Summary
Questo protocollo descrive un metodo efficiente ed economico che utilizza mezzi liquidi per valutare gli effetti delle sostanze chimiche tossiche sulla vitalità della Drosophila melanogaster adulta.
Abstract
Le industrie umane generano centinaia di migliaia di sostanze chimiche, molte delle quali non sono state adeguatamente studiate per la sicurezza ambientale o gli effetti sulla salute umana. Questo deficit di informazioni sulla sicurezza chimica è esacerbato dagli attuali metodi di test nei mammiferi che sono costosi, laboriosi e richiedono molto tempo. Recentemente, scienziati e regolatori hanno lavorato per sviluppare nuove metodologie di approccio (NAM) per i test di sicurezza chimica che sono più economici, più rapidi e riducono la sofferenza degli animali. Uno dei NAM chiave che emergono è l'uso di organismi invertebrati come sostituti dei modelli di mammiferi per chiarire le modalità chimiche di azione conservate in specie lontanamente imparentate, compresi gli esseri umani. Per far avanzare questi sforzi, qui, descriviamo un metodo che utilizza il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, per valutare la sicurezza chimica. Il protocollo descrive una procedura semplice, rapida ed economica per misurare la vitalità e il comportamento alimentare delle mosche adulte esposte. Inoltre, il protocollo può essere facilmente adattato per generare campioni per approcci genomici e metabolomici. Nel complesso, il protocollo rappresenta un importante passo avanti nella definizione di Drosophila come modello standard per l'uso nella tossicologia di precisione.
Introduction
Gli esseri umani sono costantemente esposti a sostanze chimiche provenienti da una varietà di fonti, tra cui aria1, cibo2, acqua3,4, farmaci5, detergenti6, prodotti per la cura personale 7, prodotti chimici industriali 7 e materiali da costruzione 7. Inoltre, ogni anno vengono introdotte migliaia di nuove sostanze chimiche8, molte delle quali non sono adeguatamente controllate per la salute e la sicurezza ambientale. Questa mancanza di adeguati test di sicurezza chimica deriva in parte da un'eccessiva dipendenza da modelli di mammiferi, come topi e ratti. Mentre tali modelli di roditori sono informativi, i test di sicurezza chimica in questi sistemi sono costosi, richiedono tempo e spesso causano livelli inaccettabili di sofferenza all'animale da esperimento9.
Gli oneri finanziari ed etici associati ai test di sicurezza chimica sui mammiferi, nonché la natura dispendiosa in termini di tempo degli studi sui mammiferi, sono i principali fattori che contribuiscono alla scarsità di dati che circondano le nuove sostanze chimiche. Per affrontare questo problema, l'Agenzia per la protezione dell'ambiente degli Stati Uniti (EPA), l'Agenzia europea per le sostanze chimiche (ECHA), Health Canada e altre agenzie stanno attuando misure che incorporano metodologie di nuovo approccio (NAM) nei quadri normativi10, ponendo così la politica nordamericana ed europea in linea con gli obiettivi internazionali di sostituire, ridurre e perfezionare l'uso di animali (il principio delle 3R)11, 12,13,14. I NAM comprendono una varietà di saggi basati principalmente su modelli in vitro e in silico che forniscono una comprensione meccanicistica della tossicità chimica invece di osservare le avversità inflitte alle specie di test sui mammiferi, aumentando così il tasso di generazione dei dati per la valutazione del rischio chimico pur producendo risultati ad alta fedeltà15. Tuttavia, questi metodi non hanno ancora dimostrato di salvaguardare dalla tossicità sistemica, compresa l'interruzione dei processi biologici vitali che coinvolgono la comunicazione interorgano e la segnalazione endocrina. Inoltre, non possono spiegare il bioaccumulo di sostanze chimiche all'interno di tessuti specifici, la capacità dei singoli composti di essere assorbiti e secreti e l'interazione tra comportamento ed esposizione chimica.
A causa dei limiti dei modelli in vitro e computazionali, l'uso efficace dei NAM per ridurre o sostituire i modelli di mammiferi dovrebbe includere anche modelli invertebrati in vivo, come il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster. Precedenti studi sulla mosca hanno dimostrato che questo organismo è adatto per studiare i percorsi genetici conservati che proteggono le cellule animali dalle molecole tossiche 16,17,18,19,20,21,22. Inoltre, la mosca mostra una notevole somiglianza genetica con l'uomo, compresi gli omologhi funzionali di oltre il 65% delle malattie umane 23,24,25 e una conservazione ancora maggiore di importanti vie funzionali 26. Queste caratteristiche, combinate con il loro ciclo di vita relativamente breve, i bassi costi di manutenzione e le risposte comportamentali prontamente osservabili, rendono Drosophila adatta per l'uso come modello tossicologico27,28,29,30. Inoltre, le mosche hanno un rendimento molto più elevato rispetto ai modelli di roditori e catturano effetti sul metabolismo, sulla fisiologia e sulla segnalazione ormonale che non sono facilmente rilevabili da altri NAM non organismici9.
Il protocollo qui descritto rappresenta un quadro per testare gli effetti dell'esposizione chimica sulla Drosophila adulta. Il metodo è progettato per essere efficiente, economico e riproducibile, riducendo al minimo il tempo che i ricercatori devono essere in contatto con la sostanza chimica in esame e accogliendo la raccolta di campioni per la metabolomica e altri approcci omici. Il protocollo è ottimizzato per testare una singola sostanza chimica per esperimento, ma può facilmente adattarsi ad altri parametri sperimentali, come solventi vari o combinazioni di sostanze chimiche.
Protocol
NOTA: Indossare guanti in nitrile per tutti i passaggi di questo protocollo. Indossare un camice da laboratorio, protezione per gli occhi e / o respiratori, come da schede di dati di sicurezza per ogni sostanza chimica valutata.
1. Preparazione della fiala e della camera di umidità
NOTA: I passaggi 1.1-1.5 possono essere completati in qualsiasi momento prima di iniziare le altre sezioni sperimentali. I guanti in nitrile devono essere indossati in ogni momento durante la preparazione del flaconcino per evitare contaminazioni.
