Summary
Este trabalho descreve dois métodos de fenotipagem sem o uso de cascas epidérmicas para caracterizar os genes que controlam o desenvolvimento estomatizante. O primeiro método demonstra como analisar um fenótipo estomatal usando uma epiderme vegetal corada com O azul de toluidina . O segundo método descreve como identificar ligantes estomatáticos e monitorar suas atividades biológicas.
Abstract
Os estomatos são pequenos poros na superfície das plantas terrestres que estão envolvidos na troca gasosa e na liberação de vapor de água, e sua função é crítica para a produtividade e sobrevivência das plantas. Como tal, a compreensão dos mecanismos pelos quais os estômatos se desenvolvem e padronizam tem um tremendo valor agronômico. Este trabalho descreve dois métodos fenotípicos utilizando Arabidopsis cotyledons que podem ser usados para caracterizar os genes que controlam o desenvolvimento estomático e a padronização. Primeiramente são apresentados os procedimentos para análise dos fenótipos estomatáticos utilizando cotilédones corados com azul de toluidina O. Este método é rápido e confiável e não requer o uso de peelings epidérmicos, que são amplamente utilizados para análises fenotípicas, mas exigem treinamento especializado. Devido à presença de múltiplos resíduos de cisteína, a identificação e geração de peptídeos EPF bioativos que têm um papel no desenvolvimento estomático têm sido desafiadores. Assim, apresenta-se em segundo lugar um procedimento utilizado para identificar ligantes estomatáticos e monitorar sua atividade biológica por bioensaios. A principal vantagem deste método é que ele produz dados reprodutíveis com relativa facilidade, reduzindo a quantidade de solução peptídica e o tempo necessário para caracterizar o papel dos peptídeos no controle do padrão estomático e desenvolvimento. No geral, esses protocolos bem projetados aumentam a eficiência do estudo dos potenciais reguladores estomáticos, incluindo peptídeos secretores ricos em cisteína, que exigem estruturas altamente complexas para sua atividade.
Introduction
A padronização adequada e a diferenciação dos estômatos vegetais são críticas para sua função em dois processos biológicos fundamentais, fotossíntese e transpiração, e são impostas pelas vias de sinalização do peptídeo EPF. Na Arabidopsis, três peptídeos ricos em cisteína secretados, EPF1, EPF2 e STOMAGEN/EPFL9, controlam diferentes aspectos do desenvolvimento estomático e são percebidos pelos componentes do receptor da superfície celular, incluindo quinases receptoras da família ERECTA (ER, ERL1 e ERL2), SERKs e TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Esse reconhecimento, então, leva à regulação negativa dos fatores de transcrição que promovem a diferenciação estomática por um processo dependente de MAPK11. A descoberta desses genes estomatâmicos centrais é alcançada principalmente pela triagem fenotípica de mutantes que exibem defeitos epidérmicos. Este trabalho apresenta métodos de fenotipagem relativamente simples e eficientes para a visualização dos estômatos e outras células epidérmicas, que são necessários para identificar e caracterizar os genes potenciais que controlam a padronização e diferenciação estomática.
A observação dos detalhes da epiderme vegetal tem sido tipicamente realizada por meio de peelings epidérmicos com ou sem coloração com corante como azul de toluidina O (TBO) ou safranina12,13,14. No entanto, o principal desafio desses métodos é que eles exigem treinamento especializado para descascar a epiderme foliar sem rasgar os tecidos e observar e analisar cuidadosamente os dados de padronização, evitando as imagens retiradas de diferentes partes da folha. Tratamentos químicos para limpar as amostras de tecido com reagentes, como soluções de clareamento à base de hidrato de cloral, também têm sido amplamente utilizados para uma variedade de materiais biológicos 8,15; esses tratamentos geram uma grande quantidade de informações fenotípicas, fornecendo imagens de alta qualidade, mas também exigem o uso de produtos químicos perigosos (por exemplo, formaldeído, hidrato de cloral). Este artigo apresenta primeiro um método de fenotipagem relativamente fácil e conveniente que produz imagens suficientes para análise quantitativa, mas não requer o uso de produtos químicos perigosos e cascas de folhas epidérmicas para a preparação da amostra. Uma epiderme de cotilédones corada com TBO também é ideal para o estudo do desenvolvimento estomático, pois a falta de tricomas e o menor gradiente de desenvolvimento nos cotilédones permitem a interpretação simples e tratável dos fenótipos epidérmicos.
