Summary
Этот протокол описывает эффективный и недорогой метод, который использует жидкие среды для оценки воздействия химических токсикантов на жизнеспособность взрослой Drosophila melanogaster.
Abstract
Человеческая промышленность производит сотни тысяч химических веществ, многие из которых не были должным образом изучены на предмет экологической безопасности или воздействия на здоровье человека. Этот дефицит информации о химической безопасности усугубляется современными методами тестирования на млекопитающих, которые являются дорогостоящими, трудоемкими и трудоемкими. В последнее время ученые и регулирующие органы работают над разработкой новых методологий подхода (NAM) для испытаний на химическую безопасность, которые являются более дешевыми, быстрыми и уменьшают страдания животных. Одним из ключевых направлений движения неприсоединения является использование беспозвоночных организмов в качестве замены моделей млекопитающих для выяснения консервативных химических способов действия отдаленно родственных видов, включая человека. Чтобы продвинуть эти усилия, здесь мы описываем метод, который использует плодовую муху Drosophila melanogaster для оценки химической безопасности. Протокол описывает простую, быструю и недорогую процедуру измерения жизнеспособности и пищевого поведения взрослых мух, подвергшихся воздействию. Кроме того, протокол может быть легко адаптирован для создания образцов для геномных и метаболомных подходов. В целом, протокол представляет собой важный шаг вперед в установлении дрозофилы в качестве стандартной модели для использования в точной токсикологии.
Introduction
Люди постоянно подвергаются воздействию химических веществ из различных источников, включая воздух1, продукты питания2, воду3,4, лекарства5, чистящие средства6, средства личной гигиены 7, промышленные химикаты 7 и строительные материалы 7. Кроме того, каждый годвводятся тысячи новых химических веществ, многие из которых не проходят надлежащую проверку на безопасность здоровья и окружающей среды. Это отсутствие адекватных испытаний на химическую безопасность отчасти связано с чрезмерной зависимостью от моделей млекопитающих, таких как мыши и крысы. Несмотря на то, что такие модели грызунов информативны, испытания на химическую безопасность в этих системах являются дорогостоящими, трудоемкими и часто причиняют недопустимые страдания испытуемому животному9.
Финансовое и этическое бремя, связанное с тестированием химической безопасности млекопитающих, а также трудоемкий характер исследований млекопитающих, являются основными факторами, способствующими нехватке данных о новых химических веществах. Для решения этой проблемы Агентство по охране окружающей среды США (EPA), Европейское химическое агентство (ECHA), Министерство здравоохранения Канады и другие агентства реализуют меры, которые включают новые методологии подхода (NAM) в нормативно-правовую базу10, тем самым приводя политику Северной Америки и Европы в соответствие с международными целями по замене, сокращению и совершенствованию использования животных (принцип 3R)11, 12,13,14. NAM охватывают различные анализы, основанные главным образом на моделях in vitro и in silico, которые обеспечивают механистическое понимание химической токсичности вместо наблюдения за неблагоприятными условиями, причиняемыми подопытным видам млекопитающих, тем самым увеличивая скорость получения данных для оценки химического риска, при этом получая результаты с высокой точностью15. Однако еще не доказано, что эти методы защищают от системной токсичности, включая нарушение жизненно важных биологических процессов, связанных с межорганной связью и эндокринной сигнализацией. Кроме того, они не могут объяснить биоаккумуляцию химических веществ в определенных тканях, способность отдельных соединений поглощаться и секретироваться, а также взаимодействие между поведением и химическим воздействием.
Из-за ограничений in vitro и вычислительных моделей успешное использование NAM для уменьшения или замены моделей млекопитающих должно также включать модели беспозвоночных in vivo, таких как плодовая муха Drosophila melanogaster. Предыдущие исследования на мухе показали, что этот организм хорошо подходит для изучения консервативных генетических путей, которые защищают клетки животных от токсичных молекул 16,17,18,19,20,21,22. Более того, муха демонстрирует замечательное генетическое сходство с людьми, включая функциональные гомологи более чем 65% заболеваний человека 23,24,25 и еще большую сохранность важных функциональных путей 26. Эти особенности в сочетании с их относительно коротким жизненным циклом, низкими затратами на техническое обслуживание и легко наблюдаемыми поведенческими реакциями делают дрозофилу хорошо подходящей для использования в качестве токсикологической модели27,28,29,30. Кроме того, мухи имеют гораздо более высокую пропускную способность, чем модели грызунов, и улавливают эффекты на метаболизм, физиологию и передачу сигналов гормонов, которые не могут быть легко обнаружены другими неорганизменными NAM9.
Описанный здесь протокол представляет собой основу для тестирования воздействия химического вещества на взрослых дрозофил. Метод разработан, чтобы быть эффективным, недорогим и воспроизводимым, а также сводить к минимуму время, необходимое исследователям для контакта с тестируемым химическим веществом, и приспосабливаться к сбору образцов для метаболомики и других омиксных подходов. Протокол оптимизирован для тестирования одного химического вещества в эксперименте, но может легко учитывать другие экспериментальные параметры, такие как различные растворители или комбинации химических веществ.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Надевайте нитриловые перчатки на всех этапах этого протокола. Носите лабораторный халат, средства защиты глаз и/или респираторы в соответствии с паспортами безопасности для каждого оцениваемого химического вещества.
1. Подготовка флакона и камеры влажности
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.1-1.5 могут быть выполнены в любое время до начала других экспериментальных разделов. Во время приготовления флакона необходимо постоянно надевать нитриловые перчатки, чтобы предотвратить загрязнение.
- Сложите четыре листа целлюлозной хроматографической бумаги класса 1 (см. Таблицу материалов) и разрежьте их на 2 широкие полоски. Выдавите вставки фильтровальной бумаги в форме цветка, используя 1.5-дюймовый бумажный перфоратор, содержащий матрицу в форме цветка.
- Используйте деревянный дюбель без лака размером 22 мм x 220 мм, чтобы протолкнуть фильтровальную бумагу на дно полипропиленового флакона диаметром 28,5 мм. Убедитесь, что стопка фильтровальной бумаги надежно расположена на дне флакона.
- Храните подготовленные флаконы в пластиковых или картонных лотках и помещайте лотки в большие (~280 мм x 240 мм) полиэтиленовые пакеты до использования.
