Summary
本文描述了两种不使用表皮剥皮的表型方法来表征控制气孔发育的基因。第一种方法演示了如何使用甲苯胺蓝O染色植物表皮分析气孔表型。第二种方法描述了如何识别气孔配体并监测其生物活性。
Abstract
气孔是陆地植物表面的小孔，参与气体交换和水蒸气释放，其功能对植物生产力和生存至关重要。因此，了解气孔发育和模式的机制具有巨大的农艺价值。本文描述了两种使用 拟南芥 子叶的表型方法，可用于表征控制气孔发育和模式化的基因。首先介绍使用甲苯胺蓝O染色子叶分析气孔表型的程序。该方法快速可靠，不需要使用表皮剥皮，表皮果皮广泛用于表型分析，但需要专门的培训。由于存在多个半胱氨酸残基，鉴定和生成在气孔发育中起作用的生物活性EPF肽一直具有挑战性。因此，第二呈现的是用于鉴定气孔配体并通过生物测定监测其生物活性的程序。该方法的主要优点是它相对容易地产生可重复的数据，同时减少了肽溶液的量和表征肽在控制气孔模式和发育中的作用所需的时间。总体而言，这些精心设计的方案提高了研究潜在气孔调节因子的效率，包括富含半胱氨酸的分泌肽，这些肽需要高度复杂的结构才能发挥其活性。
Introduction
植物气孔的正确图案化和分化对于它们在光合作用和蒸腾这两个基本生物过程中的功能至关重要，并且由EPF肽信号通路强制执行。在拟南芥中，三种分泌的富含半胱氨酸的肽 EPF1、EPF2 和气孔/EPFL9 控制气孔发育的不同方面，并被细胞表面受体成分感知，包括直立家族受体激酶（ER、ERL1 和 ERL2）、SERK 和 TMM1、2、3、4、5、6、7、8、9、10.然后，这种识别导致通过MAPK依赖性过程促进气孔分化的转录因子的下调11。这些核心气孔基因的发现主要是通过对表现出表皮缺陷的突变体进行表型筛选来实现的。本文提出了相对简单有效的表型方法，用于可视化气孔和其他表皮细胞，这是识别和表征控制气孔模式和分化的潜在基因所必需的。
植物表皮细节的观察通常是通过使用表皮果皮来实现的，有或没有用甲苯胺蓝O（TBO）或safranin12，13，14等染料染色。然而，这些方法的主要挑战是它们需要专门的培训来剥离叶子表皮而不撕裂组织，并仔细观察和分析图案数据，同时避免从叶子的不同部分拍摄的图像。使用水合氯醛基澄清溶液等试剂清除组织样品的化学处理也已广泛用于各种生物材料8，15;这些处理确实通过提供高质量的图像产生大量的表型信息，但也需要使用危险化学品（例如甲醛、水合氯醛）。本文首先提出了一种相对简单方便的表型分析方法，该方法产生的图像足以进行定量分析，但不需要使用危险化学品和表皮叶皮进行样品制备。TBO染色的子叶表皮也是研究气孔发育的理想选择，因为子叶中缺乏毛状体和较小的发育梯度允许对表皮表型进行简单易处理的解释。
气孔EPF肽属于植物特异性，富含半胱氨酸的肽组，具有相对较大的成熟尺寸和保守半胱氨酸残基之间的分子内二硫键。正确的构象折叠对其生物学功能至关重要，但通过化学合成或异源重组系统产生的富含半胱氨酸的肽可能是无活性的，并且是正确折叠和未折叠肽的混合物3，7，16。因此，筛选在控制气孔发育方面起作用的生物活性肽是一项非常具有挑战性的任务。本手稿还描述了一种生物测定方法，用于更好地鉴定和表征生物活性气孔肽。在该方法中，拟南芥幼苗在含有和没有潜在肽的培养基的多孔板中生长6-7天。然后，使用共聚焦显微镜观察子叶表皮。一般来说，为了清楚地看到气孔发育中潜在肽的生物活性，除了用于生物测定的野生型拟南芥对照 （Col-0） 外，还使用了产生更多和/或更少气孔谱系细胞的基因型，例如产生更多表皮细胞的 epf2 突变体和赋予降低表皮细胞密度2，4，5 的 stomagen-ami 系。
总体而言，此处介绍的两个方案可用于快速有效地评估各种表皮表型，并用于筛选在控制气孔模式和发育方面起作用的小肽和激素。
