Summary
Este artículo describe dos métodos de fenotipado sin el uso de peelings epidérmicos para caracterizar los genes que controlan el desarrollo estomatizante. El primer método demuestra cómo analizar un fenotipo estomatizado utilizando una epidermis vegetal teñida con azul de toluidina. El segundo método describe cómo identificar ligandos estomacales y monitorear sus actividades biológicas.
Abstract
Los estomas son pequeños poros en la superficie de las plantas terrestres que están involucrados en el intercambio de gases y la liberación de vapor de agua, y su función es crítica para la productividad y supervivencia de las plantas. Como tal, comprender los mecanismos por los cuales se desarrollan y modelan los estomas tiene un tremendo valor agronómico. Este artículo describe dos métodos fenotípicos utilizando Arabidopsis cotiledones que se pueden utilizar para caracterizar los genes que controlan el desarrollo estomático y el patrón. En primer lugar se presentan los procedimientos para analizar los fenotipos estomatizados utilizando cotiledones teñidos con azul de toluidina O. Este método es rápido y confiable y no requiere el uso de peelings epidérmicos, que son ampliamente utilizados para análisis fenotípicos pero requieren capacitación especializada. Debido a la presencia de múltiples residuos de cisteína, la identificación y generación de péptidos EPF bioactivos que tienen un papel en el desarrollo estomático ha sido un desafío. Por lo tanto, se presenta en segundo lugar un procedimiento utilizado para identificar ligandos estomatizados y monitorear su actividad biológica mediante bioensayos. La principal ventaja de este método es que produce datos reproducibles con relativa facilidad al tiempo que reduce la cantidad de solución peptídica y el tiempo requerido para caracterizar el papel de los péptidos en el control del patrón y desarrollo de los estomas. En general, estos protocolos bien diseñados mejoran la eficiencia del estudio de los posibles reguladores estomatales, incluidos los péptidos secretores ricos en cisteína, que requieren estructuras altamente complejas para su actividad.
Introduction
El patrón adecuado y la diferenciación de los estomas vegetales son críticos para su función en dos procesos biológicos fundamentales, la fotosíntesis y la transpiración, y son aplicados por las vías de señalización del péptido EPF. En Arabidopsis, tres péptidos ricos en cisteína secretados, EPF1, EPF2 y STOMAGEN/EPFL9, controlan diferentes aspectos del desarrollo estomatológico y son percibidos por los componentes del receptor de la superficie celular, incluidas las quinasas receptoras de la familia ELECC (ER, ERL1 y ERL2), SERKs y TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Este reconocimiento conduce entonces a la regulación a la baja de los factores de transcripción que promueven la diferenciación estomática por un proceso dependiente de MAPK11. El descubrimiento de estos genes estomatizados centrales se logra principalmente mediante el cribado fenotípico de mutantes que exhiben defectos epidérmicos. Este artículo presenta métodos de fenotipado relativamente simples y eficientes para visualizar los estomas y otras células epidérmicas, que son necesarios para identificar y caracterizar los genes potenciales que controlan el patrón y la diferenciación de los estomas.
La observación de los detalles de la epidermis vegetal se ha logrado típicamente mediante el uso de peelings epidérmicos con o sin tinción con un colorante como el azul de toluidina O (TBO) o la safranina12,13,14. Sin embargo, el principal desafío de estos métodos es que requieren capacitación especializada para pelar la epidermis de la hoja sin desgarrar los tejidos y para observar y analizar cuidadosamente los datos de patrones mientras se evitan las imágenes tomadas de diferentes partes de la hoja. Los tratamientos químicos para limpiar las muestras de tejido con reactivos como las soluciones de limpieza a base de hidrato de cloral también se han utilizado ampliamente para una amplia gama de materiales biológicos 8,15; Estos tratamientos generan una gran cantidad de información fenotípica al proporcionar imágenes de alta calidad, pero también requieren el uso de productos químicos peligrosos (por ejemplo, formaldehído, hidrato de cloral). Este documento presenta primero un método de fenotipado relativamente fácil y conveniente que produce imágenes suficientes para el análisis cuantitativo, pero no requiere el uso de productos químicos peligrosos y peelings de hojas epidérmicas para la preparación de la muestra. Una epidermis de cotiledón teñida con TBO también es ideal para el estudio del desarrollo estomatizado porque la falta de tricomas y el gradiente de desarrollo más pequeño en los cotiledones permiten la interpretación simple y manejable de los fenotipos epidérmicos.