- Impilare quattro fogli di carta cromatografica cellulosa di grado 1 (vedi Tabella dei materiali) e tagliarli in 2 in strisce larghe. Perforare gli inserti di carta da filtro a forma di fiore utilizzando un punzone di carta da 1,5 pollici contenente uno stampo a forma di fiore.
- Utilizzare un tassello di legno non verniciato da 22 x 220 mm per spingere la carta da filtro sul fondo di un flaconcino di polipropilene da 28,5 mm di diametro. Verificare che la pila di carta da filtro sia posizionata saldamente nella parte inferiore del flaconcino.
- Conservare i flaconcini preparati in vassoi di plastica o cartone e posizionare i vassoi in sacchetti di plastica grandi (~ 280 mm x 240 mm) fino all'uso.
- Costruire una camera di umidità tagliando un foro di 120 mm x 280 mm nel coperchio di plastica di una vasca di plastica da 606,24 x 225,42 mm x 403,22 mm (vedi Tabella dei materiali). Incollare la rete sopra il foro per consentire il flusso d'aria.
- Tagliare una sezione della griglia di plastica dai pannelli plafonieri a persiana (originariamente 610 mm x 1220 mm) per adattarla al fondo della vasca di plastica utilizzata nel passaggio 1.4.
NOTA: Una varietà di diverse vasche di plastica e materiali di griglia in plastica / metallo possono essere utilizzati per costruire una camera di umidità.
2. Allevamento di mosche
- Avviare colture di mosche adulte (minimo 30 adulti) in bottiglie di latte di vetro contenenti supporti standard del Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)31. Chiudere le bottiglie con un tappo di rayon avvolto in una delicata salvietta. Non affollare le bottiglie.
NOTA: Il numero di flaconi richiesti dipende dal numero di esposizioni chimiche condotte e dal genotipo del ceppo in esame. Normalmente, diverse centinaia di mosche possono essere ottenute da una singola bottiglia quando si utilizzano scorte robuste e feconde. Il test standard utilizza mosche wild-type Oregon-R (BDSC stock #2057), ma qualsiasi genotipo di interesse può essere utilizzato con questo protocollo. Ricorda che i genotipi compromessi con bassa fecondità e/o vitalità richiedono un aumento delle colture in bottiglia. - Incubare i vassoi delle bottiglie di coltura a 25 °C con circa il 60% di umidità e un ciclo luce:buio di 12:12 h fino a quando non si osservano il terzo stadio larvale o i primi stadi pupale. Questo stadio è identificabile dalla presenza di larve che vagano lungo i lati della bottiglia e dall'aspetto delle pupe sulle pareti della bottiglia.
NOTA: maneggiare le mosche solo durante il periodo di accensione delle 12:12 h light:dark cycle. Per le scorte robuste, le bottiglie raggiungono questa fase dopo 3-4 giorni nelle condizioni descritte.- Rimuovere le mosche adulte e determinare la liquidità dei media. Se il supporto scorre lungo il lato della bottiglia quando è invertito, il mezzo è troppo liquido. Inserire una delicata salvietta o una palla di rayon sul fondo della bottiglia per solidificare il cibo per mosche.
- Quando le mosche iniziano a chiudersi, elimina tutti gli adulti dalle bottiglie e consenti alle pupe di continuare a chiudersi per 48 ore. A questo punto, tutti gli adulti eliminati dalle bottiglie di coltura possono essere trasferiti in nuovi flaconi per propagare le scorte (vedi passaggio 2.1) o scartati.
- Trasferire le mosche che si chiudono nel periodo di 48 ore a nuove bottiglie contenenti supporti BDSC standard. Età per 3 giorni.
NOTA: Gli adulti in questi biberon hanno 3-5 giorni e possono essere utilizzati negli esperimenti di letalità e alimentazione. Le bottiglie utilizzate per invecchiare le mosche adulte conterranno uova e larve. Di conseguenza, queste bottiglie possono essere utilizzate per propagare la prossima generazione di mosche.
3. Preparazione delle mosche per l'esposizione chimica
- Anestetizzare mosche di 5-7 giorni con CO2. Ordina le mosche anestetizzate, per sesso, usando i loro genitali. Per assistenza con mosche anestetizzanti e sessuali, vedi riferimento28.
- Collocare gruppi di 20 moscerini maschi o 20 femmine in flaconcini contenenti supporti BDSC standard. Chiudere il flaconcino con un tappo di rayon e conservare separatamente i flaconcini maschili e femminili. Contrassegnare le fiale contenenti mosche femmine con una striscia. Lasciare le fiale con moscerini maschi non contrassegnate per evitare di mescolare accidentalmente i sessi.
NOTA: Il numero di flaconcini che devono essere preparati nella fase 3.2 è determinato dalle dimensioni degli esperimenti di esposizione. Come descritto nei punti 5.3 e 5.6, un tipico esperimento di range finding per una singola sostanza chimica in esame richiede un minimo di 40 flaconcini di maschi e 40 flaconcini di femmine. Un esperimento standard della curva dose-risposta, descritto nei punti 7.4 e 7.8, richiede un minimo di 63 flaconcini di maschi e 63 flaconcini di femmine. - Conservare i flaconcini per 48 ore in un'incubatrice a 25 °C a circa il 60% di umidità e con un ciclo luce:buio di 12:12 ore. Durante questo periodo, appoggiare il vassoio di fiale selezionate con un angolo di 60 ° per evitare che le mosche rimangano bloccate nel cibo durante il recupero dall'anestesia.
NOTA: Questo passaggio consente alle mosche di riprendersi dall'anestesia CO2 . Non anestetizzare nuovamente le mosche durante il resto del protocollo di esposizione. - Dopo il periodo di recupero di 48 ore, aggiungere 0,75 ml di acqua purificata sterile ai flaconcini preparati al punto 1.3. Il numero di flaconcini preparati in questa fase deve essere identico al numero di flaconcini impostati al punto 3.2.
