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Biochemistry

बल-संवेदनशील तत्वों पर नैनोमैकेनिकल माप के लिए उच्च गति चुंबकीय चिमटी

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65137
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 2,3, 1,4
1Department of Physics, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2School of Biological Sciences, Seoul National University, 3Institute for Molecular Biology and Genetics, Seoul National University, 4School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH)
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक उच्च गति चुंबकीय चिमटी सेटअप का वर्णन करते हैं जो 1.2 kHz की अधिकतम दर पर बल-संवेदनशील बायोमोलेक्यूल्स पर नैनोमैकेनिकल माप करता है। हम मॉडल सिस्टम के रूप में डीएनए हेयरपिन और एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स के लिए इसके आवेदन को पेश करते हैं, लेकिन यह मेकेनोबायोलॉजिकल घटनाओं में शामिल अन्य अणुओं पर भी लागू होगा।

Abstract

एकल-अणु चुंबकीय चिमटी (एमटी) ने न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन जैसे बायोमोलेक्यूल्स से बलपूर्वक पूछताछ करने के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में कार्य किया है, और इसलिए मेकेनोबायोलॉजी के क्षेत्र में उपयोगी होने के लिए तैयार हैं। चूंकि विधि आमतौर पर चुंबकीय मोतियों की छवि-आधारित ट्रैकिंग पर निर्भर करती है, छवियों को रिकॉर्ड करने और विश्लेषण करने में गति सीमा, साथ ही मोतियों के थर्मल उतार-चढ़ाव, ने लक्ष्य अणुओं में छोटे और तेज संरचनात्मक परिवर्तनों को देखने में इसके आवेदन को लंबे समय तक बाधित किया है। यह लेख एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन एमटी सेटअप के निर्माण और संचालन के लिए विस्तृत तरीकों का वर्णन करता है जो नैनोस्केल, बायोमोलेक्यूल्स और उनके परिसरों की मिलीसेकंड गतिशीलता को हल कर सकता है। अनुप्रयोग उदाहरणों के रूप में, डीएनए हेयरपिन और एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स (झिल्ली-संलयन मशीनरी) के साथ प्रयोगों का प्रदर्शन किया जाता है, इस बात पर ध्यान केंद्रित किया जाता है कि पिकोनेवटन-स्केल बलों की उपस्थिति में उनकी क्षणिक अवस्थाओं और संक्रमणों का पता कैसे लगाया जा सकता है। हम उम्मीद करते हैं कि उच्च गति वाले एमटी अणुओं पर उच्च-सटीक नैनोमैकेनिकल माप को सक्षम करना जारी रखेंगे जो कोशिकाओं में बलों को समझते हैं, संचारित करते हैं और उत्पन्न करते हैं, और इस तरह मेकेनोबायोलॉजी की हमारी आणविक स्तर की समझ को गहरा करते हैं।

Introduction

कोशिकाएं सक्रिय रूप से यांत्रिक उत्तेजनाओं को समझती हैं और प्रतिक्रिया देती हैं। ऐसा करने में, कई बायोमोलेक्यूल्स बल-निर्भर गुण प्रदर्शित करते हैं जो गतिशील संरचनात्मक परिवर्तनों को सक्षम करते हैं। अच्छी तरह से सराहना किए गए उदाहरणों में मेकेनोसेंसिटिव आयन चैनल और साइटोस्केलेटल तत्व शामिल हैं जो कोशिकाओं को उनके आसपास के वातावरण से महत्वपूर्ण यांत्रिक जानकारी प्रदान करते हैं।

इसके अलावा, अणु जो एक अद्वितीय बल-असर प्रकृति दिखाते हैं, उन्हें व्यापक अर्थों में मेकेनोसेंसिटिव भी माना जा सकता है। उदाहरण के लिए, न्यूक्लिक एसिड डुप्लेक्स के स्थानीय गठन और पिघलने के साथ-साथ जी-चौगुनी जैसी उच्च-क्रम संरचनाएं, प्रतिकृति, प्रतिलेखन, पुनर्संयोजन और हाल ही में, जीनोम संपादन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। इसके अलावा, सिनैप्टिक संचार में शामिल कुछ न्यूरोनल प्रोटीन भौतिक बलों को उत्पन्न करके अपने कार्य करते हैं जो विशिष्ट इंटरमॉलिक्युलर इंटरैक्शन के स्तर से अधिक होते हैं। कोई फर्क नहीं पड़ता कि कौन सा उदाहरण अध्ययन करता है, उच्च स्थानिक परिशुद्धता के साथ शामिल बायोमोलेक्यूल्स के नैनोमैकेनिक्स की जांच करना संबंधित मेकेनोबायोलॉजिकल प्रक्रियाओं 1,2,3 के आणविक तंत्र को प्रकट करने में अत्यधिक उपयोगी साबित होगा।

एकल-अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी विधियों ने बायोमोलेक्यूल्स 2,4,5,6 के यांत्रिक गुणों की जांच करने के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में कार्य किया है। वे बल के आवेदन के साथ समवर्ती रूप से न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन में संरचनात्मक परिवर्तनों की निगरानी कर सकते हैं, जिससे बल-निर्भर गुणों की जांच हो सकती है। दो प्रसिद्ध सेटअप ऑप्टिकल ट्वीज़र्स और चुंबकीय चिमटी (एमटी) हैं, जो अणुओं 5,6,7,8 में हेरफेर करने के लिए माइक्रोन आकार के मोतियों का उपयोग करते हैं। इन प्लेटफार्मों में, पॉलीस्टाइनिन (ऑप्टिकल ट्वीज़र्स के लिए) या चुंबकीय मोती (एमटी के लिए) को आणविक "हैंडल" के माध्यम से अणुओं (जैसे, न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन) को लक्षित करने के लिए जोड़ा जाता है, जो आमतौर पर डबल-फंसे डीएनए (डीएसडीएनए) के छोटे टुकड़ों से बने होते हैं। मोतियों को तब बल लगाने के लिए ले जाया जाता है और उनके स्थानों को ट्रैक करने के लिए चित्रित किया जाता है जो लक्ष्य अणुओं में संरचनात्मक परिवर्तनों पर रिपोर्ट करते हैं। ऑप्टिकल और चुंबकीय चिमटी अपने अनुप्रयोगों में काफी हद तक विनिमेय हैं, लेकिन बल को नियंत्रित करने के लिए उनके दृष्टिकोण में महत्वपूर्ण अंतर मौजूद हैं। ऑप्टिकल ट्वीज़र्स आंतरिक रूप से स्थिति-क्लैंप उपकरण हैं जो स्थिति में मोतियों को फंसाते हैं, जिसके कारण लागू बल में उतार-चढ़ाव होता है जब एक लक्ष्य निर्माण आकार परिवर्तन से गुजरता है; विस्तार वृद्धि, जैसे कि प्रकट होने से, टीथर को ढीला करता है और तनाव को कम करता है, और इसके विपरीत। यद्यपि ऑप्टिकल ट्वीज़र्स में बल को नियंत्रित करने के लिए सक्रिय प्रतिक्रिया लागू की जा सकती है, इसके विपरीत एमटी स्वाभाविक रूप से एक बल-क्लैंप डिवाइस के रूप में काम करते हैं, स्थायी मैग्नेट द्वारा स्थिर, दूर-क्षेत्र चुंबकीय बलों का लाभ उठाते हैं, जो पर्यावरणीय गड़बड़ी का भी सामना कर सकते हैं।

अपने लंबे इतिहास और सरल डिजाइन के बावजूद, एमटी उच्च परिशुद्धता माप के लिए अपने अनुप्रयोगों में ऑप्टिकल ट्वीज़र्स से पिछड़ गए हैं, बड़े पैमाने पर फास्ट बीड ट्रैकिंग में तकनीकी चुनौतियों के कारण। हाल ही में, हालांकि, कई समूहों ने संयुक्त रूप से एमटी उपकरणों 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 के लिए हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर दोनों के बहुआयामी सुधार का नेतृत्व किया है।. इस काम में, हम 1.2 kHz पर चलने वाले ऐसे सेटअप का एक उदाहरण पेश करते हैं और वर्णन करते हैं कि बल-संवेदनशील बायोमोलेक्यूल्स पर नैनोमैकेनिकल माप करने के लिए इसका उपयोग कैसे किया जाए। मॉडल सिस्टम के रूप में, हम डीएनए हेयरपिन और न्यूरोनल एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स को नियोजित करते हैं और पिकोनेवटन शासन में उनके तेज, संरचनात्मक परिवर्तनों की जांच करते हैं। डीएनए हेयरपिन एक अच्छी तरह से परिभाषित बल सीमा20,21 में सरल दो-राज्य संक्रमण प्रदर्शित करते हैं, और इसलिए एक चिमटी सेटअप के प्रदर्शन को सत्यापित करने के लिए खिलौना मॉडल के रूप में काम करते हैं। चूंकि एसएनएआरई प्रोटीन एक बल-संवेदनशील परिसर में इकट्ठा होते हैं जो झिल्ली संलयन22 को चलाता है, इसलिए उन्हें एकल-अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी 14,23,24,25 द्वारा भी बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। डेटा का विश्लेषण करने और ऊष्मप्रवैगिकी और कैनेटीक्स पर उपयोगी जानकारी निकालने के लिए मानक दृष्टिकोण प्रस्तुत किए गए हैं। हमें उम्मीद है कि यह लेख मेकेनोबायोलॉजिकल अध्ययन में उच्च-परिशुद्धता एमटी को अपनाने की सुविधा प्रदान कर सकता है और पाठकों को रुचि की अपनी बल-संवेदनशील प्रणालियों का पता लगाने के लिए प्रेरित कर सकता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी सामग्री और उपकरण सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं। नीचे वर्णित उच्च गति एमटी सेटअप को संचालित करने के लिए लैबव्यू सॉफ्टवेयर, साथ ही नमूना डेटा का विश्लेषण करने के लिए MATLAB स्क्रिप्ट, GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) पर जमा किए जाते हैं और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध होते हैं।

1. उपकरण का निर्माण

नोट: उच्च गति एमटी निर्माण का सामान्य सिद्धांत मानक, पारंपरिक एमटी सिस्टम के समान है, एक उच्च गति पूरक धातु ऑक्साइड अर्धचालक (सीएमओएस) कैमरे और एक उच्च शक्ति, सुसंगत प्रकाश स्रोत (चित्रा 1) के उपयोग को छोड़कर। मानक एमटी उपकरणों 5,26,27 के अधिक विवरण के लिए अन्य स्रोतों को देखें।

  1. एक एंटी-कंपन ऑप्टिकल टेबल पर एक उल्टा माइक्रोस्कोप सेट करें। एक उच्च गति सीएमओएस कैमरा और एक फ्रेम पकड़ने वाला स्थापित करें।
  2. 3 डी में मैग्नेट में हेरफेर करने के लिए एक अनुवाद चरण बनाएं। मैन्युअल एक्सवाई चरण के शीर्ष पर एक मोटरचालित रैखिक चरण (>20 मिमी यात्रा) को लंबवत रूप से माउंट करें।
    नोट: ऊर्ध्वाधर आंदोलन बल को नियंत्रित करता है, जबकि एक्सवाई चरण सेटअप के प्रारंभिक निर्माण के लिए ऑप्टिकल अक्ष पर मैग्नेट के मैनुअल संरेखण के लिए है।
  3. घूर्णन मैग्नेट के लिए एक रोटरी स्टेपर मोटर और एक बेल्ट और पुली सिस्टम स्थापित करें।
    नोट: बेल्ट मोटर शाफ्ट और मैग्नेट के बीच रोटरी गति को प्रसारित करता है जो कुछ सेंटीमीटर अलग हैं। मैग्नेट का घूर्णन ट्रांसलेशनल हेरफेर के लिए आंतरिक है।
  4. चुम्बकों को माउंट करें। एक ऐक्रेलिक धारक का उपयोग करें (एक विनिर्माण कंपनी से आदेशित; पूरक चित्रा एस 1 देखें) जो मैग्नेट के बीच एक अच्छी तरह से परिभाषित 1 मिमी अंतर के साथ समानांतर में दो समान मैग्नेट को कसकर रख सकता है (चित्रा 1 बी)। चुम्बकों की दी गई जोड़ी के साथ प्राप्त अधिकतम बल का उपयोग करने के लिए, अनुवाद चरण की ऊर्ध्वाधर स्थिति को समायोजित करें ताकि मैग्नेट की निचली सतह नमूना विमान के साथ संरेखित हो जब इसे निम्नतम स्थिति में ले जाया जाए।
    नोट: मैग्नेट28 के धारक डिजाइन और विन्यास के बारे में अधिक जानकारी के लिए लिपफर्ट एट अल देखें। मैग्नेट की ऊंचाई और अभिविन्यास को डेटा अधिग्रहण के साथ लैबव्यू सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित किया जाता है।
  5. कम-आवर्धन उद्देश्य लेंस के साथ देखना, मैग्नेट को दृश्य के क्षेत्र के केंद्र में संरेखित करें। जांचें कि मैग्नेट को घुमाने से चुंबक जोड़ी के केंद्र का बड़ा विस्थापन नहीं होता है।
    नोट: यदि मैग्नेट के बीच का मध्य बिंदु घूर्णन की धुरी के बारे में घूमता है, तो यह संभावना है कि मैग्नेट एक अपूर्ण धारक के कारण ऑफ-केंद्रित हैं। अंतराल आकार के सापेक्ष गलत संरेखण का एक छोटा स्तर सहनीय है, क्योंकि चुंबक रोटेशन केवल टेथर की जांच करने और विशिष्ट अनुप्रयोगों में टोक़ लागू करने के लिए है।
  6. मोतियों की रोशनी के लिए एक सुपरल्यूमिनेसेंट डायोड (एसएलडी) स्थापित करें। बीम को दो मैग्नेट के बीच 1 मिमी के अंतर से पारित करें। सुनिश्चित करें कि बीम को अंतराल में फिट करने के लिए ठीक से संयोजित किया गया है और रोशनी मैग्नेट द्वारा छाया नहीं है।
  7. नोजपीस पर एक पीजो लेंस स्कैनर स्थापित करें और मोती ट्रैकिंग के लिए 100x तेल-विसर्जन उद्देश्य लेंस (संख्यात्मक एपर्चर [एनए]: 1.45) माउंट करें। ट्रैकिंग परिणामों में संभावित कलाकृतियों से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि मैग्नेट को स्थानांतरित करते समय रोशनी समान रूप से बनाए रखी जाती है। अंत में, पिक्सेल को संतृप्त किए बिना प्रकाश स्तर को अधिकतम चमक में समायोजित करें।
    नोट: मोतियों की उच्च गति ट्रैकिंग के लिए विभिन्न प्रकाश स्रोतों की तुलना के लिए, डुलिन एट अल .29 देखें।