Los péptidos EPF estomatizados pertenecen al grupo de péptidos ricos en cisteína específicos de plantas que tienen tamaños maduros relativamente grandes y enlaces disulfuro intramoleculares entre residuos de cisteína conservados. El plegamiento conformacional correcto es crítico para su función biológica, pero los péptidos ricos en cisteína, que se producen por síntesis química o por un sistema de recombinación heterólogo, pueden estar inactivos y son una mezcla de péptidos correctamente plegados y desplegados 3,7,16. Por lo tanto, la selección de péptidos bioactivos que tienen un papel en el control del desarrollo estomático ha sido una tarea muy difícil. Este manuscrito describe adicionalmente un bioensayo para la mejor identificación y caracterización de péptidos estomacales bioactivos. En este método, las plántulas de Arabidopsis se cultivan en una placa de múltiples pocillos que contiene medios con y sin péptidos potenciales durante 6-7 días. Luego, la epidermis de cotiledón se visualiza usando un microscopio confocal. En general, para visualizar claramente la actividad biológica de los péptidos potenciales en el desarrollo estomatal, se utilizan los genotipos que producen más y/o menos células de linaje estomatárico, como el mutante epf2, que produce más células epidérmicas, y la línea STOMAGEN-ami, que confiere una densidad celular epidérmica reducida 2,4,5, además del control de Arabidopsis de tipo salvaje (Col-0) para los bioensayos.
En general, los dos protocolos presentados aquí se pueden utilizar para la evaluación rápida y eficiente de varios fenotipos epidérmicos y para la detección de pequeños péptidos y hormonas que tienen un papel en el control del patrón y desarrollo de los estomas.
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Protocol
1. Tinción de Arabidopsis cotiledones con TBO
- Esterilización de semillas y condiciones de crecimiento
- Esterilice ~ 30 semillas de Arabidopsis por genotipo en un tubo de microcentrífuga agregando 1 ml de una solución de esterilización de semillas (33% lejía comercial, 0.1% Triton X-100) y balancee suavemente durante 10-12 minutos a temperatura ambiente (RT).
NOTA: Esterilice ~30 semillas de la accesión de Arabidopsis de tipo silvestre Columbia (Col-0) y/o ~60 semillas de plantas transgénicas portadoras de un gen químicamente inducible (por ejemplo, Est::EPF27) para usar plántulas transgénicas cultivadas en 1/2 placas de Murashige y Skoog (MS) (2.16 g/L que contienen 0.8% de agar [p/v]) sin inductor (por ejemplo, β-estradiol) como controles (Figura 1 y Figura 2). - Retire la solución de esterilización, lave las semillas cuatro veces con 1 ml de agua estéril en una campana de flujo laminar y vuelva a suspenderlas en ~ 200 μL de agar estéril al 0,1%.
- Siembrar ~30 semillas por genotipo en placas de agar 1/2 MS o 1/2 placas de agar MS que contengan un inductor (por ejemplo, 10 μM β-estradiol) para la inducción química del transgén (por ejemplo, Est::EPF27) usando una pipeta, y sellar con cinta de microporos.
NOTA: Las semillas deben distribuirse uniformemente en el plato para evitar colocarlas muy cerca, ya que esto evitará que las plántulas crezcan uniformemente. - Estratificar las semillas colocando las placas a 4 °C sin luz durante 3-5 días para sincronizar la germinación.