- Trasferire i moscerini ordinati e abbinati al sesso nella fiala di fame aprendo il flaconcino di vetro contenente i moscerini dal punto 3.2, inserendolo nella bocca del flaconcino di plastica preparato e quindi picchiettando il fondo del flaconcino di plastica contro un piano di lavoro. Chiudere il flaconcino di plastica con un tappo di acetato di cellulosa (comunemente noto come colpo di fortuna).
- Registrare eventuali mosche perse in questo trasferimento (trasferimento in registrazioni del numero iniziale di mosche per ogni flaconcino in seguito).
- Contrassegna le fiale di fame contenenti mosche femmine con una striscia. Lasciare le fiale con moscerini maschi non contrassegnate per evitare di mescolare accidentalmente i sessi.
- Preparare la camera di umidità per l'esposizione notturna. Vedere i passaggi 1.4-1.5 per una descrizione di come costruire questa camera.
- Posizionare sei tovaglioli di carta standard sul fondo della camera di umidità. Immergere i tovaglioli di carta con 100 ml di acqua.
- Mettere la griglia di plastica (punto 1.5) sopra gli asciugamani bagnati per assicurarsi che i flaconcini non entrino in contatto con gli asciugamani di carta saturi.
- Posizionare i vassoi delle fiale di fame in posizione orizzontale all'interno delle camere di umidità. Posizionare le camere di umidità in un'incubatrice a 25 °C (a circa il 60% di umidità) durante la notte.
NOTA: Idealmente, il periodo di fame durante la notte dura circa 16 ore; Tuttavia, la tempistica può essere regolata per i singoli programmi di laboratorio.
4. Preparazione delle soluzioni madre
NOTA: Le mosche vengono alimentate con sostanze chimiche di prova in un mezzo liquido di lievito e saccarosio. Questa sezione descrive la preparazione di soluzioni stock di mezzi di alimentazione concentrati e sostanze chimiche in esame.
- Preparare una soluzione 4x di lievito-saccarosio contenente il 16% di saccarosio e il 6% di estratto di lievito (m/v) (vedi Tabella dei materiali) sciolta in acqua purificata sterile. Autoclavare la soluzione su un ciclo liquido per il tempo di sterilizzazione appropriato (ad esempio, 40 minuti per 1 L).
NOTA: La soluzione può essere preparata alla rinfusa e conservata in aliquote a -20 °C. Scongelare le singole aliquote 1 giorno prima dell'uso ponendoli in frigorifero a 4 °C. - Preparare una scorta della sostanza chimica in esame. Per l'esperimento iniziale, la soluzione madre deve essere prodotta alla massima concentrazione in modo che la sostanza chimica possa essere completamente disciolta in acqua.
NOTA: solventi diversi dall'acqua possono essere utilizzati per sciogliere la sostanza chimica in esame. Vedi la discussione riguardante le avvertenze per l'uso di solventi alternativi. - Preparare una soluzione madre di colorante blu 100x sciogliendo 1 g di FD&C Blue No. 1 (vedi Tabella dei materiali) in 10 ml di acqua purificata sterile.
NOTA: La soluzione madre di colorante blu può essere prodotta alla rinfusa e conservata in aliquote a 4 °C.
5. Preparazione delle fiale di esposizione: esperimento di ricerca della gamma
NOTA: Le fasi 5 e 6 del protocollo sono progettate per identificare la dose più bassa di sostanza chimica in esame che induce il 100% di letalità e la dose più alta che non riesce a indurre un fenotipo letale. Se queste concentrazioni sono già determinate da esperimenti precedenti, vedere i punti 7 e 8 per il calcolo di una curva dose-risposta. I mezzi di esposizione devono essere preparati immediatamente prima di aggiungere mosche ai flaconcini di esposizione.
- Etichettare otto provette da centrifuga da 15 mL come segue: (i) nessuna sostanza chimica, (ii) concentrazione massima, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 e 1:1.000.
- Preparare i mezzi di esposizione nelle provette da centrifuga marcate dal punto 5.1 aggiungendo prima 2,5 ml di soluzione madre 4x di lievito/saccarosio a tutti gli otto tubi marcati.
- Aggiungere 7,5 ml di acqua purificata sterile al tubo etichettato "senza sostanze chimiche". Questa diluizione è il controllo negativo.
- Aggiungere 7,4 mL della soluzione madre della sostanza chimica in esame alla provetta etichettata come "massima concentrazione". Aggiungere 100 μL di acqua purificata sterile a questo tubo, quindi il volume finale è di 10 ml. Calcolare e registrare la molarità della sostanza chimica in esame in questa soluzione.
NOTA: L'aggiunta di 100 μL di acqua purificata sterile al tubo assicura che la concentrazione chimica in questa fase sia identica a quella utilizzata nella fase 5.5, in cui una soluzione madre di colorante blu viene aggiunta al mezzo di esposizione come metodo per valutare il comportamento alimentare. - Aggiungere la quantità appropriata di soluzione madre di sostanze chimiche in esame e acqua purificata sterile alle provette rimanenti. Il volume finale di ciascun tubo deve essere di 10 ml. La concentrazione finale di sostanze chimiche in esame in queste provette rispetto alla provetta di "massima concentrazione" deve essere 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 e 1:1.000.
- Preparare ed etichettare otto flaconcini di esposizione per ogni singola concentrazione di mezzi di esposizione generati nella fase 5.1. Ci dovrebbero essere otto set di flaconcini (64 flaconcini in totale) contenenti le seguenti etichette: nessuna sostanza chimica, massima concentrazione, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 e 1:1.000.
- Pipettare 0,75 mL di materiale di esposizione preparato al punto 5.2.3 nel set corrispondente di flaconcini di esposizione.
- Etichettare otto provette singole da 5 mL come segue: (i) nessuna sostanza chimica, (ii) massima concentrazione, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 e 1:1.000.
- Preparare i mezzi di esposizione al colorante blu mescolando prima 500 μL di soluzione madre di lievito/saccarosio 4x e 20 μL di soluzione madre di colorante blu in otto tubi marcati da 5 ml.
- Aggiungere 1,48 ml di acqua purificata sterile al tubo etichettato "senza sostanze chimiche". Questa diluizione è il controllo negativo.