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Protocol
1. 用TBO染色 拟南芥 子叶
- 种子灭菌和生长条件
- 通过加入 1 mL 种子灭菌溶液（33% 商业漂白剂，0.1% Triton X-100），在微量离心管中对每个基因型的拟 南芥 种子进行灭菌，并在室温 （RT） 下轻轻摇动 10-12 分钟。
注意：灭菌~30粒野生型 拟南芥 加入哥伦比亚（Col-0）种子和/或~60粒携带化学诱导基因（例如， Est：：EPF27）的转基因植物种子，以使用在1/2 Murashige和Skoog（MS）平板上生长的转基因幼苗（2.16g / L含有0.8%琼脂[w / v]），而不使用诱导剂（例如β-雌二醇）作为对照（图1 和 图2）。 - 取出灭菌溶液，在层流罩中用 1 mL 无菌水洗涤种子四次，然后将它们重悬于 ~200 μL 无菌 0.1% 琼脂中。
- 在含有诱导剂（例如，10μM β-雌二醇）的 1/2 MS 琼脂平板或 1/2 MS 琼脂平板上播种每个基因型 ~30 粒种子，用于化学诱导转基因（例如， Est：：EPF27），并用微孔胶带密封。
注意：种子需要均匀分布在盘子上，以避免将它们放在很近的地方，因为这会阻止幼苗均匀生长。 - 通过将板置于4°C无光下3-5天来分层种子以同步发芽。
- 分层后，将板在22°C的生长室中在120μmol·m−2·s−1 光下孵育，光周期为16小时光照和8小时黑暗10天。
- 通过加入 1 mL 种子灭菌溶液（33% 商业漂白剂，0.1% Triton X-100），在微量离心管中对每个基因型的拟 南芥 种子进行灭菌，并在室温 （RT） 下轻轻摇动 10-12 分钟。
- 拟南芥子叶的取样和TBO染色
- 在发芽后10天，仔细选择并从单个幼苗中切出一个子叶，这些子叶与盘子上的其他幼苗均匀生长，以限制变异性。
注意：子叶取自10日龄幼苗，因为它们没有毛状体和未成熟的表皮细胞，这简化了表皮表型的解释。 - 使用镊子将每个子叶放入含有 1 mL 固定溶液（9：1 乙醇至乙酸）的微量离心管中，并将样品至少在室温下在固定溶液中过夜。
注意：在这种情况下，样品可以保存长达几年。 图像图2E 取自在固定溶液中储存超过3年的子叶样品。重要的是在切割后立即将子叶保持在固定溶液中，并在每个微量离心管中放置不超过五个子叶，以便以后进行均匀的样品制备。 - 取出固定溶液，加入 1 mL 70% 乙醇。倒置试管几次后，将装有样品的试管置于室温~30分钟。
- 使用1 mL的50%乙醇和20%乙醇重复步骤1.2.3。
- 用 1 mL 蒸馏水替换 1 mL 20% 乙醇，然后在倒置试管几次后将装有子叶样品的管放置 ~30 分钟。
注意：样品可以在蒸馏水中停留超过24小时，但不建议这样做以获得高质量的图像（不同表皮细胞类型的染色良好的图像）进行定量分析。 - 从管中取出所有蒸馏水。然后，立即加入~200μLTBO染色溶液（H2O中的0.5%TBO，过滤）~2分钟。
注意：通过在孵育期间轻轻轻弹试管，确保每个子叶样品均匀地暴露于TBO溶液中。为防止TBO过度染色（染色时间至关重要，并且每个基因型都可以变化），一次不要处理超过六个含有样品的试管。 - 尽可能彻底地去除TBO染色溶液，然后立即加入1 mL新鲜蒸馏水洗涤样品几次。
- 在发芽后10天，仔细选择并从单个幼苗中切出一个子叶，这些子叶与盘子上的其他幼苗均匀生长，以限制变异性。
- 成像和数据分析
- 取显微镜载玻片，加入一滴15%甘油（~50μL）。使用细镊子将子叶与远轴面朝上放入载玻片上的15%甘油中。然后，用盖玻片轻轻盖住它，以便从样品中去除形成的任何气泡。
