Summary
Denne artikkelen beskriver to fenotypingsmetoder uten bruk av epidermal peeling for å karakterisere genene som styrer stomatal utvikling. Den første metoden demonstrerer hvordan man analyserer en stomatal fenotype ved hjelp av en toluidinblå O-farget planteepidermis. Den andre metoden beskriver hvordan man identifiserer stomatale ligander og overvåker deres biologiske aktiviteter.
Abstract
Stomata er små porer på overflaten av landplanter som er involvert i gassutveksling og vanndamputslipp, og deres funksjon er kritisk for planteproduktivitet og overlevelse. Som sådan har forståelse av mekanismene som stomata utvikler seg og mønster enorm agronomisk verdi. Denne artikkelen beskriver to fenotypiske metoder ved bruk av Arabidopsis cotyledoner som kan brukes til å karakterisere genene som styrer stomatal utvikling og mønster. Presentert først er prosedyrer for analyse av stomatale fenotyper ved bruk av toluidinblå O-fargede cotyledoner. Denne metoden er rask og pålitelig og krever ikke bruk av epidermale peeling, som er mye brukt for fenotypiske analyser, men krever spesialisert opplæring. På grunn av tilstedeværelsen av flere cysteinrester har identifisering og generering av bioaktive EPF-peptider som har en rolle i stomatal utvikling vært utfordrende. Dermed presenteres andre er en prosedyre som brukes til å identifisere stomatale ligander og overvåke deres biologiske aktivitet ved bioassay. Den største fordelen med denne metoden er at den produserer reproduserbare data relativt enkelt, samtidig som mengden peptidløsning reduseres og tiden som kreves for å karakterisere peptidenes rolle i å kontrollere stomatal mønster og utvikling. Samlet sett forbedrer disse veldesignede protokollene effektiviteten ved å studere potensielle stomatale regulatorer, inkludert cysteinrike sekretoriske peptider, som krever svært komplekse strukturer for deres aktivitet.
Introduction
Riktig mønster og differensiering av plantestomata er avgjørende for deres funksjon i to grunnleggende biologiske prosesser, fotosyntese og transpirasjon, og håndheves av EPF-peptidsignalveier. I Arabidopsis kontrollerer tre utskilte cysteinrike peptider, EPF1, EPF2 og STOMAGEN / EPFL9, forskjellige aspekter av stomatal utvikling og oppfattes av celleoverflatereseptorkomponenter, inkludert ERECTA-familie reseptorkinaser (ER, ERL1 og ERL2), SERKs og TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Denne erkjennelsen fører deretter til nedregulering av transkripsjonsfaktorene som fremmer stomatal differensiering ved en MAPK-avhengig prosess11. Oppdagelsen av disse kjernestomatale genene oppnås først og fremst ved fenotypisk screening av mutanter som viser epidermale defekter. Denne artikkelen presenterer relativt enkle og effektive fenotypingsmetoder for å visualisere stomata og andre epidermale celler, som kreves for å identifisere og karakterisere potensielle gener som styrer stomatal mønster og differensiering.
Observasjonen av detaljene i planteepidermis har vanligvis blitt oppnådd ved å bruke epidermale peelinger med eller uten farging med et fargestoff som toluidinblå O (TBO) eller safranin12,13,14. Hovedutfordringen med disse metodene er imidlertid at de krever spesialisert trening for å skrelle bladepidermis uten å rive vevet og nøye observere og analysere mønsterdataene samtidig som man unngår bildene tatt fra forskjellige deler av bladet. Kjemiske behandlinger for å fjerne vevsprøvene med reagenser som kloralhydratbaserte clearingløsninger har også blitt mye brukt for et annet utvalg av biologiske materialer 8,15; Disse behandlingene genererer mye fenotypisk informasjon ved å gi bilder av høy kvalitet, men krever også bruk av farlige kjemikalier (f.eks. Formaldehyd, kloralhydrat). Denne artikkelen presenterer først en relativt enkel og praktisk fenotypingsmetode som produserer bilder som er tilstrekkelige for kvantitativ analyse, men krever ikke bruk av farlige kjemikalier og epidermale bladpeelinger for prøveprepareringen. En TBO-farget cotyledon epidermis er også ideell for studiet av stomatal utvikling fordi mangelen på trikomer og den mindre utviklingsgradienten i cotyledoner tillater enkel og traktabel tolkning av epidermale fenotyper.