2. चुंबकीय बल का अंशांकन

  1. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर; तालिका 1 देखें) का उपयोग करके, 5 केबीपी डीएसडीएनए टुकड़े (प्राइमर बी, प्राइमर Z_5k, और 3-डीएनए का उपयोग करके) तैयार करें जिन्हें एक छोर पर बायोटिन (सतह अनुलग्नक के लिए) और दूसरे छोर पर एज़ाइड (मोती लगाव के लिए) के साथ लेबल किया जाता है।
  2. खंड 6 के बाद, 5 केबीपी अणुओं के साथ एक प्रवाह सेल तैयार करें।
  3. खंड 7 के बाद, इसके विस्तार और रोटेशन को सत्यापित करके एक अच्छे मोती-टीथर निर्माण की पहचान करें। विशेष रूप से, ऑफ-केंद्रित लगाव 30,31 के कारण मोती की ऊंचाई ऑफसेट को कम करने के लिए न्यूनतम घूर्णी प्रक्षेपवक्र (यानी, त्रिज्या <200 एनएम के साथ) के साथ एक मोती चुनना सुनिश्चित करें। एक बार एक अच्छे टीथर की पहचान हो जाने के बाद, धारा 9 का उल्लेख करते हुए बीड ट्रैकिंग शुरू करें।
  4. यदि सेटअप नया है, तो विश्वसनीय उच्च-रिज़ॉल्यूशन माप के लिए इसके शोर और स्थिरता को चिह्नित करें। चुंबक ~ 3 मिमी को प्रवाह सेल की सतह से रखें (>10 pN लागू करने और एक मोती की ब्राउनियन गति को दबाने के लिए), 1.2 kHz पर मोती की z-स्थिति को ट्रैक करें, और z-समन्वय समय श्रृंखला32,33 (चित्रा 2C) से एलन विचलन (AD) की गणना करें। जांचें कि कुछ नैनोमीटर के एडी मान उच्च गति शासन (<0.1 एस) में प्राप्त किए जा सकते हैं, और यह कि अंतर ट्रैकिंग (संदर्भ मोती के सापेक्ष चुंबकीय मोती की स्थिति) लंबे समय में एडी को कम करती है।
    नोट: हम आम तौर पर अधिकतम दर (1.2 kHz या 0.83 ms रिज़ॉल्यूशन) पर <3 nm का AD प्राप्त करते हैं, और AD कम से कम 10 s तक घटता रहता है, जिसका अर्थ है न्यूनतम बहाव। अन्य ने समान सेटअप 9,10,11,12,34 पर समान मूल्यों की सूचना दी है।
  5. आराम करने की स्थिति (F ~ 0 pN) में मैग्नेट के साथ, 1.2 kHz पर टेथर्ड मोती के x- और y-निर्देशांक रिकॉर्ड करें। पर्याप्त रूप से लंबी अवधि के लिए स्थिति रिकॉर्ड करें (यानी, उतार-चढ़ाव35 के विशिष्ट विश्राम समय से पर्याप्त रूप से लंबा) ताकि ब्राउनियन गति का पर्याप्त रूप से नमूना लिया जा सके।
    नोट: यहां, एक्स-दिशा चुंबकीय क्षेत्र की दिशा के साथ है, जबकि वाई में आंदोलन क्षेत्र के लंबवत अनुप्रस्थ गति का प्रतिनिधित्व करता है।
  6. मैग्नेट को प्रवाह सेल के करीब ले जाएं और मोती-स्थिति माप को दोहराएं जब तक कि मैग्नेट धीरे से प्रवाह सेल के शीर्ष को न छुएं। बड़े चरणों (जैसे, 1-2 मिमी) में आगे बढ़ें जब मैग्नेट नमूना विमान से 7 मिमी से अधिक दूर होते हैं (चूंकि मैग्नेट के दूर के क्षेत्र में लागू बल धीरे-धीरे बढ़ता है), लेकिन चरण आकार को धीरे-धीरे कम करें (उदाहरण के लिए, 0.1-0.5 मिमी) क्योंकि वे उच्च बल स्तरों पर महीन अंशांकन के करीब आते हैं (चित्रा 2 बी)।
  7. प्रत्येक चुंबक स्थिति पर बल की गणना करें, डी, दो वैकल्पिक तरीकों में से किसी एक का उपयोग करके (दोनों विधियों सहित एक MATLAB स्क्रिप्ट "बल अंशांकन.m" प्रदान की जाती है; पूरक फ़ाइल 1 देखें)।
    1. मोती के वाई-निर्देशांक, (चित्रा 2 डी) और सबसे कम स्थिति के सापेक्ष मोती की औसत जेड-स्थितिEquation 2 के विचरण को मापें (चित्रा 2 बी,Equation 1 नीचे)। फिर, बल का अनुमान लगाने के लिए समीकरण (1)7,27,36 का उपयोग करें (एक निश्चित मोती त्रिज्या R = 1,400 nm और थर्मल ऊर्जा k RT = 4.11 pN:nm के साथ):
      Equation 3(1)
    2. वैकल्पिक रूप से, वाई-निर्देशांक, एसवाई (चित्रा 2 ई) के पावर स्पेक्ट्रल घनत्व (पीएसडी) की गणना करें। समीकरण (2) का उपयोग करके मापा एसवाई में डबल-लोरेंत्ज़ियन मॉडल37 फिट करके लागू बल एफ निर्धारित करें।
      Equation 4(2)
      यहाँ, R मोती त्रिज्या है, γyऔर γ φ क्रमशः ट्रांसलेशनल और घूर्णी ड्रैग गुणांक हैं (स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण से अनुमानित), kRT थर्मल ऊर्जा है, Equation 5f + और f- समीकरण (3) का उपयोग करके प्राप्त दो विशिष्ट आवृत्तियों हैं।
      Equation 6 (3)
      नोट: चूंकि टीथर एक्सटेंशन एल बल का एक कार्य है जो अच्छी तरह से स्थापित कीड़े जैसी श्रृंखला (डब्ल्यूएलसी) मॉडल का अनुसरण करता है, उपरोक्त अभिव्यक्तियां एफ को एकमात्र फिटिंग पैरामीटर के रूप में छोड़ती हैं (हम सादगी के लिए आर को 1,400 एनएम तय करते हैं क्योंकि यह सभी बल स्तरों पर साझा किया जाता है और सटीक मूल्य परिणामों को काफी प्रभावित नहीं करता है)। जब आवश्यक हो, कैमरा-आधारित छवि अधिग्रहण से मोशन ब्लर और उपनाम को38,39 माना जाना चाहिए, लेकिन यह प्रभाव 5 केबीपी टेथर के साथ 1 kHz से ऊपर हमारे उच्च गति माप में नगण्य है।
  8. कुछ और संरचनाओं के लिए चरण 2.4-2.7 दोहराएँ। चुंबकीय मोतियों के बीच बल परिवर्तनशीलता को औसत करने के लिए तीन से पांच अलग-अलग मोतियों की जांच करें।
    नोट: औसत के लिए संरचनाओं की उचित संख्या निर्धारित करने के लिए उपयोग में चुंबकीय मोतियों के बीच बल भिन्नता पर विचार किया जाना चाहिए। यह परिवर्तनशीलता छोटी है, लेकिनवाणिज्यिक उत्पादों के लिए भी मापा बल में 1 pN से अधिक त्रुटि हो सकती है। अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए, जहां शामिल बलों का पूर्ण निर्धारण महत्वपूर्ण नहीं है, तीन से पांच मोतियों के अंशांकन परिणामों का औसत आम तौर पर पर्याप्त है। इस भिन्नता के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रयोग की शुरुआत में अलग-अलग टेथर के साथ बल को मापना है, जो समय लेने वाला हो सकता है। एक अन्य विकल्प हेयरपिन संरचनाओं को एम्बेड करना है जो प्रत्येक निर्माण31 में ज्ञात बल स्तरों पर अनज़िप करते हैं।
  9. मापा बल को चुंबक दूरी के एक फ़ंक्शन के रूप में प्लॉट करें और समीकरण (4) का उपयोग करके डेटा (चित्रा 2 एफ) में एक डबल घातीय फ़ंक्शन फिट करें।
    Equation 7(4)
    यहां, एफ0 (बेसलाइन), ए 1 और ए 2 (आयाम), और डी 1 और डी2 (क्षय स्थिरांक) उपयुक्त पैरामीटर हैं। सुनिश्चित करें कि दो विधियों से बल मान, साथ ही परिणामस्वरूप डबल-घातीय फिट, काफी हद तक सहमत हैं (चित्रा 2 एफ, जी)।
    नोट: यह पुष्टि करने के लिए कि बल अंशांकन ठीक से आयोजित किया जाता है, विस्तार बनाम मापा बल की योजना बनाकर जांच किए गए निर्माणों के बल-विस्तार संबंध को सत्यापित करें।
  10. चुंबकीय मोतियों के बल-निर्भर झुकावके परिणामस्वरूप मोती की ऊंचाई को सही करने के लिए, समीकरण (5) का उपयोग करके एक मोती त्रिज्या के साथ एक ऑफ-केंद्रित टीथर की ज्यामिति पर विचार करते हुए, पार्श्व ऑफसेट एक्सऑफ से जेडका अनुमान लगाएं, और मापित विस्तार मूल्यों पर मूल्योंको लागू करें। यह चरण MATLAB स्क्रिप्ट "बल अंशांकन.m" (लाइनों 252-254) में लागू किया गया है।
    Equation 8(5)
    नोट: यद्यपि यह सुधार विस्तार में छोटे बदलाव करता है, विशेष रूप से रोटेशन (<200 एनएम) की एक छोटी त्रिज्या वाले मोतियों के लिए, यह ऑफसेट अक्सर लोचदार प्रतिक्रिया को गंभीर रूप से प्रभावित करता है, जैसा कि चित्रा 2 एच से चित्रा 2 आई 30,31 में परिवर्तन में देखा गया है।
  11. समीकरण (6) का उपयोग करके डेटा में एक्सटेंसिबल डब्ल्यूएलसी मॉडल फिट करके दृढ़ता लंबाई एलपी की जांच करें।
    Equation 9(6)
    यहां, एल 0 समोच्च लंबाई (5 केबीपी के लिए 1.7 μm) है और K0 एंथेल्पिक स्ट्रेचिंग के लिए मापांक है।
    नोट: यद्यपि डीएसडीएनए के एल पी को फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) जैसे विशिष्ट बफर में 40-50 एनएम के रूप में अच्छी तरह से स्वीकार किया जाता है, छोटे अणुओं (<5 केबीपी) पर लागू डब्ल्यूएलसी सूत्र व्यवस्थित रूप से एल पी को कम आंकता है क्योंकि एल0 31,40 कम हो जाता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि शास्त्रीय डब्ल्यूएलसी मॉडल एक बहुलक का अनुमान लगाता है जिसकी श्रृंखला की लंबाई इसकी दृढ़ता लंबाई से पर्याप्त रूप से लंबी है। यहां, हमने 5 केबीपी निर्माण (चित्रा 2 एच) के लिए एलपी = 40 ± 3 एनएम प्राप्त किया, और विस्तार सुधार ने आगे 1,100 ± 200 पीएन (चित्रा 2 आई) का एक सजातीय के0 प्राप्त किया। एक परिमित डब्ल्यूएलसी मॉडल 31,40 को लागू करने के साथ-साथ विस्तार वितरण 41 में गैर-गॉसियनिटी के लिए सुधार, एलपी में थोड़ी वृद्धि होगी।
  12. एक बार बल अंशांकन सत्यापित हो जाने के बाद, प्रदान किए गए लैबव्यू सॉफ़्टवेयर (पूरक फ़ाइल 2) पर डबल-घातीय मॉडल के प्राप्त फिटिंग पैरामीटर लागू करें और मोटर रीडिंग (यानी, चुंबक स्थिति) से वास्तविक समय में वर्तमान बल की गणना करने के लिए सॉफ़्टवेयर की प्रतीक्षा करें। चूंकि व्युत्क्रम फ़ंक्शन डी (एफ) के लिए एक विश्लेषणात्मक अभिव्यक्ति उपलब्ध नहीं है, इसलिए डी लक्ष्य बल स्तरों के संख्यात्मक अनुमान द्वारा 0.1 पीएन चरणों में डी बनाम एफ की एक लुकअप तालिका तैयार करें। बल नियंत्रण को कमांड करने के लिए इस तालिका को सॉफ्टवेयर में भी स्टोर करें।

3. डीएनए हेयरपिन का संश्लेषण

नोट: एमटी प्रयोगों के लिए डीएनए हेयरपिन निर्माण दो कस्टम प्राइमरों के साथ डीएनए में 510 बीपी क्षेत्र के पीसीआर प्रवर्धन द्वारा तैयार किए जाते हैं, जिनमें से एक में इसके 5'-अंत पर हेयरपिन संरचना होती है (चित्रा 3 ए)। इस तरह, पीसीआर उत्पाद के एक छोर पर एक हेयरपिन मोटिफ रखा जाता है।