- Después de la estratificación, incubar las placas en una cámara de crecimiento a 22 °C bajo 120 μmol·m−2·s−1 de luz con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad durante 10 días.
- Esterilice ~ 30 semillas de Arabidopsis por genotipo en un tubo de microcentrífuga agregando 1 ml de una solución de esterilización de semillas (33% lejía comercial, 0.1% Triton X-100) y balancee suavemente durante 10-12 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Muestreo y tinción TBO de Arabidopsis cotyledons
- A los 10 días posteriores a la germinación, seleccione cuidadosamente y corte uno de los cotiledones de las plántulas individuales que crecen uniformemente con otras plántulas en la placa para limitar la variabilidad.
NOTA: Los cotiledones se muestrean de plántulas de 10 días de edad porque no tienen tricomas ni células de epidermis inmaduras, lo que simplifica la interpretación de los fenotipos epidérmicos. - Coloque cada cotiledón en un tubo de microcentrífuga que contenga 1 ml de una solución de fijación (etanol 9:1 a ácido acético) usando fórceps, y deje la muestra en la solución de fijación durante la noche, como mínimo y a temperatura ambiente.
NOTA: Las muestras se pueden almacenar hasta por un par de años en esta condición. La imagen Figura 2E se tomó de una muestra de cotiledón que se almacenó en solución de fijación durante más de 3 años. Es importante mantener el cotiledón en una solución de fijación inmediatamente después del corte y no colocar más de cinco cotiledones en cada tubo de microcentrífuga para la preparación homogénea de la muestra más adelante. - Retire la solución de fijación y agregue 1 ml de etanol al 70%. Después de invertir el tubo un par de veces, deje el tubo que contiene las muestras en RT durante ~ 30 min.
- Repita el paso 1.2.3 usando 1 ml de etanol al 50% y luego etanol al 20%.
- Reemplace el 1 ml de etanol al 20% con 1 ml de agua destilada, y luego deje el tubo que contiene las muestras de cotiledón durante ~ 30 minutos después de invertir el tubo varias veces.
NOTA: Las muestras pueden permanecer en agua destilada durante más de 24 h, pero esto no se recomienda para obtener imágenes de buena calidad (imágenes bien teñidas para diferentes tipos de células epidérmicas) para el análisis cuantitativo. - Retire toda el agua destilada del tubo. Luego, agregue inmediatamente ~ 200 μL de solución de tinción TBO (0.5% TBO en H 2 O, filtrado) durante ~2min.
NOTA: Asegúrese de que cada muestra de cotiledón esté expuesta uniformemente a la solución TBO moviendo suavemente los tubos durante la incubación. Para evitar la sobretinción con TBO (el momento de la tinción es esencial y puede ser variable para cada genotipo), no procese más de seis tubos que contengan muestras a la vez. - Retire la solución de tinción TBO lo más completamente posible, y luego lave inmediatamente las muestras un par de veces agregando 1 ml de agua destilada fresca.
- A los 10 días posteriores a la germinación, seleccione cuidadosamente y corte uno de los cotiledones de las plántulas individuales que crecen uniformemente con otras plántulas en la placa para limitar la variabilidad.
- Imágenes y análisis de datos
- Tome un portaobjetos de microscopio y agregue una gota de glicerol al 15% (~ 50 μL). Coloque el cotiledón con el lado abaxial hacia arriba en glicerol al 15% en el portaobjetos usando pinzas finas. Luego, cúbralo suavemente con un cubreobjetos para que cualquier burbuja de aire formada pueda eliminarse de la muestra.
- Obtener imágenes del lado abaxial de la epidermis del cotiledón utilizando un microscopio de campo claro (Figura 1 y Figura 2), y luego examinar el fenotipo epidérmico contando el número de estomas y otros tipos de células epidérmicas.
