Summary
Bu yazıda stoma gelişimini kontrol eden genleri karakterize etmek için epidermal peeling kullanılmadan iki fenotipleme yöntemi anlatılmaktadır. İlk yöntem, toluidin mavisi O-boyalı bitki epidermisi kullanılarak stoma fenotipinin nasıl analiz edileceğini göstermektedir. İkinci yöntem, stoma ligandlarının nasıl tanımlanacağını ve biyolojik aktivitelerinin nasıl izleneceğini açıklar.
Abstract
Stomalar, gaz değişimi ve su buharı salınımında rol oynayan kara bitkilerinin yüzeyindeki küçük gözeneklerdir ve işlevleri bitki verimliliği ve hayatta kalması için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, stomaların geliştiği mekanizmaları ve desenini anlamak muazzam bir agronomik değere sahiptir. Bu yazıda Arabidopsis kotiledonlarının kullanıldığı ve stoma gelişimini ve paternlemesini kontrol eden genleri karakterize etmek için kullanılabilecek iki fenotipik yöntem anlatılmaktadır. İlk olarak toluidin mavisi O-boyalı kotiledonlar kullanılarak stoma fenotiplerini analiz etmek için prosedürler sunulmuştur. Bu yöntem hızlı ve güvenilirdir ve fenotipik analizler için yaygın olarak kullanılan ancak özel eğitim gerektiren epidermal peelinglerin kullanılmasını gerektirmez. Multipl sistein kalıntılarının varlığı nedeniyle, stoma gelişiminde rol oynayan biyoaktif EPF peptitlerinin tanımlanması ve üretilmesi zor olmuştur. Bu nedenle, ikinci sunulan stoma ligandlarını tanımlamak ve biyolojik aktivitelerini biyotahlillerle izlemek için kullanılan bir prosedürdür. Bu yöntemin temel avantajı, peptid çözeltisinin miktarını ve peptidlerin stoma desenini ve gelişimini kontrol etmedeki rolünü karakterize etmek için gereken süreyi azaltırken, nispeten kolay bir şekilde tekrarlanabilir veriler üretmesidir. Genel olarak, bu iyi tasarlanmış protokoller, aktiviteleri için oldukça karmaşık yapılar gerektiren sistein bakımından zengin salgı peptitleri de dahil olmak üzere potansiyel stoma düzenleyicilerini incelemenin verimliliğini arttırır.
Introduction
Bitki stomalarının uygun şekilde modellenmesi ve farklılaşması, fotosentez ve terleme olmak üzere iki temel biyolojik süreçteki işlevleri için kritik öneme sahiptir ve EPF peptid sinyal yolları tarafından uygulanır. Arabidopsis'te, salgılanan üç sistein bakımından zengin peptit, EPF1, EPF2 ve STOMAGEN / EPFL9, stoma gelişiminin farklı yönlerini kontrol eder ve ERECTA-ailesi reseptör kinazları (ER, ERL1 ve ERL2), SERK'ler ve TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 dahil olmak üzere hücre yüzeyi reseptör bileşenleri tarafından algılanır. . Bu tanıma daha sonra MAPK'ya bağımlı bir süreç11 ile stoma farklılaşmasını teşvik eden transkripsiyon faktörlerinin aşağı regülasyonuna yol açar. Bu çekirdek stoma genlerinin keşfi öncelikle epidermal defekt sergileyen mutantların fenotipik taraması ile sağlanır. Bu yazıda, stoma paternini ve farklılaşmasını kontrol eden potansiyel genleri tanımlamak ve karakterize etmek için gerekli olan stomaların ve diğer epidermal hücrelerin görselleştirilmesi için nispeten basit ve etkili fenotipleme yöntemleri sunulmaktadır.