- Aggiungere 1,48 mL della soluzione madre della sostanza chimica in esame alla provetta etichettata come "massima concentrazione". Non viene aggiunta acqua a questo tubo. Calcolare e registrare la molarità della sostanza chimica in esame in questa soluzione.
- Aggiungere la quantità appropriata di soluzione madre di sostanze chimiche in esame e acqua purificata sterile alle provette rimanenti. Il volume finale di ciascun tubo dovrebbe essere di 2 ml. La concentrazione finale della sostanza chimica in esame in queste provette rispetto alla provetta a "massima concentrazione" deve essere 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 e 1:1.000.
- Preparare ed etichettare due flaconcini di esposizione con ogni singola concentrazione di mezzi di esposizione blu. Ci devono essere otto serie di flaconcini (16 flaconcini in totale) contenenti le seguenti etichette: nessuna sostanza chimica, massima concentrazione, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 e 1:1.000. La parola "blu" dovrebbe anche essere scritta su queste fiale.
- Pipettare 0,75 mL di materiale filtrante blu nel set corrispondente di flaconcini di esposizione blu.
6. Esposizione chimica della mosca: esperimento di ricerca della gamma
- Preparare i flaconcini di esposizione chimica usando i flaconcini di mosche affamate durante la notte dal punto 3.7 come segue:
- Trasferire quattro flaconcini di moscerini femmina affamati (20 moscerini per fiala) in quattro flaconcini di esposizione di ciascuna concentrazione chimica. Etichettare questi flaconcini come "femmina". Utilizzare lo stesso metodo di trasferimento descritto nel passaggio 3.5.
- Trasferire quattro flaconcini di moscerini maschi affamati (20 moscerini per flaconcino) in quattro flaconcini di esposizione di ciascuna concentrazione chimica. Etichettare questi flaconcini "maschio". Utilizzare lo stesso metodo di trasferimento descritto nel passaggio 3.5.
- Preparare flaconcini di esposizione chimica contenenti colorante blu usando i flaconcini di mosche affamate durante la notte dal punto 3.7 come segue:
- Trasferire un flaconcino di moscerini femmina affamati (20 moscerini per flaconcino) in un flaconcino di esposizione blu per ogni concentrazione chimica. Etichettare questo flaconcino come "femmina". Utilizzare lo stesso metodo di trasferimento descritto nel passaggio 3.5.
- Trasferire un flaconcino di moscerini maschi affamati (20 moscerini per flaconcino) in un flaconcino di esposizione blu per ogni concentrazione chimica. Etichettare questo flaconcino "maschio". Utilizzare lo stesso metodo di trasferimento descritto nel passaggio 3.5.
- Registrare il numero di mosche presenti in ogni fiala dopo il trasferimento e annotare il numero di mosche morte o fuggite. Normalmente, tutte e 20 le mosche dovrebbero sopravvivere durante la notte alla fame e al trasferimento.
- Posizionare i flaconcini di esposizione orizzontalmente in camere di umidità appena preparate (vedere il punto 3.6 per la preparazione della camera di umidità). Collocare le camere in un'incubatrice a 25 °C con circa il 60% di umidità e un ciclo luce:buio di 12:12 ore.
- Esaminare i flaconcini di esposizione a 24 e 48 ore dopo l'inizio dell'esposizione chimica. Contare e registrare il numero di mosche morte in ogni fiala in ogni punto temporale.
NOTA: La morte viene utilizzata come lettura per questo test, ma il protocollo può essere adattato per esaminare altri fenotipi. Le mosche esposte sono comunemente raccolte in questi punti temporali per studi trascrittomici e metabolomici. - Esaminare i flaconcini di esposizione blu a 24 ore dopo l'inizio dell'esposizione chimica. Utilizzare le seguenti tecniche per determinare se le mosche esposte hanno consumato i mezzi di esposizione blu:
- Esaminare le pareti della fiala per indicazioni di feci blu, che appaiono come piccoli punti sul lato della fiala di esposizione e sul flug.
- Anestetizzare le mosche con CO2 ed esaminare gli addomi per la presenza di colorante blu.
NOTA: Normalmente, le fiale di esposizione blu vengono analizzate dopo 24 ore. Tuttavia, questo passaggio potrebbe essere eseguito a 48 h, invece. Le mosche che hanno mangiato normalmente hanno una striscia blu attraverso l'addome, indicando che il mezzo di esposizione è entrato nell'intestino. - Esaminare le mosche per comportamenti alimentari anormali, come rigurgito, distensione delle colture e rottura della funzione di barriera intestinale (indicata dalla comparsa di colorante blu in tutto l'organismo piuttosto che limitata al tratto gastrointestinale, comunemente indicato come puffo32,33).
- Gettare tutte le fiale contaminate, la carta da filtro, i flugs e le mosche in appositi contenitori di rifiuti chimici. Se le mosche vive rimangono nelle fiale, congelare le fiale per ucciderle prima di gettarle nell'apposito contenitore dei rifiuti.
NOTA: Lo smaltimento delle fiale e delle mosche di esposizione è dettato dalle sostanze chimiche analizzate nell'esperimento. Seguire sempre le procedure di sicurezza chimica descritte nella scheda di sicurezza chimica. Se le concentrazioni utilizzate nell'esperimento di range finding uccidono le mosche alla dose più bassa, ripetere la sezione 6 usando una serie di diluizioni, iniziando con la concentrazione più bassa che ha ucciso il 100% degli animali.
7. Preparazione dei flaconcini di esposizione: generazione di una curva dose-risposta
NOTA: Il protocollo descritto nei passaggi 5 e 6 è progettato per determinare ampiamente la concentrazione chimica necessaria per suscitare un fenotipo. I passaggi 7 e 8 del protocollo vengono utilizzati per calcolare una curva dose-risposta accurata.
- Calcolare le concentrazioni di sostanze chimiche in esame che devono essere analizzate per generare una curva dose-risposta utilizzando il seguente metodo:
- Determinare la concentrazione più bassa della sostanza chimica in esame che uccide il 100% delle mosche esposte a 48 ore.