- Сконструируйте камеру влажности, вырезав отверстие размером 120 мм x 280 мм в пластиковой крышке пластиковой ванны размером 606,24 мм x 225,42 мм x 403,22 мм (см. Таблицу материалов). Приклейте сетку поверх отверстия, чтобы обеспечить поток воздуха.
- Отрежьте часть пластиковой сетки из жалюзийных потолочных панелей (первоначально 610 мм x 1220 мм), чтобы она поместилась в дно пластиковой ванны, используемой на шаге 1.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для создания камеры влажности можно использовать множество различных пластиковых ванн и пластиковых / металлических сетчатых материалов.
2. Муховодство
- Начните культивирование взрослых мух (минимум 30 взрослых особей) в стеклянных бутылках из-под молока, содержащих стандартные носители Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)31. Закройте бутылки вискозной пробкой, завернутой в деликатную салфетку. Не переполняйте бутылки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество необходимых флаконов зависит от количества проводимых химических воздействий и генотипа исследуемого штамма. Обычно из одной бутылки можно получить несколько сотен мух при использовании крепких и плодовитых запасов. В стандартном анализе используются мухи дикого типа Oregon-R (запас BDSC #2057), но с этим протоколом можно использовать любой интересующий генотип (генотипы). Помните, что скомпрометированные генотипы с низкой плодовитостью и/или жизнеспособностью требуют увеличения бутылочных культур. - Инкубируйте лотки бутылок для культур при температуре 25 °C при влажности примерно 60% и цикле светлый: темнота 12:12 ч до тех пор, пока не наступит третий возраст личинок или ранние стадии куколки. Эту стадию можно определить по присутствию личинок, блуждающих по стенкам бутылки, и появлению куколок на стенках бутылки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте с мухами только в период включения света в 12:12 ч цикла светлый: темный. Для надежных запасов бутылки достигают этой стадии через 3-4 дня при описанных условиях.- Удалите взрослых мух и определите текучесть среды. Если носитель течет по стенке бутылки при переворачивании, среда слишком жидкая. Вставьте деликатную салфетку или вискозный шарик на дно бутылки, чтобы затвердеть корм для мух.
- Когда мухи начнут закрываться, очистите всех взрослых особей от бутылок и дайте куколкам продолжать закрываться в течение 48 часов. На этом этапе любые взрослые особи, очищенные от бутылок с культурой, могут быть либо переведены в новые бутылки для размножения запасов (см. шаг 2.1), либо выброшены.
- Переносите мух, которые улетают в течение 48 часов, на новые бутылки, содержащие стандартные средства BDSC. Возраст 3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослым особям в этих бутылочках 3-5 дней, и их можно использовать в экспериментах по летальности и кормлению. Бутылки, используемые для старения взрослых мух, будут содержать яйца и личинки. В результате эти бутылки можно использовать для размножения следующего поколения мух.
3. Подготовка мух к химическому воздействию
- Обезболивайте 5-7-дневных мухСО2. Отсортируйте анестезированных мух по полу, используя их гениталии. Для получения помощи в анестезии и определении пола мух см. ссылку28.
- Поместите группы из 20 самцов или 20 самок мух во флаконы, содержащие стандартные средства BDSC. Закройте флакон вискозной пробкой и храните мужской и женский флаконы отдельно. Пометьте флаконы, содержащие самок мух, полосой. Оставьте флаконы с самцами мух без опознавательных знаков, чтобы случайно не смешать полы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество флаконов, которые должны быть приготовлены на шаге 3.2, определяется размером экспериментов по экспозиции. Как описано в шагах 5.3 и 5.6, типичный эксперимент по определению дальности для одного испытуемого химического вещества требует как минимум 40 флаконов самцов и 40 флаконов самок. Стандартный эксперимент по кривой доза-реакция, описанный на этапах 7.4 и 7.8, требует как минимум 63 флаконов для мужчин и 63 флаконов для женщин. - Храните флаконы в течение 48 часов в инкубаторе при температуре 25 °C при влажности около 60% и с циклом света и темноты 12:12 ч. В течение этого времени подпирайте лоток с отсортированными флаконами под углом 60 °, чтобы мухи не застряли в еде во время восстановления после анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволяет мухам оправиться от анестезии CO2 . Не обезболивайте мух снова в течение оставшейся части протокола воздействия. - После 48-часового периода восстановления добавьте 0,75 мл стерильной очищенной воды во флаконы, приготовленные на этапе 1.3. Количество флаконов, приготовленных на этом этапе, должно быть идентично количеству флаконов, установленных на шаге 3.2.
- Перенесите отсортированных, подобранных по полу мух во флакон для голодания, открыв стеклянный флакон, содержащий мух из шага 3.2, поместив его в рот подготовленного пластикового флакона, а затем постучав дном пластикового флакона по столешнице. Закройте пластиковый флакон пробкой из ацетата целлюлозы (широко известной как flug).
- Запишите всех мух, потерянных в этой передаче (позже перенесите в записи о начальном количестве мух для каждого флакона).
- Пометьте полоской флаконы, содержащие самок мух. Оставьте флаконы с самцами мух без опознавательных знаков, чтобы случайно не смешать полы.
- Подготовьте камеру влажности к ночной выдержке. Смотрите шаги 1.4-1.5 для описания того, как построить эту камеру.
- Поместите шесть стандартных бумажных полотенец на дно камеры влажности. Смочите бумажные полотенца 100 мл воды.
- Положите пластиковую сетку (шаг 1.5) на влажные полотенца, чтобы флаконы не соприкасались с пропитанными бумажными полотенцами.
- Поместите лотки с голодными флаконами в горизонтальное положение в камерах влажности. Поместите камеры влажности в инкубатор с температурой 25 °C (влажность примерно 60%) на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале период ночного голодания длится примерно 16 часов; Тем не менее, время может быть скорректировано для индивидуальных лабораторных графиков.
4. Приготовление исходных растворов
ПРИМЕЧАНИЕ: Мух кормят тестируемыми химикатами в жидкой среде с дрожжами и сахарозой. В этом разделе описывается приготовление исходных растворов концентрированных питательных сред и тестируемых химикатов.
- Приготовьте 4-кратный раствор дрожжей-сахарозы, содержащий 16% сахарозы и 6% дрожжевого экстракта (м/об) (см. Таблицу материалов), растворенный в стерильной очищенной воде. Автоклавируйте раствор на жидком цикле в течение соответствующего времени стерилизации (например, 40 мин на 1 л).