Bitki epidermisinin detaylarının gözlemlenmesi tipik olarak, toluidin mavisi O (TBO) veya safranin12,13,14 gibi bir boya ile lekelenmiş veya lekelenmemiş epidermal kabuklar kullanılarak elde edilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin temel zorluğu, yaprakları yırtmadan yaprak epidermisini soymak ve yaprağın farklı bölgelerinden alınan görüntülerden kaçınırken desen verilerini dikkatlice gözlemlemek ve analiz etmek için özel eğitim gerektirmesidir. Doku örneklerini kloral hidrat bazlı temizleme çözeltileri gibi reaktiflerle temizlemeye yönelik kimyasal işlemler, çeşitli biyolojik materyaller için de yaygın olarak kullanılmaktadır 8,15; Bu tedaviler, yüksek kaliteli görüntüler sağlayarak çok sayıda fenotipik bilgi üretir, ancak aynı zamanda tehlikeli kimyasalların (örneğin, formaldehit, kloral hidrat) kullanılmasını gerektirir. Bu yazıda ilk olarak, kantitatif analiz için yeterli görüntü üreten, ancak numune hazırlama için tehlikeli kimyasalların ve epidermal yaprak kabuklarının kullanılmasını gerektirmeyen nispeten kolay ve kullanışlı bir fenotipleme yöntemi sunulmaktadır. TBO boyalı kotiledon epidermisi stoma gelişiminin incelenmesi için de idealdir, çünkü trikomların eksikliği ve kotiledonlardaki daha küçük gelişimsel gradyan, epidermal fenotiplerin basit ve izlenebilir bir şekilde yorumlanmasına izin verir.
Stomatal EPF peptitleri, nispeten büyük olgun boyutlara ve korunmuş sistein kalıntıları arasındaki intramoleküler disülfit bağlarına sahip bitkiye özgü, sistein bakımından zengin peptitler grubuna aittir. Doğru konformasyonel katlama, biyolojik işlevleri için kritik öneme sahiptir, ancak kimyasal sentez veya heterolog bir rekombinasyon sistemi tarafından üretilen sistein bakımından zengin peptitler inaktif olabilir ve hem uygun şekilde katlanmış hem de katlanmamış peptitlerin bir karışımıdır 3,7,16. Bu nedenle, stoma gelişiminin kontrolünde rol oynayan biyoaktif peptitlerin taranması çok zorlu bir görev olmuştur. Bu makale ayrıca biyoaktif stoma peptitlerinin daha iyi tanımlanması ve karakterizasyonu için bir biyotahlil açıklamaktadır. Bu yöntemde, Arabidopsis fideleri 6-7 gün boyunca potansiyel peptitleri olan ve olmayan ortamlar içeren çok kuyucuklu bir plakada yetiştirilir. Daha sonra, kotiledon epidermisi konfokal mikroskop kullanılarak görselleştirilir. Genel olarak, stoma gelişiminde potansiyel peptitlerin biyolojik aktivitesini açıkça görselleştirmek için, daha fazla epidermal hücre üreten epf2 mutantı ve azalmış epidermalhücre yoğunluğu 2,4,5 veren STOMAGEN-ami hattı gibi az ya da çok stoma soy hücreleri üreten genotipler, biyotahliller için vahşi tip Arabidopsis kontrolüne (Col-0) ek olarak kullanılır.
Genel olarak, burada sunulan iki protokol, çeşitli epidermal fenotiplerin hızlı ve verimli bir şekilde değerlendirilmesi ve stoma paterninin ve gelişiminin kontrolünde rol oynayan küçük peptitlerin ve hormonların taranması için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Arabidopsis kotiledonlarının TBO ile boyanması
- Tohum sterilizasyonu ve büyüme koşulları
- Bir mikrosantrifüj tüpünde genotip başına ~ 30 Arabidopsis tohumunu, 1 mL tohum sterilizasyon çözeltisi (% 33 ticari ağartıcı,% 0.1 Triton X-100) ekleyerek sterilize edin ve oda sıcaklığında (RT) 10-12 dakika boyunca hafifçe sallayın.