- Determinare la massima concentrazione di sostanza chimica in esame che non ha alcun effetto sulla vitalità a 48 ore.
- Calcolare altre quattro concentrazioni equamente distribuite tra le concentrazioni determinate nei punti 7.1.1 e 7.1.2.
- Etichettare nove provette da centrifuga singole da 15 mL con la molarità delle seguenti concentrazioni: i) nessuna sostanza chimica, ii) concentrazione determinata nella fase 7.1.1, iii) concentrazione determinata nella fase 7.1.2, iv) concentrazioni determinate al punto 7.1.3, v) il doppio della concentrazione determinata nella fase 7.1.1, vi) una diluizione 1:2 della concentrazione determinata nella fase 7.1.2.
NOTA: Per calcolare con precisione la curva dose-risposta è importante includere le concentrazioni che sono il doppio della concentrazione determinata al punto 7.1.1 e una diluizione 1:2 di quella determinata al punto 7.1.2. - Preparare il mezzo di esposizione aggiungendo prima 2,5 ml di soluzione madre 4x di lievito/saccarosio a nove provette da centrifuga da 15 ml etichettate preparate al punto 7.2.
- Aggiungere 7,5 ml di acqua purificata sterile al tubo etichettato "senza sostanze chimiche". Questa diluizione è il controllo negativo.
- Aggiungere la quantità appropriata di soluzione madre di sostanze chimiche in esame e acqua purificata sterile alle provette rimanenti. Il volume finale di ciascun tubo deve essere di 10 ml. La concentrazione finale di sostanza chimica all'interno di un singolo tubo deve essere uguale a quella scritta all'esterno del tubo.
- Preparare ed etichettare 12 flaconcini di esposizione per ogni concentrazione di mezzi di esposizione generata nella fase 7.2. Ci dovrebbero essere nove set di flaconcini (108 flaconcini in totale).
- Pipettare 0,75 mL di materiale di esposizione nel set corrispondente di flaconcini di esposizione.
Nota : i passaggi da 7.6 a 7.8 sono facoltativi. Se è noto che le concentrazioni di sostanze chimiche in esame preparate al punto 7.2 non influenzano il comportamento alimentare, questi passaggi possono essere saltati. - Preparare ed etichettare nove diverse provette da 5 ml per i mezzi di esposizione blu con la stessa serie di concentrazioni utilizzate nella fase 7.2.
- Preparare i mezzi di esposizione al colorante blu mescolando prima 500 μL di 4x soluzione madre di lievito/saccarosio e 20 μL di soluzione madre di colorante blu.
- Aggiungere 1,48 ml di acqua sterile purificata al tubo etichettato "senza sostanze chimiche". Questa diluizione è il controllo negativo.
- Aggiungere la quantità appropriata di soluzione madre della sostanza chimica in esame e acqua sterile purificata alle provette rimanenti. Il volume finale di ogni tubo deve essere di 2 ml. La concentrazione finale di sostanza chimica all'interno di un singolo tubo deve essere uguale a quella scritta all'esterno del tubo.
- Preparare ed etichettare due flaconcini di esposizione per ogni singola concentrazione di mezzi di esposizione blu. Ci devono essere nove serie di flaconcini (18 flaconcini in totale), con ogni set di flaconcini etichettati con le concentrazioni elencate al punto 7.2. La parola "blu" dovrebbe anche essere scritta su queste fiale.
- Pipettare 0,75 mL di materiale filtrante blu nel set corrispondente di flaconcini di esposizione blu.
8. Esposizione chimica della mosca: generazione di una curva dose-risposta
- Preparare i flaconcini di esposizione chimica usando i flaconcini di mosche affamate durante la notte dal punto 3.7 come segue:
- Trasferire sei flaconcini di moscerini femmina affamati (20 moscerini per flaconcino) in sei flaconcini di esposizione di ciascuna concentrazione chimica. Etichettare questi flaconcini come "femmina". Utilizzare lo stesso metodo di trasferimento descritto nel passaggio 3.5.
- Trasferire sei flaconcini di moscerini maschi affamati (20 moscerini per flaconcino) in sei flaconcini di esposizione di ciascuna concentrazione chimica. Etichettare questi flaconcini "maschio". Utilizzare lo stesso metodo di trasferimento descritto nel passaggio 3.5.
- Preparare flaconcini di esposizione chimica contenenti colorante blu usando i flaconcini di mosche affamate durante la notte dal punto 3.7 come segue:
- Trasferire un flaconcino di moscerini femmina affamati (20 moscerini per flaconcino) in un flaconcino di esposizione blu per ogni concentrazione chimica. Etichettare questo flaconcino come "femmina". Utilizzare lo stesso metodo di trasferimento descritto nel passaggio 3.5.
- Trasferire un flaconcino di moscerini maschi affamati (venti moscerini per flaconcino) in un flaconcino blu per ogni concentrazione chimica. Etichettare questo flaconcino "maschio". Utilizzare lo stesso metodo di trasferimento descritto nel passaggio 3.5.
- Registrare il numero di mosche presenti in ogni flaconcino dopo il trasferimento. Normalmente, tutte e 20 le mosche dovrebbero sopravvivere alla fame durante la notte e al trasferimento, ma assicurarsi che quelle morte o fuggite durante il trasferimento vengano sottratte dal totale.
- Posizionare i flaconcini di esposizione orizzontalmente in camere di umidità appena preparate (vedere il punto 3.6 per la preparazione della camera di umidità). Collocare le camere in un'incubatrice a 25 °C con circa il 60% di umidità e un ciclo luce:buio di 12:12 ore.
- Esaminare i flaconcini di esposizione a 24 e 48 ore dopo l'inizio dell'esposizione chimica. Contare e registrare il numero di mosche morte in ogni fiala in ogni punto temporale.
- Esaminare i flaconcini di esposizione blu a 24 ore dopo l'inizio dell'esposizione chimica. Utilizzare il metodo descritto nel passaggio 6.6 per valutare i cambiamenti nel comportamento alimentare.
- Gettare tutte le fiale contaminate, la carta da filtro, i flugs e le mosche in appositi contenitori di rifiuti chimici. Se le mosche vive rimangono nelle fiale, congelare le fiale per ucciderle prima di gettarle nell'apposito contenitore dei rifiuti.