Stomatale EPF-peptider tilhører gruppen av plantespesifikke, cysteinrike peptider som har relativt store modne størrelser og intramolekylære disulfidbindinger mellom konserverte cysteinrester. Korrekt konformasjonsfolding er kritisk for deres biologiske funksjon, men cysteinrike peptider, som produseres ved enten kjemisk syntese eller et heterologt rekombinasjonssystem, kan være inaktive og er en blanding av både riktig foldede og utfoldede peptider 3,7,16. Dermed har screening av bioaktive peptider som har en rolle i å kontrollere stomatal utvikling vært en svært utfordrende oppgave. Dette manuskriptet beskriver i tillegg et bioassay for bedre identifisering og karakterisering av bioaktive stomatale peptider. I denne metoden dyrkes Arabidopsis-frøplanter i en flerbrønnsplate som inneholder medier med og uten potensielle peptider i 6-7 dager. Deretter visualiseres cotyledon epidermis ved hjelp av et konfokalmikroskop. Generelt, for å tydelig visualisere den biologiske aktiviteten til potensielle peptider i stomatal utvikling, brukes genotypene som produserer flere og / eller mindre stomatale avstamningsceller, som epf2-mutanten, som produserer flere epidermale celler, og STOMAGEN-ami-linjen, som gir redusert epidermal celletetthet 2,4,5, i tillegg til villtype Arabidopsis-kontrollen (Col-0) for bioassayene.
Samlet sett kan de to protokollene som presenteres her brukes til rask og effektiv vurdering av ulike epidermale fenotyper og for screening av små peptider og hormoner som har en rolle i å kontrollere stomatal mønster og utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Farging av Arabidopsis cotyledoner med TBO
- Frøsterilisering og vekstforhold
- Steriliser ~30 Arabidopsisfrø per genotype i et mikrosentrifugerør ved å tilsette 1 ml av en frøsteriliseringsløsning (33% kommersielt blekemiddel, 0,1% Triton X-100), og gyng forsiktig i 10-12 minutter ved romtemperatur (RT).
MERK: Steriliser ~ 30 frø av villtype Arabidopsis tiltredelse Columbia (Col-0) og / eller ~ 60 frø av transgene planter som bærer et kjemisk induserbart gen (f.eks. Est:: EPF27) for å bruke transgene frøplanter dyrket på 1/2 Murashige og Skoog (MS) plater (2,16 g / L inneholdende 0,8% agar [w / v]) uten induktor (f.eks. β-østradiol) som kontroller (figur 1 og figur 2). - Fjern steriliseringsløsningen, vask frøene fire ganger med 1 ml sterilt vann i en laminær strømningshette, og resuspender dem i ~ 200 μL steril 0,1% agar.
- Så ~30 frø per genotype på 1/2 MS agarplater eller 1/2 MS agarplater inneholdende en induktor (f.eks. 10 μM β-østradiol) for kjemisk induksjon av transgenet (f.eks. Est::EPF27) ved hjelp av en pipette, og forsegle med mikroporetape.
NOTAT: Frøene må fordeles jevnt på tallerkenen for å unngå å plassere dem i nærheten, da dette vil forhindre at plantene vokser jevnt. - Stratifiser frøene ved å plassere platene ved 4 °C uten lys i 3-5 dager for å synkronisere spiringen.
- Etter lagdeling, inkuber platene i et vekstkammer ved 22 °C under 120 μmol·m−2·s−1 lys med en fotoperiode på 16 timer lys og 8 timer mørkt i 10 dager.
- Steriliser ~30 Arabidopsisfrø per genotype i et mikrosentrifugerør ved å tilsette 1 ml av en frøsteriliseringsløsning (33% kommersielt blekemiddel, 0,1% Triton X-100), og gyng forsiktig i 10-12 minutter ved romtemperatur (RT).
- Prøvetaking og TBO-farging av Arabidopsis cotyledoner
- På 10 dager etter spiring, velg nøye ut og kutt ut en av cotyledonene fra de enkelte plantene som vokser jevnt med andre frøplanter på platen for å begrense variasjonen.
MERK: Cotyledoner er samplet fra 10 dager gamle frøplanter fordi de ikke har trichomes og umodne epidermisceller, noe som forenkler tolkningen av epidermale fenotyper. - Plasser hver cotyledon i et mikrosentrifugerør inneholdende 1 ml av en fikseringsløsning (9: 1 etanol til eddiksyre) ved hjelp av tang, og la prøven ligge i fikseringsløsningen over natten, minimum og ved romtemperatur.