NOT: Kimyasal olarak indüklenebilir bir gen (örneğin, Est::EPF2 7) taşıyan ~30 yabani tip Arabidopsis katılımının ~30 tohumunu ve/veya kimyasal olarak indüklenebilir bir gen (örneğin, Est::EPF27) taşıyan ~60 transgenik bitki tohumunu, kontrol olarak indükleyici olmadan (örneğin β, Şekil 1 ve Şekil 2) indükleyici olmadan (örneğin, %0,8 agar [w/v] içeren 2,16 g/L) sterilize edin (Şekil 1 ve Şekil 2). - Sterilizasyon çözeltisini çıkarın, tohumları laminer bir akış başlığında 1 mL steril suyla dört kez yıkayın ve ~ 200 μL steril% 0.1 agar içinde tekrar askıya alın.
- Bir pipet kullanarak transgenin kimyasal indüksiyonu için 1/2 MS agar plakalarına veya bir indükleyici (örneğin, 10 μM β-estradiol) içeren 1/2 MS agar plakalarına genotip başına ~ 30 tohum ekin ve mikropore bant ile kapatın.
NOT: Tohumların yakın bir yere yerleştirilmemesi için plakaya eşit olarak dağıtılması gerekir, çünkü bu, fidelerin düzgün bir şekilde büyümesini önleyecektir. - Çimlenmeyi senkronize etmek için plakaları 3-5 gün boyunca ışıksız 4 ° C'ye yerleştirerek tohumları tabakalaştırın.
- Tabakalaşmadan sonra, plakaları 10 gün boyunca 16 saat ışık ve 8 saat karanlık fotoperiyodu ile 120 μmol · m − 2 · s − 1 ışık altında 22 ° C'de bir büyüme odasında inkübe edin.
- Bir mikrosantrifüj tüpünde genotip başına ~ 30 Arabidopsis tohumunu, 1 mL tohum sterilizasyon çözeltisi (% 33 ticari ağartıcı,% 0.1 Triton X-100) ekleyerek sterilize edin ve oda sıcaklığında (RT) 10-12 dakika boyunca hafifçe sallayın.
- Arabidopsis kotiledonlarının örneklenmesi ve TBO boyanması
- Çimlenmeden sonraki 10 günde, değişkenliği sınırlamak için plakadaki diğer fidelerle eşit olarak büyüyen bireysel fidelerden kotiledonlardan birini dikkatlice seçin ve kesin.
NOT: Kotiledonlar 10 günlük fidelerden örneklenir, çünkü epidermal fenotiplerin yorumlanmasını kolaylaştıran trikomlara ve olgunlaşmamış epidermis hücrelerine sahip değildirler. - Forseps kullanarak her bir kotiledonu, 1 mL'lik bir sabitleme çözeltisi (asetik aside 9: 1 etanol) içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve numuneyi sabitleme çözeltisinde geceleyin, minimumda ve oda sıcaklığında bırakın.
NOT: Numuneler daha sonra bu durumda birkaç yıla kadar saklanabilir. Şekil 2E görüntüsü, 3 yıldan fazla bir süredir sabitleme çözeltisinde saklanan bir kotiledon örneğinden alınmıştır. Kotiledonun kesildikten hemen sonra bir sabitleme çözeltisinde tutulması ve daha sonra homojen numune hazırlanması için her mikrosantrifüj tüpüne beşten fazla kotiledon yerleştirilmemesi önemlidir. - Sabitleme çözeltisini çıkarın ve 1 mL% 70 etanol ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirdikten sonra, numuneleri içeren tüpü RT'de ~ 30 dakika bekletin.
- 1.2.3 adımını 1 mL% 50 etanol ve ardından% 20 etanol kullanarak tekrarlayın.
- 1 mL% 20 etanol'ü 1 mL damıtılmış su ile değiştirin ve ardından tüpü birkaç kez ters çevirdikten sonra kotiledon örneklerini içeren tüpü ~ 30 dakika bırakın.