NOTA: Lo smaltimento delle fiale e delle mosche di esposizione è dettato dalle sostanze chimiche analizzate nell'esperimento. Seguire sempre le procedure di sicurezza chimica descritte nella scheda di sicurezza chimica.
9. Calcolo di una curva dose-risposta
- Utilizzare il Benchmark Dose Software (BMDS, versione 3.2; vedi Tabella dei Materiali) o altro software simile per analizzare i dati34. Di seguito viene descritto il flusso di lavoro utilizzando il software BMDS.
- Fare clic sulla scheda Dati di BMDS e fare clic su Inserisci nuovo set di dati. Immettere il numero di campioni nel set di dati, fare clic su dicotomico e quindi fare clic su Crea set di dati. Immettere ogni replica come singola riga nel set di dati.
- Inserire la dose nella prima colonna della tabella generata, il numero iniziale di mosche escluse quelle morte o perse prima della fase 8.3) nella seconda colonna e il numero di mosche morte per esposizione chimica nella terza colonna.
- Fare clic sulla scheda Principale di BMDS.
- Fare clic sulla freccia a discesa per il menu Seleziona tipo di modello e fare clic su Dicotomous.
- Fare clic su Attiva per il set di dati dal passaggio 9.2 nella tabella Set di dati.
- Fare clic sulle caselle per i modelli desiderati per l'analisi nella tabella MLE e Alternative.
NOTA: è stato utilizzato principalmente il modello Frequentist Restricted Dichotomous Hill. - Fare clic su Esegui analisi. Il programma genererà un file di output con le curve di letalità e ulteriori dettagli sui modelli.
Representative Results
La mosca è servita a lungo come modello negli studi per determinare la tossicità dell'arsenito di sodio (NaAsO2)35,36,37,38. Per dimostrare l'efficacia del protocollo, moscerini maschi e femmine sono stati esposti a NaAsO2, con l'obiettivo di confrontare questi risultati con studi precedenti. Utilizzando la metodologia sopra descritta, maschi e femmine adulti Oregon-R (BDSC stock #2057) sono stati esposti a una gamma di concentrazioni di NaAsO 2 (0, 0,01, 0,02, 0,1, 0,2, 1 e2 mM) e hanno ottenuto un punteggio per la letalità 48 ore dopo l'inizio dell'esposizione (Figura 1A, B).
Lo scopo di questa analisi iniziale era quello di identificare l'intervallo approssimativo di concentrazioni che avrebbe permesso una caratterizzazione più precisa della tossicità di NaAsO2. Negli esperimenti successivi, sono state selezionate concentrazioni (0, 0,2, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 e 5 mM) che hanno definito più precisamente la curva dose-risposta NaAsO2 (Figura 1C, D). Si noti che l'analisi risultante ha esaminato diverse concentrazioni che hanno indotto il 100% di letalità. I dati sono stati analizzati utilizzando il software Benchmark Dose Software dell'Environmental Protection Agency, disponibile al pubblico, versione 3.2.0.125. I dati sono stati modellati come "dicotomici" e il modello di Hill dicotomico è stato utilizzato per analisi successive. Sulla base di questo modello, i LD 10, LD25 e LD50 finali dei moscerini maschi alimentati con NaAsO2 erano rispettivamente 0,30 mM, 0,50 mM e 0,65 mM. Per le mosche femmine, questi valori erano leggermente più alti, con un LD10 di 0,30 mM, un LD25 di 0,65 mM e un LD50 di 0,90 mM. Nel complesso, i valori ottenuti con questo metodo sono simili a quelli precedentemente riportati per la tossicità da arsenico nella Drosophila melanogaster35,36,37,38, convalidando così la metodologia.
Oltre alle sei repliche utilizzate per calcolare la curva dose-risposta, i moscerini maschi e femmine sono stati alimentati anche con soluzioni di esposizione a NaAsO2 contenenti l'1% di blu FD & C, che è facilmente visibile nel tratto digestivo utilizzando la microscopia ottica. Sulla base della presenza di colorante blu all'interno dell'intestino delle mosche alimentate con NaAsO 2, sia i moscerini maschi che le femmine hanno continuato a nutrirsi 24 ore dopo l'inizio dell'esposizione chimica, indipendentemente dalla concentrazione di NaAsO 2 presente all'interno dei mezzi liquidi (Figura 2). Tuttavia, è stato osservato che il cibo ingerito veniva occasionalmente rigurgitato a dosi superiori a 0,2 mM per le femmine e 0,5 mM per i maschi (Figura 2). Questi risultati suggeriscono che il rigurgito potrebbe svolgere un ruolo chiave nella risposta della Drosophila all'avvelenamento da arsenico.
Figura 1: Curve dose-risposta per Drosophila maschio e femmina trattati con NaAsO2 per 48 ore. Tutti i grafici mostrano le proporzioni stimate di mosche morte ad ogni concentrazione di NaAsO2 testata sulla base del modello di Dichotomous Hill. (A,B) È stata testata un'ampia gamma di concentrazioni di NaAsO2 per approssimare la dose alla quale ogni sesso di mosca inizia a morire. (A) mostra i dati maschili e (B) mostra i dati femminili. N = 4 flaconcini, con 20 mosche per flaconcino. (C,D) È stata testata una gamma più ristretta di concentrazioni di NaAsO2 per determinare dosi precise alle quali sono morti il 10%, il 25% e il 50% di ciascun sesso di mosche. Queste dosi sono indicate a destra di ciascun grafico. (C) mostra i dati maschili e (D) mostra i dati femminili. N = 6 flaconcini, con 20 mosche per flaconcino. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Risultati rappresentativi del test del colorante blu di Drosophila maschile e femminile trattati con NaAsO2 per 24 ore. Le micrografie mostrano mosche alimentate con concentrazioni crescenti di NaAsO2. La riga (A) mostra mosche maschili, e la riga (B) mostra mosche femmine, con la concentrazione di NaAsO2 che aumenta da sinistra a destra. L'addome mostra una piccola quantità di blu vicino al torace a basse concentrazioni, indicando che i mezzi di esposizione sono entrati nell'intestino. A concentrazioni più elevate, il colorante blu inizia ad accumularsi intorno alla bocca, suggerendo che i mezzi di esposizione vengono rigurgitati. La barra della scala è di 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster sta emergendo come un potente sistema per i NAM16,18,19,21. Sfruttando le impareggiabili risorse genetiche disponibili per la comunità dei moscerini, combinate con i recenti progressi nella genomica e nella metabolomica, gli studi di sicurezza chimica che utilizzano Drosophila sono in grado di identificare rapidamente i meccanismi molecolari attraverso i quali i singoli composti interferiscono con il metabolismo, la fisiologia e la segnalazione cellulare (ad esempio, vedi39). Questo protocollo economico è progettato per definire rapidamente le curve dose-risposta e successivamente generare campioni per l'analisi dell'RNA-seq e della metabolomica. Inoltre, questo protocollo flessibile può essere adattato per l'uso con qualsiasi genotipo e può ospitare molte classi di sostanze chimiche.
