt ovan och så ungefär hälften av fröna på var och en av två 1/2 MS-agarplattor i en laminär flödeshuv.
OBS: Använd genotypen med höga och / eller låga epidermala celler (t.ex. epf22) istället för att använda en vildtypbakgrund (t.ex. Col-0) för att enkelt detektera peptidernas biologiska aktiviteter på epidermal cellmönstring och differentiering (figur 4). - Stratifiera fröna i 3 dagar vid 4 °C i mörker.
- Ta ut var och en av de två plattorna med ~10 timmars mellanrum och inkubera fröna på plattorna vid 22 °C under 120 μmol·m−2·s−1 ljus med en fotoperiod på 16 timmar ljus och 8 timmar mörkt i 1 dag.
- Sterilisera ~ 25 frön för varje behandling enligt ovan och så ungefär hälften av fröna på var och en av två 1/2 MS-agarplattor i en laminär flödeshuv.
- Peptidbehandling och avbildning
- I en laminär flödeshuv, transplantera försiktigt 10-12 en dag gamla Arabidopsis-plantor från var och en av de två beredda plattorna till en 24-brunnsplatta innehållande 1,5 ml 1/2 MS flytande medium i varje brunn (~ 20 plantor per brunn).
OBS: Tidpunkten för peptidbehandlingen för plantorna är avgörande för de fenotypiska resultaten av peptidbehandlingen, så förbered fröna på två separata plattor för att erhålla två olika plantutvecklingsstadier för behandlingen. - Tillsätt antingen en buffert ensam (50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) eller två olika koncentrationer av peptiden (vanligtvis 1 μM och 2,5 μM peptid i 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) till varje brunn som innehåller ~ 20 en dag gamla Arabidopsis-plantor som groddar på 1/2 MS-agarplattor.
OBS: Ta bort peptidlösningsalikvoterna från en frys och förvara dem vid rumstemperatur i några minuter före behandlingen. Peptider som förvaras i en frys vid -80 ° C är stabila i ett par år, men frys-tina cykler bör undvikas genom att lagra peptidlösningen i små alikvoter. - Efter att plantorna försiktigt blandats med en buffert ensam eller en peptidlösning med en pipett, försegla plattan med mikroportejp. Inkubera analysplattan under långa dagsförhållanden (16 timmars fotoperiod, 120 μmol·m−2·s−1 ljus) i 5–7 dagar vid 22 °C.
OBS: Förhindra att plantorna växer för nära varandra så att varje planta kan ha jämn exponering för peptidlösningen. Rotera försiktigt plattan i 2-3 timmar innan du inkuberar plattan i en tillväxtkammare för att öka luftningen. - Överför varje planta från brunnen som innehåller antingen buffert ensam eller peptid på ett täckglas och dissekera plantans cotyledon. Placera den abaxiella sidan av cotyledonen upp med pincett och skär den i små bitar.
- Ta en annan ren mikroskopglas och placera på den en droppe propidiumjodidlösning (~ 25 μL, 2 mg / ml iH2O).
- Placera en av de små bitarna av cotyledon i en droppe propidiumjodidlösning med pincett och placera försiktigt täckglaset. Applicera ytterligare propidiumjodidlösning på kanten av täckglaset för att avlägsna eventuella luftbubblor som har bildats.
- Avbilda den abaxiella sidan av cotyledonen med hjälp av ett konfokalmikroskop och jämför bilderna med bilderna från plantor odlade i 1/2 MS-medium som endast innehåller buffert.
OBS: Bilderna som presenteras i figur 4 togs från Col-0 av vildtyp eller epf22,5 plantor som endast behandlades med buffert (figur 4A, B) eller två satser EPF2-peptidlösning (figur 4C-F) och lagrades vid −80 °C under 1 år.