NOT: Numuneler damıtılmış suda 24 saatten fazla kalabilir, ancak kantitatif analiz için iyi kalitede görüntüler (farklı epidermal hücre tipleri için iyi boyanmış görüntüler) elde etmek için bu önerilmez. - Tüm damıtılmış suyu tüpten çıkarın. Ardından, hemen ~2 dakika boyunca ~200 μL TBO boyama çözeltisi (H2O'da% 0.5 TBO, filtrelenmiş) ekleyin.
NOT: İnkübasyon sırasında tüpleri hafifçe sallayarak her kotiledon numunesinin TBO çözeltisine eşit şekilde maruz kaldığından emin olun. TBO ile aşırı boyama önlemek için (boyama zamanlaması esastır ve her genotip için değişken olabilir), bir seferde numune içeren altıdan fazla tüp işlemeyin. - TBO boyama çözeltisini mümkün olduğunca iyice çıkarın ve ardından 1 mL taze damıtılmış su ekleyerek numuneleri birkaç kez hemen yıkayın.
- Çimlenmeden sonraki 10 günde, değişkenliği sınırlamak için plakadaki diğer fidelerle eşit olarak büyüyen bireysel fidelerden kotiledonlardan birini dikkatlice seçin ve kesin.
- Görüntüleme ve veri analizi
- Bir mikroskop slaytı alın ve% 15 gliserol (~ 50 μL) damla ekleyin. Kotiledonu, abaksiyel tarafı yukarı doğru ince forseps kullanarak slaytta% 15 gliserol içine yerleştirin. Ardından, oluşan hava kabarcıklarının numuneden çıkarılabilmesi için yavaşça bir kapak kayması ile örtün.
- Kotiledon epidermisinin abaksiyel tarafını parlak alan mikroskobu kullanarak görüntüleyin (Şekil 1 ve Şekil 2) ve ardından stoma sayısını ve diğer epidermal hücre tiplerini sayarak epidermal fenotipi inceleyin.
- Her genotip için, Jangra ve ark.17 tarafından açıklanan aşağıdaki formülleri kullanarak epidermal fenotipi hesaplayın:
Stomatal indeks (%) = (Domates sayısı/Toplam epidermal hücre sayısı) × 100
Stomatal yoğunluk (mm−2) = Domates sayısı/Alan (mm2)
NOT: Her genotip için en az sekiz kotiledon (N = 8) görüntüleyin ve her genotipin epidermal fenotipini, bir indükleyici olmadan yetiştirilen kimyasal olarak indüklenebilir bir transgeni ifade eden vahşi tip bitki ve / veya transgenik bitkilerin fenotipiyle karşılaştırarak belgeleyin.
2. Stoma peptitleri için biyotahliller
NOT: Biyotahliller için prosedür Şekil 3'te gösterilmiştir.
- Tohum sterilizasyonu ve büyüme koşulları
- Yukarıdaki gibi her işlem için ~ 25 tohumu sterilize edin ve tohumların yaklaşık yarısını laminer bir akış başlığında iki 1/2 MS agar plakasının her birine ekin.
NOT: Peptitlerin epidermal hücre paternleme ve farklılaşması üzerindeki biyolojik aktivitelerini kolayca tespit etmek için vahşi tip bir arka plan (örneğin, Col-0) kullanmak yerine, yüksek ve / veya düşük epidermal hücrelerle (örneğin, epf2 2) genotipi kullanın (örneğin, epf2 2). - Tohumları karanlıkta 4 ° C'de 3 gün boyunca tabakalaştırın.
- İki plakanın her birini ~ 10 saatlik aralıklarla çıkarın ve tohumları 1 gün boyunca 120 μmol · m − 2 · s − 1 ışık altında 22 ° C'de plakalar üzerinde 16 saat ışık ve 8 saat karanlık fotoperiyodu ile inkübe edin.
- Yukarıdaki gibi her işlem için ~ 25 tohumu sterilize edin ve tohumların yaklaşık yarısını laminer bir akış başlığında iki 1/2 MS agar plakasının her birine ekin.