Os peptídeos estomáticos EPF pertencem ao grupo de peptídeos específicos de plantas, ricos em cisteína, que têm tamanhos maduros relativamente grandes e ligações dissulfeto intramoleculares entre resíduos de cisteína conservados. O correto dobramento conformacional é fundamental para sua função biológica, mas os peptídeos ricos em cisteína, que são produzidos por síntese química ou por um sistema de recombinação heteróloga, podem ser inativos e são uma mistura de peptídeos adequadamente dobrados e desdobrados 3,7,16. Assim, o rastreamento de peptídeos bioativos que têm um papel no controle do desenvolvimento estomático tem sido uma tarefa muito desafiadora. Este manuscrito descreve adicionalmente um bioensaio para a melhor identificação e caracterização de peptídeos estomáticos bioativos. Neste método, as mudas de Arabidopsis são cultivadas em uma placa de múltiplos poços contendo meios com e sem peptídeos potenciais por 6-7 dias. Em seguida, a epiderme do cotilédones é visualizada usando um microscópio confocal. Em geral, para visualizar claramente a atividade biológica de peptídeos potenciais no desenvolvimento estomático, os genótipos que produzem mais e/ou menos células estomáticas da linhagem, como o mutante epf2, que produz mais células epidérmicas, e a linhagem STOMAGEN-ami, que confere densidade celular epidérmica reduzida 2,4,5, são utilizados além do controle de Arabidopsis do tipo selvagem (Col-0) para os bioensaios.
No geral, os dois protocolos aqui apresentados podem ser utilizados para a avaliação rápida e eficiente de vários fenótipos epidérmicos e para o rastreamento de pequenos peptídeos e hormônios que têm um papel no controle do padrão estomático e do desenvolvimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Coloração de Arabidopsis cotyledons com TBO
- Esterilização de sementes e condições de crescimento
- Esterilizar ~30 sementes de Arabidopsis por genótipo em um tubo de microcentrífuga adicionando 1 mL de uma solução de esterilização de sementes (33% de alvejante comercial, 0,1% de Triton X-100) e balançar suavemente por 10-12 min à temperatura ambiente (RT).
NOTA: Esterilizar ~30 sementes do tipo selvagem Arabidopsis adesão Columbia (Col-0) e/ou ~60 sementes de plantas transgênicas portadoras de um gene quimicamente induzível (por exemplo, Est::EPF27) para usar plântulas transgênicas cultivadas em placas 1/2 Murashige e Skoog (MS) (2,16 g/L contendo 0,8% de ágar [p/v]) sem indutor (por exemplo, β-estradiol) como controles (Figura 1 e Figura 2). - Retire a solução de esterilização, lave as sementes quatro vezes com 1 mL de água estéril em um exaustor de fluxo laminar e ressuscite-as em ~200 μL de ágar estéril a 0,1%.
- Semeie ~30 sementes por genótipo em placas de ágar 1/2 MS ou placas de ágar 1/2 MS contendo um indutor (por exemplo, 10 μM β-estradiol) para a indução química do transgene (por exemplo, Est::EPF27) usando uma pipeta e sele com fita de microporos.
NOTA: As sementes precisam ser distribuídas uniformemente na placa para evitar colocá-las em estreita proximidade, pois isso impedirá que as mudas cresçam uniformemente. - Estratificar as sementes colocando as placas a 4 °C sem luz por 3-5 dias para sincronizar a germinação.