- 使用明场显微镜对子叶表皮的远轴侧进行成像（图1 和 图2），然后通过计数气孔和其他表皮细胞类型的数量来检查表皮表型。
- 对于每种基因型，使用Jangra等人描述的以下公式计算表皮表型17：
造口指数（%）=（造口数/表皮细胞总数）×100
气孔密度 （mm−2） = 气孔数/面积 （mm2）
注意：为每个基因型至少八个子叶（N = 8）成像，并通过将其与野生型植物和/或表达化学诱导转基因的转基因的表型进行比较来记录每个基因型的表皮表型没有诱导剂生长。
2. 气孔肽的生物测定
注意：生物测定的程序如图 3所示。
- 种子灭菌和生长条件
- 如上所述，每次处理灭菌~25粒种子，并将大约一半的种子播种到层流罩中的两个1/2 MS琼脂平板上。
注意：使用具有高和/或低表皮细胞的基因型（例如， epf22）而不是使用野生型背景（例如，Col-0）来轻松检测肽对表皮细胞模式和分化的生物活性（图4）。 - 在黑暗中将种子在4°C下分层3天。
- 以~10小时间隔取出两个平板中的每一个，并将种子在22°C的平板上在120μmol·m−2·s-1 光下孵育，光周期为16小时光照和8小时黑暗1天。
- 如上所述，每次处理灭菌~25粒种子，并将大约一半的种子播种到层流罩中的两个1/2 MS琼脂平板上。
- 肽处理和成像
- 在层流罩中，小心地将两个制备的平板中的每一个的10-12个一日龄 拟南芥 幼苗移植到每个孔中含有1.5mL 1/2MS液体培养基的24孔板中（每孔~20个幼苗）。
注意：幼苗肽处理的时机对于肽处理的表型结果至关重要，因此在两个单独的板上准备种子以获得两个不同的幼苗发育阶段进行处理。 - 单独加入缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 8.0]）或两种不同浓度的肽（通常，50 mM Tris-HCl [pH 8.0]中的 1 μM 和 2.5 μM 肽）到含有 ~20 个在 1/2 MS 琼脂平板上发芽的一日龄 拟南芥 幼苗的孔中。
注意：从冰箱中取出肽溶液等分试样，并在治疗前将其在室温下保持几分钟。储存在-80°C冰箱中的肽可以稳定保存几年，但应通过将肽溶液以小等分试样储存来避免冻融循环。 - 将幼苗单独与缓冲液或使用移液管的肽溶液轻轻混合后，用微孔胶带密封板。将测定板在长日照条件下（16小时光周期，120μmol·m−2·s-1光）在22°C孵育5-7 天。
注意：防止幼苗生长得太近，以使每个幼苗均匀地暴露于肽溶液中。轻轻旋转板2-3小时，然后将板在生长室中孵育以增加通气。 - 将每个幼苗从含有单独缓冲液或肽的孔中转移到盖玻片上，并解剖幼苗的子叶。用镊子将子叶的远轴侧向上放置，并将其切成小块。
- 取另一张干净的显微镜载玻片，在其上滴一滴碘化丙啶溶液（~25μL，2mg / mL在H2O中）。
- 用镊子将一小块子叶放入一滴碘化丙啶溶液中，然后轻轻放置盖玻片。在盖玻片的边缘涂上额外的碘化丙啶溶液，以去除已形成的任何气泡。
- 使用共聚焦显微镜对子叶的远轴侧进行成像，并将图像与仅在含有缓冲液的1/2MS培养基中生长的幼苗的图像进行比较。
注意：图4中显示的图像取自仅用缓冲液（图4A，B）或两批EPF2肽溶液（图4C-F）处理的野生型Col-0或epf22，5幼苗，并在-80°C下储存1年。
- 在层流罩中，小心地将两个制备的平板中的每一个的10-12个一日龄 拟南芥 幼苗移植到每个孔中含有1.5mL 1/2MS液体培养基的24孔板中（每孔~20个幼苗）。
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Representative Results