- Peptit tedavisi ve görüntüleme
- Laminer bir akış başlığında, hazırlanan iki plakanın her birinden 10-12 günlük Arabidopsis fidelerini, her bir kuyucukta 1,5 mL 1/2 MS sıvı ortam içeren 24 kuyucuklu bir plakaya dikkatlice aktarın (kuyu başına ~ 20 fide).
NOT: Fideler için peptid tedavisinin zamanlaması, peptid tedavisinin fenotipik sonuçları için kritik öneme sahiptir, bu nedenle tedavi için iki farklı fide gelişim aşaması elde etmek için tohumları iki ayrı plaka üzerinde hazırlayın. - 1/2 MS agar plakalarında çimlenmiş ~20 günlük Arabidopsis fideleri içeren her bir kuyuğa tek başına bir tampon (50 mM Tris-HCl [pH 8.0]) veya iki farklı peptit konsantrasyonu (tipik olarak, 50 mM Tris-HCl [pH 8.0]'da 1 μM ve 2.5 μM peptid) ekleyin.
NOT: Peptit çözeltisi alikotlarını bir dondurucudan çıkarın ve tedaviden önce birkaç dakika RT'de tutun. Bir dondurucuda -80 ° C'de depolanan peptitler birkaç yıl boyunca stabildir, ancak peptid çözeltisini küçük alikotlarda depolayarak donma-çözülme döngülerinden kaçınılmalıdır. - Fideleri tek başına bir tamponla veya pipet kullanarak bir peptit çözeltisiyle hafifçe karıştırdıktan sonra, plakayı mikro gözenek bandı ile kapatın. Tahlil plakasını 22 °C'de 5-7 gün boyunca uzun gün koşullarında (16 saatlik fotoperiyot, 120 μmol · m − 2 · s − 1 ışık) inkübe edin.
NOT: Her bir fidenin peptit çözeltisine bile maruz kalmasına izin vermek için fidelerin birbirine çok yakın büyümesini önleyin. Havalandırmayı arttırmak için plakayı bir büyüme odasında inkübe etmeden önce plakayı 2-3 saat yavaşça döndürün. - Her bir fideyi tek başına tampon veya peptit içeren kuyudan bir kapak slaytına aktarın ve fidenin kotiledonunu disseke edin. Kotiledonun abaxial tarafını forseps kullanarak yukarı yerleştirin ve küçük parçalara ayırın.
- Başka bir temiz mikroskop slaytı alın ve üzerine bir damla propidium iyodür çözeltisi (~ 25 μL, H 2 O'da2mg / mL) yerleştirin.
- Küçük kotiledon parçalarından birini forseps kullanarak bir damla propidium iyodür çözeltisine yerleştirin ve kapak kaymasını yavaşça yerleştirin. Oluşan hava kabarcıklarını gidermek için kapak kaymasının kenarına ek propidiyum iyodür çözeltisi uygulayın.
- Konfokal mikroskop kullanarak kotiledonun abaksiyel tarafını görüntüleyin ve görüntüleri yalnızca tampon içeren 1/2 MS ortamında yetiştirilen fidelerden elde edilen görüntülerle karşılaştırın.
NOT: Şekil 4'te sunulan görüntüler, sadece tamponla muamele edilen vahşi tip Col-0 veya epf22,5 fidelerinden (Şekil 4A, B) veya iki parti EPF2 peptid çözeltisinden (Şekil 4C-F) alınmış ve 1 yıl boyunca -80 ° C'de saklanmıştır.