  1. प्राइमर तैयार करें।
    1. फॉरवर्ड प्राइमर: प्राइमर B_hp जो ग्लास सतह अनुलग्नक के लिए 5'-बायोटिन-लेबल है और -डीएनए को बांधता है। इस प्राइमर में 8 बीपी स्टेम और 6 एनटी लूप के साथ एक हेयरपिन मोटिफ होता है, जो 5 ' बाइंडिंग क्षेत्र में होता है।
    2. रिवर्स प्राइमर: प्राइमर Z_hp जो चुंबकीय मोती लगाव के लिए 5'-एज़ाइड-लेबल है और आगे के प्राइमर से 1 केबीपी दूर 3-डीएनए को बांधता है।
  2. पीसीआर को -डीएनए (टेम्प्लेट), एनटीएक्यू पोलीमरेज़ और मानक पीसीआर स्थितियों के साथ सेट अप करें और चलाएं ( तालिका 1 देखें)। एक वाणिज्यिक शुद्धिकरण किट के साथ उत्पाद को साफ करें।
  3. 260 एनएम (ए 260) पर यूवी अवशोषण द्वारा डीएनए एकाग्रता को मापें और उत्पाद के आकार को सत्यापित करने के लिए एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन (2% जेल) ( तालिका 2 देखें) करें। एक विशिष्ट उपज ~ 600 एनएम समाधान का ~ 35 μL है।

4. एसएनएआरई प्रोटीन की तैयारी

नोट: न्यूरोनल एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स ई कोलाई से व्यक्त तीन शुद्ध चूहे प्रोटीन के संयोजन से इकट्ठे होते हैं: वीएएमपी 2 / सिनैप्टोब्रेविन -2, सिंटैक्सिन -1 ए, और एसएनएपी -25 (चित्रा 3 बी)। उनके संयोजन को सुविधाजनक बनाने के लिए, सिंटैक्सिन और एसएनएपी -25 को एक वीएएमपी 2 टुकड़े (एन-टर्मिनल क्षेत्र की कमी; जिसे "एन-वीएएमपी 2" कहा जाता है) के साथ "त्रिभुज-कॉम्प्लेक्स" नामक संरचना में सह-व्यक्त किया जाता है, और फिर पूर्ण परिसर बनाने के लिए डीएनए हैंडल अटैचमेंट के बाद पूर्ण लंबाई वाले वीएएमपी 2 के साथ मिलाया जाता है।

  1. एसएनएआरई प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए सीडीएनए युक्त प्लास्मिड तैयार करें (सभी प्लास्मिड के लिए डीएनए अनुक्रम सामग्री की तालिका में दिए गए हैं)।
    1. ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन की कमी वाले 6×हिस-टैग किए गए वीएएमपी 2 तैयार करें (2-97; डाइसल्फ़ाइड लिंकेज के लिए L32C/I97C) को pET28a वेक्टर में क्लोन किया गया।
    2. एचएबीसी और ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन (डाइसल्फ़ाइड लिंकेज के लिए 191-267, आई202सी/आई266सी प्रतिस्थापन) की कमी वाले सिंटैक्सिन -1 ए को 6×हिस-टैग किए गए त्रिभुज-वीएएमपी 2 (49-96) के साथ मिलकर पीईटीड्यूएट -1 वेक्टर में क्लोन किया गया है।
    3. पूर्ण लंबाई एसएनएपी -25 आइसोफॉर्म बी (2-206, सभी सी से ए) को पीईटी 28 ए वेक्टर में क्लोन तैयार करें। इसका उपयोग त्रिभुज परिसरों को तैयार करने के लिए किया जाएगा।
    4. 6×हिस-टैग की गई पूर्ण-लंबाई एसएनएपी -25 आइसोफॉर्म बी (1-206, सभी सी से ए) को पीईटी 28 ए वेक्टर में क्लोन किया गया है ताकि एमटी परख बफर के सीधे जोड़ के बाद एसएनएआरई परिसरों को फिर से इकट्ठा किया जा सके।
  2. रोसेटा (डीई 3) ई कोलाई कोशिकाओं के दो ट्यूब तैयार करें। एक समूह को वैम्प 2 प्लास्मिड (चरण 4.1.1 से) के साथ बदलें, एक सिंटैक्सिन -1 ए / त्रिभुज-वीएएमपी 2 और अनटैग किए गए एसएनएपी -25 प्लास्मिड (चरण 4.1.2 और 4.1.3 से) के साथ एक को एन-कॉम्प्लेक्स व्यक्त करने के लिए, और दूसरे को हिस-टैग किए गए एसएनएपी -25 प्लास्मिड (चरण 4.1.4 से) के साथ।
  3. रूपांतरित कोशिकाओं को उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ लुरिया-बर्टानी शोरबा (एलबी) में स्थानांतरित करें (यहां, वीएएमपी 2 के लिए कनामाइसिन और क्लोरैम्फेनिकॉल और हिस-टैग एसएनएपी -25; कैनमाइसिन, क्लोरैम्फेनिकॉल, और एम्पीसिलिन के लिए एम्पसीलिन)। उन्हें हिलाने वाले इनक्यूबेटर (220 आरपीएम) में 37 डिग्री सेल्सियस पर तब तक बढ़ाएं जब तक कि शोरबा का ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) 0.7-0.9 तक न पहुंच जाए।
  4. प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए 1 एमएम आइसोप्रोपिल β-डी-1-थियोगैलेक्टोपायरानोसाइड (आईपीटीजी) जोड़ें और एक हिलने वाले इनक्यूबेटर (220 आरपीएम) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 4,500 × ग्राम पर कल्चर को सेंट्रीफ्यूज करके कोशिकाओं को नीचे गिराएं।
  6. प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए बफर तैयार करें ( तालिका 2 देखें)।
  7. 40 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे लाइसिस बफर में एसएनएआरई-व्यक्त सेल छर्रों को निलंबित करें और बर्फ पर सोनिकेशन द्वारा कोशिकाओं को लाइज़ करें (15% आयाम, 5 एस ऑन और 5 एस ऑफ, कुल 30 मिनट)।
  8. अघुलनशील सामग्री को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 15,000 × ग्राम पर लाइसेट को सेंट्रीफ्यूज करें।
  9. सतह पर तैरनेवाला को 1 मिलीलीटर नी-एनटीए राल से भरे गुरुत्वाकर्षण स्तंभ के माध्यम से पारित करें। राल को वॉश बफर ए के साथ धोएं, फिर वॉश बफर बी के साथ, और प्रोटीन को 10 एमएल क्षालन बफर के साथ मिलाएं।
  10. डीसाल्टिंग कॉलम का उपयोग करके एलुएंट से ट्रिस (2-कार्बोक्साथाइल) फॉस्फीन (टीसीईपी) और इमिडाज़ोल को हटा दें (निर्माता के निर्देशों का पालन करें)। पीबीएस के साथ नमूना तैयार करें।
  11. पीबीएस में प्रोटीन को बनाए रखते हुए केन्द्रापसारक फिल्टर (10 केडीए कटऑफ) के साथ प्रोटीन को ~ 70 μM तक केंद्रित करें (आमतौर पर 2 एमएल उपज)। प्रोटीन एकाग्रता को या तो पराबैंगनी (यूवी) अवशोषण द्वारा 280 एनएम (ए 280) या ब्रैडफोर्ड परख द्वारा मापें।
  12. छोटे एलिकोट तैयार करें, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रीज करें, और उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: डीएनए हैंडल (नीचे देखें) पर एन-कॉम्प्लेक्स को संयुग्मित करने के बाद पूर्ण एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स को इकट्ठा किया जाएगा।

5. डीएनए हैंडल का अनुलग्नक

नोट: एक छोर पर प्राथमिक अमाइन समूहों वाले दो 510 बीपी डीएसडीएनए हैंडल पहले पीसीआर द्वारा तैयार किए जाते हैं, और अमाइन समूहों को फिर एक द्विक्रियाशील क्रॉसलिंकर, एसएम (पीईजी) 2 का उपयोग करके मैलिमाइड समूहों में परिवर्तित किया जाता है। दो हैंडल तब साइट-विशिष्ट संयुग्मन (चित्रा 3 बी) के लिए अपने सिस्टीन समूहों के माध्यम से एसएनएआरई परिसरों से सहसंयोजक रूप से जुड़े होते हैं।

  1. प्राइमर तैयार करें।
    1. आगे प्राइमर तैयार करें: प्राइमर बी (हैंडल बी को बढ़ाने के लिए) जो ग्लास सतह अनुलग्नक के लिए 5'-बायोटिन-लेबल है और -डीएनए को बांधता है; प्राइमर जेड (हैंडल जेड को बढ़ाने के लिए) जो चुंबकीय मोती अनुलग्नक के लिए 5'-एज़ाइड-लेबल है और इसमें प्राइमर बी के समान अनुक्रम है।
    2. एक रिवर्स प्राइमर तैयार करें: प्राइमर एन (हैंडल बी और हैंडल जेड के लिए साझा) जो प्रोटीन संयुग्मन के लिए 5'-अमाइन-लेबल है और फॉरवर्ड प्राइमर से दूर 510 बीपी को बांधता है।
  2. पीसीआर प्रतिक्रियाओं के दो सेट सेट करें और चलाएं (प्रत्येक हैंडल के लिए 200 μL प्रतिक्रिया के 18 ट्यूब) के साथ --डीएनए (टेम्पलेट), nTaq पोलीमरेज़, और मानक पीसीआर स्थितियों ( तालिका 1 देखें)। उत्पाद को पीसीआर क्लीन-अप किट के साथ साफ करें और प्रत्येक हैंडल को 45 μL अल्ट्राप्योर पानी से धोएं। बाद के चरणों में एक प्रभावी प्रतिक्रिया के लिए हैंडल की उच्च सांद्रता प्राप्त करने के लिए पानी की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करें।
  3. A260 द्वारा डीएनए एकाग्रता को मापें। विशिष्ट उपज प्रत्येक हैंडल के लिए ~ 2 μM समाधान का ~ 650 μL है। अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन में बाद में सत्यापन के लिए छोटे नमूने अलग रखें।
  4. 5 mM SM (PEG)2 के साथ प्रत्येक हैंडल (PBS में 1 μM) पर प्रतिक्रिया करें। कोमल रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। 1 घंटे के बाद, अप्रयुक्त एसएम (पीईजी) 2 को हटाने के लिए डीएनए शोधन किट का उपयोग करें। ~ 2 μM समाधान प्राप्त करने के लिए पीबीएस के 250 μL के साथ प्रत्येक हैंडल को मिलाएं।
  5. पीबीएस में हैंडल बी और त्रिभुज-कॉम्प्लेक्स के घोल ों को 1:16 (जैसे, 1 μM हैंडल B और 16 μM ΜN-कॉम्प्लेक्स) के दाढ़ अनुपात में मिलाएं और आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए एक छोटा सा नमूना अलग रखें।
  6. पिछले चरण में उपयोग किए गए त्रिभुज-कॉम्प्लेक्स पर 2.5 गुना मोलर अधिकता में वीएएमपी 2 का घोल जोड़ें। मिश्रण को आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर एक और 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इस चरण में पूर्ण एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स इकट्ठे किए जाते हैं।
  7. ताजा पीबीएस और एक केन्द्रापसारक फिल्टर (100 केडीए कटऑफ) के साथ बफर एक्सचेंज द्वारा मुक्त प्रोटीन निकालें: 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 14,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, कम से कम 6x दोहराएं, और अंतिम स्पिन के लिए 15 मिनट तक चलाएं। मुक्त प्रोटीन को हटाने की निगरानी के लिए A260/A280 अनुपात में वृद्धि को मापें। Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए एक छोटा सा नमूना अलग रखें।
  8. हैंडल Z को हैंडल B पर 15 गुना मोलर अधिकता में घोल में जोड़ें। प्रतिक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए हैंडल Z की एकाग्रता कम से कम 1 μM से ऊपर रखें। मिश्रण को आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  9. एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 3 बी, इनसेट) द्वारा मध्यवर्ती (हैंडल बी और उसके प्रोटीन संयुग्म) और अंतिम उत्पाद (दो हैंडल के साथ एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स) को सत्यापित करें ( तालिका 2 देखें)।
    नोट: यदि प्रोटीन सफलतापूर्वक हैंडल बी से जुड़े होते हैं, तो एक गतिशीलता बदलाव का पता लगाया जाएगा। विशेष रूप से, डीएनए हैंडल पर पूर्ण एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स के गठन की पुष्टि सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) के प्रतिरोध से की जा सकती है, जो कि एन-कॉम्प्लेक्स के विपरीत है, जो एसडीएस में अलग हो जाते हैं और केवल सिंटैक्सिन को डीएनए से बंधे छोड़ देते हैं ( चित्रा 3 बी में बी और सी की तुलना करें)।
  10. छोटे एलिकोट तैयार करें, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रीज करें, और उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: हालांकि अंतिम समाधान में अप्रयुक्त हैंडल होते हैं, केवल वांछित निर्माण जो बायोटिन और एज़ाइड के साथ दोगुना लेबल किया जाता है, को फ्लो सेल में नमूना असेंबली के दौरान चुना जाएगा।

6. प्रवाह कोशिकाओं का निर्माण

नोट: एमटी माप के लिए फ्लो सेल का निर्माण डबल-साइडेड टेप (चित्रा 3 सी) द्वारा एक साथ बंधे दो ग्लास कवरलिप्स से किया जाता है। एक कवरस्लिप को पीईजी और बायोटिनीलेटेड पॉलीथीन ग्लाइकॉल (पीईजी) के मिश्रण के साथ लेपित किया जाता है ताकि गैर-विशिष्ट बंधन से बचा जा सके और बायोटिन-न्यूट्राविडिन लिंकेज (चित्रा 3 डी) के माध्यम से लक्ष्य अणुओं के विशिष्ट टेदरिंग को सक्षम किया जा सके। फिर, एमटी प्रयोगों के लिए सामग्री के समाधान को क्रमिक रूप से एक सिरिंज पंप (चित्रा 3 सी, डी) का उपयोग करके प्रवाह सेल में डाला जाता है।