MERK: Prøvene kan deretter lagres i opptil et par år i denne tilstanden. Bildet Figur 2E ble hentet fra en cotyledonprøve som ble lagret i fikseringsløsning i over 3 år. Det er viktig å holde cotyledon i en fikseringsløsning umiddelbart etter kutting og å plassere ikke mer enn fem cotyledoner i hvert mikrosentrifugerør for homogen prøvepreparering senere. - Fjern fikseringsløsningen, og tilsett 1 ml 70% etanol. Etter å ha snudd røret et par ganger, la røret inneholde prøvene ved RT i ~ 30 min.
- Gjenta trinn 1.2.3 med 1 ml 50 % etanol og deretter 20 % etanol.
- Bytt ut 1 ml 20% etanol med 1 ml destillert vann, og la deretter røret som inneholder cotyledonprøvene stå i ~ 30 minutter etter å ha snudd røret noen ganger.
MERK: Prøvene kan forbli i destillert vann i mer enn 24 timer, men dette anbefales ikke for å oppnå bilder av god kvalitet (godt fargede bilder for forskjellige epidermale celletyper) for kvantitativ analyse. - Fjern alt destillert vann fra røret. Deretter tilsettes du umiddelbart ~200 μL TBO-fargeløsning (0,5% TBO iH2O, filtrert) i ~2 min.
MERK: Forsikre deg om at hver cotyledonprøve er jevnt utsatt for TBO-oppløsning ved å forsiktig flikke rørene under inkubering. For å unngå overfarging med TBO (tidspunktet for fargingen er viktig og kan variere for hver genotype), må du ikke behandle mer enn seks rør som inneholder prøver om gangen. - Fjern TBO-fargeløsningen så grundig som mulig, og vask deretter prøvene umiddelbart et par ganger ved å tilsette 1 ml ferskt destillert vann.
- På 10 dager etter spiring, velg nøye ut og kutt ut en av cotyledonene fra de enkelte plantene som vokser jevnt med andre frøplanter på platen for å begrense variasjonen.
- Bildebehandling og dataanalyse
- Ta et mikroskoplysbilde, og tilsett en dråpe på 15% glyserol (~ 50 μL). Plasser cotyledon med abaxialsiden opp i 15% glyserol på lysbildet ved hjelp av fine tang. Dekk den deretter forsiktig med en deksellapp slik at eventuelle luftbobler som dannes kan fjernes fra prøven.
- Avbilde den abaxiale siden av cotyledon epidermis ved hjelp av et brightfield-mikroskop (figur 1 og figur 2), og undersøk deretter epidermal fenotype ved å telle antall stomata og andre epidermale celletyper.
- For hver genotype, beregne epidermal fenotype ved hjelp av følgende formler beskrevet av Jangra et al.17:
Stomatal indeks (%) = (antall stomata/totalt antall epidermale celler) × 100
Stomatal tetthet (mm-2) = Antall stomata/areal (mm2)
MERK: Avbilde minst åtte cotyledoner (N = 8) for hver genotype, og dokumenter epidermal fenotype for hver genotype ved å sammenligne den med fenotypen til villtypeplanten og/eller transgene planter som uttrykker et kjemisk induserbart transgen dyrket uten en induktor.
2. Bioassays for stomatale peptider
MERK: Prosedyren for bioassays er vist i figur 3.
- Frøsterilisering og vekstforhold
- Steriliser ~25 frø for hver behandling som ovenfor, og så omtrent halvparten av frøene på hver av to 1/2 MS agarplater i en laminær strømningshette.
MERK: Bruk genotypen med høye og / eller lave epidermale celler (f.eks. epf22) i stedet for å bruke en villtypebakgrunn (f.eks. Col-0) for enkelt å oppdage de biologiske aktivitetene til peptidene på epidermal cellemønster og differensiering (figur 4). - Lag frøene i 3 dager ved 4 °C i mørket.
- Ta ut hver av de to platene med ~10 timers mellomrom, og rug frøene på plater ved 22 °C under 120 μmol·m−2·s−1 lys med en fotoperiode på 16 timer lys og 8 timer mørkt i 1 dag.
- Steriliser ~25 frø for hver behandling som ovenfor, og så omtrent halvparten av frøene på hver av to 1/2 MS agarplater i en laminær strømningshette.