- Para cada genotipo, calcular el fenotipo epidérmico utilizando las siguientes fórmulas descritas por Jangra et al.17:
Índice estomatológico (%) = (Número de estomas/Número total de células epidérmicas) × 100
Densidad estomática (mm−2) = Número de estomas/área (mm2)
NOTA: Imagine al menos ocho cotiledones (N = 8) para cada genotipo, y documente el fenotipo epidérmico de cada genotipo comparándolo con el fenotipo de la planta de tipo silvestre y / o plantas transgénicas que expresan un transgen químicamente inducible cultivado sin un inductor.
2. Bioensayos para péptidos estomatizados
NOTA: El procedimiento para los bioensayos se muestra en la Figura 3.
- Esterilización de semillas y condiciones de crecimiento
- Esterilice ~ 25 semillas para cada tratamiento como se mencionó anteriormente, y siembre aproximadamente la mitad de las semillas en cada una de las dos placas de agar 1/2 MS en una campana de flujo laminar.
NOTA: Utilice el genotipo con células epidérmicas altas y/o bajas (por ejemplo, epf22) en lugar de utilizar un fondo de tipo salvaje (por ejemplo, Col-0) para detectar fácilmente las actividades biológicas de los péptidos en el patrón y la diferenciación de las células epidérmicas (Figura 4). - Estratificar las semillas durante 3 días a 4 °C en la oscuridad.
- Sacar cada una de las dos placas a intervalos de ~10 h, e incubar las semillas en placas a 22 °C bajo 120 μmol·m−2·s−1 de luz con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad durante 1 día.
- Esterilice ~ 25 semillas para cada tratamiento como se mencionó anteriormente, y siembre aproximadamente la mitad de las semillas en cada una de las dos placas de agar 1/2 MS en una campana de flujo laminar.
- Tratamiento con péptidos e imágenes
- En una campana de flujo laminar, transplante cuidadosamente 10-12 plántulas de Arabidopsis de un día de edad de cada una de las dos placas preparadas en una placa de 24 pocillos que contenga 1.5 ml de medio líquido de 1/2 MS en cada pocillo (~ 20 plántulas por pozo).
NOTA: El momento del tratamiento con péptidos para las plántulas es crítico para los resultados fenotípicos del tratamiento con péptidos, así que prepare las semillas en dos placas separadas para obtener dos etapas diferentes de desarrollo de plántulas para el tratamiento. - Agregue un tampón solo (50 mM Tris-HCl [pH 8.0]) o dos concentraciones diferentes del péptido (típicamente, péptido 1 μM y 2.5 μM en 50 mM Tris-HCl [pH 8.0]) a cada pocillo que contiene ~ 20 plántulas de Arabidopsis de un día germinadas en placas de agar MS de 1/2.
NOTA: Retire las alícuotas de la solución peptídica de un congelador y manténgalas en RT durante unos minutos antes del tratamiento. Los péptidos almacenados en un congelador a -80 °C son estables durante un par de años, pero los ciclos de congelación-descongelación deben evitarse almacenando la solución peptídica en pequeñas alícuotas. - Después de mezclar suavemente las plántulas con un tampón solo o una solución peptídica con una pipeta, selle la placa con cinta de microporos. Incubar la placa de ensayo en condiciones de días largos (fotoperiodo de 16 h, 120 μmol·m−2·s−1 luz) durante 5-7 días a 22 °C.
NOTA: Evite que las plántulas crezcan demasiado juntas para permitir que cada plántula tenga una exposición uniforme a la solución peptídica. Gire suavemente la placa durante 2-3 h antes de incubar la placa en una cámara de crecimiento para aumentar la aireación. - Transfiera cada plántula del pozo que contiene tampón solo o péptido en un portaobjetos de cobertura, y diseccione el cotiledón de la plántula. Coloque el lado abaxial del cotiledón con pinzas y córtelo en trozos pequeños.
- Tome otro portaobjetos de microscopio limpio y coloque sobre él una gota de solución de yoduro de propidio (~ 25 μL, 2 mg / ml en H2O).