  1. दो ग्लास कवरलिप्स तैयार करें, शीर्ष (24 मिमी × 50 मिमी, नंबर 1.5 मोटाई) और नीचे (24 मिमी × 60 मिमी, नंबर 1.5 मोटाई) सतह के लिए एक-एक। 30 मिनट के लिए 1 एम कोएच में सोनिकेशन द्वारा कवरलिप्स को साफ करें। सोनिकेशन के बाद, आसुत पानी के साथ कवरलिप्स को कुल्ला करें और अगले चरण तक पानी में रखें।
  2. प्रकाशित प्रोटोकॉल42,43 का पालन करते हुए नीचे कवरस्लिप को पीईजीलेट करें। 100 एमएम बाइकार्बोनेट बफर में बायोटिन-पीईजी-एसवीए और एमपीईजी-एसवीए के 1:100 (डब्ल्यूडब्ल्यू) मिश्रण और सिलेनाइजेशन के लिए एन-[3-(ट्राइमेथॉक्सीसिलिल) प्रोपिल] एथिलीनडायमाइन का उपयोग करें। पीईजीलेटेड कवरलिप्स को -20 डिग्री सेल्सियस पर सूखा रखें और उन्हें कुछ हफ्तों के लिए स्टोर करें।
  3. प्रयोगों के दिन, PEGylated कवरलिप्स को बाहर निकालें और उन्हें नाइट्रोजन गन के साथ सुखाएं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे साफ हैं, गंदगी के लिए नेत्रहीन निरीक्षण करें।
  4. नमूना चैनल बनाने के लिए, डबल-साइडेड टेप की ~ 2 मिमी चौड़ी स्ट्रिप्स तैयार करें और एक निचले कवरस्लिप (पीईजीलेटेड सतह ऊपर) पर चार स्ट्रिप्स बिछाएं, जो ~ 5 मिमी (चित्रा 3 सी) द्वारा एक दूसरे के समानांतर और अलग हों।
    नोट: इस तरह, एक प्रवाह सेल में तीन 5 मिमी चौड़े नमूना चैनल बनाए जा सकते हैं।
  5. चैनल इनलेट्स और आउटलेट के लिए छोटे किनारों पर ~ 5 मिमी जगह छोड़ते हुए, निचले कवरस्लिप के केंद्र में एक शीर्ष कवरस्लिप रखें। चैनलों को मजबूती से सील करने के लिए चिमटी के साथ शीर्ष कवरस्लिप के पिछले हिस्से को धीरे से दबाएं।
  6. एक इनलेट जलाशय बनाने के लिए, 200 μL पिपेट टिप के किनारे को ट्रिम करें। ~ 200 μL घोल को पकड़ने की अनुमति देने के लिए व्यापक उद्घाटन से ~ 10 मिमी काट लें। तीन प्रवाह चैनलों के लिए उनमें से तीन बनाएं। आउटलेट को कॉन्फ़िगर करने के लिए, तीन सिरिंज सुइयां तैयार करें जो सिरिंज पंप के लिए टयूबिंग को फिट करती हैं।
  7. 5 मिनट एपॉक्सी का उपयोग करके, जलाशयों और सुई हब को प्रवाह सेल में गोंद दें। सुनिश्चित करें कि रिसाव से बचने के लिए एक पूर्ण सील बनाई गई है, और यह कि चैनल अतिरिक्त गोंद से अवरुद्ध नहीं हैं। इसे कम से कम 30 मिनट तक सूखने दें।

7. मोती-टीथर संरचनाओं का संयोजन

नोट: एमटी प्रयोगों के लिए सामग्री के समाधान, जिनमें बीड-टेथर निर्माण भी शामिल हैं, को क्रमिक रूप से सिरिंज पंप (चित्रा 3 सी, डी) का उपयोग करके प्रवाह कोशिकाओं में पेश किया जाता है।

  1. चुंबकीय मोती तैयार करें। स्टॉक समाधान से 5 मिलीग्राम एम 270-एपॉक्सी मोती लें (~ 3.3 × 108 मोती 167.5 μL डाइमिथाइलफॉर्मामाइड में) और मोतियों के चुंबकीय पृथक्करण द्वारा विलायक को फॉस्फेट बफर ( तालिका 2 देखें) के साथ बदलें।
  2. 1 एम अमोनियम सल्फेट के साथ फॉस्फेट बफर में ~ 1.1 × 109 मोती एमएल -1 पर मोती तैयार करें और उन्हें 2 एमएम डिबेंजोसाइक्लोक्टिन (डीबीसीओ) - एनएच2 के साथ प्रतिक्रिया करें। कमरे के तापमान पर एक घूर्णन मिक्सर पर मिश्रण को 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। प्रतिक्रिया के बाद, अपरिवर्तित अणुओं को हटाने के लिए ताजा फॉस्फेट बफर के साथ मोती 3 x धो लें।
    नोट: धुले हुए मोतियों को उपयोग से पहले कई हफ्तों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त रोटेशन के बिना संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. पॉलीथीन टयूबिंग के साथ सिरिंज पंप से प्रवाह-सेल चैनल निकास पर एक सुई कनेक्ट करें। पीबीएस के साथ चैनलों को समतुल्य करें।
  4. पंप के साथ सक्शन करके चैनल में क्रमिक रूप से निम्नलिखित समाधान पेश करें: न्यूट्राविडिन, लक्ष्य निर्माण (डीएनए हेयरपिन या डीएनए हैंडल के साथ एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स), संदर्भ पॉलीस्टाइनिन मोती, और डीबीसीओ-लेपित चुंबकीय मोती। उपयोग करने से पहले, संभावित मोती समुच्चय को फैलाने के लिए मोती के घोल को अच्छी तरह से भंवर करें।
  5. 0.1 pN बल लगाते समय अनबाउंड मोतियों को धो लें।
    नोट: एक छोटे से ऊपर की ओर बल का आवेदन अनबाउंड मोतियों को हटाने की सुविधा प्रदान करता है और विशेष रूप से बंधे मोती-टीथर संरचनाओं के टूटने से बचने में मदद करता है।
  6. SNARE परिसरों के साथ प्रयोगों के लिए, अंतिम बफर में 1.5 μM SNAP-25 शामिल करें।
    नोट: मुक्त स्नैप -25 अणु प्रकट होने के बाद एसएनएआरई परिसरों को फिर से बांध सकते हैं और एक ही परिसर पर बार-बार माप की अनुमति दे सकते हैं।

8. लक्ष्य संरचनाओं की पहचान

  1. प्रवाह-सेल चैनल की सतह पर, चुंबकीय मोतियों की खोज करें जो लक्ष्य निर्माण के एकल अणुओं से जुड़े होते हैं। सुनिश्चित करें कि एक संदर्भ मोती पास में स्थित है।
  2. एक उम्मीदवार मोती घुमाएं और जांचें कि यह स्वतंत्र रूप से घूमता है। यदि मोती कई अणुओं से जुड़ा होता है, तो यह एक विवश गति प्रदर्शित करता है।
  3. मोती को कुछ पूर्ण मोड़ों के लिए घुमाएं और रोटेशन की त्रिज्या का पता लगाएं (यह फ़ंक्शन प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर में लागू किया गया है)। अधिमानतः, एक छोटे घूर्णी त्रिज्या के साथ एक मोती चुनें।
    नोट: यह त्रिज्या इंगित करती है कि मोती टेथर अक्ष से कितना दूर केंद्रित है, जो बीड-टेथर असेंबली30,31 के दौरान यादृच्छिक रूप से निर्धारित किया जाता है। सभी प्रयोगों में, एक मोती का न्यूनतम ऑफ-सेंटरिंग हमारे द्वारा उपयोग किए जाने वाले उच्च मोती त्रिज्या से टेथर एक्सटेंशन अनुपात से जुड़ी कई कलाकृतियों को कम करता है।
  4. अच्छे एकल-टेथर्ड मोतियों की पहचान करने के लिए बल को 0 से 5 पीएन तक बढ़ाएं। 1 केबीपी टीथर (या समकक्ष दो 510 बीपी हैंडल) के खिंचाव के परिणामस्वरूप एक मोती के विवर्तन पैटर्न में एक बड़े बदलाव की तलाश करें। यदि विवर्तन पैटर्न में काफी बदलाव नहीं होता है, तो बल को शून्य तक कम करें और किसी अन्य उम्मीदवार मोती के लिए स्कैन करें।
    नोट: वास्तव में ट्रैकिंग प्रक्रिया शुरू किए बिना कच्ची छवियों से एक मोती के ~ 300 एनएम उठाने को आसानी से देखा जा सकता है।

9. विस्तार माप के लिए मोती ट्रैकिंग

नोट: इस लेख के साथ प्रदान किए गए लैबव्यू सॉफ्टवेयर में वास्तविक समय में मोती छवियों का विश्लेषण करके मोतियों की ट्रैकिंग की जाती है। ट्रैकिंग विधि और इसके वेरिएंट का उपयोग अधिकांश पारंपरिक एमटी सिस्टम में किया गया है और पिछले साहित्य 2,5,7,26 में समझाया गया है। एक निश्चित संदर्भ मोती (यानी, अंतर ट्रैकिंग) के सापेक्ष एक चुंबकीय मोती की स्थिति को मापने से, स्थिति माप एक बाहरी गड़बड़ी के लिए बेहद मजबूत हो जाते हैं।

  1. एक बार एक उचित चुंबकीय मोती एक संदर्भ मोती के साथ स्थित होने के बाद, मोती ट्रैकिंग की तैयारी शुरू करने के लिए कैलिब्रेट बटन पर क्लिक करें।
  2. मोतियों के स्थानों को परिभाषित करने के लिए छवि में मोतियों पर क्लिक करें। छवियों को फिर मोतियों के चारों ओर रुचि के क्षेत्रों (आरओआई) (जैसे, 3 μm मोती के लिए 150 x 150 पिक्सेल) में क्रॉप किया जाएगा और फिर सटीक मोती निर्देशांक निकालने के लिए आगे विश्लेषण किया जाएगा।
  3. चुंबक रोटेशन पूरा होने की प्रतीक्षा करें। यह प्रक्रिया मोती के एक्स- और वाई-निर्देशांक (2 डी क्रॉस-सहसंबंध 44 की गणना करके या मोती छवियों के रेडियल समरूपता45 का उपयोग करके, तुलनीय प्रदर्शन के साथ) को रिकॉर्ड करती है, जबकि मैग्नेट को मोती31 के ऑफ-केंद्रित लगाव का दस्तावेजीकरण करने के लिए घुमाती है।
  4. जेड-दिशा में ट्रैकिंग के लिए, फोकल प्लेन से अलग-अलग दूरी पर मोतियों की विवर्तन छवियों की लुकअप टेबल उत्पन्न करने के लिए सॉफ़्टवेयर की प्रतीक्षा करें। यह समान दूरी के चरणों में पीजो स्कैनर के साथ उद्देश्य लेंस को कदम उठाकर और प्रत्येक स्थिति में उतार-चढ़ाव-औसत मोती छवियों को रिकॉर्ड करके किया जाता है। फिर, वास्तविक प्रयोगों में मोतियों के जेड-निर्देशांक प्रक्षेप7 के साथ लुकअप तालिका में वास्तविक समय की मोती छवियों की तुलना करके निर्धारित किए जाते हैं।
  5. जब लुकअप टेबल जनरेशन समाप्त हो जाता है, तो ट्रैकिंग और ऑटोफोकसिंग सक्षम करें (ट्रैक और एएफ दबाएं? बटन) और मोती की स्थिति रिकॉर्ड करना शुरू करने के लिए अधिग्रहण बटन पर क्लिक करें।
    नोट: ऑटोफोकसिंग वैकल्पिक है लेकिन अधिग्रहण के दौरान जेड में चरण बहाव को सही करने की सिफारिश की जाती है।