- Laminer bir akış başlığında, hazırlanan iki plakanın her birinden 10-12 günlük Arabidopsis fidelerini, her bir kuyucukta 1,5 mL 1/2 MS sıvı ortam içeren 24 kuyucuklu bir plakaya dikkatlice aktarın (kuyu başına ~ 20 fide).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Daha az veya daha fazla stoma yoğunluğuna ve kümelenmesine sahip olduğu bilinen çeşitli stoma transgenik bitkileri ve mutantları (epf2 2,5, epf1 epf2 2,5, tmm12, STOMAGEN-susturulmuş bir hat4 ve estradiol ile indüklenebilir Est::EPF1 veya Est::EPF2 aşırı ekspresyon yapısını taşıyan transgenik hatlar 7 ) stoma gelişimi ve modellemesinde rol oynayan genleri tanımlamayı ve karakterize etmeyi amaçlayan burada sunulan iki fenotipik analizin etkinliğini göstermek için kullanılmıştır. Analiz için farklı tipte epidermal hücreleri ölçmek için epidermal peelinglere ihtiyaç duymadan yüksek kaliteli epidermis görüntüleri üretmek için, her genotip için TBO ile numune boyama süresini önceden ayarlamak çok önemlidir, çünkü her biri vahşi tip kontrolüne (Col-0) kıyasla farklı epidermal fenotiplere sahip olabilir (Şekil 1A ve Şekil 2A). Deneyimlere dayanarak, daha az stomaya sahip genotipler TBO ile daha uzun boyama süreleri gerektirirken (Şekil 1B ve Şekil 2D, E), daha fazla stoma ve kümelenme ile genotipler daha kısa boyama süreleri gerektirir (Şekil 1C ve Şekil 2B, C). Toplam peptit çözeltisindeki uygun şekilde katlanmış peptitlerin değişen miktarları, stoma gelişiminde peptitlerin biyolojik aktivitesini maskeleyebildiğinden, biyotahliller için peptid çözeltisinin ek, daha yüksek toplam konsantrasyonlarının (örneğin, 2.5 μM EPF2) yanı sıra daha az veya daha fazla stoma fenotipine (örneğin, epf2) sahip genotiplerin kullanılması iyi bir uygulamadır. Stoma başlangıcını inhibe etmede rol oynayan EPF2 peptidlerinin aktivitesi, hazırlanan EPF2 peptidlerinin belirli partilerinde peptidin biyoaktif formlarının daha küçük miktarlarına sahip olsa bile, Col-0'dan daha fazla epidermal hücreye sahip epf2 mutantları kullanılarak kolayca tespit edilmiştir (örneğin, Şekil 4'teki EPF2 peptid çözeltisi parti 1).
Şekil 1: TBO ile inkübasyon süresinin farklı epidermal fenotipler sergileyen genotipler üzerindeki etkisi. Üç Arabidopsis genotipinin 10 günlük fidelerinden abaxial kotiledon görüntüleri: (A) vahşi tip (Col-0), (B) bir STOMAGEN-susturulmuş çizgi (STOMAGEN-ami) ve (C) epf1 epf2 mutantları. Col-0, vahşi tip Arabidopsis kontrolünü temsil eder ve STOMAGEN-susturulmuş çizgi ve epf1 epf2 mutantları, sırasıyla düşük ve yüksek sayıda stoma ile genotipleri temsil eder. Görüntüler, 20x objektif lensli (0.35 mm2 görüş alanı) ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak çekildi. Görüntülerin kalitesi değişkendi, ancak farklı genotiplerden alınan tüm kotiledon örnekleri görüntülemeden önce aynı süre (2 dakika) boyunca TBO (H2O'da% 0.5 TBO) ile boyandı. Bu nedenle, analiz için iyi boyanmış görüntüler elde etmek için, her genotip için yeterli TBO boyama süresini önceden belirlemek önemlidir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kantitatif analiz için epidermal peeling kullanılmadan TBO boyalı epidermis görüntüleri. Epidermal fenotipin kantitatif analizi için (A) vahşi tip (Col-0), (B) tmm ve (C,D) transgenik çizgilerin 10 günlük fidelerinden elde edilen kotiledonların temsili epidermis görüntüleri, estradiol ile indüklenebilir EPF2 (Est::EPF2) veya (E) EPF1 aşırı ekspresyon yapısı (Est::EPF1) için kullanılabilir. (E)'de sunulan görüntüyü almak için 3 yıldan fazla bir süredir sabitleme çözeltisindeki bir kotiledon kullanıldı. Görüntüler, 20x objektif lensli (0.35 mm2 görüş alanı) ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak çekildi. Hücreler TBO boyama ile özetlendi ve tam boyutlu görüntülerin genişliğinin yarısı görüntülenmek üzere sunuldu. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Biyotahlil prosedürü . (A) Tohumlar iki adet 1/2 MS agar plakasına ekilir ve 10 saatlik aralıklarla çıkarılır. (B) 1 günlük Arabidopsis fideleri, sahte veya iki farklı peptit konsantrasyonu ile 1/2 MS ortamı içeren 24 kuyucuklu plakalara nakledilir. (C) 5-7 gün sonra, fideler stoma gelişimi ve modellemesinde peptitlerin biyolojik aktivitesini belirlemek için görüntülemeye hazırdır. (D) Bir kotiledon dilimi, görüntüleme için mikroskop slaytı üzerine bir damla propidiyum iyodür çözeltisi içine yerleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Peptit tedavisini takiben Arabidopsis kotiledonlarının abaxial epidermisinin konfokal mikroskopisi. Bir tampon çözeltisinde 6-7 gün boyunca yetiştirilen (A) vahşi tip ve (B) epf2 kotiledon epidermisinin ve iki farklı EPF2 peptit partisi ile yetiştirilen bir (C-F) epf2 kotiledon epidermisinin temsili konfokal görüntüleri. Görüntüler, propidyum iyodür boyamasını yakalamak ve hücre ana hatlarını görselleştirmek için 40x objektif lens (561 nm uyarma ve 561 nm uzun geçirgen emisyon filtresi) kullanılarak konfokal bir mikroskop kullanılarak çekildi. Hazırlanan her EPF2 peptid çözeltisi, peptitlerin farklı miktarlarda düzgün katlanmış (biyoaktif) ve yanlış katlanmış (inaktif) formlarına sahiptir. Bu nedenle, stoma gelişiminde potansiyel bir rolü olan peptitlerin ilk taraması için, biyotahliller için belirtildiği gibi toplam peptid çözeltilerinin iki farklı konsantrasyonunun kullanılması önerilir. Ölçek çubuğu = 30 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan stoma paternleme ve farklılaşmayı kontrol eden genleri tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılan iki fenotipik analiz yöntemi, protokoller epidermal peelinglerin ve özel ekipmanların (zaman alıcı olan ve numune hazırlama için özel eğitim gerektiren) kullanılmasını gerektirmediğinden, ancak epidermal fenotiplerin kantitatif analizi için yüksek kaliteli görüntüler ürettiğinden, uygun ve güvenilir analizlerdir.
TBO boyalı Arabidopsis kotiledonları kullanılarak yapılan fenotipik analiz için bu tekniğin bir sınırlaması, farklı epidermal hücre tipleri için görsel kontrastlı yüksek kaliteli görüntüler elde etmenin boyama süresine ve hem türe bağımlı hem de genotipe bağımlı olabilen dokunun benzersiz özelliklerine bağlı olmasıdır (Şekil 1)18 . Epidermal peelingleri kullanarak epidermal hücreleri gözlemlemek için kullanılan diğer fenotipleme yöntemleri de aynı zorluklara sahiptir ve ayrıca daha fazla zaman ve özel eğitim gerektirir. Veri analizi için yeterli olan düzgün boyanmış epidermis görüntülerinin elde edilmesindeki zorluklar, genotiplerden kotiledonların daha uzun süre daha az stoma ile boyanması ve genotiplerden alınan örneklerin daha kısa süreler için daha fazla stomaya sahip olması ile önlenebilir. Her genotip için boyama süresi, benzer epidermal fenotiplere sahip genotipler için boyama süresini optimize etmek için önce sadece birkaç örnek kontrol edilerek de ayarlanabilir.