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор можно производить навалом и хранить в аликвотах при -20 °C. Разморозьте отдельные аликвоты за 1 день до использования, поместив их в холодильник при температуре 4 °C. - Подготовьте запас исследуемого химиката. Для первоначального эксперимента исходный раствор следует сделать в самой высокой концентрации, чтобы химическое вещество можно было полностью растворить в воде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для растворения испытуемого химического вещества можно использовать растворители, отличные от воды. Смотрите обсуждение предостережений по использованию альтернативных растворителей. - Приготовьте 100-кратный раствор синего красителя, растворив 1 г FD&C Blue No. 1 (см. Таблицу материалов) в 10 мл стерильной очищенной воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исходный раствор синего красителя может быть изготовлен навалом и храниться в аликвотах при 4 ° C.
5. Подготовка флаконов с экспозицией: эксперимент по определению дальности
ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 5 и 6 протокола предназначены для определения самой низкой дозы испытуемого химического вещества, которая вызывает 100% летальность, и самой высокой дозы, которая не может вызвать смертельный фенотип. Если эти концентрации уже определены предыдущими экспериментами, см. шаги 7 и 8 для расчета кривой доза-реакция. Экспонирующие среды должны быть подготовлены непосредственно перед добавлением мух во флаконы для воздействия.
- Маркируйте восемь центрифужных пробирок объемом 15 мл следующим образом: (i) без химикатов, (ii) самая высокая концентрация, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 и 1:1000.
- Подготовьте экспонирующую среду в меченых центрифужных пробирках с этапа 5.1, сначала добавив 2,5 мл 4-кратного исходного раствора дрожжей/сахарозы во все восемь меченых пробирок.
- Добавьте 7,5 мл стерильной очищенной воды в пробирку с надписью «без химикатов». Это разбавление является отрицательным контролем.
- Добавьте 7,4 мл исходного раствора исследуемого химического вещества в пробирку с пометкой «наивысшая концентрация». Добавьте в эту пробирку 100 мкл стерильной очищенной воды, чтобы конечный объем составил 10 мл. Рассчитайте и запишите молярность испытуемого химического вещества в этом растворе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление 100 мкл стерильной очищенной воды в пробирку гарантирует, что химическая концентрация на этой стадии идентична той, которая используется на стадии 5.5, где исходный раствор синего красителя добавляют к экспонирующей среде в качестве метода оценки поведения при кормлении. - Добавьте соответствующее количество исходного раствора исследуемого химиката и стерильной очищенной воды в оставшиеся пробирки. Конечный объем каждой пробирки должен составлять 10 мл. Конечная концентрация исследуемых химических веществ в этих пробирках по отношению к пробирке с «самой высокой концентрацией» должна составлять 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 и 1:1000.
- Подготовьте и промаркируйте восемь экспонирующих флаконов для каждой отдельной концентрации экспонирующей среды, полученной на этапе 5.1. Должно быть восемь наборов флаконов (всего 64 флакона), содержащих следующие этикетки: без химикатов, самая высокая концентрация, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 и 1:1000.
- Пипеткой 0,75 мл экспонирующей среды, приготовленной на этапе 5.2.3, в соответствующий набор экспонирующих флаконов.
- Маркируйте восемь отдельных пробирок по 5 мл следующим образом: (i) без химикатов, (ii) самая высокая концентрация, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 и 1:1000.
- Приготовьте среду для воздействия синего красителя, сначала смешав 500 мкл 4-кратного исходного раствора дрожжей/сахарозы и 20 мкл исходного раствора синего красителя в восьми меченых пробирках объемом 5 мл.
- Добавьте 1,48 мл стерильной очищенной воды в пробирку с надписью «без химикатов». Это разбавление является отрицательным контролем.
- Добавьте 1,48 мл исходного раствора исследуемого химического вещества в пробирку с надписью «наивысшая концентрация». Вода в эту трубку не добавляется. Рассчитайте и запишите молярность испытуемого химического вещества в этом растворе.
- Добавьте соответствующее количество исходного раствора исследуемого химиката и стерильной очищенной воды в оставшиеся пробирки. Конечный объем каждой пробирки должен составлять 2 мл. Конечная концентрация испытуемого химического вещества в этих пробирках по отношению к пробирке с «самой высокой концентрацией» должна составлять 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 и 1:1000.
- Подготовьте и промаркируйте два флакона для экспозиции с каждой отдельной концентрацией синих экспонирующих сред. Должно быть восемь наборов флаконов (всего 16 флаконов), содержащих следующие этикетки: без химикатов, самая высокая концентрация, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 и 1:1000. На этих флаконах также должно быть написано слово «синий».
- Пипеткой 0,75 мл синих экспонирующих сред в соответствующий набор синих экспонирующих флаконов.
6. Химическое воздействие мух: эксперимент по определению дальности
- Подготовьте флаконы с химическим воздействием, используя флаконы ночных голодных мух из шага 3.7 следующим образом:
- Переложите четыре флакона голодающих самок мух (по 20 мух на флакон) в четыре флакона воздействия каждой химической концентрации. Пометьте эти флаконы «женскими». Используйте тот же метод передачи, который описан в шаге 3.5.
- Переложите четыре флакона голодающих самцов мух (20 мух на флакон) в четыре флакона воздействия каждой химической концентрации. Маркируйте эти флаконы «мужскими». Используйте тот же метод передачи, который описан в шаге 3.5.
- Подготовьте флаконы с химическим воздействием, содержащие синий краситель, используя флаконы ночных голодающих мух из шага 3.7 следующим образом:
- Переложите один флакон голодающих самок мух (20 мух на флакон) в один синий флакон для каждой концентрации химического вещества. Пометьте этот флакон «женским». Используйте тот же метод передачи, который описан в шаге 3.5.
- Переложите один флакон с голодными самцами мух (20 мух на флакон) в один синий флакон для воздействия на каждую химическую концентрацию. Пометьте этот флакон «мужским». Используйте тот же метод передачи, который описан в шаге 3.5.
- Запишите количество мух, которые присутствуют в каждом флаконе после переноса, и запишите количество погибших или сбежавших. В норме все 20 мух должны пережить ночное голодание и перелететь.
- Поместите экспонирующие флаконы горизонтально в свежеприготовленные камеры влажности (см. шаг 3.6 для подготовки камеры влажности). Поместите камеры в инкубатор с температурой 25 °C и влажностью около 60% и циклом света и темноты 12:12 ч.