已知具有较少或更多气孔密度和聚集的各种气孔转基因植物和突变体（epf2 2，5、epf1 epf2 2，5、tmm12、气孔沉默系4 和携带雌二醇诱导的 Est：：EPF1 或 Est：：EPF2 过表达构建体7 的转基因系）用于证明此处介绍的两种表型分析的有效性，旨在鉴定和表征在气孔发育和模式中起作用的基因。为了产生高质量的表皮图像，而无需表皮剥离来量化不同类型的表皮细胞进行分析，使用TBO预先调整每种基因型的样品染色时间至关重要，因为与野生型对照（Col-0）相比，每种表皮表型可能具有不同的表皮表型（图1A和图2A）。根据经验，气孔较少的基因型需要更长的TBO染色时间（图1B和图2D，E），而气孔和聚集性较多的基因型需要更短的染色时间（图1C和图2B，C）。由于总肽溶液中不同量的适当折叠肽可以掩盖气孔发育中肽的生物活性，因此最好使用额外的、更高的总浓度的肽溶液（例如，2.5μM EPF2）以及具有较少或更多气孔表型的基因型（例如，EPF2）进行生物测定。EPF2肽的活性在抑制气孔起始方面发挥作用，即使某些批次的制备的EPF2肽具有较少量的肽的生物活性形式（例如，图4中的EPF2肽溶液批次1），也可以通过使用表皮细胞比Col-0更多的EPF2突变体轻松检测。
图 1：TBO 孵育时间对表现出不同表皮表型的基因型的影响。来自三种拟南芥基因型的 10 日龄幼苗的远轴子叶图像：（A） 野生型 （Col-0）、（B） 气孔沉默系 （气孔原-ami） 和 （C） epf1 epf2 突变体。Col-0代表野生型拟南芥对照，气孔原沉默系和EPF1 epf2突变体分别代表气孔数量少和多的基因型。图像是使用带有20倍物镜（0.35 mm2视场）的倒置显微镜拍摄的。图像的质量是可变的，尽管来自不同基因型的所有子叶样品在成像前用TBO（H 2 O中的0.5%TBO）染色相同的时间（2分钟）。因此，为了获得染色良好的图像进行分析，重要的是预先确定每种基因型的适当TBO染色时间。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：无需使用表皮果皮进行定量分析的 TB 染色表皮图像。携带雌二醇诱导型EPF2（Est：：EPF2）或（E）EPF1过表达构建体（Est：：EPF1）的（A）野生型（Col-0），（B）tmm和（C，D）转基因系的10日龄幼苗的子叶的代表性表皮图像可用于表皮表型的定量分析。使用固定溶液中的子叶超过3年来拍摄（E）中所示的图像。图像是使用带有20倍物镜（0.35 mm2视场）的倒置显微镜拍摄的。通过TBO染色勾勒出细胞的轮廓，并呈现全尺寸图像宽度的一半以供显示。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图3：生物测定程序 。 （A）将种子播种在两个1/2MS琼脂平板上，并以10小时的间隔取出。（B）将1天龄 拟南芥 幼苗移植到含有1/2MS培养基的24孔板中，具有模拟或两种不同的肽浓度。（C）5-7天后，幼苗准备好进行成像，以确定肽在气孔发育和图案中的生物活性。（D）将子叶切片置于显微镜载玻片上的一滴碘化丙啶溶液中进行成像。 请点击此处查看此图的大图。
图4：肽处理后拟南芥子叶远轴表皮的共聚焦显微镜。 （A）野生型和（B）EPF2子叶表皮在缓冲溶液中生长6-7天的代表性共聚焦图像和用两个不同批次的EPF2肽生长的（C-F）epf2子叶表皮。使用共聚焦显微镜拍摄图像，共聚焦显微镜使用40倍物镜（激发561 nm和561 nm长通发射滤光片）以捕获碘化丙啶染色并可视化细胞轮廓。制备的每种EPF2肽溶液具有不同数量的正确折叠（生物活性）和错误折叠（非活性）形式的肽。因此，对于在气孔发育中具有潜在作用的肽的初步筛选，建议使用两种不同浓度的总肽溶液，如生物测定所示。比例尺 = 30 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