- Peptidbehandling og avbildning
- I en laminær strømningshette, transplanter forsiktig 10-12 en dag gamle Arabidopsis-frøplanter fra hver av de to tilberedte platene til en 24-brønnsplate som inneholder 1,5 ml 1/2 MS flytende medium i hver brønn (~ 20 frøplanter per brønn).
MERK: Tidspunktet for peptidbehandlingen for plantene er avgjørende for de fenotypiske resultatene av peptidbehandlingen, så forbered frøene på to separate plater for å oppnå to forskjellige utviklingsstadier for frøplanter for behandlingen. - Legg enten en buffer alene (50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) eller to forskjellige konsentrasjoner av peptidet (vanligvis 1 μM og 2,5 μM peptid i 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) til hver brønn som inneholder ~ 20 en dag gamle Arabidopsis-frøplanter spiret på 1/2 MS agarplater.
MERK: Fjern peptidoppløsningsalikotene fra en fryser, og hold dem på RT i noen minutter før behandlingen. Peptider lagret i fryser ved -80 °C er stabile i et par år, men fryse-tine-sykluser bør unngås ved å lagre peptidløsningen i små alikoter. - Etter forsiktig blanding av plantene med en buffer alene eller en peptidløsning ved hjelp av en pipette, forsegl platen med mikroporebånd. Inkuber analyseplaten under lange dagsforhold (16 timers fotoperiode, 120 μmol·m−2·s−1 lys) i 5-7 dager ved 22 °C.
MERK: Forhindre at plantene vokser for tett sammen slik at hver frøplante kan ha jevn eksponering for peptidløsningen. Roter platen forsiktig i 2-3 timer før du inkuberer platen i et vekstkammer for å øke luftingen. - Overfør hver frøplante fra brønnen som inneholder enten buffer alene eller peptid på et deksel, og dissekere plantens cotyledon. Plasser den abaxiale siden av cotyledon opp med tang, og kutt den i små biter.
- Ta et annet rent mikroskoplysbilde, og legg på det en dråpe propidiumjodidoppløsning (~ 25 μL, 2 mg / ml i H2O).
- Plasser en av de små bitene av cotyledon i en dråpe propidiumjodidoppløsning ved hjelp av tang, og plasser forsiktig dekselet. Påfør ytterligere propidiumjodidoppløsning på kanten av dekselet for å fjerne eventuelle luftbobler som har dannet seg.
- Bilde den abaxiale siden av cotyledon ved hjelp av et konfokalmikroskop, og sammenlign bildene med bildene fra frøplanter dyrket i 1/2 MS medium som bare inneholder buffer.
MERK: Bildene presentert i figur 4 ble tatt fra villtype Col-0 eller epf22,5 frøplanter som kun ble behandlet med buffer (figur 4A, B) eller to partier EPF2 peptidløsning (figur 4C-F) og ble lagret ved -80 ° C over 1 år.
- I en laminær strømningshette, transplanter forsiktig 10-12 en dag gamle Arabidopsis-frøplanter fra hver av de to tilberedte platene til en 24-brønnsplate som inneholder 1,5 ml 1/2 MS flytende medium i hver brønn (~ 20 frøplanter per brønn).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ulike stomatale transgene planter og mutanter kjent for å ha mindre eller mer stomatal tetthet og klynger (epf2 2,5, epf1 epf2 2,5, tmm12, en STOMAGEN-lydløs linje4, og transgene linjer som bærer den østradiolinduserbare Est::EPF1 eller Est::EPF2 overuttrykkskonstruksjon7 ) ble brukt til å demonstrere effektiviteten av de to fenotypiske analysene som presenteres her, som hadde som mål å identifisere og karakterisere gener som har en rolle i stomatal utvikling og mønstre. For å produsere høykvalitets epidermisbilder uten behov for epidermale peelinger for å kvantifisere de forskjellige typene epidermale celler for analyse, er det avgjørende å forhåndsjustere prøvefargingstiden med TBO for hver genotype, da hver enkelt kan ha forskjellige epidermale fenotyper sammenlignet med villtypekontrollen (Col-0) (figur 1A og figur 2A). Basert på erfaring krever genotyper med færre stomater lengre fargetid med TBO (figur 1B og figur 2D,E), mens genotyper med mer stomata og clustering krever kortere fargetider (figur 1C og figur 2B,C). Siden varierende mengder riktig foldede peptider i den totale peptidløsningen kan maskere den biologiske aktiviteten til peptidene i stomatal utvikling, er det god praksis å bruke ytterligere, høyere totale konsentrasjoner av peptidløsningen (f.eks. 2,5 μM EPF2), samt genotyper som har mindre eller flere stomatale fenotyper (f.eks. epf2), for bioassayene. Aktiviteten til EPF2-peptider, som har en rolle i å hemme stomatal initiering, ble lett detektert ved å bruke epf2-mutanter med flere epidermale celler enn Col-0, selv om visse partier av de preparerte EPF2-peptidene hadde mindre mengder av de bioaktive formene av peptidet (f.eks. EPF2-peptidløsningsbatch 1 i figur 4).