- Осматривают экспозиционные флаконы через 24 и 48 ч после начала химического воздействия. Подсчитайте и запишите количество мертвых мух в каждом флаконе в каждый момент времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смерть используется в качестве показания для этого анализа, но протокол может быть адаптирован для изучения других фенотипов. Подвергшихся воздействию мух обычно собирают в эти моменты времени для транскриптомных и метаболомных исследований. - Осмотрите флаконы с синей экспозицией через 24 ч после начала химического воздействия. Используйте следующие методы, чтобы определить, потребляли ли подвергшиеся воздействию мухи синие среды воздействия:
- Осмотрите стенки флакона на наличие признаков синего кала, который выглядит как маленькие точки на боковой стороне флакона для воздействия, а также на флуг.
- Обезболивают мухСО2 и осматривают брюшко на наличие синего красителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно флаконы с синей экспозицией анализируются через 24 часа. Однако этот шаг можно выполнить через 48 часов. Мухи, которые ели нормально, имеют синюю полосу через брюшко, указывающую на то, что среда воздействия попала в кишечник. - Исследуйте мух на предмет аномального пищевого поведения, такого как срыгивание, растяжение урожая и нарушение барьерной функции кишечника (на что указывает появление синего красителя по всему организму, а не только в желудочно-кишечном тракте, обычно называемое смурфингом32,33).
- Выбросьте все загрязненные флаконы, фильтровальную бумагу, флуги и мух в соответствующие контейнеры для химических отходов. Если во флаконах остаются живые мухи, заморозьте флаконы, чтобы убить мух, прежде чем выбрасывать их в соответствующий контейнер для отходов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Утилизация флаконов и мух продиктована химическим веществом(ами), анализируемым в эксперименте. Всегда соблюдайте процедуры химической безопасности, изложенные в паспорте химической безопасности. Если концентрации, используемые в эксперименте по определению диапазона, убивают мух при самой низкой дозе, повторите раздел 6, используя серию разбавлений, начиная с самой низкой концентрации, которая убила 100% животных.
7. Подготовка флаконов для воздействия: построение кривой доза-реакция
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, изложенный в шагах 5 и 6, предназначен для широкого определения химической концентрации, необходимой для выявления фенотипа. Этапы 7 и 8 протокола используются для расчета точной кривой доза-реакция.
- Рассчитайте концентрации испытуемых химических веществ, которые необходимо проанализировать для построения кривой доза-реакция, используя следующий метод:
- Определите самую низкую концентрацию исследуемого химического вещества, которое убивает 100% подвергшихся воздействию мух через 48 часов.
- Определите самую высокую концентрацию исследуемого химического вещества, которая не влияет на жизнеспособность через 48 часов.
- Рассчитайте дополнительные четыре концентрации, которые равномерно распределяются между концентрациями, определенными на этапах 7.1.1 и 7.1.2.
- Маркировать девять отдельных центрифужных пробирок объемом 15 мл молярностью следующих концентраций: (i) отсутствие химического вещества, (ii) концентрация, определенная на этапе 7.1.1, (iii) концентрация, определенная на этапе 7.1.2, (iv) концентрации, определенные на этапе 7.1.3, (v) концентрация, в два раза превышающая концентрацию, определенную на этапе 7.1.1, (vi) разбавление концентрации в соотношении 1:2, определенное на этапе 7.1.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Включение концентраций, которые в два раза превышают концентрацию, определенную в 7.1.1, и разбавление 1:2 по сравнению с концентрацией, определенной на этапе 7.1.2, имеет важное значение для точного расчета кривой доза-реакция. - Подготовьте экспонирующую среду, сначала добавив 2,5 мл 4-кратного исходного раствора дрожжей/сахарозы в девять меченых отдельных центрифужных пробирок объемом 15 мл, приготовленных на этапе 7.2.
- Добавьте 7,5 мл стерильной очищенной воды в пробирку с надписью «без химикатов». Это разбавление является отрицательным контролем.
- Добавьте соответствующее количество исходного раствора исследуемого химиката и стерильной очищенной воды в оставшиеся пробирки. Конечный объем каждой пробирки должен составлять 10 мл. Конечная концентрация химического вещества в отдельной пробирке должна быть равна той, которая указана на внешней стороне пробирки.
- Подготовьте и промаркируйте 12 экспонирующих флаконов для каждой концентрации экспонирующих сред, полученных на шаге 7.2. Должно быть девять наборов флаконов (всего 108 флаконов).
- Пипетка 0,75 мл экспонирующей среды в соответствующий набор флаконов для экспозиции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги с 7.6 по 7.8 являются необязательными. Если известно, что концентрация испытуемых химических веществ, полученных на этапе 7.2, не влияет на пищевое поведение, эти этапы можно пропустить. - Подготовьте и промаркируйте девять различных пробирок по 5 мл для синих экспозиционных сред с той же серией концентраций, что и на этапе 7.2.
- Приготовьте среду для воздействия синего красителя, сначала смешав 500 мкл 4-кратного раствора дрожжей/сахарозы и 20 мкл исходного раствора синего красителя.
- Добавьте 1,48 мл очищенной стерильной воды в пробирку с надписью «без химикатов». Это разбавление является отрицательным контролем.
- Добавьте соответствующее количество исследуемого химического раствора и очищенной стерильной воды в оставшиеся пробирки. Конечный объем каждой пробирки должен составлять 2 мл. Конечная концентрация химического вещества в отдельной пробирке должна быть равна той, которая указана на внешней стороне пробирки.
- Подготовьте и промаркируйте два экспонирующих флакона для каждой отдельной концентрации синих экспонирующих сред. Должно быть девять наборов флаконов (всего 18 флаконов), причем каждый набор флаконов помечен концентрациями, перечисленными на шаге 7.2. На этих флаконах также должно быть написано слово «синий».
- Пипеткой 0,75 мл синих экспонирующих сред в соответствующий набор синих экспонирующих флаконов.
8. Химическое воздействие мух: построение кривой доза-реакция
- Подготовьте флаконы с химическим воздействием, используя флаконы ночных голодных мух из шага 3.7 следующим образом:
- Переложите шесть флаконов с голодными самками мух (по 20 мух на флакон) в шесть флаконов с каждой химической концентрацией. Пометьте эти флаконы «женскими». Используйте тот же метод передачи, который описан в шаге 3.5.