10. बल अनुप्रयोग योजनाएं

  1. बल-रैंप प्रयोग: निर्माण के बल-विस्तार संबंध को सत्यापित करने के लिए, एक स्थिर लोडिंग दर (± 1.0 pN s-1) (चित्रा 4A) पर एक बल रैंप ऊपर और नीचे लागू करें। उदाहरण के लिए, निर्माण की समग्र लंबाई और हैंडल के बल-विस्तार वक्र को सत्यापित करने के लिए 0-20-0 पीएन चक्र के तीन राउंड लागू करें।
  2. सॉफ्टवेयर में टेथर मापदंडों को निर्दिष्ट करके, मापा डेटा के शीर्ष पर एक डब्ल्यूएलसी बल-विस्तार वक्र को ओवरले करें, और निर्धारित करें कि लक्ष्य मोती उचित डीएनए हैंडल के साथ एक वास्तविक नमूना निर्माण द्वारा जुड़ा हुआ है या नहीं। प्रारंभिक बिंदु के रूप में निर्माण की ज्ञात समोच्च लंबाई (जैसे, 1 kbp dsDNA के लिए ~ 340 nm) और WLC दृढ़ता लंबाई (लघु dsDNA31 के लिए 30-45 nm) का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो तो चरण 2.11 में वर्णित एक्सटेंशन सुधार विधि लागू करें।
  3. यदि निर्माण सत्यापित है, तो लक्ष्य अणुओं-हेयरपिन या एसएनएआरई परिसरों से उत्पन्न अतिरिक्त विस्तार को देखने के लिए बल-विस्तार प्रतिक्रिया की विस्तार से जांच करें।
  4. निरंतर-बल प्रयोग: लक्ष्य अणुओं की बल संवेदनशीलता की जांच करने के लिए असतत चरणों में लागू बल को धीरे-धीरे भिन्न करें (चित्रा 4 बी)।
    नोट: एमटी सरल और प्रभावी निरंतर-बल प्रयोगों को सक्षम करते हैं क्योंकि मैग्नेट को स्थिर रखने पर लागू बल स्थिर रहता है।
    1. डीएनए हेयरपिन के लिए, 0.2-0.5 पीएन चरणों के साथ 4-8 पीएन बल लागू करें, और प्रत्येक बल स्तर पर ~ 10 एस के लिए मोती की स्थिति को मापें।
    2. एसएनएआरई परिसरों के लिए, 0.1-0.2 पीएन चरणों के साथ 14-16 पीएन बल लागू करें, और प्रत्येक बल स्तर पर ~ 10 एस के लिए मोती की स्थिति को मापें।
  5. बल-कूद प्रयोग: एसएनएआरई परिसरों की संक्रमण घटनाओं का निरीक्षण करें।
    नोट: बल-कूद प्रयोग, निरंतर-बल प्रयोगों की तरह, बल के स्तर में परिवर्तन शामिल हैं। हालांकि, बल कूद लागू बल में अधिक अचानक परिवर्तन ों को नियोजित करते हैं, जिससे जांच किए गए अणुओं में बल-ट्रिगर घटनाओं की निगरानी की अनुमति मिलती है, जैसे कि प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का अचानक टूटना। उदाहरण के लिए, चूंकि एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स बल साइक्लिंग23 में संरचनात्मक हिस्टैरिसीस प्रदर्शित करते हैं, इसलिए बल-कूद प्रयोगों को करने और संक्रमण के लिए विलंबता को मापना सूचनात्मक है (चित्रा 4 सी)।
    1. अनज़िपिंग: एक बरकरार, त्रिआधारी एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स से एक वीएएमपी 2 अणु को छीलना, सिंटैक्सिन -1 ए और एसएनएपी -25 के एक द्विआधारी परिसर को छोड़ना।
    2. पुन: ज़िपिंग: एक बरकरार एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स को पुनर्जीवित करने के लिए अनज़िप ्ड वीएएमपी 2 अणु का उपयोग करना।
      1. खुलासा: एसएनएपी -25 के पूर्ण पृथक्करण के साथ एक एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स का पूर्ण विघटन। केवल वीएएमपी 2 और सिंटैक्सिन अणु प्रकट होने के बाद निर्माण में रहते हैं।
      2. पुन: मोड़ना: बफर से एक मुक्त एसएनएपी -25 अणु के बंधन पर एक एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स का पुनर्जनन।
  6. 2 pN पर, एक मुक्त SNAP25 अणु के जुड़ाव के लिए प्रतीक्षा (~ 30 s) द्वारा एक बरकरार SNARE कॉम्प्लेक्स की असेंबली को प्रेरित करें। एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स के गठन पर विस्तार में अचानक कमी देखी जाती है।
  7. अनज़िपिंग घटनाओं का निरीक्षण करने के लिए, 10-12 pN पर कुछ सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें, और फिर अधिकतम मोटर गति के साथ अचानक 14-15 pN पर जाएं। लक्ष्य बल के आधार पर, एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स या तो आंशिक रूप से अनियंत्रित मध्यवर्ती (जैसा कि निरंतर-बल प्रयोगों में) के बीच एक प्रतिवर्ती संक्रमण प्रदर्शित करेगा या यादृच्छिक प्रतीक्षा समय (या विलंबता) के बाद ~ 25 एनएम की छलांग को उच्च, अनियंत्रित अवस्था में प्रदर्शित करेगा।
  8. रिज़िपिंग घटनाओं का निरीक्षण करने के लिए, अनज़िपिंग देखे जाने के तुरंत बाद बल को 10-12 pN तक कम करें। फिर, एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स कुछ यादृच्छिक विलंबता के बाद निचले, जिपर वाली स्थिति में एक स्टोकेस्टिक संक्रमण प्रदर्शित करता है। यदि अनज़िपिंग के बाद खुलासा हुआ है, तो कॉम्प्लेक्स रीज़िप करने में विफल रहेगा, क्योंकि एसएनएपी -25 अणु गायब होगा।
  9. सामने आने वाली घटनाओं का निरीक्षण करने के लिए, विस्तार (~ 2 एनएम) में और वृद्धि का पता लगाने के लिए अनज़िपिंग देखे जाने के बाद लंबी अवधि तक प्रतीक्षा करें।

11. डेटा विश्लेषण

नोट: एमटी डेटा के साथ किए जा सकने वाले विश्लेषण के प्रकार लक्ष्य प्रणाली पर निर्भर करते हैं। हालांकि, चित्रा 4 में वर्णित संबंधित प्रयोगों से उपयोगी जानकारी निकालने के लिए सामान्य दृष्टिकोण हैं। सभी विश्लेषण इस लेख के साथ प्रदान किए गए कस्टम कोड का उपयोग करके MATLAB (R2021a) के साथ किए जाते हैं। ये कोड इस आलेख में प्रस्तुत समान डेटा का उपयोग करके प्लॉट उत्पन्न करते हैं। ध्यान दें कि जबकि 100 हर्ट्ज ट्रैकिंग से कच्चे डेटा को सीधे विश्लेषण के लिए लिया गया था, 1.2 kHz ट्रैकिंग से डेटा को आमतौर पर शोर को कम करने के लिए विश्लेषण से पहले (पांच-बिंदु स्लाइडिंग विंडो के साथ) औसत-फ़िल्टर किया गया था (शोर विश्लेषण को छोड़कर)।

  1. बल-रैंप प्रयोग: बल-विस्तार संबंध (जैसे, पॉलिमर की लोच) का विश्लेषण करें और नैनोमैकेनिकल गुणों पर जानकारी निकालने के लिए बल को संक्रमण करें।
  2. निरंतर-बल प्रयोग: संरचनात्मक (जैसे, संक्रमण में शामिल क्षेत्र), थर्मोडायनामिक (जैसे, मुक्त ऊर्जा अंतर), और गतिज (जैसे, ऊर्जा बाधा) मापदंडों को निकालने के लिए बल के कार्य के रूप में राज्य आबादी और निवास समय (या संक्रमण दर) का विश्लेषण करें।
  3. बल-कूद प्रयोग: लक्ष्य अणुओं और उनकी अवस्थाओं की स्थिरता निकालने के लिए टूटना कैनेटीक्स (जैसे, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और रिसेप्टर-लिगैंड बाइंडिंग) या क्षणिक मध्यवर्ती (जैसे, बायोमोलेक्यूल्स का प्रकटीकरण) के जीवनकाल का विश्लेषण करें।
  4. प्रतिनिधि अनुप्रयोगों के रूप में, डीएनए हेयरपिन और एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स के लिए नमूना डेटा का विश्लेषण करें:
    1. डीएनए हेयरपिन के दो-राज्य संक्रमण: अनज़िपिंग बल, खुलने की दूरी, जनसंख्या बदलाव की बल निर्भरता, और एक छिपे हुए मार्कोव मॉडल (एचएमएम) (मैटलैब कोड प्रदान किए गए) के साथ राज्य असाइनमेंट और संक्रमण दर माप।
    2. एसएनएआरई परिसरों के विरूपण परिवर्तन : अस्थिर बल, मध्यवर्ती अवस्थाओं की बल निर्भरता और विलंबता को कम करना, रिज़िपिंग में हिस्टैरिसीस, और प्रकट / पुन: मोड़ने वाला व्यवहार।
      नोट: डीएनए हैंडल, डीएनए हेयरपिन और एसएनएआरई जटिल रचना के लिए बल-विस्तार मॉडल पिछले संदर्भ14,31 में दिए गए हैं।

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Representative Results

बल अंशांकन;
दो बल माप विधियों (मोतियों के पार्श्व विस्थापन विचरण और पावर स्पेक्ट्रम विश्लेषण) के परिणाम 0-2 pN (चित्रा 2G) से भिन्न थे। चित्रा 2 एफ में परिणामों के अनुसार, हम नियमित नियोडिमियम मैग्नेट के साथ विश्वसनीय रूप से 30 pN तक पहुंच सकते हैं।

8 बीपी डीएनए हेयरपिन के दो-राज्य संक्रमण
हमने पहले एक छोटे डीएनए हेयरपिन (चित्रा 5) के नैनोमैकेनिक्स की जांच की। डीएनए हेयरपिन को बड़े पैमाने पर पारंपरिक एकल-अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा विशेषता दी गई है, और इसलिए तुलना करने के लिए संदर्भों का एक विशाल स्रोत उपलब्ध है। एक छोटे हेयरपिन की अनज़िपिंग आमतौर पर प्रतिवर्ती होती है, इसलिए इसकी रीज़िपिंग घटनाओं को भी उसी बल सीमा में देखा जाता है जिसमें अनज़िपिंग होती है (चित्रा 5 ए)। 0 pN और 20 pN (चित्रा 5B) के बीच एक बल रैंप लागू करके, हेयरपिन निर्माण के बल-प्रेरित विस्तार को WLC मॉडल का पालन करने के लिए सत्यापित किया गया था, जिसे पूरी तरह से डीएनए हैंडल की लोच के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है (चित्रा 5 सी, "बंद")। लगभग 6 pN पर, निर्माण ने विस्तार में अतिरिक्त उतार-चढ़ाव प्रदर्शित किया, जो हेयरपिन संरचना (चित्रा 5 सी, इनसेट) के प्रतिवर्ती अनज़िपिंग से जुड़ा था। अंत में, ~ 8 pN पर, संक्रमण अंततः गायब हो गया और विस्तार ऊपरी स्थिति पर बस गया जिसे ~ 7 एनएम तक बढ़ाया गया। नतीजतन, 8 pN से ऊपर मापा गया बल-विस्तार प्रोफ़ाइल एक नए मॉडल वक्र (चित्रा 5C, "खुला") पर टूट गया, जिसमें अनज़िप ्ड हेयरपिन के एकल-फंसे हुए क्षेत्र की लंबाई शामिल है।

फिर हमने हेयरपिन संक्रमण की व्यवस्थित रूप से जांच करने के लिए निरंतर-बल प्रयोग किए। मोती की स्थिति को प्रत्येक स्तर पर ~ 10 एस के लिए 0.5 पीएन चरणों के साथ 4-8 पीएन की बल सीमा में मापा गया था; फिर, बल के कार्य के रूप में उनके संतुलन वितरण को मापने के लिए विस्तार मूल्यों को एकत्र और विश्लेषण किया गया। 100 हर्ट्ज ट्रैकिंग के परिणामों ने इस बल शासन (चित्रा 5 डी) में एक अधिक विस्तारित स्थिति की ओर क्रमिक बदलाव का सुझाव दिया, लेकिन विस्तार के प्राप्त हिस्टोग्राम अलग-अलग आबादी को हल करने के लिए पर्याप्त स्पष्ट नहीं थे (चित्रा 5 ई)। इसके विपरीत, जब वही प्रयोग 1.2 kHz (चित्रा 5F) पर किए गए थे, तो कोमल फ़िल्टरिंग (पांच-बिंदु औसत फ़िल्टर) के बाद विस्तार परिवर्तनों के उच्च गति प्रक्षेपवक्र ने दो अलग-अलग आबादी का खुलासा किया जो दो गॉसियन वितरण (चित्रा 5 जी) के मिश्रण द्वारा अच्छी तरह से वर्णित हैं। दो आबादी के बीच अलगाव, हेयरपिन की शुरुआती दूरी को दर्शाता है, अनज़िपिंग बल शासन (चित्रा 5 एच) में ~ 7 एनएम पर अपरिवर्तित रहा। छोरों (4 pN और 8 pN) में विचलन इसकी कमी के कारण एक राज्य के गलत स्थानीयकरण के कारण था।

आंकड़ों से पता चला है कि अनज़िपिंग संक्रमण के लिए मध्य-बल (वह बल जिस पर बंद और खुली आबादी बराबर हो जाती है) एफ1/2 ~ 6 पीएन था, और ऊपरी, खुली स्थिति धीरे-धीरे प्रमुख हो गई क्योंकि हमने 4-8 पीएन (चित्रा 5 आई) में बल बढ़ाया। जब खुली संभावना के लिए बोल्ट्जमैन संबंध के साथ फिट किया जाता है, Equation 10तो एफ 1/2 = 5.9 pN और त्रिभुजz = 7.1 nm के सटीक मान प्राप्त किए गए थे, जो उपरोक्त अवलोकनों के अनुरूप थे। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बल उत्पादन में मोती-से-मोती परिवर्तनशीलता के कारण एकल निर्माण से प्राप्त उद्घाटन बल सटीक नहीं हो सकता है, जिसे वाणिज्यिक एम 270 मोती31 के लिए ~ 4% मापा गया था। इसके अलावा, चूंकि स्टेम लंबाई (8 बीपी) कम है, इसलिए विभिन्न न्यूक्लियोटाइड संरचना वाले अन्य 8 बीपी हेयरपिन का ग्राउंड-ट्रुथ ओपनिंग बल बहुतभिन्न हो सकता है। अंत में, हमने राज्य संक्रमण को मैप करने के लिए विस्तार के निशान पर एचएमएम लागू किया और इस तरह संक्रमण दर (चित्रा 5 एफ, लाल ट्रेस) को मापा। अनज़िपिंग और रीज़िपिंग दोनों दरें लागू बल (चित्रा 5 जे) के साथ तेजी से भिन्न होती हैं, इस तरह से कि बल अनज़िपिंग को बढ़ावा देता है और रीज़िपिंग को रोकता है। यदि आवश्यक हो, तो ऊर्जा परिदृश्य (जैसे, बाधा ऊंचाई और दूरी) के मापदंडों को निकालने के लिए क्लासिक बेल अभिव्यक्ति का उपयोग किया जा सकता है।

विस्तार माप में थर्मल उतार-चढ़ाव का लक्षण वर्णन।
हेयरपिन निर्माण का उपयोग करते हुए, हमने विस्तार माप में बल-निर्भर शोर को प्रोफाइल किया। सबसे पहले, एक टेथर्ड मोती के थर्मल उतार-चढ़ाव की गणनाइन प्रयोगों 2,5 (चित्रा 5 के, ठोस वक्र) के लिए उपयुक्त मापदंडों (जैसे, मोती त्रिज्या, टेथर लंबाई) का उपयोग करके समीकरणों से की गई थी। हमने अलग-अलग बल स्तरों पर हेयरपिन निर्माण के समय के निशान से मापा गया विस्तार Equation 11 के मानक विचलन को भी प्लॉट किया। चूंकि इस अणु में एक हेयरपिन आकृति थी, इसलिए 4 pN (बंद अवस्था) के तहत इसकी प्रतिक्रिया का उपयोग आंतरिक शोर के माप के लिए किया गया था, जबकि हेयरपिन गतिशीलता का पता लगाया गया था ~ 6 pN, जैसा कि अपेक्षित था, और एक जांच के रूप में कार्य किया। हेयरपिन के ज्यादातर खुले होने के बाद उतार-चढ़ाव का बल-निर्भर दमन भी देखा गया (8 pN बनाम 4 pN की तुलना करें)। थर्मल सीमा के साथ तुलना इंगित करती है कि सुधार के लिए एक जगह है, लेकिन यह शेष शोर अक्सर चुंबकीय मोती30 के घूर्णी उतार-चढ़ाव से जुड़ा होता है, जो यादृच्छिक और हल करने के लिए चुनौतीपूर्ण होता है। अवलोकन समय में ब्राउनियन शोर के अधिक व्यवस्थित विश्लेषण के लिए, एलन विचलन की गणना अक्सर32,33 नियोजित की जाती है। हमने चित्रा 5 एफ में प्रस्तुत हेयरपिन डेटा के लिए एलन विचरण की गणना की, चित्रा 2 सी में 5 केबीपी माप के समान। चित्रा 5 एल के परिणाम बताते हैं कि, 4-8 pN की मध्यवर्ती बल सीमा में, हमने अधिकतम गति (1.2 kHz) पर एलन विचलन के 2-3 एनएम प्राप्त किए, और यह मान 0.1 सेकंड से अधिक अवलोकन समय के लिए 1 एनएम से नीचे गिर गया। दिलचस्प बात यह है कि हेयरपिन गतिशीलता ~ 0.01 एस (चित्रा 5 एल, इनसेट) के लिए 5-7 पीएन के आसपास उभरी, जो चित्रा 5 आई, जे में मापा संक्रमण बल और दरों के अनुरूप है।