Un aspetto notevole di questo protocollo è la scelta del cibo liquido utilizzato nell'esposizione chimica, che si basa su uno studio precedente, ma differisce dai terreni solidi utilizzati dalla maggior parte degli studi tossicologici di Drosophila 18,22. Questo specifico mezzo liquido è stato selezionato per riflettere il contenuto nutrizionale del mezzo BDSC standard e solido che le mosche sono anche alimentate in questo protocollo, per garantire che le mosche ricevano un'alimentazione coerente. La semplicità dei mezzi di alimentazione liquidi ha molti vantaggi. I mezzi liquidi sono più facili da maneggiare rispetto agli alimenti solidi, che devono essere fusi e risolidificati o ricostituiti dalla polvere. I fluidi liquidi aumentano anche la produttività del sistema, garantiscono una distribuzione uniforme delle sostanze chimiche in tutti i mezzi di alimentazione e riducono il tempo impiegato per lavorare con composti pericolosi. Inoltre, il fluido non richiede soluzioni da riscaldare, il che facilita il test dei composti di prova volatili. Infine, a causa dei relativamente pochi componenti inclusi nella soluzione alimentare, le reazioni collaterali indesiderate sono ridotte al minimo tra la sostanza chimica in esame e altri componenti dietetici. Anche il lievito utilizzato nel cibo è inattivo, limitando ulteriormente la reattività del mezzo di alimentazione. Tuttavia, si noti che il metodo non è adatto per testare la tossicità dello sviluppo o larvale.
Alcuni dei materiali utilizzati nel protocollo possono essere sostituiti, come l'uso di fiale di mosca di vetro piuttosto che di polipropilene. Tuttavia, i materiali utilizzati sono stati selezionati per essere sia inerti che usa e getta per evitare reazioni chimiche indesiderate tra i reagenti e le esposizioni chimiche che potrebbero derivare dalla pulizia della vetreria.
L'uso di alimenti liquidi richiede un veicolo per la consegna di cibo. La carta da filtro in acetato di cellulosa è stata scelta per questo scopo per la sua flessibilità e natura inerte28. Altri ricercatori hanno utilizzato protocolli simili ma con altri veicoli, come salviette delicate o filtri in fibra di vetro29,30. La carta da filtro in acetato di cellulosa è adatta a queste esigenze perché è un veicolo inerte che può essere tagliato nella forma ideale per inserirlo nel fondo delle fiale di mosca senza grandi spazi tra la carta e la parete della fiala, evitando la morte a causa delle mosche che rimangono bloccate nei mezzi o nel veicolo stesso.
Un importante limite di questo sistema è che la concentrazione massima verificabile di una sostanza chimica è legata alla solubilità della sostanza chimica. I composti non solubili in acqua richiedono un solvente aggiuntivo, che può portare a effetti aggiuntivi o sinergici con la sostanza chimica di interesse. Ciò può anche creare situazioni in cui non è possibile preparare soluzioni madre sufficientemente concentrate per raggiungere l'endpoint desiderato in tutti gli organismi, limitando quindi l'analisi dei dati risultanti31. Per risolvere questo problema, le sostanze chimiche con bassa solubilità in acqua possono essere testate aggiungendo fino allo 0,5% di dimetilsolfossido alla soluzione alimentare. Altri solventi potrebbero essere utilizzati, ma sono necessarie ulteriori ricerche per ciascun solvente di interesse per determinare la concentrazione massima accettabile di solvente all'interno della soluzione per massimizzare la solubilità riducendo al minimo gli effetti del solvente sull'organismo.
Un'ampia caratterizzazione della risposta olfattiva nella Drosophila ha descritto come le mosche evitano di consumare composti tossici40,41, portando a una riduzione dell'alimentazione sui terreni trattati. Il test del colorante blu affronta questo fenomeno consentendo ai ricercatori di esaminare in modo efficiente i comportamenti di alimentazione delle mosche alimentate con ogni concentrazione di sostanza chimica sperimentale42,43,44. La presenza o l'assenza di blu nel tratto gastrointestinale della mosca indica se la mosca ha mangiato il mezzo contenente sostanze tossiche. Sebbene esistano metodi più sofisticati per valutare i comportamenti di alimentazione delle mosche, come il Fly Liquid-Food Interaction Counter45, questo metodo qualitativo è più adatto per lo screening a più alto rendimento.
Un aspetto notevole di questo protocollo è che è stato ottimizzato per un periodo di esposizione di 48 ore senza la necessità di trasferire mosche o aggiungere ulteriore liquido alla fiala di esposizione. L'uso di una camera di umidità e il posizionamento delle camere in un incubatore mantenuto ad alta umidità hanno impedito alla carta da filtro contenente il mezzo di alimentazione di asciugarsi durante questo lasso di tempo. Il protocollo può essere adattato per periodi di esposizione più lunghi, ma il metodo deve essere adattato per garantire che la carta da filtro non si asciughi e causi cambiamenti significativi nella concentrazione della soluzione o nella letalità dovuta all'essiccazione.