- Переложите шесть флаконов с голодными самцами мух (по 20 мух на флакон) в шесть флаконов с каждой химической концентрацией. Маркируйте эти флаконы «мужскими». Используйте тот же метод передачи, который описан в шаге 3.5.
- Подготовьте флаконы с химическим воздействием, содержащие синий краситель, используя флаконы ночных голодающих мух из шага 3.7 следующим образом:
- Переложите один флакон голодающих самок мух (20 мух на флакон) в один синий флакон для каждой концентрации химического вещества. Пометьте этот флакон «женским». Используйте тот же метод передачи, который описан в шаге 3.5.
- Перелейте один флакон голодных самцов мух (двадцать мух на флакон) в один синий флакон для воздействия на каждую химическую концентрацию. Пометьте этот флакон «мужским». Используйте тот же метод передачи, который описан в шаге 3.5.
- Запишите количество мух, присутствующих в каждом флаконе после переноса. Обычно все 20 мух должны пережить ночное голодание и перенос, но убедитесь, что все, кто умер или сбежал во время переноса, вычитаются из общего количества.
- Поместите экспонирующие флаконы горизонтально в свежеприготовленные камеры влажности (см. шаг 3.6 для подготовки камеры влажности). Поместите камеры в инкубатор с температурой 25 °C и влажностью около 60% и циклом света и темноты 12:12 ч.
- Осматривают экспозиционные флаконы через 24 и 48 ч после начала химического воздействия. Подсчитайте и запишите количество мертвых мух в каждом флаконе в каждый момент времени.
- Осмотрите флаконы с синей экспозицией через 24 ч после начала химического воздействия. Используйте метод, описанный на шаге 6.6, для оценки изменений в пищевом поведении.
- Выбросьте все загрязненные флаконы, фильтровальную бумагу, флуги и мух в соответствующие контейнеры для химических отходов. Если во флаконах остались живые мухи, заморозьте флаконы, чтобы убить мух, прежде чем выбрасывать их в соответствующий контейнер для отходов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Утилизация флаконов и мух продиктована химическим веществом(ами), анализируемым в эксперименте. Всегда соблюдайте процедуры химической безопасности, изложенные в паспорте химической безопасности.
9. Расчет кривой доза-реакция
- Используйте программное обеспечение Benchmark Dose (BMDS, версия 3.2; см. Таблицу материалов) или другое аналогичное программное обеспечение для анализа данных34. Ниже описан рабочий процесс с использованием программного обеспечения BMDS.
- Перейдите на вкладку «Данные» BMDS и нажмите « Вставить новый набор данных». Введите количество выборок в наборе данных, нажмите « Дихотомия», а затем нажмите « Создать набор данных». Введите каждую репликацию в виде отдельной строки в наборе данных.
- Введите дозу в первом столбце сгенерированной таблицы, начальное количество мух, исключая любые, которые погибли или были потеряны до шага 8.3) во втором столбце и количество мух, погибших от химического воздействия, в третьем столбце.
- Перейдите на вкладку «Основные» BMDS.
- Нажмите на стрелку раскрывающегося списка для меню «Выбрать тип модели» и выберите « Дихотомия».
- Нажмите « Включить» для набора данных из шага 9.2 в таблице «Наборы данных».
- Установите флажки для нужных моделей для анализа в таблице MLE и Alternatives.
ПРИМЕЧАНИЕ: В основном использовалась модель Frequentist Restricted Dichotomous Hill. - Нажмите « Запустить анализ». Программа сгенерирует выходной файл с кривой летальности и дополнительными сведениями о модели (моделях).
Representative Results
Муха долгое время служила моделью в исследованиях по определению токсичности арсенита натрия (NaAsO2)35,36,37,38. Чтобы продемонстрировать эффективность протокола, самцы и самки мух были подвергнуты воздействию NaAsO2 с целью сравнения этих результатов с более ранними исследованиями. Используя методологию, описанную выше, взрослые мужчины и женщины Oregon-R (BDSC stock #2057) подвергались воздействию диапазона концентраций NaAsO 2 (0, 0,01, 0,02, 0,1, 0,2, 1 и2 мМ) и оценивались на летальность через 48 часов после начала воздействия (рис. 1A, B).
Цель этого первоначального анализа состояла в том, чтобы определить приблизительный диапазон концентраций, который позволил бы более точно охарактеризовать токсичность NaAsO2. В последующих экспериментах были выбраны концентрации (0, 0,2, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 и 5 мМ), которые более точно определяли кривую доза-реакция NaAsO2 (рис. 1C, D). Обратите внимание, что в результате анализа было изучено несколько концентраций, которые вызывали 100% летальность. Данные были проанализированы с использованием общедоступного программного обеспечения Benchmark Dose версии 3.2.0.125 Агентства по охране окружающей среды. Данные были смоделированы как «дихотомические», а для последующего анализа использовалась дихотомическая модель Хилла. Основываясь на этой модели, конечные LD10, LD25 и LD 50 самцов мух, получавших NaAsO2, составляли 0,30 мМ,0,50 мМ и 0,65 мМ соответственно. Для самок мух эти значения были немного выше: LD 10 0,30 мМ, LD25 0,65 мМ и LD50 0,90 мМ. В целом, значения, полученные с использованием этого метода, аналогичны значениям, о которых сообщалось ранее для токсичности мышьяка в Drosophila melanogaster35,36,37,38, что подтверждает правильность методологии.
В дополнение к шести репликам, используемым для расчета кривой доза-реакция, самцов и самок мух также кормили растворами воздействия NaAsO2, которые содержали 1% синего FD & C, который легко виден в пищеварительном тракте с помощью световой микроскопии. Основываясь на наличии синего красителя в кишечнике мух, получавших NaAsO 2, как самцы, так и самки мух продолжали питаться через 24 часа после начала химического воздействия, независимо от концентрации NaAsO 2, присутствующей в жидкой среде (рис. 2). Однако было замечено, что проглоченная пища иногда отрыгивается в дозах выше 0,2 мМ для женщин и 0,5 мМ для мужчин (рис. 2). Эти данные свидетельствуют о том, что регургитация может играть ключевую роль в реакции дрозофилы на отравление мышьяком.