这里介绍的用于鉴定和表征控制气孔模式和分化的基因的两种表型分析方法是方便可靠的测定，因为该方案不需要使用表皮剥离和专用设备（这很耗时并且需要特殊的样品制备培训），但确实可以产生高质量的图像用于表皮表型的定量分析。
该技术使用TBO染色拟 南芥 子叶进行表型分析的局限性在于，获得不同表皮细胞类型的具有视觉对比度的高质量图像取决于染色时间和组织的独特特征，这可能既是物种依赖性的，也是基因型依赖性的（图1）18.使用表皮果皮观察表皮细胞的其他表型方法具有相同的挑战，并且它们也需要更多的时间和特殊培训。通过较长时间对气孔较少的基因型的子叶进行染色，以及将气孔较多的基因型的样品染色较短的时间，可以避免难以获得足以进行数据分析的适当染色的表皮图像。每种基因型的染色时间也可以通过首先仅检查几个样本来调整，以优化具有相似表皮表型的基因型的染色时间。
获得足够数量的折叠良好的生物活性肽，特别是富含半胱氨酸的肽（它们是在控制植物发育方面具有多种功能的配体，包括气孔图案），一直是一个挑战1，2，3，4，5，6，19，20，21，22，23.此外，即使产生了生物活性肽，筛选在特定生物过程中具有潜在功能的肽也是另一项具有挑战性的任务，因为产生的生物活性肽通常是折叠良好、活性和非活性肽的混合物。本文提出了一种有效的生物测定方法来发现和表征潜在的气孔肽。该方法已成功鉴定控制拟南芥气孔发育不同方面的各种重要肽，以及草Brachypodium3，4，7，17。然而，该技术的主要局限性是表型反应的可变性，这很可能是由于使用了发育阶段略有不同的幼苗和含有不同量的生物活性肽的肽溶液。这种方法的早期尝试涉及在分层后将野生型种子直接放置在含有肽溶液的板的孔中。不使用具有更多和/或更少表皮细胞的基因型（例如，epf22，图4）和在1/2MS琼脂平板上发芽的1天大的拟南芥幼苗，较少数量的幼苗能够在肽施用后生长并显示出清晰的表型反应。在该协议中，通过使用~20个具有两个不同发育阶段的一日龄拟南芥幼苗和使用两种不同浓度的肽溶液（1μM和2.5μM）来解决变异性问题。
肽处理样品的表皮表型也可以通过使用TBO染色样品呈现的第一个表型分析方法进行分析。该方法允许相对容易的定量表型分析，因为可以分析每个样品的相对较大的区域。此外，该方法在收获在相同成像条件下制备的样品后，为样品制备提供了灵活性。但是，通过此方法拍摄的图像通常不是最高质量的。另一方面，碘化丙啶染色后的共聚焦成像可提供具有表皮细节的更高质量的图像。然而，这种方法只允许集中一小部分组织进行分析。此外，一次只能分析一定数量的制备的活组织。
总之，本文介绍的表型分析可用于快速有效地检查控制气孔模式和分化的潜在基因，从而提高对气孔发育和肽功能机制的理解。此外，该生物测定方案可用于鉴定在表皮组织图案中起作用的其他小分子，并作为初步筛选方法来确定折叠良好的生物活性肽的结构。
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Disclosures
没有宣布利益冲突。
Acknowledgments
这项研究由加拿大自然资源和工程研究委员会（NSERC）发现计划和康考迪亚大学资助。K.B.得到了印度国家海外奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
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