Infine, una caratteristica importante di questo protocollo è che può facilmente ospitare varianti genetiche, il che consente ai ricercatori di utilizzare la vasta gamma di strumenti genetici per Drosophila per espandere questi studi preliminari su organismi wild-type per comprendere meglio i meccanismi di azione chimica in vivo. A questo proposito, il protocollo sopra descritto potrebbe essere facilmente modificato per integrare un protocollo JoVE precedentemente descritto da Peterson e Long che consente l'analisi tossicologica delle mosche catturate in natura18.
A causa dell'ampia varietà di studi precedenti sulla tossicità dell'arsenito di sodio in Drosophila 32,33,34,35,36, le mosche Oregon-R sono state trattate con questo composto per dimostrare l'efficacia del nostro sistema. I moscerini maschi hanno mostrato un LD 50 di 0,65 mM e le femmine hanno mostrato un LD50 di 0,90 mM. Ciò si allinea con studi precedenti sulla Drosofila adulta adulta trattata con arsenito di sodio. Ad esempio, Goldstein e Babich37 hanno scoperto che il 50% delle mosche (sessi misti) è morto dopo 7 giorni di esposizione a 0,5 mM NaAsO2. Sebbene questa sia una dose leggermente inferiore a quella attualmente osservata, le differenze tra i loro metodi e questo metodo (compreso l'uso di mezzi di esposizione solidi, una scala temporale più lunga e sessi misti) probabilmente spiegano questa differenza. È importante sottolineare che entrambi i metodi hanno portato a valori LD50 complessivamente simili.
Le osservazioni degli esperimenti che utilizzano questo protocollo possono essere utilizzate per trovare bersagli genetici e molecolari per successivi studi comportamentali o meccanicistici. Il metodo di esposizione può anche essere usato per trattare Drosophila per il campionamento per la metabolomica e la proteomica, rendendo questo protocollo adatto al crescente campo della tossicologia di precisione (modellato dal campo della medicina di precisione46). A questo proposito, le mosche esposte possono essere raccolte dopo la fase 8 per la successiva analisi genomica e metabolomica. I campioni raccolti nella fase 8 possono quindi essere elaborati, come descritto da Li e Tennessen47, a partire dalla fase 3.
In definitiva, i dati acquisiti dagli esperimenti sopra descritti, così come tutti i successivi dati di metabolomica e proteomica, sarebbero idealmente utilizzati nei confronti tra specie. Come notato in precedenza26, tali studi interspecie sono potenti e in grado di determinare come le singole sostanze chimiche interferiscono con i percorsi biologici conservati. Pertanto, il protocollo sopra descritto può essere utilizzato per trovare punti in comune evolutivi in risposta a singoli tossici attraverso i phyla e contribuire a informare la regolamentazione della sicurezza chimica.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi da divulgare.
Acknowledgments
Ringraziamo il nostro staff per l'aiuto con il test e l'ottimizzazione di questo protocollo: Ameya Belamkar, Marilyn Clark, Alexander Fitt, Emma Rose Gallant, Ethan Golditch, Matthew Lowe, Morgan Marsh, Kyle McClung, Andy Puga, Darcy Rose, Cameron Stockbridge e Noelle Zolman. Ringraziamo anche i nostri colleghi del Precision Toxicology Group, in particolare le nostre controparti dell'Exposure Group, per aver contribuito a identificare gli obiettivi del protocollo.
Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 965406. Il lavoro presentato in questa pubblicazione è stato eseguito nell'ambito del cluster ASPIS. Questo risultato riflette solo le opinioni degli autori e l'Unione europea non può essere ritenuta responsabile per qualsiasi uso che possa essere fatto delle informazioni in esso contenute. Questa pubblicazione è stata resa possibile anche grazie al supporto dell'Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, che è finanziato in parte dal premio numero UL1TR002529 del National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Parti di questo progetto sono state sostenute da fondi dell'Università dell'Indiana assegnati al JRS e al consorzio PhyloTox. JMH ed EMP sono stati supportati dal premio NIH P40OD018537 al Bloomington Drosophila Stock Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 inch flower lever action craft punch | Bira Craft | HCP-115-024 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL |
| 2 ml Tubes | VWR | 16466-044 | Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom |
| 5 ml Tubes | VWR | 60818-576 | Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430290 | 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap |
| Benchmark Dose Software version 3.2 | U.S. Environmental Protection Agency | ||
| Cardboard trays | Genesee Scientific flystuff | 32-122 | trays and dividers for narrow vials |
| CO2 gas pads | Genesee Scientific flystuff | 59-114 | FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus |
| Combitips advanced, 50 mL | Eppendorf | 0030089693 | Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips |
| Cotton balls | Genesee Scientific flystuff | 51-101 | Cotton balls, large, fits narrow vials |
| Delicate task wipes | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39" |
| Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) | VWR | 89168-888 | Wide |
| FD&C Blue No. 1 | Spectrum Chemical | FD110 | CAS number 3844-45-9 |
| Flies | BDSC | Stock #2057 | OregonR wildtype |
| Gloves (nitrile) | Kimtech | 55082/55081/55083 | Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" |
| Grade 1 CHR cellulose chromatography paper | Cytvia | 3001-917 | Sheet, 46 x 57 cm |
| Mesh for humidity chamber | |||
| Multipette / Repeater (X) stream | Eppendorf | 022460811 | Repeater Xstream |
| Plastic grate | Plaskolite | 18469 (from lowes) | Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs |
| Plastic trays for glass vials | Genesee Scientific flystuff | 59-207 | Narrow fly vial reload tray |
| Polypropylene Drosophila Vial | VWR | 75813-156 | Wide (28.5 mm) |
| Rubbermaid tubs | Rubbermaid | 3769017 (from Lowes) | Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H |
| Sucrose ultra pure | MP Biomedicals, Inc. | 821721 | |
| Tube racks for wide-mouthed tubes | Thermo scientific | 5970-0230 | Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes |
| Water Purification System | Millipore Milli-Q | ZMQ560F01 | Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier |
| Yeast extract | Acros Organics | 451120050 | CAS number 84604-16-0 |
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