Figur 1: Effekten av inkubasjonstiden med TBO på genotypene med ulike epidermale fenotyper. Abaxial cotyledon bilder fra 10 dager gamle frøplanter av tre Arabidopsis genotyper: (A) villtype (Col-0), (B) en STOMAGENlydløs linje (STOMAGEN-ami), og (C) epf1 epf2 mutanter. Col-0 representerer villtype Arabidopsis-kontrollen, og den STOMAGEN-dempede linjen og epf1 epf2-mutantene representerer genotypene med henholdsvis lavt og høyt antall stomata. Bildene ble tatt med et invertert mikroskop med en 20x objektivlinse (0,35 mm2 synsfelt). Kvaliteten på bildene var variabel, selv om alle cotyledonprøvene fra de forskjellige genotypene ble farget med TBO (0,5% TBO i H 2 O) i samme tid (2min) før avbildning. Derfor, for å få godt fargede bilder for analyse, er det viktig å forhåndsbestemme tilstrekkelig TBO-fargetid for hver genotype. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: TBO-fargede epidermisbilder uten bruk av epidermal peeling for kvantitativ analyse. Representative epidermisbilder av cotyledoner fra 10 dager gamle frøplanter av (A) villtype (Col-0), (B) tmm og (C,D) transgene linjer som bærer en østradiolinduserbar EPF2 (Est:: EPF2) eller (E) EPF1 overuttrykkskonstruksjon (Est:: EPF1) kan brukes til kvantitativ analyse av epidermal fenotype. En cotyledon i en festeløsning i over 3 år ble brukt til å ta bildet presentert i (E). Bildene ble tatt med et invertert mikroskop med en 20x objektivlinse (0,35 mm2 synsfelt). Cellene ble skissert ved TBO-farging, og halvparten av bredden på bildene i full størrelse presenteres for visning. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Prosedyre for bioassays . (A) Frøene sås på to 1/2 MS agarplater og tas ut med 10 timers mellomrom. (B) De 1 dag gamle Arabidopsis-plantene transplanteres til 24-brønnsplater som inneholder 1/2 MS-medium med enten mock eller to forskjellige peptidkonsentrasjoner. (C) Etter 5-7 dager er plantene klare for avbildning for å bestemme peptidenes biologiske aktivitet i stomatal utvikling og mønster. (D) En cotyledon skive er plassert i en dråpe propidiumjodidoppløsning på et mikroskopglass for avbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Konfokalmikroskopi av abaksial epidermis av Arabidopsis cotyledoner etter peptidbehandling. Representative konfokale bilder av (A) villtype og (B) epf2 cotyledon epidermis dyrket i 6-7 dager i en bufferløsning og en (C-F) epf2 cotyledon epidermis dyrket med to forskjellige batcher EPF2 peptider. Bildene ble tatt ved hjelp av et konfokalmikroskop ved hjelp av en 40x objektivlinse (eksitasjon på 561 nm og et 561 nm langpassutslippsfilter) for å fange propidiumjodidfargingen og visualisere cellekonturene. Hver EPF2-peptidløsning fremstilt har forskjellige mengder av riktig foldede (bioaktive) og misfoldede (inaktive) former av peptidene. For innledende screening av peptider med en potensiell rolle i stomatal utvikling anbefales det derfor å bruke to forskjellige konsentrasjoner av de totale peptidløsningene som angitt for bioassayene. Skala bar = 30 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De to fenotypiske analysemetodene for å identifisere og karakterisere genene som kontrollerer stomatal mønster og differensiering presentert her, er praktiske og pålitelige analyser siden protokollene ikke krever bruk av epidermale peelinger og spesialutstyr (som er tidkrevende og krever spesiell trening for prøvepreparering), men produserer bilder av høy kvalitet for kvantitativ analyse av epidermale fenotyper.