- Após a estratificação, incubar as placas em uma câmara de crescimento a 22 °C sob 120 μmol·m−2·s−1 de luz com um fotoperíodo de 16 h de luz e 8 h de escuridão por 10 dias.
- Esterilizar ~30 sementes de Arabidopsis por genótipo em um tubo de microcentrífuga adicionando 1 mL de uma solução de esterilização de sementes (33% de alvejante comercial, 0,1% de Triton X-100) e balançar suavemente por 10-12 min à temperatura ambiente (RT).
- Amostragem e coloração TBO de Arabidopsis cotyledons
- Aos 10 dias após a germinação, selecione cuidadosamente e corte um dos cotilédones das plântulas individuais que estão crescendo uniformemente com outras mudas na placa para limitar a variabilidade.
NOTA: Os cotilédones são amostrados de plântulas de 10 dias de idade por não possuírem tricomas e células imaturas da epiderme, o que simplifica a interpretação dos fenótipos epidérmicos. - Colocar cada cotilédones num tubo de microcentrífuga contendo 1 ml de uma solução de fixação (etanol 9:1 a ácido acético) utilizando pinça e deixar a amostra na solução de fixação durante a noite, no mínimo e à temperatura ambiente.
NOTA: As amostras podem então ser armazenadas por até alguns anos nesta condição. A imagem Figura 2E foi retirada de uma amostra de cotilédones que foi armazenada em solução de fixação por mais de 3 anos. É importante manter o cotilédones numa solução de fixação imediatamente após o corte e colocar não mais do que cinco cotilédones em cada tubo de microcentrífuga para uma preparação homogénea da amostra mais tarde. - Retire a solução de fixação e adicione 1 mL de etanol a 70%. Depois de inverter o tubo algumas vezes, deixe o tubo contendo as amostras em RT por ~ 30 min.
- Repita a etapa 1.2.3 usando 1 mL de etanol a 50% e, em seguida, etanol a 20%.
- Substitua o 1 mL de etanol a 20% por 1 mL de água destilada e, em seguida, deixe o tubo contendo as amostras de cotilédones por ~30 min após a inversão do tubo algumas vezes.
NOTA: As amostras podem permanecer em água destilada por mais de 24 h, mas isso não é recomendado para a obtenção de imagens de boa qualidade (imagens bem coradas para diferentes tipos de células epidérmicas) para análise quantitativa. - Retire toda a água destilada do tubo. Em seguida, adicione imediatamente ~200 μL de solução de coloração TBO (TBO a 0,5% em H2O, filtrado) por ~2 min.
NOTA: Certifique-se de que cada amostra de cotilédones está uniformemente exposta à solução de TBO, agitando suavemente os tubos durante a incubação. Para evitar a sobrecoloração com TBO (o momento da coloração é essencial e pode ser variável para cada genótipo), não processe mais de seis tubos contendo amostras de cada vez. - Remova a solução de coloração TBO o mais completamente possível e, em seguida, lave imediatamente as amostras algumas vezes, adicionando 1 mL de água fresca destilada.
- Aos 10 dias após a germinação, selecione cuidadosamente e corte um dos cotilédones das plântulas individuais que estão crescendo uniformemente com outras mudas na placa para limitar a variabilidade.
- Imagens e análise de dados
- Pegue uma lâmina de microscópio e adicione uma gota de 15% de glicerol (~ 50 μL). Coloque o cotilédones com o lado abaxial em glicerol a 15% na lâmina usando pinça fina. Em seguida, cubra-o suavemente com uma tampa para que quaisquer bolhas de ar formadas possam ser removidas da amostra.
- Fotografe o lado abaxial da epiderme do cotilédones usando um microscópio de campo brilhante (Figura 1 e Figura 2) e, em seguida, examine o fenótipo epidérmico contando o número de estômatos e outros tipos de células epidérmicas.