न्यूरोनल एसएनएआरई परिसरों के विरूपण परिवर्तन।
फिर हमने न्यूरोनल एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स को प्रोटीन मॉडल के रूप में नियोजित किया और उनके बल-निर्भर यांत्रिक गुणों की जांच की। हेयरपिन निर्माण के विपरीत, एकल एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स दो 510 बीपी डीएसडीएनए हैंडल (चित्रा 6 ए) के बीच आयोजित किए गए थे। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सिंटैक्सिन -1 ए और वीएएमपी 2 की टर्मिनी, हैंडल से दूर, कृत्रिम सिस्टीन अवशेषों के बीच एक डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड द्वारा क्रॉसलिंक की गई थी ताकि टूटने से बचा जा सके और किसी दिए गए निर्माण के कई राउंड को सक्षम किया जा सके।

हमने पहले क्रमशः लक्ष्य निर्माण को फैलाने और आराम करने के लिए बढ़ते और घटते बल स्तर (± 1 pN s-1) के साथ एक बल रैंप लागू किया। निम्न-से-मध्य-बल शासन (0-10 pN) में, दो हैंडल स्वतंत्र रूप से WLC पॉलिमर के रूप में व्यवहार करते हैं, कुल मिलाकर बल-विस्तार वक्र को 1 kbp dsDNA (चित्रा 6B, काला) से अप्रभेद्य आकार देते हैं। हालांकि, जब बल को 10 pN से ऊपर बढ़ाया गया था, तो एक्सटेंशन मान WLC मॉडल से काफी हद तक विचलित हो गए, यह दर्शाता है कि एम्बेडेड SNARE कॉम्प्लेक्स ने एक्सटेंशन में अतिरिक्त वृद्धि प्रदर्शित की। अधिक विशेष रूप से, विस्तार वृद्धि को तीन अलग-अलग चरणों में संक्षेपित किया जा सकता है: (ए) 11-13 पीएन में मामूली, क्रमिक वृद्धि, (बी) 14-16 पीएन में तेजी से और बड़ा (~ 10 एनएम) उतार-चढ़ाव, और (सी) लगभग ~ 20 एनएम का अंतिम, अपरिवर्तनीय अनज़िपिंग। इसके अतिरिक्त, जब निर्माण को आराम देने के लिए बल को कम किया गया था, तो विस्तार या तो कम बल (<15 pN) पर मूल बल-विस्तार वक्र पर वापस आ गया या एक बड़े विस्तार (चित्रा 6 B, नीला) के साथ एक नए मॉडल वक्र का अनुसरण किया। कुल विस्तार को अंततः 5 pN से नीचे निचले मूल्यों ( चित्रा 6B में नीले से काले तक) में बहाल किया गया था और एक ही बल-रैंप चक्र लागू किया जा सकता था, जिसने एक समान प्रवृत्ति दिखाई।

एसएनएआरई जटिल रचना के आणविक मॉडल से, हम संभावित मध्यवर्ती (चित्रा 6 सी) के संभावित विस्तार मूल्यों की सटीक गणना कर सकते हैं। इसके अलावा, अनकोल्ड पॉलीपेप्टाइड्स के लिए डब्ल्यूएलसी व्यवहार को मानते हुए, एक्सटेंशन को बल के कार्य के रूप में अनुमानित किया जा सकता है, इस प्रकार विभिन्न अनुरूपताओं (चित्रा 6 बी, डॉटेड लाइनों) के लिए पूर्ण बल-विस्तार मॉडल उत्पन्न होता है। इन मूल्यों को संदर्भ के रूप में लेते हुए, हमने उपरोक्त संक्रमणों की व्याख्या निम्नानुसार की 14,23: (ए)11-13 पीएन में पूरी तरह से ज़िपर्ड स्टेट (एफजेड) से लिंकर-ओपन स्टेट (एलओ) में क्रमिक बदलाव, जिसका अर्थ है सिंटैक्सिन -1 ए और वीएएमपी 2 के लिंकर क्षेत्रों का उद्घाटन; (बी) एलओ और अर्ध-जिपर अवस्था (एचजेड) के बीच तेजी से संक्रमण, जिसका अर्थ है शून्य आयनिक परत तक एसएनएआरई परिसर का उद्घाटन; और (ग) या तो अनज़िप्ड (यूजेड) या अनफोल्डेड स्टेट (यूएफ) में अंतिम संक्रमण, जिसका अर्थ है कि परिसर के बाकी हिस्सों से वीएएमपी 2 का पूरी तरह से पता चल जाएगा। यूजेड अवस्था यूएफ से अलग है क्योंकि एसएनएपी -25 का संबंधित अणु अभी भी सिंटैक्सिन -1 ए से बंधा हुआ है, जो एक द्विआधारी परिसर को बनाए रखता है। यूएफ (एसएनएपी -25 के बिना) के मामले में, पूर्ण एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स को केवल तभी पुनर्जीवित किया जा सकता है जब समाधान से एक मुक्त एसएनएपी -25 अणु फिर से जुड़ जाता है, जिसमें इस तरह के पुनर्संयोजन की अनुमति देने के लिए लागू बल को कम करना महत्वपूर्ण है।

एसएनएआरई परिसरों के संवहन परिवर्तनों को अधिक व्यवस्थित तरीके से सत्यापित करने के लिए, हमने तब बल शासन में बल-कूद प्रयोगों का प्रदर्शन किया, जहां विरूपण उतार-चढ़ाव अक्सर 14-15 pN (चित्रा 6 डी) पर देखा गया था। आमतौर पर, हमने पहले 10 pN पर मोती की स्थिति को मापकर शुरू किया और स्थिर विस्तार के लिए जांच की, जो SNARE से संबंधित परिवर्तनों की अनुपस्थिति का संकेत देता है। फिर, बल स्तर को अचानक 14-15 pN तक बढ़ा दिया गया था, जिस पर विस्तार की निगरानी तब तक की गई थी जब तक कि अनज़िपिंग नहीं हुई, यदि कोई हो। अंत में, सामने आने से जुड़े विस्तार में किसी भी लगातार वृद्धि की जांच के लिए बल को वापस 10 pN तक कम कर दिया गया था। 14 pN पर, विस्तार के निशान ज्यादातर एलओ अवस्था में रहते हैं, कभी-कभी HZ अवस्था में स्पाइक्स के साथ। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एचजेड राज्य के इन संक्षिप्त भ्रमण को 100 हर्ट्ज ट्रैकिंग में याद किए जाने की संभावना है, जो 12 के कारक से औसत और डाउन-सैंपल बीड छवियों को औसत करता है। एचजेड राज्य के स्पष्ट और लगातार दौरे के बावजूद, कॉम्प्लेक्स यूजेड राज्य (चित्रा 6 ई) में पूर्ण संक्रमण करने में विफल रहा, यह सुझाव देते हुए कि बाहरी बल ऊर्जा बाधा को दूर करने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं था। इसके विपरीत, बल में एक छोटी सी वृद्धि (14.3 pN तक) ने भी संक्रमण को बहुत कुशल बना दिया ताकि UZ स्थिति ज्यादातर कुछ सेकंड के भीतर पहुंच जाए (चित्रा 6F)। लगातार, अनज़िपिंग ज्यादातर 1 सेकंड के भीतर समाप्त हो गई थी जब हमने कॉम्प्लेक्स में 14.5 पीएन लागू किया था (चित्रा 6 जी, एच)। विशेष रूप से, उच्च बलों पर अनज़िपिंग ने अक्सर पूरे परिसर को पूरी तरह से प्रकट किया (एसएनएपी -25 को हटाने के साथ), जैसा कि यूजेड (चित्रा 6 एच) के ऊपर विस्तार में थोड़ी अतिरिक्त वृद्धि और 2 पीएन (चित्रा 6 आई) पर देखे गए रिफोल्डिंग हस्ताक्षर से स्पष्ट है। कुल मिलाकर, ये आंकड़े एसएनएआरई परिसरों के प्रकटन के लिए शास्त्रीय स्लिप-बॉन्ड व्यवहारदिखाते हैं, जो पिछली रिपोर्ट 14,23,48 के अनुरूप है।