Рисунок 1: Кривые доза-реакция для самцов и самок дрозофилы , получавших NaAsO2 в течение 48 часов. На всех графиках показаны расчетные пропорции мертвых мух при каждой концентрации NaAsO2 , протестированной на основе модели Дихотомического холма. (А,Б) Был протестирован широкий диапазон концентраций NaAsO2 , чтобы приблизиться к дозе, при которой каждый пол мухи начинает умирать. (А) показывает мужские данные, а (Б) показывает женские данные. N = 4 флакона, по 20 мух на флакон. (С,Д) Более узкий диапазон концентраций NaAsO2 был протестирован для определения точных доз, при которых погибало 10%, 25% и 50% каждого пола мух. Эти дозы указаны справа от каждого графика. (C) показывает мужские данные, а (D) показывает женские данные. N = 6 флаконов, по 20 мух на флакон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные результаты анализа синего красителя самцов и самок дрозофилы, получавших NaAsO2 в течение 24 часов. Микрофотографии показывают, что мухи кормят растущими концентрациями NaAsO2. В ряду (А) показаны самцы мух, а в ряду (В) - самки мух, при этом концентрация NaAsO2 увеличивается слева направо. Брюшная полость показывает небольшое количество синего цвета возле грудной клетки при низких концентрациях, что указывает на то, что среда воздействия попала в кишечник. При более высоких концентрациях синий краситель начинает накапливаться вокруг рта, что свидетельствует о том, что среда воздействия отрыгивается. Масштабная линейка составляет 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Плодовая муха Drosophila melanogaster становится мощной системой для NAMs 16,18,19,21. Используя беспрецедентные генетические ресурсы, доступные сообществу мух, в сочетании с последними достижениями в области геномики и метаболомики, исследования химической безопасности с использованием дрозофилы способны быстро идентифицировать молекулярные механизмы, с помощью которых отдельные соединения влияют на метаболизм, физиологию и клеточную сигнализацию (например, см.39). Этот недорогой протокол предназначен для быстрого определения кривых доза-реакция и последующего создания образцов для анализа РНК-секвенирования и метаболомики. Более того, этот гибкий протокол может быть адаптирован для использования с любым генотипом и может вместить многие классы химических веществ.
Примечательным аспектом этого протокола является выбор жидкой пищи, используемой при химическом воздействии, который основан на предыдущем исследовании, но отличается от твердых сред, используемых в большинстве токсикологических исследований дрозофилы18,22. Эта конкретная жидкая среда была выбрана таким образом, чтобы отразить питательную ценность стандартной, твердой среды BDSC, которой мухи также кормят в этом протоколе, чтобы гарантировать, что мухи получают постоянное питание. Простота жидких питательных сред имеет много преимуществ. С жидкими средами легче обращаться, чем с твердой пищей, которую необходимо либо расплавить и затвердеть, либо восстановить из порошка. Жидкие среды также увеличивают пропускную способность системы, обеспечивают равномерное распределение химикатов по питательной среде и сокращают время, затрачиваемое на работу с опасными соединениями. Кроме того, среда не требует нагрева растворов, что облегчает тестирование летучих исследуемых соединений. Наконец, из-за относительно небольшого количества компонентов, включенных в пищевой раствор, нежелательные побочные реакции сводятся к минимуму между исследуемым химическим веществом и другими диетическими компонентами. Дрожжи, используемые в пище, также неактивны, что еще больше ограничивает реакционную способность питательной среды. Однако обратите внимание, что этот метод не подходит для тестирования токсичности для развития или личинок.
Некоторые из материалов, используемых в протоколе, могут быть заменены, например, использование стеклянных флаконов вместо полипропилена. Однако используемые материалы были выбраны как инертные, так и одноразовые, чтобы избежать нежелательных химических реакций между реагентами и химическими воздействиями, которые могут возникнуть в результате очистки стеклянной посуды.
Использование жидкой пищи требует транспортного средства для доставки еды. Фильтровальная бумага из ацетата целлюлозы была выбрана для этой цели из-за ее гибкости и инертности28. Другие исследователи использовали аналогичные протоколы, но с другими транспортными средствами, такими как деликатные рабочие салфетки или фильтр из стекловолокна29,30. Фильтровальная бумага из ацетата целлюлозы соответствовала этим потребностям, потому что это инертное транспортное средство, которое можно разрезать до идеальной формы, чтобы поместить его в дно флаконов с мухами без больших зазоров между бумагой и стенкой флакона, предотвращая гибель из-за застревания мух в среде или самом транспортном средстве.
Важным ограничением этой системы является то, что максимальная проверяемая концентрация химического вещества связана с растворимостью химического вещества. Нерастворимые в воде соединения требуют дополнительного растворителя, что может привести к дополнительным или синергетическим эффектам с интересующим химическим веществом. Это также может создавать ситуации, в которых невозможно приготовить исходные растворы, которые достаточно сконцентрированы для достижения желаемой конечной точки во всех организмах, что ограничивает анализ полученных данных31. Чтобы решить эту проблему, химические вещества с низкой растворимостью в воде можно протестировать, добавив до 0,5% диметилсульфоксида в пищевой раствор. Можно использовать и другие растворители, но для каждого интересующего растворителя необходимы дополнительные исследования, чтобы определить максимально приемлемую концентрацию растворителя в растворе, чтобы максимизировать растворимость при минимизации воздействия растворителя на организм.
Обширная характеристика реакции обоняния у дрозофилы описала, как мухи избегают потребления токсичных соединений40,41, что приводит к уменьшению питания обработанными средами. Анализ синего красителя устраняет это явление, позволяя исследователям эффективно проверять пищевое поведение мух, получавших каждую концентрацию экспериментального химического вещества42,43,44. Наличие или отсутствие синего цвета в желудочно-кишечном тракте мухи указывает на то, питалась ли муха средой, содержащей токсиканты. Несмотря на то, что существуют более сложные методы оценки поведения мух при кормлении, такие как счетчик45 взаимодействия жидкости мухи с пищей, этот качественный метод лучше подходит для скрининга с более высокой пропускной способностью.
Примечательным аспектом этого протокола является то, что он был оптимизирован для 48-часового периода воздействия без необходимости переноса мух или добавления дополнительной жидкости во флакон для воздействия. Использование камеры влажности и помещение камер в инкубатор с высокой влажностью предотвратило высыхание фильтровальной бумаги, содержащей питательную среду, в течение этого периода времени. Протокол может быть адаптирован для более длительной экспозиции, но метод должен быть скорректирован таким образом, чтобы фильтровальная бумага не высохла и не вызвала значительных изменений концентрации раствора или летальности из-за высыхания.