- Para cada genótipo, calcule o fenótipo epidérmico utilizando as seguintes fórmulas descritas por Jangra et al.17:
Índice estomático (%) = (Número de estômatos/Número total de células epidérmicas) × 100
Densidade estomática (mm−2) = Número de estômatos/Área (mm2)
NOTA: Captar pelo menos oito cotilédones (N = 8) para cada genótipo e documentar o fenótipo epidérmico de cada genótipo, comparando-o com o fenótipo da planta selvagem e/ou plantas transgênicas que expressam um transgene quimicamente induzível cultivado sem um indutor.
2. Bioensaios para peptídeos estomatáticos
NOTA: O procedimento para bioensaios é mostrado na Figura 3.
- Esterilização de sementes e condições de crescimento
- Esterilize ~ 25 sementes para cada tratamento como acima, e semeie aproximadamente metade das sementes em cada uma das duas placas de ágar 1/2 MS em um exaustor de fluxo laminar.
NOTA: Use o genótipo com células epidérmicas altas e/ou baixas (por exemplo, epf22) em vez de usar um fundo do tipo selvagem (por exemplo, Col-0) para detectar facilmente as atividades biológicas dos peptídeos no padrão e diferenciação de células epidérmicas (Figura 4). - Estratificar as sementes durante 3 dias a 4 °C no escuro.
- Retire cada uma das duas placas em intervalos de ~10 h e incube as sementes em placas a 22 °C sob 120 μmol·m−2·s−1 de luz com um fotoperíodo de 16 h de luz e 8 h de escuridão por 1 dia.
- Esterilize ~ 25 sementes para cada tratamento como acima, e semeie aproximadamente metade das sementes em cada uma das duas placas de ágar 1/2 MS em um exaustor de fluxo laminar.
- Tratamento peptídico e imagem
- Em um exaustor de fluxo laminar, transplante cuidadosamente 10-12 mudas de Arabidopsis de um dia de idade de cada uma das duas placas preparadas em uma placa de 24 poços contendo 1,5 mL de 1/2 MS de meio líquido em cada poço (~ 20 mudas por poço).
NOTA: O momento do tratamento peptídico para as mudas é crítico para os resultados fenotípicos do tratamento peptídico, portanto, prepare as sementes em duas placas separadas para obter dois estágios diferentes de desenvolvimento de plântulas para o tratamento. - Adicione um tampão sozinho (50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) ou duas concentrações diferentes do peptídeo (tipicamente, 1 μM e peptídeo 2,5 μM em 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) a cada poço contendo ~20 mudas de Arabidopsis de um dia germinadas em placas de ágar 1/2 MS.
NOTA: Remova as alíquotas da solução peptídica de um congelador e mantenha-as em RT por alguns minutos antes do tratamento. Os peptídeos armazenados em um freezer a -80 °C são estáveis por alguns anos, mas os ciclos de congelamento-descongelamento devem ser evitados armazenando a solução peptídica em pequenas alíquotas. - Depois de misturar suavemente as mudas com um tampão sozinho ou uma solução peptídica usando uma pipeta, sele a placa com fita de microporos. Incubar a placa de ensaio em condições de dia longo (fotoperíodo de 16 h, 120 μmol·m−2·s−1 luz) durante 5-7 dias a 22 °C.
NOTA: Evite que as mudas cresçam muito próximas umas das outras para permitir que cada plântula tenha uma exposição uniforme à solução peptídica. Gire suavemente a placa por 2-3 h antes de incubar a placa em uma câmara de crescimento para aumentar a aeração. - Transferir cada plântula do poço contendo tampão sozinho ou peptídeo em uma lâmina de cobertura e dissecar o cotilédones da plântula. Coloque o lado abaxial do cotilédones para cima usando pinça e corte-o em pequenos pedaços.