Figure 1
चित्र 1: उपकरण सेटअप। एक उच्च गति एमटी सेटअप के योजनाबद्ध (ए) और फोटोग्राफ (बी)। एक रैखिक और एक रोटेशन मोटर द्वारा नियंत्रित मैग्नेट 100x तेल-विसर्जन लेंस और एक उच्च गति वाले CMOS कैमरे से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप के नमूना चरण के ऊपर स्थित हैं। एक सुपरल्यूमिनेसेंट डायोड से प्रकाश किरण मैग्नेट के माध्यम से गुजरती है और क्षेत्र को रोशन करती है। इनसेट: फोकल प्लेन से अलग-अलग दूरी पर स्थित मोतियों की प्रतिनिधि विवर्तन छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: बल अंशांकन। (ए) बल अंशांकन नमूने का योजनाबद्ध। 1 मिमी पृथक्करण के साथ मैग्नेट की एक समानांतर जोड़ी द्वारा लगाए गए बल के परिमाण को 5 केबीपी डीएसडीएनए टुकड़े से बंधे चुंबकीय मोती (एम 270) के विस्थापन से चुंबक दूरी डी के कार्य के रूप में मापा जाता है। (बी) बल अंशांकन प्रक्रिया से प्रतिनिधि डेटा। रंगीन तीर उन क्षेत्रों को इंगित करते हैं जो (डी) (मिलान रंग) में विस्तारित होते हैं। (सी) 5 केबीपी टेथर्ड बीड की जेड-स्थिति के लिए एलन विचलन 15-20 पीएन के साथ मापा जाता है। संदर्भ मोती की स्थिति को घटाने से पहले (नीला) और बाद में (लाल) चुंबकीय मोती जेड-निर्देशांक के लिए वक्र दिखाए गए हैं। (डी) संकेतित चुंबक दूरी पर मापा गया वाई-स्थिति की प्रतिनिधि समय श्रृंखला वाई-समन्वय वितरण के संबंधित हिस्टोग्राम को गॉसियन फिट (लाल) के साथ दाईं ओर दिखाया गया है। (ई) (डी) में दिखाए गए आंकड़ों से प्रतिनिधि पीएसडी। संबंधित पीएसडी में एक मॉडल (लाल) फिट करके प्राप्त बल मान शीर्ष पर दिए गए हैं। (च) चुंबक दूरी के फलन के रूप में चुंबकीय बल का अंशांकन। बलों को या तो विचरण (बाएं) या पीएसडी विधि (दाएं) से मापा गया था। फिट (लाल) एनोटेटेड समीकरण के साथ एक डबल-घातीय मॉडल को इंगित करता है। (छ) विचरण और पीएसडी से प्राप्त मापित बल में अंतर। (एफ) में दिखाए गए फिट के लिए एक लाल वक्र की गणना की जाती है। (एच, आई) 5 केबीपी अंशांकन निर्माण के बल-विस्तार संबंध का सत्यापन। अलग-अलग बल स्तरों पर औसत विस्तार मान (विचरण से मापा जाता है) का उपयोग या तो सीधे (एच) या ऑफ-केंद्रित मोती31 के झुकाव के कारण मोती-ऊंचाई ऑफसेट (आई) के लिए सही करने के बाद किया गया था। एन = 5 अणुओं के लिए बल-विस्तार डेटा को एक एक्सटेंसिबल डब्ल्यूएलसी मॉडल द्वारा फिट किया गया था और फिट किए गए पैरामीटर (दृढ़ता लंबाई एलपी और खिंचाव मापांक केओ) को शीर्ष पर एनोटेट किया जाता है (औसत ± एसडी)। संक्षिप्त नाम: पीएसडी = पावर स्पेक्ट्रल घनत्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: नमूना तैयारी । (ए) 8 बीपी डीएनए हेयरपिन संरचनाओं की तैयारी 1 केबीपी क्षेत्र के पीसीआर प्रवर्धन द्वारा की जाती है। (बी) दो 510 बीपी डीएनए हैंडल के साथ एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स संरचनाओं की तैयारी। इनसेट: डीएनए हैंडल का सत्यापन और एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन (2% जेल) द्वारा प्रोटीन के साथ उनका लगाव। तीर उत्पाद प्रजातियों की गतिशीलता बदलाव (रंग-कोडित) को इंगित करते हैं: मुफ्त 510 बीपी हैंडल (मैजेंटा); सिंटैक्सिन (लाल), त्रिभुज-कॉम्प्लेक्स (हरा), और एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स (नीला) से जुड़े हैंडल बी; और अंतिम दो-नियंत्रित एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स (हरा)। एसडीएस को जोड़ने से त्रिभुज-कॉम्प्लेक्स (बी में मौजूद) बाधित होता है, लेकिन पूर्ण लंबाई वाले वीएएमपी 2 (सी में मौजूद) द्वारा गठित पूर्ण एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स नहीं। (सी) एमटी प्रयोगों के लिए एक प्रवाह सेल का डिजाइन और फोटोग्राफ। (डी) प्रवाह-सेल चैनल में नमूना समाधानों के अनुक्रमिक परिचय का योजनाबद्ध। संक्षिप्त नाम: एमटी = चुंबकीय चिमटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि प्रयोगों के प्रकार। (ए-सी) बल-रैंप, बल-क्लैंप और बल-कूद प्रयोगों (शीर्ष) के योजनाबद्ध, संबंधित माप (मध्य) से विस्तार के प्रतिनिधि समय के निशान के साथ। विश्लेषण के प्रकार जो आयोजित किए जा सकते हैं, वे नीचे दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: 8 बीपी डीएनए हेयरपिन का दो-राज्य संक्रमण। (ए) डीएनए हेयरपिन पर एमटी प्रयोगों का योजनाबद्ध जिसमें अपेक्षित अनज़िपिंग और रीज़िपिंग संक्रमण होता है। (बी) बल स्तरों में वृद्धि (~ 0.25 pN s-1) के साथ बल-रैंप प्रयोगों से निर्माण विस्तार का प्रतिनिधि निशान। (सी) प्रतिनिधि बल-विस्तार वक्र (बी) में डेटा से पुनर्निर्मित किया गया। पीले वक्र बंद (ठोस) और खुले (डैश्ड) रचना में हेयरपिन के साथ हेयरपिन निर्माण के लिए डब्ल्यूएलसी मॉडल को इंगित करते हैं। (डी) बढ़ते बल स्तरों के साथ निरंतर-बल प्रयोगों से प्रतिनिधि विस्तार ट्रेस, 100 हर्ट्ज पर मापा जाता है। (F, G) (डी) और (ई) में समान प्रयोगों के लिए परिणाम लेकिन 1.2 kHz ट्रैकिंग के साथ। कच्चे 1.2 kHz समय श्रृंखला को पांच-बिंदु औसत फ़िल्टर लागू करके चिकना किया गया था। (एफ) के विस्तारित दृश्य में लाल निशान एक एचएमएम से प्राप्त किए गए थे। (जी) में लाल रेखाएं गॉसियन आबादी के स्थानों को इंगित करती हैं। (H) (G) में दो आबादी के बीच की दूरी। (i) लागू बल के फलन के रूप में खुली अवस्था में संभाव्यता। लाल वक्र एक फिट किया गया बोल्ट्जमैन मॉडल (Equation 10) है जिसमें मध्य बल F1/2 = 5.9 pN है। (जे) एचएमएम परिणामों से मापा गया संक्रमण दरों को अनज़िपिंग और रीज़िपिंग करना। ठोस रेखाएं बल पर घातीय निर्भरता का संकेत देती हैं। (के) विस्तार माप में थर्मल उतार-चढ़ाव। हेयरपिन एक्सटेंशन डेटा के मानक विचलन (फ़िल्टरिंग के बिना) को बल के कार्य के रूप में दिखाया गया है। थर्मल रिज़ॉल्यूशन सीमा जो थर्मल उतार-चढ़ाव के सैद्धांतिक परिमाण का प्रतिनिधित्व करती है, का अनुमान चोई एट अल.2 द्वारा 1 केबीपी टीथर के साथ 2.8 μm मोती के लिए किए गए काम में Eq. 9 से लगाया गया था। (एल) एलन विचलन की गणना (एफ) (फ़िल्टरिंग के बिना) में 1.2 kHz हेयरपिन डेटा से की जाती है। इनसेट बल के कार्य के रूप में 0.01 एस पर एलन विचलन दिखाता है, जो हेयरपिन गतिशीलता के कारण उतार-चढ़ाव की क्रमिक वृद्धि और कमी को दर्शाता है। संक्षिप्त नाम: एमटी = चुंबकीय चिमटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: न्यूरोनल एसएनएआरई परिसरों के विरूपण परिवर्तन। (ए) एसएनएआरई परिसरों पर एमटी प्रयोगों का योजनाबद्ध। (बी) एसएनएआरई निर्माण के लिए प्रतिनिधि बल-विस्तार वक्र। बल-रैंप प्रयोगों में क्रमशः स्ट्रेचिंग और आराम की अवधि से काले और नीले निशान (100 हर्ट्ज) प्राप्त किए गए थे। डैश्ड लाइनें विस्तार मॉडल को इंगित करती हैं, जो (सी) में दिखाए गए एसएनएआरई परिसरों के विभिन्न अनुरूपताओं के लिए जिम्मेदार हैं। (सी) संबंधित गणना किए गए एक्सटेंशन के साथ एसएनएआरई जटिल अनुरूपता के आणविक मॉडल। मूल्यों का अनुमान हेलिकल बंडलों के ज्यामितीय मापदंडों और पॉलीपेप्टाइड क्षेत्र14 के लिए एक डब्ल्यूएलसी मॉडल से लगाया गया था। (डी) एसएनएआरई जटिल अनुरूपताओं की जांच करने के लिए बल-कूद प्रयोगों का योजनाबद्ध। (E-H) प्रतिनिधि विस्तार बल के संकेतित स्तरों पर किए गए बल-कूद प्रयोगों से पता चलता है। (ई) में, अनज़िपिंग नहीं देखी गई थी। (एफ) और (जी) में, अनज़िपिंग देखी गई और उसके बाद 10 बजे रीज़िपिंग देखी गई। (एच) में, अनज़िपिंग के बाद एक और सामने आने वाली घटना हुई। (i) 2 बजे एसएनएआरई परिसर को पुन चालू करना। यूएफ से एफजेड राज्य तक विस्तार में स्पष्ट कमी 5 बजे देखी गई थी। संक्षिप्त नाम: एमटी = चुंबकीय चिमटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पीसीआर सेटिंग दशा
सामग्री 1.25 μg/mL -DNA (टेम्प्लेट), 1 μM फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर, 0.2 mM dNTP, 0.05 U/μL nTaq, 1x nTaq बफर
विकृतीकरण। 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस
एनीलिंग अंशांकन निर्माण: 30 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस
डीएनए हेयरपिन: 30 सेकंड के लिए 57 डिग्री सेल्सियस
डीएनए हैंडल: 30 सेकंड के लिए 50 डिग्री सेल्सियस
विस्तार डीएनए हेयरपिन और हैंडल: 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस
अंशांकन निर्माण: 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस
चक्र 30–34
Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन
जैल 0.5x tris-borate-EDTA (TBE, pH 8.3) में 1x SYBR सुरक्षित
भागना मुपिड -2 प्लस (एडवांस) पर पूर्ण शक्ति (108 वी औसत), 40-50 मिनट

तालिका 1: पीसीआर प्रतिक्रियाओं और एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए स्थितियां। डीएनए संरचनाओं के पीसीआर के लिए प्रतिक्रिया पैरामीटर, जिसमें बल अंशांकन के लिए 5 केबीपी डीएसडीएनए, डीएनए हेयरपिन निर्माण और एसएनएआरई संलग्न करने के लिए डीएनए हैंडल शामिल हैं। प्राइमर अनुक्रम सामग्री की तालिका में दिए गए हैं।

प्रोटीन शोधन बफर संयोजन
वॉश बफर ए 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM NaCl, 7 mM β-mercaptoethanol (BME), 10% ग्लिसरॉल, और 20 mM इमिडाज़ोल
बफर बी धोएं 50 mM HEPES (pH 7.2), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10% ग्लिसरॉल, और 20 mM इमिडाज़ोल
लाइसिस बफर वॉश बफर ए 1% ट्राइटन एक्स -100, 1 एमएम फेनिलमिथाइलसल्फोनिल फ्लोराइड (पीएमएसएफ), और 1 एक्स प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल के साथ पूरक है।
क्षालन बफर वॉश बफर बी 400 एमएम इमिडाज़ोल के साथ पूरक
फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) 81 mM सोडियम फॉस्फेट डाइबासिक (Na 2 HPO 4), 19 mM सोडियम फॉस्फेट मोनोबैसिक (NaH 2 PO4) (pH7.2), 150 mM NaCl
फॉस्फेट बफर 81 mM Na 2 HPO 4, 19 mM NaH2PO 4,pH7.4

तालिका 2: बफर और उनकी संरचना। प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले बफर की संरचना।

पूरक चित्रा एस 1: एक चुंबक धारक का चित्रण। 1 मिमी अंतराल के साथ दो 10 मिमी x 10 मिमी x 12 मिमी मैग्नेट के लिए एक ऐक्रेलिक धारक के आयाम दिखाए गए हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: MATLAB कोड युक्त एक ज़िप फ़ाइल। बल अंशांकन, हेयरपिन और एसएनएआरई जटिल विश्लेषण सहित उच्च गति चुंबकीय चिमटी प्रयोगों द्वारा उत्पादित डेटा का विश्लेषण करने के लिए MATLAB स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: LabVIEW सॉफ्टवेयर पैकेज ज़िप फ़ाइल। एक उच्च गति चुंबकीय चिमटी सेटअप संचालित करने और इसके साथ डेटा प्राप्त करने के लिए लैबव्यू कोड का एक पूर्ण पैकेज। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस काम में, हमने एक एकल-अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी सेटअप पेश किया जो उच्च स्थानिक परिशुद्धता पर बायोमोलेक्यूल्स के संरचनात्मक परिवर्तनों का निरीक्षण कर सकता है। उपयोग किया गया हाई-स्पीड सीएमओएस कैमरा 1,280 x 1,024 रिज़ॉल्यूशन पर 1,200 फ्रेम एस -1 प्राप्त करता है, जिससे 1.2 किलोहर्ट्ज बीड ट्रैकिंग सक्षम होती है। हालांकि, माप की गति वर्तमान में मोती ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर द्वारा सीमित है, इसलिए आरओआई आमतौर पर उच्च गति माप में छोटे क्षेत्रों में कम हो जाता है। एसएलडी की उच्च शक्ति एक उज्ज्वल रोशनी प्रदान करती है जो कुछ kHz बैंडविड्थ तक तेजी से मोती इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, बीम का स्थानिक सामंजस्य मोतियों के चारों ओर उच्च-विपरीत, संकेंद्रित विवर्तन छल्ले उत्पन्न करता है (चित्रा 1 ए, इनसेट), जो समरूपता के आधार पर मोती की स्थिति के सटीक निर्धारण को सक्षम करता है।

मोती-टेथर निर्माण पर लगाए गए चुंबकीय बल को टेथर्ड मोती35,37,38 के ब्राउनियन उतार-चढ़ाव को मापकर निर्धारित किया जा सकता है। चूंकि वास्तविक समय बल विश्लेषण गणना-भारी है, इसलिए लागू बल को आमतौर पर संदर्भ निर्माण का उपयोग करके पहले से मापा जाता है। उदाहरण के लिए, उपयोग किए जाने वाले चुंबकीय मोतियों को लंबे (>5 केबीपी) डीएसडीएनए टुकड़ों से जोड़ा जाता है, और मोती की स्थिति में संबंधित थर्मल उतार-चढ़ाव को चुंबक दूरी (चित्रा 2 ए) के कार्य के रूप में मापा जाता है। बल अंशांकन आमतौर पर सेटअप के निर्माण के बाद एक बार किया जाता है, लेकिन इसे नियमित रूप से दोहराना आवश्यक नहीं है जब तक कि सेटअप को संशोधित नहीं किया जाता है, उदाहरण के लिए, मैग्नेट को बदलकर। चूंकि लागू बल2 के साथ मोती के उतार-चढ़ाव की विशिष्ट आवृत्ति बढ़ जाती है, इसलिए एक उच्च गति सेटअप विशेष रूप से एक उच्च-बल शासन में तेज गतिशीलता को पकड़ने और बल को सटीक रूप से मापने के लिए उपयोगी होता है। आवृत्ति डोमेन में वर्णक्रमीय विश्लेषण की तुलना में विचरण से बल आकलन इसके कार्यान्वयन में बहुत सरल है, लेकिन यह बहाव, कैमरा-आधारित अधिग्रहण से कलाकृतियों और ऑफ-केंद्रित मोती अनुलग्नक31,37,38 के कारण विस्तार परिवर्तनों के लिए अतिसंवेदनशील है। फिर भी, दो विधियों के परिणाम केवल 0-2 pN से भिन्न होते हैं यदि ठीक से प्राप्त किया जाता है (चित्रा 2 जी); इसलिए, विचरण विधि पर्याप्त विश्वसनीय है जब बल का पूर्ण निर्धारण महत्वपूर्ण नहीं है।

30 pN से ऊपर और लगभग 65 pN (जिस पर dsDNA ओवरस्ट्रेचिंग एक बेंचमार्क के रूप में कार्य करता है) पर उच्च बलों के लिए, या तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उच्च-ग्रेड (N50-N52) मैग्नेट स्थापित किए जाने चाहिए, मैग्नेट के बीच के अंतर को कम किया जाना चाहिए, या चुंबकीय क्षेत्र को आगे28,49 इंजीनियर किया जाना चाहिए। इस सेटअप में, ऊर्ध्वाधर मोटर की सबसे तेज़ गति 30 मिमी / सेकंड है, जो ~ 0.6 एस में 0 pN से 20 pN तक बल कूद की अनुमति देता है। यदि मोटर गति बल लोडिंग दर को सीमित करती है तो कुछ तेजी से बल-निर्भर संरचनात्मक परिवर्तन छूट सकते हैं। आवेदन के आधार पर, मैग्नेट को स्थानांतरित करने के तरीके में परिवर्तन और आगे अनुकूलन आवश्यक हो सकता है। एक उदाहरण में चुंबकीय टेप हेड15 का रचनात्मक उपयोग शामिल है।