- Coloque uno de los trozos pequeños de cotiledón en una gota de solución de yoduro de propidio con fórceps y coloque suavemente el cubreobjetos. Aplique una solución adicional de yoduro de propidio en el borde del cubreobjetos para eliminar cualquier burbuja de aire que se haya formado.
- Obtener una imagen del lado abaxial del cotiledón usando un microscopio confocal y comparar las imágenes con las imágenes de plántulas cultivadas en medio 1/2 MS que contiene tampón solamente.
NOTA: Las imágenes presentadas en la Figura 4 se tomaron de plántulas Col-0 o epf22,5 de tipo silvestre que se trataron solo con tampón (Figura 4A, B) o dos lotes de solución peptídica EPF2 (Figura 4C-F) y se almacenaron a -80 °C durante 1 año.
- En una campana de flujo laminar, transplante cuidadosamente 10-12 plántulas de Arabidopsis de un día de edad de cada una de las dos placas preparadas en una placa de 24 pocillos que contenga 1.5 ml de medio líquido de 1/2 MS en cada pocillo (~ 20 plántulas por pozo).
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Representative Results
Varias plantas y mutantes transgénicos estomatizados que se sabe que tienen menos o más densidad y agrupamiento estomatático (epf2 2,5, epf1 epf2 2,5, tmm12, unalínea 4 silenciada por STOMAGEN, y líneas transgénicas que llevan la construcción de sobreexpresión Est::EPF1 o Est::EPF2 inducible por estradiol7 ) se utilizaron para demostrar la efectividad de los dos análisis fenotípicos presentados aquí, que tenían como objetivo identificar y caracterizar los genes que tienen un papel en el desarrollo y patrón de los estomas. Para producir imágenes de epidermis de alta calidad sin necesidad de peelings epidérmicos para cuantificar los diferentes tipos de células epidérmicas para su análisis, es fundamental preajustar el tiempo de tinción de la muestra con TBO para cada genotipo, ya que cada uno puede tener fenotipos epidérmicos diferentes en comparación con el del control de tipo salvaje (Col-0) (Figura 1A y Figura 2A). Según la experiencia, los genotipos con menos estomas requieren tiempos de tinción más largos con TBO (Figura 1B y Figura 2D, E), mientras que los genotipos con más estomas y agrupamiento requieren tiempos de tinción más cortos (Figura 1C y Figura 2B, C). Como cantidades variables de péptidos correctamente plegados en la solución peptídica total pueden enmascarar la actividad biológica de los péptidos en el desarrollo estomatático, es una buena práctica utilizar concentraciones totales adicionales más altas de la solución peptídica (por ejemplo, 2,5 μM EPF2), así como genotipos que tienen menos o más fenotipos estomacales (por ejemplo, epf2), para los bioensayos. La actividad de los péptidos EPF2, que tienen un papel en la inhibición de la iniciación estomática, se detectó fácilmente mediante el uso de mutantes epf2 con más células epidérmicas que Col-0, incluso si ciertos lotes de los péptidos EPF2 preparados tenían cantidades más pequeñas de las formas bioactivas del péptido (por ejemplo, el lote 1 de la solución peptídica EPF2 en la Figura 4).