- Pegue outra lâmina de microscópio limpa e coloque sobre ela uma gota de solução de iodeto de propídio (~25 μL, 2 mg/mL em H2O).
- Coloque um dos pequenos pedaços de cotilédones em uma gota de solução de iodeto de propídio usando pinça e coloque suavemente a tampa. Aplique uma solução adicional de iodeto de propídio na borda da tampa para remover quaisquer bolhas de ar que se formaram.
- Fotografe o lado abaxial do cotilédone, utilizando um microscópio confocal, e compare as imagens com as imagens de plântulas cultivadas em meio de 1/2 MS contendo apenas tamponamento.
NOTA: As imagens apresentadas na Figura 4 foram retiradas de plântulas do tipo selvagem Col-0 ou epf22,5 que foram tratadas apenas com tampão (Figura 4A, B) ou dois lotes de solução peptídica EPF2 (Figura 4C-F) e foram armazenadas a -80 °C durante 1 ano.
- Em um exaustor de fluxo laminar, transplante cuidadosamente 10-12 mudas de Arabidopsis de um dia de idade de cada uma das duas placas preparadas em uma placa de 24 poços contendo 1,5 mL de 1/2 MS de meio líquido em cada poço (~ 20 mudas por poço).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Várias plantas transgênicas estomáticas e mutantes conhecidos por terem menos ou mais densidade estomática e agrupamento (epf2 2,5, epf1 epf2 2,5, tmm12, uma linha4 silenciada por STOMAGEN, e linhas transgênicas que carregam o construto de superexpressão Est::EPF1 ou Est::EPF2 induzível por estradiol7 ) foram utilizados para demonstrar a efetividade das duas análises fenotípicas aqui apresentadas, que tiveram como objetivo identificar e caracterizar os genes que têm papel no desenvolvimento e padronização estomática. Para produzir imagens de epiderme de alta qualidade sem a necessidade de peelings epidérmicos para quantificar os diferentes tipos de células epidérmicas para análise, é fundamental pré-ajustar o tempo de coloração da amostra com TBO para cada genótipo, pois cada um pode ter fenótipos epidérmicos diferentes em comparação com o do controle do tipo selvagem (Col-0) (Figura 1A e Figura 2A). Com base na experiência, genótipos com menos estômatos requerem tempos de coloração mais longos com TBO (Figura 1B e Figura 2D,E), enquanto genótipos com mais estômatos e agrupamentos requerem tempos de coloração mais curtos (Figura 1C e Figura 2B,C). Como quantidades variáveis de peptídeos adequadamente dobrados na solução peptídica total podem mascarar a atividade biológica dos peptídeos no desenvolvimento estomático, é uma boa prática usar concentrações totais adicionais e mais altas da solução peptídica (por exemplo, 2,5 μM EPF2), bem como genótipos que tenham menos ou mais fenótipos estomatáticos (por exemplo, epf2), para os bioensaios. A atividade dos peptídeos EPF2, que têm um papel na inibição do início estomatizante, foi facilmente detectada usando mutantes epf2 com mais células epidérmicas do que Col-0, mesmo que certos lotes dos peptídeos EPF2 preparados tivessem quantidades menores das formas bioativas do peptídeo (por exemplo, lote 1 de solução de peptídeo EPF2 na Figura 4).