- I en laminär flödeshuv, transplantera försiktigt 10-12 en dag gamla Arabidopsis-plantor från var och en av de två beredda plattorna till en 24-brunnsplatta innehållande 1,5 ml 1/2 MS flytande medium i varje brunn (~ 20 plantor per brunn).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Olika stomatala transgena växter och mutanter som är kända för att ha mindre eller mer stomatal densitet och klusterbildning (epf2 2,5, epf1 epf2 2,5, tmm12, en STOMAGENljuddämpad linje4 och transgena linjer som bär den östradiolinducerbara Est::EPF1 eller Est::EPF2 överuttryckskonstruktion7 ) användes för att demonstrera effektiviteten av de två fenotypiska analyserna som presenteras här, som syftade till att identifiera och karakterisera de gener som har en roll i stomatal utveckling och mönstring. För att producera epidermisbilder av hög kvalitet utan behov av epidermal peeling för att kvantifiera de olika typerna av epidermala celler för analys, är det viktigt att förjustera provfärgningstiden med TBO för varje genotyp, eftersom var och en kan ha olika epidermala fenotyper jämfört med vildtypskontrollen (Col-0) (figur 1A och figur 2A). Baserat på erfarenhet kräver genotyper med färre klyvöppningar längre färgningstider med TBO (figur 1B och figur 2D,E), medan genotyper med mer klyvöppning och klustring kräver kortare färgningstider (figur 1C och figur 2B,C). Eftersom varierande mängder av korrekt veckade peptider i den totala peptidlösningen kan maskera peptidernas biologiska aktivitet vid stomatal utveckling, är det god praxis att använda ytterligare, högre totala koncentrationer av peptidlösningen (t.ex. 2,5 μM EPF2), liksom genotyper som har mindre eller fler stomatala fenotyper (t.ex. epf2), för bioanalyserna. Aktiviteten hos EPF2-peptider, som har en roll i att hämma stomatal initiering, detekterades lätt genom att använda epf2-mutanter med fler epidermala celler än Col-0, även om vissa satser av de beredda EPF2-peptiderna hade mindre mängder av de bioaktiva formerna av peptiden (t.ex. EPF2-peptidlösningssats 1 i figur 4).
Figur 1: Effekten av inkubationstiden med TBO på de genotyper som uppvisar olika epidermala fenotyper. Abaxiala cotyledonbilder från 10 dagar gamla plantor av tre Arabidopsis genotyper: (A) vildtyp (Col-0), (B) en STOMAGEN-ljuddämpad linje (STOMAGEN-ami) och (C) epf1 epf2-mutanter. Col-0 representerar den vilda typen Arabidopsis-kontrollen, och den STOMAGEN-tystade linjen och epf1 epf2-mutanterna representerar genotyperna med lågt respektive högt antal stomata. Bilderna togs med ett inverterat mikroskop med en 20x objektivlins (0,35 mm2 synfält). Kvaliteten på bilderna varierade, även om alla hjärtbladprover från de olika genotyperna färgades med TBO (0,5% TBO i H 2 O) under samma tid (2min) före avbildning. För att få välfärgade bilder för analys är det därför viktigt att i förväg bestämma lämplig TBO-färgningstid för varje genotyp. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: TBO-färgade epidermisbilder utan användning av epidermal peeling för kvantitativ analys. Representativa epidermisbilder av kotyledoner från 10 dagar gamla plantor av (A) vildtyp (Col-0), (B) tmm och (C,D) transgena linjer som bär en östradiolinducerbar EPF2 (Est::EPF2) eller (E) EPF1-överuttryckskonstruktion (Est::EPF1) kan användas för kvantitativ analys av den epidermala fenotypen. En cotyledon i en fixeringslösning i över 3 år användes för att ta bilden som presenteras i (E). Bilderna togs med ett inverterat mikroskop med en 20x objektivlins (0,35 mm2 synfält). Cellerna skisserades av TBO-färgning, och halva bredden på bilderna i full storlek presenteras för visning. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Förfarande för bioassays . (A) Fröna sås på två 1/2 MS agarplattor och tas ut med 10 timmars intervall. (B) De 1 dag gamla Arabidopsis-plantorna transplanteras till 24-brunnsplattor innehållande 1/2 MS-medium med antingen mock eller två olika peptidkoncentrationer. (C) Efter 5-7 dagar är plantorna redo för avbildning för att bestämma peptidernas biologiska aktivitet vid stomatal utveckling och mönstring. (D) En cotyledonskiva placeras i en droppe propidiumjodidlösning på ett objektglas för avbildning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Konfokalmikroskopi av abaxial epidermis hos Arabidopsis cotyledons efter peptidbehandling. Representativa konfokala bilder av (A) vildtyp och (B) epf2 cotyledon epidermis odlad i 6-7 dagar i en buffertlösning och en (C-F) epf2 cotyledon epidermis odlad med två olika satser av EPF2 peptider. Bilderna togs med hjälp av ett konfokalmikroskop med en 40x objektivlins (excitation av 561 nm och ett 561 nm långpassemissionsfilter) för att fånga propidiumjodidfärgningen och visualisera cellkonturerna. Varje EPF2-peptidlösning som framställs har olika mängder korrekt vikta (bioaktiva) och felveckade (inaktiva) former av peptiderna. För den initiala screeningen av peptider med en potentiell roll i stomatal utveckling rekommenderas därför att använda två olika koncentrationer av de totala peptidlösningarna som indikeras för bioanalyserna. Skalstapel = 30 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De två fenotypiska analysmetoderna för att identifiera och karakterisera generna som styr stomatalmönstring och differentiering som presenteras här är praktiska och tillförlitliga analyser eftersom protokollen inte kräver användning av epidermala skal och specialutrustning (som är tidskrävande och kräver särskild utbildning för provberedning) men producerar högkvalitativa bilder för kvantitativ analys av epidermala fenotyper.