एमटी के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन माप के लिए, विभिन्न स्रोतों से शोर के स्तर का मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण है। एक बार ऑप्टिकल घटक (एक उच्च-आवर्धन लेंस, उज्ज्वल प्रकाश स्रोत और तेज कैमरे के साथ एक माइक्रोस्कोप) ठीक से कॉन्फ़िगर किए जाने के बाद, मोती ट्रैकिंग में उप-नैनोमीटर परिशुद्धता प्राप्त की जा सकती है। फिर, शोर का प्रमुख स्रोत एक मोती की ब्राउनियन गति बन जाता है, जिसका उपयोग लागू बल को मापने के लिए किया जाता है। एक टेथर्ड मोती का थर्मल उतार-चढ़ाव इसकी त्रिज्या, टेथर लंबाई और लागू बल पर निर्भर करता है। यद्यपि जेड-दिशा में आंतरिक उतार-चढ़ाव (यानी, विस्तार परिवर्तन) पूरी तरह से थर्मल ऊर्जा और टीथर कठोरता पर निर्भर करता है, बीड-टेथर गतिशीलता और कैमरा-आधारित अधिग्रहण की दर मोती के आंदोलन को फ़िल्टर करती है और इस प्रकार बारी-बारी से लक्ष्य बायोमोलेक्यूल्स की निगरानी होती है। इसलिए, मोती के आकार और नमूना करण दर को रणनीतिक रूप से चुना जाना चाहिए ताकि अच्छे स्थानिक रिज़ॉल्यूशन को प्राप्त किया जा सके। हमारे द्वारा नियोजित 2.8 μm मोती के विकल्प के रूप में, छोटे 1 μm मोती भी लोकप्रिय हैं और उनकी तेज प्रतिक्रिया के कारण तेजी से माप के लिए फायदेमंद हो सकते हैं। हालांकि, एक महत्वपूर्ण कमजोरी छोटी चुंबकीय सामग्री है, जो उत्पन्न होने वाले अधिकतम बल को सीमित करती है (Equation 121). चूंकि छोटे मोती अभी भी कम से कम 10 pN तक बल लगा सकते हैं, इसलिए वे कमजोर-बल की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हो सकते हैं, जैसे कि डीएनए सुपरकॉइलिंग में। इसके विपरीत, आणविक मोटर्स, प्रोटीन फोल्डिंग (जैसे, एसएनएआरई, यहां दिखाया गया है), या सेल मैकेनिक्स 50 की जांच के लिए उच्च बलों के आवेदन की आवश्यकता होती है, इस स्थिति में कोई भी लागू बल28,51 की सीमा का विस्तार करने के लिए चुंबक विन्यास (जैसे, अंतर या दूरी को कम करना) को संशोधित करने पर विचार कर सकता है।

क्योंकि तकनीक बायोफिज़िकल रूप से प्रासंगिक पैमाने पर बल लागू करते समय लक्ष्य अणुओं की नैनोमैकेनिकल प्रतिक्रियाओं की जांच करती है, यह आदर्श रूप से बल-संवेदनशील तत्वों का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है जो मेकेनोबायोलॉजिकल प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उच्च-परिशुद्धता एमटी परख की व्यापक प्रयोज्यता को स्पष्ट करने के लिए, हमने एक न्यूक्लिक एसिड और एक प्रोटीन मॉडल दोनों को नियोजित किया जो एक पिकोनवटन-स्केल बल के आवेदन पर गतिशील और तेजी से संवहन परिवर्तन प्रदर्शित करते हैं। तकनीक की एक सीमा शुद्ध न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन की आवश्यकता है, जिसने विशेष रूप से प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इसके व्यापक विस्तार को हतोत्साहित किया है। इन विट्रो प्रोटीन अभिव्यक्ति और संयुग्मन प्रौद्योगिकियों की प्रगति कम अध्ययन किए गए प्रोटीन तक पहुंच प्रदान करना जारी रखेगी। एक संबंधित मुद्दा यह है कि लक्ष्य संरचना पर प्राथमिक ज्ञान अक्सर डिजाइन प्रयोगों (जैसे, हैंडल का लगाव) के लिए महत्वपूर्ण होता है। हम उम्मीद करते हैं कि एकल-कण क्रायो-ईएम52 और अल्फाफोल्ड 253 का आगमन एकल प्रोटीन अणुओं पर यांत्रिक माप के डिजाइन और विश्लेषण का दृढ़ता से समर्थन करेगा और उच्च-रिज़ॉल्यूशन एमटी के अधिक शक्तिशाली अनुप्रयोगों को उजागर करेगा।

डीएनए हेयरपिन का अनज़िपिंग बल अनुक्रम, संरचना और बफर संरचना सहित कई कारकों पर निर्भर करता है, लेकिन स्टेम लंबाई और गुआनिन-साइटोसिन (जीसी) सामग्री20 पर सबसे गंभीर रूप से। हाई-स्पीड ट्रैकिंग की शक्ति का प्रदर्शन करने के लिए, हमने जानबूझकर एक 8 बीपी स्टेम (तीन जीसी बेस जोड़े के साथ) तैयार किया जो तेज गतिशीलता के साथ कम बल पर सामने आने की उम्मीद थी। दरअसल, चित्रा 5 के परिणाम बताते हैं कि इस तरह की तेज गतिशीलता को 10 एमएस रिज़ॉल्यूशन या उससे कम की विशेषता वाली मानक तकनीकों के साथ हल करना मुश्किल होगा। इस पहलू की पुष्टि एचएमएम विश्लेषण से मापी गई संक्रमण दरों द्वारा की जाती है, जिसकी उच्च दर 100 और 200 एस -1 (चित्रा 5 जे) के बीच थी।

न्यूरोनल एसएनएआरई को सिनैप्टिक पुटिका एक्सोसाइटोसिस को चलाने के लिए माना जाता है। विशेष रूप से, एसएनएआरई प्रोटीन संबंधित ऊर्जा बाधा को कम करके झिल्ली संलयन को उत्प्रेरित करते हैं, जैसे पुटिका और प्लाज्मा झिल्ली के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण। तदनुसार, एसएनएआरई परिसरों के विरूपण उतार-चढ़ाव 12-15 pN की संकीर्ण बल सीमा में पाए जाते हैं, जो प्रतिकारक बलों के अपेक्षित स्तर14,23 से मेल खाता है। यहां वर्णित उच्च गति वाले एमटी का उपयोग करते हुए, हमने न्यूरोनल एसएनएआरई परिसरों के बल-निर्भर व्यवहार पर प्रमुख निष्कर्षों को दोहराया। अनज़िपिंग और रीज़िपिंग में बल हिस्टैरिसीस (चित्रा 6 बी) इंगित करता है कि रीज़िपिंग अनज़िपिंग की तुलना में कम बल पर होता है, और इसलिए इस चक्र के दौरान काम किया जाता है। इस तरह के गैर-संतुलन संक्रमणों को बल-कूद प्रयोगों द्वारा बेहतर तरीके से संपर्क किया जाता है, जिसमें लोड के तहत संक्रमण करने की विलंबता (बॉन्ड टूटने की घटना के समान) या अनज़िपिंग से पहले विरूपण उतार-चढ़ाव को मापा जा सकता है। दोनों मामलों को उच्च गति सेटअप से लाभ होता है, जैसा कि बायोमोलेक्यूल्स और उनके परिसरों 15,17,54,55,56 की क्षणिक अवस्थाओं पर हाल के अध्ययनों से पता चलता है।

सामूहिक रूप से, ये परिणाम पारंपरिक एकल-अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ रिपोर्ट किए गए डीएनए हेयरपिन और न्यूरोनल एसएनएआरई कॉम्प्लेक्स के विशिष्ट बल-निर्भर परिवर्तनों से सहमत हैं। इसके साथ ही, वे बायोमोलेक्यूल्स और उनकी विधानसभाओं की बल संवेदनशीलता को प्रकट करने के लिए उच्च-सटीक यांत्रिक माप की उपयोगिता को रेखांकित करते हैं। हमें उम्मीद है कि यह लेख मेकेनोबायोलॉजी के क्षेत्र से अधिक लोगों को आकर्षित कर सकता है, शोधकर्ताओं को उनकी अनूठी प्रणालियों की जांच में उच्च गति वाले एमटी को नियोजित करने के लिए प्रेरित करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को कोरियाई सरकार (एमएसआईटी) (एनआरएफ -2022 आर 1 सी 1 सी 1012176, एनआरएफ -2021 आर 1 ए 4 ए 1031754, और एनआरएफ - 2021 आर 1 ए 6 ए 1 ए 10042944) द्वारा वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। एस-एचआर को एनआरएफ अनुदान (2021 आर 1 सी 1 सी 2009717) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for construct synthesis
Agarose gel electrophoresis system Advance Mupid-2plus
DNA ladder Bioneer D-1037
nTaq polymerase Enzynomics P050A
PCR purification kit LaboPass CMR0112
PEGylated SMCC crosslinker / SM(PEG)2 ThermoFisher Scientific 22102 For SNARE–DNA coupling
Primer B Bioneer 5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For 5-kbp force calibration construct and DNA handles
Primer B_hp IDT 5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT
TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'		 For hairpin construct
Primer N Bioneer 5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3' For DNA handles
Primer Z Bioneer 5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For DNA handles
Primer Z_5k Bioneer 5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA
TCG-3'		 For 5-kbp force calibration construct
Primer Z_hp Bioneer 5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3' For hairpin construct
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher Scientific S33102
λ-DNA Bioneer D-2510 Template strand for PCR
DNA sequences for SNARE proteins
6×His-tagged SNAP-25b (2-206; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
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6×His-tagged VAMP2 (2-97, L32C/I97C; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
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GAAGAGAGTAAAGATGCTGG
CATCAGGACTTTGGTTATGTT
GGATGAGCAAGGCGAACAAC
TGGAACGCATTGAGGAAGGG
ATGGACCAAATCAATAAGGAC
ATGAAAGAAGCAGAAAAGAAT
TTGACGGACCTAGGAAAATTC
GCCGGCCTTGCCGTGGCCCC
CGCCAACAAGCTTAAATCCAG
TGATGCTTACAAAAAAGCCTG
GGGCAATAATCAGGATGGAGT
AGTGGCCAGCCAGCCTGCCC
GTGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTGGC
TTCATCCGCAGGGTAACAAAT
GATGCCCGGGAAAATGAGATG
GATGAGAACCTGGAGCAGGT
GAGCGGCATCATCGGAAACCT
CCGCCACATGGCTCTAGACAT
GGGCAATGAGATTGACACCCA
GAATCGCCAGATCGACAGGAT
CATGGAGAAGGCTGATTCCAA
CAAAACCAGAATTGATGAAGC
CAACCAACGTGCAACAAAGAT
GCTGGGAAGTGGTTAA
ctcgagcaccaccaccaccaccactgag
atccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgagc
aataactagcataaccccttggggcctc
taaacgggtcttgaggggttttttgctgaa
aggaggaactatatccggat
Materials for protein purificaiton
2-Mercaptoethanol SIGMA M3148-25ML
Agar LPS Solution AGA500
Ampicillin, Sodium salt PLS AC1043-005-00
Chloramphenicol PLS CR1023-050-00
Competent cells (E. coli) Novagen 70956 Rosetta(DE3)pLysS
Glycerol SIGMA G5516-500ML
HEPES SIGMA H4034-100G
Hydrochloric acid / HCl SIGMA 320331-500ML
Imidazole SIGMA I2399-100G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside / IPTG SIGMA 10724815001
Kanamycin Sulfate PLS KC1001-005-02
Luria-Bertani (LB) Broth LPS Solution LB-05
Ni-NTA resin Qiagen 30210
PD MiniTrap G-25 (desalting column) Cytiva GE28-9180-07 For instructions, see: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174
Phenylmethylsulfonyl fluoride / PMSF ThermoFisher Scientific 36978
Plasmids for SNARE proteins cloned in house N/A Available upon request
Protease inhibitor cocktail genDEPOT P3100
Sodium chloride SIGMA S5886-500G
Sodium phosphate dibasic / Na2HPO4 SIGMA S7907-100G
Sodium phosphate monobasic / NaH2PO4 SIGMA S3139-250G
Tris(2-carboxyethyl)phosphine / TCEP SIGMA C4706-2G
Trizma base SIGMA T1503-250G
Materials for sample assembly
Biotin-PEG-SVA LAYSAN BIO BIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1g For PEGylation
Dibenzocyclooctyne-amine / DBCO-NH2 SIGMA 761540-10MG For bead coating
Double-sided tape 3M 136 For flow cell assembly
Epoxy glue DEVCON S-208 For flow cell assembly
Glass coverslip for bottom surface VWR 48393-251 Rectangular, 60×24 mm, #1.5
Glass coverslip for top surface VWR 48393-241 Rectangular, 50×24 mm, #1.5
Magnetic bead ThermoFisher Scientific 14301 Dynabeads M-270 Epoxy, 2.8 μm
mPEG-SVA LAYSAN BIO mPEG-SVA 1g For PEGylation
N,N-Dimethylformamide / DMF SIGMA D4551-250ML For bead coating
N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine SIGMA 104884-100ML For PEGylation
Neutravidin ThermoFisher Scientific 31000 For sample tethering
Phosphate buffered saline / PBS, pH 7.2 PLS PR2007-100-00
Plastic syringe Norm-ject A5 5 ml, luer tip
Polyethylene Tubing SCI BB31695-PE/4 PE-60
Reference bead SPHEROTECH SVP-30-5 Streptavidin-coated Polystyrene Particles; 3.0-3.4 µm
Syringe needle Kovax 21G-1 1/4'' 21 G
Syringe pump KD SCIENTIFIC 788210
Equipment for magnetic tweezer instrument
1-axis motorized microtranslation stage PI M-126.PD1 For vertical positioning of magnets
2-axis manual translation stage ST1 LEE400 For alignment of magnets to the optical axis
Acrylic holder for magnets DaiKwang Precision custum order Drawing available upon request
Frame grabber Active Silicon AS-FBD-4XCXP6-2PE8
High-speed CMOS camera Mikrotron EoSens 3CXP
Inverted microscope Olympus IX73P2F-1-2
Neodymium magnets LG magnet ND 10x10x12t Dimension: 10 mm × 10 mm × 12 mm; two needed
Objective lens Olympus UPLXAPO100XO Oil-immersion, NA 1.45
Objective lens nanopositioner Mad City Labs Nano-F100S
Rotation stepper motor AUTONICS A3K-S545W For rotating magnets
Superluminescent diode QPHOTONICS QSDM-680-2 680 nm
Software
LabVIEW National Instruments v20.0f1
MATLAB MathWorks v2021a

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References

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