Figura 1: Efeito do tempo de incubação com TBO sobre os genótipos que apresentaram diferentes fenótipos epidérmicos. Imagens de cotilédones abaxiais de plântulas de 10 dias de idade de três genótipos de Arabidopsis: (A) tipo selvagem (Col-0), (B) linhagem silenciada por STOMAGEN (STOMAGEN-ami) e (C) epf1 epf2 mutantes. Col-0 representa o controle de Arabidopsis do tipo selvagem, e a linha silenciada por STOMAGEN e os mutantes epf1 epf2 representam os genótipos com baixo e alto número de estômatos, respectivamente. As imagens foram obtidas em microscópio invertido com lente objetiva de 20x (campo de visão de 0,35 mm2). A qualidade das imagens foi variável, embora todas as amostras de cotilédones dos diferentes genótipos tenham sido coradas com TBO (TBO a 0,5% em H 2 O) pelo mesmo período de tempo (2min) antes da imagem. Portanto, para a obtenção de imagens bem coradas para análise, é importante predeterminar o tempo adequado de coloração de TBO para cada genótipo. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens da epiderme corada por TBO sem o uso de peelings epidérmicos para análise quantitativa. Imagens representativas da epiderme de cotilédones de plântulas de 10 dias de idade de linhagens transgênicas do tipo selvagem (Col-0), (B) tmm e (C,D) carregando um construto de superexpressão EPF2 induzível por estradiol (Est::EPF2) ou (E) EPF1 (Est::EPF1) podem ser usadas para a análise quantitativa do fenótipo epidérmico. Um cotilédones em solução de fixação por mais de 3 anos foi utilizado para a obtenção da imagem apresentada em (E). As imagens foram obtidas em microscópio invertido com lente objetiva de 20x (campo de visão de 0,35 mm2). As células foram delineadas por coloração TBO, e metade da largura das imagens em tamanho real é apresentada para exibição. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Procedimento para os bioensaios . (A) As sementes são semeadas em duas placas de ágar 1/2 MS e retiradas em intervalos de 10 h. (B) As plântulas de Arabidopsis de 1 dia de idade são transplantadas para placas de 24 poços contendo 1/2 MS de meio com simulado ou duas concentrações peptídicas diferentes. (C) Após 5-7 dias, as plântulas estão prontas para exames de imagem para determinar a atividade biológica dos peptídeos no desenvolvimento e padronização estomática. (D) Uma fatia de cotilédones é colocada em uma gota de solução de iodeto de propídio em uma lâmina de microscópio para geração de imagens. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Microscopia confocal da epiderme abaxial de Arabidopsis cotyledons após tratamento peptídico. Imagens confocais representativas de epiderme de cotilédones do tipo selvagem (A) e (B) epf2 cultivadas por 6-7 dias em uma solução tampão e uma epiderme de cotilédones (C-F) epf2 cultivadas com dois lotes diferentes de peptídeos EPF2. As imagens foram obtidas em microscópio confocal com lente objetiva de 40x (excitação de 561 nm e filtro de emissão passa-longa de 561 nm) para captar a coloração de iodeto de propídio e visualizar os contornos celulares. Cada solução de peptídeo EPF2 preparada tem diferentes quantidades de formas devidamente dobradas (bioativas) e mal dobradas (inativas) dos peptídeos. Portanto, para a triagem inicial de peptídeos com um papel potencial no desenvolvimento estomático, recomenda-se a utilização de duas concentrações diferentes das soluções peptídicas totais, conforme indicado para os bioensaios. Barra de escala = 30 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os dois métodos de análise fenotípica para identificar e caracterizar os genes que controlam a padronização e diferenciação estomática aqui apresentados são ensaios convenientes e confiáveis, uma vez que os protocolos não exigem o uso de peelings epidérmicos e equipamentos especializados (que são demorados e requerem treinamento especial para o preparo da amostra), mas produzem imagens de alta qualidade para a análise quantitativa dos fenótipos epidérmicos.
Uma limitação dessa técnica para análise fenotípica utilizando Arabidopsis cotyledons corados com TBO é que a obtenção de imagens de alta qualidade com contraste visual para diferentes tipos de células epidérmicas depende do tempo de coloração e das características únicas do tecido, que podem ser tanto dependentes da espécie quanto dependentes do genótipo (Figura 1)18 . Outros métodos de fenotipagem para observar células epidérmicas usando peelings epidérmicos têm os mesmos desafios, e também exigem mais tempo e treinamento especial. Dificuldades na obtenção de imagens de epiderme adequadamente coradas suficientes para a análise dos dados podem ser evitadas pela coloração de cotilédones de genótipos com menos estômatos por períodos mais longos de tempo e amostras de genótipos com mais estômatos por períodos mais curtos de tempo. O tempo de coloração para cada genótipo também pode ser ajustado verificando primeiro apenas algumas amostras para otimizar o tempo de coloração para genótipos com fenótipos epidérmicos semelhantes.