En begrensning ved denne teknikken for fenotypisk analyse ved bruk av TBO-fargede Arabidopsis cotyledoner er at det å ta bilder av høy kvalitet med visuell kontrast for forskjellige epidermale celletyper avhenger av fargetiden og vevets unike egenskaper, som kan være både artsavhengige og genotypeavhengige (figur 1)18 . Andre fenotypingsmetoder for å observere epidermale celler ved hjelp av epidermal peeling har de samme utfordringene, og de krever også mer tid og spesiell trening. Vanskeligheter med å skaffe riktig fargede epidermisbilder tilstrekkelig for dataanalyse kan unngås ved å farge cotyledoner fra genotyper med færre stomata i lengre perioder og prøver fra genotyper med mer stomata i kortere perioder. Fargetiden for hver genotype kan også justeres ved først å sjekke bare noen få prøver for å optimalisere fargetiden for genotyper med lignende epidermale fenotyper.
Å skaffe en tilstrekkelig mengde godt foldede bioaktive peptider, spesielt cysteinrike peptider (som er ligander som har forskjellige funksjoner i å kontrollere planteutvikling, inkludert stomatal mønster), har vært en utfordring 1,2,3,4,5,6,19,20,21,22,23 . Videre, selv om bioaktive peptider genereres, er screening av peptider som har potensielle funksjoner i spesifikke biologiske prosesser en annen utfordrende oppgave fordi de bioaktive peptidene som produseres ofte er en blanding av godt foldede, aktive og inaktive peptider. Denne artikkelen presenterer en effektiv bioassay-metode for å oppdage og karakterisere potensielle stomatale peptider. Denne metoden har vært vellykket i å identifisere ulike viktige peptider som styrer ulike aspekter av stomatal utvikling i Arabidopsis, samt gresset Brachypodium 3,4,7,17. Den største begrensningen i denne teknikken er imidlertid variabiliteten i fenotypiske responser, som mest sannsynlig oppstår på grunn av bruk av frøplanter med litt forskjellige utviklingsstadier og peptidløsninger som inneholder forskjellige mengder bioaktive peptider. Tidlige forsøk på denne metoden involverte plassering av frø av villtype direkte i brønnene på en plate som inneholdt en peptidløsning etter stratifisering. Uten bruk av genotyper som har flere og/eller færre epidermale celler (f.eks. epf2 2, figur 4) og 1 dag gamle Arabidopsis-frøplanter spiret på 1/2 MS-agarplater, kan et lavere antall frøplanter vokse og vise klare fenotypiske responser etter peptidapplikasjonen. I denne protokollen ble variabilitetsproblemet løst ved å bruke ~ 20 en-dags gamle Arabidopsis-frøplanter med to forskjellige utviklingsstadier og ved å bruke to forskjellige konsentrasjoner av peptidløsning (1 μM og 2,5 μM).
De epidermale fenotypene til de peptidbehandlede prøvene kan også analyseres ved den første fenotypiske analysemetoden presentert ved hjelp av TBO-fargede prøver. Denne metoden muliggjør relativt enkel kvantitativ fenotypisk analyse fordi et relativt stort område av hver prøve kan analyseres. I tillegg gir denne metoden fleksibilitet i prøvepreparering etter høsting av prøver fremstilt under de samme forholdene for avbildning. Imidlertid er bildene tatt med denne metoden generelt ikke av høyeste kvalitet. På den annen side gir konfokal avbildning etter propidiumjodidfarging bilder av høyere kvalitet med epidermale detaljer. Imidlertid tillater denne metoden bare at et lite område av vev skal fokuseres på for analyse. I tillegg kan bare et visst antall av de levende vevene som er forberedt, analyseres samtidig.
Avslutningsvis kan den fenotypiske analysen som presenteres her, brukes til rask og effektiv undersøkelse av potensielle gener som styrer stomatal mønster og differensiering, og dermed forbedre forståelsen av mekanismene for stomatal utvikling og peptidfunksjon. I tillegg kan denne bioassayprotokollen brukes til å identifisere andre små molekyler som har en rolle i epidermal vevsmønster og som en innledende screeningsmetode for å bestemme strukturen av godt foldede bioaktive peptider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det ble ikke oppgitt interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert gjennom Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery-programmet og Concordia University. KB støttes av National Overseas Scholarship fra India.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1--A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