Figura 1: El efecto del tiempo de incubación con TBO sobre los genotipos que exhiben diferentes fenotipos epidérmicos. Imágenes de cotiledón abaxial de plántulas de 10 días de edad de tres genotipos de Arabidopsis: (A) tipo silvestre (Col-0), (B) una línea silenciada por STOMAGEN (STOMAGEN-ami) y (C) mutantes epf1 epf2. Col-0 representa el control de Arabidopsis de tipo salvaje, y la línea silenciada por STOMAGEN y los mutantes epf1 epf2 representan los genotipos con un número bajo y alto de estomas, respectivamente. Las imágenes fueron tomadas usando un microscopio invertido con una lente de objetivo 20x (campo de visión de 0.35 mm2). La calidad de las imágenes fue variable, aunque todas las muestras de cotiledón de los diferentes genotipos se tiñeron con TBO (0,5% TBO enH2O) durante la misma cantidad de tiempo (2 min) antes de la imagen. Por lo tanto, para obtener imágenes bien teñidas para el análisis, es importante predeterminar el tiempo de tinción TBO adecuado para cada genotipo. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de epidermis teñidas con TBO sin el uso de peelings epidérmicos para el análisis cuantitativo. Para el análisis cuantitativo del fenotipo epidérmico se pueden utilizar imágenes representativas de la epidermis de cotiledones de plántulas de 10 días de edad de (A) líneas transgénicas de tipo silvestre (Col-0), (B) tmm y (C,D) que llevan un constructo de sobreexpresión de EPF2 (Est::EPF2) inducible por estradiol (Est::EPF1). Se utilizó un cotiledón en una solución de fijación durante más de 3 años para tomar la imagen presentada en (E). Las imágenes fueron tomadas usando un microscopio invertido con una lente de objetivo 20x (campo de visión de 0.35 mm2). Las celdas se delinearon mediante tinción TBO, y la mitad del ancho de las imágenes de tamaño completo se presenta para su visualización. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Procedimiento para los bioensayos . (A) Las semillas se siembran en dos placas de agar MS y se sacan a intervalos de 10 h. (B) Las plántulas de Arabidopsis de 1 día de edad se trasplantan a placas de 24 pocillos que contienen 1/2 medio MS con concentraciones de péptidos simuladas o dos diferentes. (C) Después de 5-7 días, las plántulas están listas para obtener imágenes para determinar la actividad biológica de los péptidos en el desarrollo y patrón estomatático. (D) Se coloca una rodaja de cotiledón en una gota de solución de yoduro de propidio en un portaobjetos de microscopio para obtener imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Microscopía confocal de la epidermis abaxial de Arabidopsis cotiledones tras tratamiento peptídico. Imágenes confocales representativas de (A) epidermis de cotiledón de tipo salvaje y (B) epf2 cultivada durante 6-7 días en una solución tampón y una epidermis de cotiledón epf2 (C-F) cultivada con dos lotes diferentes de péptidos EPF2. Las imágenes se tomaron utilizando un microscopio confocal utilizando una lente objetivo de 40x (excitación de 561 nm y un filtro de emisión de paso largo de 561 nm) para capturar la tinción de yoduro de propidio y visualizar los contornos celulares. Cada solución peptídica EPF2 preparada tiene diferentes cantidades de formas correctamente plegadas (bioactivas) y mal plegadas (inactivas) de los péptidos. Por lo tanto, para el cribado inicial de péptidos con un papel potencial en el desarrollo estomatático, se recomienda utilizar dos concentraciones diferentes de las soluciones peptídicas totales como se indica para los bioensayos. Barra de escala = 30 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los dos métodos de análisis fenotípico para identificar y caracterizar los genes que controlan el patrón estomatológico y la diferenciación presentados aquí son ensayos convenientes y confiables, ya que los protocolos no requieren el uso de peelings epidérmicos y equipos especializados (que requieren mucho tiempo y requieren capacitación especial para la preparación de muestras), pero producen imágenes de alta calidad para el análisis cuantitativo de fenotipos epidérmicos.
Una limitación de esta técnica para el análisis fenotípico utilizando Arabidopsis cotiledones teñidas con TBO es que la obtención de imágenes de alta calidad con contraste visual para diferentes tipos de células epidérmicas depende del tiempo de tinción y de las características únicas del tejido, que puede ser tanto dependiente de la especie como del genotipo (Figura 1)18 . Otros métodos de fenotipado para observar las células epidérmicas mediante peelings epidérmicos tienen los mismos desafíos, y también requieren más tiempo y entrenamiento especial. Las dificultades para obtener imágenes de la epidermis teñidas adecuadamente suficientes para el análisis de datos pueden evitarse tiñendo cotiledones de genotipos con menos estomas durante períodos de tiempo más largos y muestras de genotipos con más estomas durante períodos de tiempo más cortos. El tiempo de tinción para cada genotipo también se puede ajustar comprobando primero solo unas pocas muestras para optimizar el tiempo de tinción para genotipos con fenotipos epidérmicos similares.