Наконец, важной характеристикой этого протокола является то, что он может легко приспосабливаться к генетическим вариантам, что позволяет исследователям использовать широкий спектр генетических инструментов для дрозофилы , чтобы расширить эти предварительные исследования организмов дикого типа, чтобы лучше понять механизмы химического действия in vivo. В связи с этим протокол, изложенный выше, может быть легко изменен, чтобы дополнить ранее описанный протокол JoVE Петерсоном и Лонгом, который позволяет проводить токсикологический анализ пойманных в дикой природе мух18.
Из-за большого разнообразия предыдущих исследований токсичности арсенита натрия у дрозофилы 32,33,34,35,36 мух Oregon-R обрабатывали этим соединением, чтобы продемонстрировать эффективность нашей системы. Самцы мух показали LD 50 0,65 мМ, а самки показали LD50 0,90 мМ. Это согласуется с предыдущими исследованиями взрослой дрозофилы, обработанной арсенитом натрия. Например, Гольдштейн и Бабич37 обнаружили, что 50% мух (смешанного пола) погибли после 7 дней воздействия 0,5 мМ NaAsO2. Хотя это несколько меньшая доза, чем наблюдалось в настоящее время, различия между их методами и этим методом (включая использование твердых сред воздействия, более длительную временную шкалу и смешанный пол), вероятно, объясняют эту разницу. Важно отметить, что оба метода привели к общим одинаковым значениям LD50.
Наблюдения экспериментов с использованием этого протокола могут быть использованы для поиска генетических и молекулярных мишеней для последующих поведенческих или механистических исследований. Метод воздействия также может быть использован для лечения дрозофилы для отбора проб для метаболомики и протеомики, что делает этот протокол хорошо подходящим для растущей области прецизионной токсикологии (смоделированной из области прецизионной медицины46). В связи с этим подвергшиеся воздействию мухи могут быть собраны после шага 8 для последующего геномного и метаболомного анализа. Образцы, собранные на шаге 8, затем могут быть обработаны, как описано Ли и Теннессеном47, начиная с шага 3.
В конечном счете, данные, полученные в результате описанных выше экспериментов, а также любые последующие данные метаболомики и протеомики, в идеале должны использоваться в межвидовых сравнениях. Как отмечалось ранее26, такие межвидовые исследования являются мощными и способны определить, как отдельные химические вещества влияют на консервативные биологические пути. Таким образом, протокол, описанный выше, может быть использован для поиска эволюционных общих черт в ответ на отдельные токсиканты по всему типу и помочь в определении правил химической безопасности.
Disclosures
Отсутствие конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.
Acknowledgments
Мы благодарим наших сотрудников за помощь в тестировании и оптимизации этого протокола: Амейю Беламкар, Мэрилин Кларк, Александра Фитта, Эмму Роуз Галлант, Итана Голдича, Мэтью Лоу, Моргана Марша, Кайла МакКланга, Энди Пуга, Дарси Роуза, Кэмерона Стокбриджа и Ноэль Золман. Мы также благодарим наших коллег из Группы прецизионной токсикологии, особенно наших коллег из Группы воздействия, за помощь в определении целей протокола.
Этот проект получил финансирование от программы исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 965406. Работа, представленная в данной публикации, выполнена в рамках кластера ASPIS. Этот вывод отражает только точку зрения авторов, и Европейский Союз не может нести ответственность за любое использование содержащейся в нем информации. Эта публикация также стала возможной при поддержке Института клинических и трансляционных наук штата Индиана, который частично финансируется за счет премии No UL1TR002529 от Национальных институтов здравоохранения, Национального центра развития трансляционных наук, премии в области клинических и трансляционных наук. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Часть этого проекта была поддержана за счет средств Университета Индианы, выделенных JRS и консорциуму PhyloTox. JMH и EMP были поддержаны NIH P40OD018537 награды Фондовому центру дрозофилы в Блумингтоне.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 inch flower lever action craft punch | Bira Craft | HCP-115-024 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL |
| 2 ml Tubes | VWR | 16466-044 | Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom |
| 5 ml Tubes | VWR | 60818-576 | Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430290 | 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap |
| Benchmark Dose Software version 3.2 | U.S. Environmental Protection Agency | ||
| Cardboard trays | Genesee Scientific flystuff | 32-122 | trays and dividers for narrow vials |
| CO2 gas pads | Genesee Scientific flystuff | 59-114 | FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus |
| Combitips advanced, 50 mL | Eppendorf | 0030089693 | Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips |
| Cotton balls | Genesee Scientific flystuff | 51-101 | Cotton balls, large, fits narrow vials |
| Delicate task wipes | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39" |
| Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) | VWR | 89168-888 | Wide |
| FD&C Blue No. 1 | Spectrum Chemical | FD110 | CAS number 3844-45-9 |
| Flies | BDSC | Stock #2057 | OregonR wildtype |
| Gloves (nitrile) | Kimtech | 55082/55081/55083 | Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" |
| Grade 1 CHR cellulose chromatography paper | Cytvia | 3001-917 | Sheet, 46 x 57 cm |
| Mesh for humidity chamber | |||
| Multipette / Repeater (X) stream | Eppendorf | 022460811 | Repeater Xstream |
| Plastic grate | Plaskolite | 18469 (from lowes) | Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs |
| Plastic trays for glass vials | Genesee Scientific flystuff | 59-207 | Narrow fly vial reload tray |
| Polypropylene Drosophila Vial | VWR | 75813-156 | Wide (28.5 mm) |
| Rubbermaid tubs | Rubbermaid | 3769017 (from Lowes) | Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H |
| Sucrose ultra pure | MP Biomedicals, Inc. | 821721 | |
| Tube racks for wide-mouthed tubes | Thermo scientific | 5970-0230 | Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes |
| Water Purification System | Millipore Milli-Q | ZMQ560F01 | Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier |
| Yeast extract | Acros Organics | 451120050 | CAS number 84604-16-0 |
References
- United States Occupational Safety and Health Administration. Construction industry: OSHA safety and health standards (29 CFR 1926/1910). United States Occupational Safety and Health Administration. , (2022).