Yeterli miktarda iyi katlanmış biyoaktif peptitlerin, özellikle de sistein bakımından zengin peptitlerin (stoma modellemesi de dahil olmak üzere bitki gelişimini kontrol etmede çeşitli işlevlere sahip ligandlar olan) elde edilmesi zor olmuştur 1,2,3,4,5,6,19,20,21,22,23 . Ayrıca, biyoaktif peptitler üretilse bile, belirli biyolojik süreçlerde potansiyel işlevlere sahip peptitlerin taranması başka bir zorlu görevdir, çünkü üretilen biyoaktif peptitler genellikle iyi katlanmış, aktif ve inaktif peptitlerin bir karışımıdır. Bu yazıda potansiyel stoma peptitlerini keşfetmek ve karakterize etmek için etkili bir biyotahlil yöntemi sunulmaktadır. Bu yöntem, Arabidopsis'te stoma gelişiminin farklı yönlerini kontrol eden çeşitli önemli peptitlerin yanı sıra Brachypodium 3,4,7,17 çiminin tanımlanmasında başarılı olmuştur. Bununla birlikte, bu tekniğin en büyük sınırlaması, büyük olasılıkla biraz farklı gelişim aşamalarına sahip fidelerin ve farklı miktarlarda biyoaktif peptit içeren peptit çözeltilerinin kullanımı nedeniyle ortaya çıkan fenotipik yanıtlardaki değişkenliktir. Bu yöntemdeki ilk girişimler, vahşi tip tohumların tabakalaşmadan sonra doğrudan bir peptid çözeltisi içeren bir plakanın kuyucuklarına yerleştirilmesini içeriyordu. Daha fazla ve / veya daha az epidermal hücreye sahip genotipler (örneğin, epf22, Şekil 4) ve 1/2 MS agar plakaları üzerinde çimlenmiş 1 günlük Arabidopsis fideleri kullanılmadan, peptid uygulamasından sonra daha az sayıda fide büyüyebilir ve net fenotipik yanıtlar gösterebilir. Bu protokolde, değişkenlik sorunu, iki farklı gelişim aşamasına sahip ~ 20 adet bir günlük Arabidopsis fidanı kullanılarak ve iki farklı konsantrasyonda peptid çözeltisi (1 μM ve 2.5 μM) kullanılarak ele alınmıştır.
Peptit ile muamele edilmiş numunelerin epidermal fenotipleri, TBO boyalı numuneler kullanılarak sunulan ilk fenotipik analiz yöntemi ile de analiz edilebilir. Bu yöntem nispeten kolay kantitatif fenotipik analize izin verir, çünkü her numunenin nispeten geniş bir alanı analiz edilebilir. Ek olarak, bu yöntem görüntüleme için aynı koşullarda hazırlanan numunelerin toplanmasından sonra numune hazırlamada esneklik sunar. Bununla birlikte, bu yöntemle çekilen görüntüler genellikle en yüksek kalitede değildir. Öte yandan propidium iyodür boyama sonrası konfokal görüntüleme, epidermal detaylarla daha kaliteli görüntüler verir. Bununla birlikte, bu yöntem analiz için sadece küçük bir doku alanına odaklanılmasına izin verir. Ayrıca hazırlanan canlı dokuların sadece belirli bir kısmı aynı anda analiz edilebilir.
Sonuç olarak, burada sunulan fenotipik analiz, stoma paternini ve farklılaşmasını kontrol eden potansiyel genlerin hızlı ve etkili bir şekilde incelenmesi için kullanılabilir, böylece stoma gelişimi ve peptid fonksiyonunun mekanizmalarının anlaşılmasını geliştirebilir. Ek olarak, bu biyotahlil protokolü, epidermal doku modellemesinde rol oynayan diğer küçük molekülleri tanımlamak için ve iyi katlanmış biyoaktif peptitlerin yapısını belirlemek için ilk tarama yöntemi olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Herhangi bir çıkar çatışması ilan edilmedi.
Acknowledgments
Bu araştırma, Kanada Doğal Kaynaklar ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Keşif programı ve Concordia Üniversitesi tarafından finanse edilmiştir. K.B., Hindistan'dan Ulusal Denizaşırı Bursu tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1--A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