Obter uma quantidade suficiente de peptídeos bioativos bem dobrados, especialmente peptídeos ricos em cisteína (que são ligantes que têm diversas funções no controle do desenvolvimento das plantas, incluindo a padronização estomática), tem sido um desafio 1,2,3,4,5,6,19,20,21,22,23 . Além disso, mesmo que peptídeos bioativos sejam gerados, a triagem de peptídeos que têm funções potenciais em processos biológicos específicos é outra tarefa desafiadora porque os peptídeos bioativos produzidos são frequentemente uma mistura de peptídeos bem dobrados, ativos e inativos. Este trabalho apresenta um método de bioensaio eficiente para descobrir e caracterizar potenciais peptídeos estomáticos. Esse método tem sido bem-sucedido na identificação de vários peptídeos importantes que controlam diferentes aspectos do desenvolvimento estomático em Arabidopsis, bem como no capim Brachypodium 3,4,7,17. No entanto, a principal limitação dessa técnica é a variabilidade nas respostas fenotípicas, o que provavelmente ocorre devido ao uso de plântulas com estágios de desenvolvimento ligeiramente diferentes e soluções peptídicas contendo diferentes quantidades de peptídeos bioativos. As primeiras tentativas deste método envolveram a colocação de sementes do tipo selvagem diretamente nos poços de uma placa contendo uma solução peptídica após a estratificação. Sem o uso de genótipos que tenham mais e/ou menos células epidérmicas (por exemplo, epf2 2, Figura 4) e plântulas de Arabidopsis com 1 dia de idade germinadas em placas de ágar 1/2 MS, um número menor de plântulas é capaz de crescer e mostrar respostas fenotípicas claras após a aplicação do peptídeo. Neste protocolo, a questão da variabilidade foi abordada usando ~20 mudas de Arabidopsis de um dia de idade com dois estágios de desenvolvimento diferentes e usando duas concentrações diferentes de solução peptídica (1 μM e 2,5 μM).
Os fenótipos epidérmicos das amostras tratadas com peptídeos também podem ser analisados pelo primeiro método de análise fenotípica apresentado por meio de amostras coradas com TBO. Este método permite uma análise fenotípica quantitativa relativamente fácil porque uma área relativamente grande de cada amostra pode ser analisada. Além disso, este método oferece flexibilidade na preparação da amostra após a colheita de amostras preparadas nas mesmas condições para a imagem. No entanto, as imagens tiradas por este método geralmente não são da mais alta qualidade. Por outro lado, a imagem confocal após a coloração com iodeto de propídio fornece imagens de maior qualidade com detalhes epidérmicos. No entanto, este método só permite que uma pequena área de tecido seja focada para análise. Além disso, apenas um certo número de tecidos vivos preparados pode ser analisado de uma só vez.
Em conclusão, a análise fenotípica aqui apresentada pode ser utilizada para o exame rápido e eficaz dos potenciais genes que controlam a padronização e diferenciação estomática, melhorando assim a compreensão dos mecanismos de desenvolvimento estomático e função peptídica. Além disso, este protocolo de bioensaio pode ser usado para identificar outras pequenas moléculas que têm um papel na padronização do tecido epidérmico e como um método de triagem inicial para determinar a estrutura de peptídeos bioativos bem dobrados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não foram declarados conflitos de interesses.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada através do programa de Descoberta do Conselho de Pesquisa de Recursos Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) e da Universidade de Concordia. K.B. é apoiado pela National Overseas Scholarship da Índia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1--A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