En begränsning med denna teknik för fenotypisk analys med TBO-färgade Arabidopsis-cotyledoner är att erhållandet av högkvalitativa bilder med visuell kontrast för olika epidermala celltyper beror på färgningstiden och vävnadens unika egenskaper, som kan vara både artberoende och genotypberoende (figur 1)18 . Andra fenotypningsmetoder för att observera epidermala celler med epidermal peeling har samma utmaningar, och de kräver också mer tid och specialträning. Svårigheter att få korrekt färgade epidermisbilder som är tillräckliga för dataanalys kan undvikas genom färgning av kotyledoner från genotyper med färre klyvöppningar under längre tidsperioder och prover från genotyper med mer klyvöppning under kortare tidsperioder. Färgningstiden för varje genotyp kan också justeras genom att först kontrollera endast ett fåtal prover för att optimera färgningstiden för genotyper med liknande epidermala fenotyper.
Att erhålla en tillräcklig mängd välveckade bioaktiva peptider, särskilt cysteinrika peptider (som är ligander som har olika funktioner för att kontrollera växtutveckling, inklusive stomatalmönster), har varit en utmaning 1,2,3,4,5,6,19,20,21,22,23 . Dessutom, även om bioaktiva peptider genereras, är screening av peptider som har potentiella funktioner i specifika biologiska processer en annan utmanande uppgift eftersom de bioaktiva peptiderna som produceras ofta är en blandning av välveckade, aktiva och inaktiva peptider. Denna artikel presenterar en effektiv bioanalysmetod för att upptäcka och karakterisera potentiella stomatalpeptider. Denna metod har varit framgångsrik i att identifiera olika viktiga peptider som styr olika aspekter av stomatal utveckling i Arabidopsis, liksom gräset Brachypodium 3,4,7,17. Den största begränsningen av denna teknik är emellertid variationen i fenotypiska svar, vilket sannolikt uppstår på grund av användningen av plantor med något olika utvecklingsstadier och peptidlösningar innehållande olika mängder bioaktiva peptider. Tidiga försök med denna metod involverade placering av vildtypsfrön direkt i brunnarna på en platta innehållande en peptidlösning efter stratifiering. Utan användning av genotyper som har mer och/eller mindre epidermala celler (t.ex. epf2 2, figur 4) och 1 dag gamla Arabidopsisplantor som groddar på 1/2 MS-agarplattor, kan ett lägre antal plantor växa och visa tydliga fenotypiska svar efter peptidappliceringen. I detta protokoll åtgärdades variabilitetsproblemet genom att använda ~ 20 en dag gamla Arabidopsis-plantor med två olika utvecklingsstadier och genom att använda två olika koncentrationer av peptidlösning (1 μM och 2,5 μM).
De epidermala fenotyperna hos de peptidbehandlade proverna kan också analyseras med den första fenotypiska analysmetoden presenterad med användning av TBO-färgade prover. Denna metod möjliggör relativt enkel kvantitativ fenotypisk analys eftersom ett relativt stort område av varje prov kan analyseras. Dessutom erbjuder denna metod flexibilitet vid provberedning efter skörd av prover som beretts under samma förhållanden för avbildning. Bilderna som tas med denna metod är dock i allmänhet inte av högsta kvalitet. Å andra sidan ger konfokal avbildning efter färgning av propidiumjodid bilder av högre kvalitet med epidermala detaljer. Denna metod tillåter emellertid endast att ett litet vävnadsområde fokuseras på för analys. Dessutom kan endast ett visst antal av de framställda levande vävnaderna analyseras samtidigt.
Sammanfattningsvis kan den fenotypiska analysen som presenteras här användas för snabb och effektiv undersökning av de potentiella generna som styr stomatalmönster och differentiering, vilket förbättrar förståelsen för mekanismerna för stomatal utveckling och peptidfunktion. Dessutom kan detta bioanalysprotokoll användas för att identifiera andra små molekyler som har en roll i epidermal vävnadsmönstring och som en initial screeningmetod för att bestämma strukturen hos välveckade bioaktiva peptider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklarerades.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades genom Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery-programmet och Concordia University. K.B. stöds av National Overseas Scholarship från Indien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1--A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