Obtener una cantidad suficiente de péptidos bioactivos bien plegados, especialmente péptidos ricos en cisteína (que son ligandos que tienen diversas funciones en el control del desarrollo de las plantas, incluido el patrón estomático), ha sido un desafío 1,2,3,4,5,6,19,20,21,22,23 . Además, incluso si se generan péptidos bioactivos, la detección de péptidos que tienen funciones potenciales en procesos biológicos específicos es otra tarea desafiante porque los péptidos bioactivos producidos son a menudo una mezcla de péptidos bien plegados, activos e inactivos. Este artículo presenta un método de bioensayo eficiente para descubrir y caracterizar posibles péptidos estomatizados. Este método ha tenido éxito en la identificación de varios péptidos importantes que controlan diferentes aspectos del desarrollo estomático en Arabidopsis, así como la hierba Brachypodium 3,4,7,17. Sin embargo, la principal limitación de esta técnica es la variabilidad en las respuestas fenotípicas, que probablemente ocurre debido al uso de plántulas con etapas de desarrollo ligeramente diferentes y soluciones peptídicas que contienen diferentes cantidades de péptidos bioactivos. Los primeros intentos de este método implicaron la colocación de semillas de tipo silvestre directamente en los pocillos de una placa que contenía una solución peptídica después de la estratificación. Sin el uso de genotipos que tienen más y/o menos células epidérmicas (por ejemplo, epf22, Figura 4) y plántulas de Arabidopsis de 1 día germinadas en placas de agar MS, un menor número de plántulas pueden crecer y mostrar respuestas fenotípicas claras después de la aplicación del péptido. En este protocolo, el problema de la variabilidad se abordó utilizando ~ 20 plántulas de Arabidopsis de un día de edad con dos etapas de desarrollo diferentes y utilizando dos concentraciones diferentes de solución peptídica (1 μM y 2.5 μM).
Los fenotipos epidérmicos de las muestras tratadas con péptidos también se pueden analizar mediante el primer método de análisis fenotípico presentado utilizando muestras teñidas con TBO. Este método permite un análisis fenotípico cuantitativo relativamente fácil porque se puede analizar un área relativamente grande de cada muestra. Además, este método ofrece flexibilidad en la preparación de muestras después de la recolección de muestras preparadas en las mismas condiciones para la obtención de imágenes. Sin embargo, las imágenes tomadas por este método generalmente no son de la más alta calidad. Por otro lado, las imágenes confocales después de la tinción de yoduro de propidio proporcionan imágenes de mayor calidad con detalles epidérmicos. Sin embargo, este método solo permite enfocar una pequeña área de tejido para el análisis. Además, solo un cierto número de los tejidos vivos preparados pueden analizarse a la vez.
En conclusión, el análisis fenotípico presentado aquí se puede utilizar para el examen rápido y eficaz de los genes potenciales que controlan el patrón estomatológico y la diferenciación, mejorando así la comprensión de los mecanismos de desarrollo estomático y la función peptídica. Además, este protocolo de bioensayo se puede utilizar para identificar otras moléculas pequeñas que tienen un papel en el patrón del tejido epidérmico y como un método de detección inicial para determinar la estructura de péptidos bioactivos bien plegados.
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Disclosures
No se declararon conflictos de intereses.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada a través del programa Discovery del Consejo de Investigación de Recursos Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) y la Universidad de Concordia. K.B. cuenta con el apoyo de la Beca Nacional de Ultramar de la India.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1--A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