- Chemical, Metals, Natural Toxins & Pesticides Guidance Documents & Regulations. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/food/guidance-documents-regulatory-information-topic-food-and-dietary-supplements/chemical-metals-natural-toxins-pesticides-guidance-documents-regulations (2022).
- Drinking Water Contaminant Candidate List (CCL) and Regulatory Determination. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.epa.gov/cci (2022).
- Administration Bottled Water/Carbonated Soft Drinks Guidance Documents & Regulatory Information. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/food/guidance-documents-regulatory-information-topic-food-and-dietary-supplements/bottled-watercarbonated-soft-drinks-guidance-documents-regulatory-information (2022).
- United States Congress. Federal Food, Drug, and Cosmetic Act. United States Congress. 21, 301-392 (1934).
- Determining if a Cleaning Product is a Pesticide Under FIFRA. Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/pesticide-registration/determining-if-cleaning-produt-pesticide-under-fifra (2022).
- United States Congress. Toxic Substances Control Act of 1976. H.R. 12440. Library of Congress, United States. , 1640-1707 (1976).
- Wang, Z., Walker, G. W., Muir, D. C. G., Nagatani-Yoshida, K. Toward a global understanding of chemical pollution: a first comprehensive analysis of national and regional chemical inventories. Environmental Science Technology. 54 (5), 2575-2584 (2020).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
- New Approach Methods Work Plan. United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/system/files/documents/2021-11/nams-work-plan_11_15_21_508-tagged.pdf (2021).
- Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
- Mahony, C. Building confidence in non-animal methods: Practical examples of collaboration between regulators, researchers and industry. Computational Toxicology. 10, 78-80 (2019).
- Kavlock, R. J., et al. Accelerating the pace of chemical risk assessment. Chemical Research in Toxicology. 31 (5), 287-290 (2018).
- European Chemicals Agency. New Approach Methodologies in Regulatory Science, Proceedings of the Scientific Workshop. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland, 19-20 April 2016 (2016).
- Wambaugh, J. F., et al. New approach methodologies for exposure science. Current Opinion in Toxicology. 15, 76-92 (2019).
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32 (1), 74-83 (2010).
- Ong, C., Yung, L. Y. L., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9 (3), 396-403 (2015).
- Peterson, E. K., Long, H. E. Experimental protocol for using Drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory. Journal of Visualized Experiments. (137), e57450 (2018).
- Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental toxicity assays using the Drosophila model. Current Protocols in Toxicology. 59, 11-20 (2014).
- Misra, J. R., Horner, M. A., Lam, G., Thummel, C. S. Transcriptional regulation of xenobiotic detoxification in Drosophila. Genes & Development. 25 (17), 1796-1806 (2011).
- Rocha, J. B. T. Drosophila melanogaster as a promising model organism in toxicological studies. Archives of Basic and Applied Medicine. 1 (1), 33-38 (2013).
- Affleck, J. G., Walker, V. K. Drosophila as a model for developmental toxicology: using and extending the drosophotoxicology model. Methods in Molecular Biology. 1965, 139-153 (2019).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
- Chien, S., Reiter, L. T., Bier, E., Gribskov, M. Homophila: human disease gene cognates in Drosophila. Nucleic Acids Research. 30 (1), 149-151 (2002).
- Wangler, M. F., et al. Model organisms facilitate rare disease diagnosis and therapeutic research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
- Colbourne, J. K., et al. Toxicity by descent: A comparative approach for chemical hazard assessment. Environmental Advances. 9, 100287 (2022).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Markstein, M. Drosophila Workers Unite! A Laboratory Manual for Working with Drosophila. , Available from: http://marksteinlab.org/wp-content/uploads/2019/01/MicheleMarkstein-DrosophiliaWorkersUnite-PREPRINT-JAN2019.pdf (2018).
- Vang, L. L., Medvedev, A. V., Adler, J. Simple ways to measure behavioral responses of Drosophila to stimuli and use of these methods to characterize a novel mutant. PLoS One. 7 (5), 37495 (2012).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B., Byfield, F. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), e3795 (2012).
- Bloomington Drosophilia Stock Center. BDSC Cornmeal Food. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2022).
- Martins, R. R., McCracken, A. W., Simons, M. J. P., Henriques, C. M., Rera, M. How to catch a Smurf? - ageing and beyond… in vivo assessment of intestinal permeability in multiple model organisms. Bio-Protocol. 8 (3), 2722 (2018).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Benchmark Dose Software (BMDS) (Build 3.3; Model Library Version 2022.10) [Computer Software]. United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/bmds/download-bmds (2022).
- Ortiz, J. G., Opoka, R., Kane, D., Cartwright, I. L. Investigating arsenic susceptibility from a genetic perspective in Drosophila reveals a key role for glutathione synthetase. Toxicological Sciences. 107 (2), 416-426 (2009).
- Pickett, A. D., Patterson, N. A. Arsenates: effect on fecundity in some Diptera. Science. 140 (3566), 493-494 (1963).
- Goldstein, S. H., Babich, H. Differential effects of arsenite and arsenate to Drosophila melanogaster in a combined adult/developmental toxicity assay. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 42 (2), 276-282 (1989).
- Polak, M., Opoka, R., Cartwright, I. L. Response of fluctuating asymmetry to arsenic toxicity: support for the developmental selection hypothesis. Environmental Pollution. 118 (1), 1928 (1928).
- Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), 1006907 (2017).
- Anholt, R. R. H. Chemosensation and evolution of Drosophila host plant selection. iScience. 23 (1), 100799 (2020).
- Depetris-Chauvin, A., Galagovsky, D., Grosjean, Y. Chemicals and chemoreceptors: ecologically relevant signals driving behavior in Drosophila. Frontiers in Ecology and Evolution. 3, 41 (2015).
- Aryal, B., et al. Protocol for binary food choice assays using Drosophila melanogaster. STAR Protocols. 3 (2), 101410 (2022).
- Shimada, I., Nakao, M., Kawazoe, Y. Acute differential sensitivity and role of the central nervous system in the feeding behavior of Drosophila melanogaster. Chemical Senses. 12 (3), 481-490 (1987).
- Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147 (4), 433-437 (1982).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
- National Research Council. Toward Precision Medicine: Building a Knowledge Network for Biomedical Research and a New Taxonomy of Disease. National Academy of Sciences. , National Academies Press. US. (2011).
- Li, H., Tennessen, J. M. Preparation of Drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based metabolomics. Journal of Visualized Experiments. (136), e57847 (2018).
