Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzette für nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Elementen

Summary

Hier beschreiben wir eine magnetische Hochgeschwindigkeitspinzette, die nanomechanische Messungen an kraftsensitiven Biomolekülen mit einer maximalen Rate von 1,2 kHz durchführt. Wir stellen seine Anwendung auf DNA-Haarnadeln und SNARE-Komplexe als Modellsysteme vor, aber es wird auch auf andere Moleküle anwendbar sein, die an mechanobiologischen Ereignissen beteiligt sind.

Abstract

Einzelmolekül-Magnetpinzetten (MTs) haben sich als leistungsstarke Werkzeuge zur gewaltsamen Abfrage von Biomolekülen wie Nukleinsäuren und Proteinen erwiesen und sind daher bereit, auf dem Gebiet der Mechanobiologie nützlich zu sein. Da die Methode in der Regel auf bildbasiertem Tracking von magnetischen Beads beruht, haben die Geschwindigkeitsbegrenzung bei der Aufnahme und Analyse von Bildern sowie die thermischen Fluktuationen der Beads ihre Anwendung bei der Beobachtung kleiner und schneller struktureller Veränderungen in Zielmolekülen lange Zeit behindert. Dieser Artikel beschreibt detaillierte Methoden für den Aufbau und Betrieb eines hochauflösenden MT-Aufbaus, der die nanoskalige Millisekundendynamik von Biomolekülen und ihren Komplexen auflösen kann. Als Anwendungsbeispiele werden Experimente mit DNA-Haarnadeln und SNARE-Komplexen (Membranfusionsmaschinerie) demonstriert, wobei der Schwerpunkt darauf liegt, wie deren transiente Zustände und Übergänge in Gegenwart von Kräften auf der Piconewton-Skala detektiert werden können. Wir gehen davon aus, dass Hochgeschwindigkeits-MTs weiterhin hochpräzise nanomechanische Messungen an Molekülen ermöglichen werden, die Kräfte in Zellen wahrnehmen, übertragen und erzeugen, und damit unser Verständnis der Mechanobiologie auf molekularer Ebene vertiefen werden.

Introduction

Zellen nehmen mechanische Reize aktiv wahr und reagieren darauf. Dabei weisen viele Biomoleküle kraftabhängige Eigenschaften auf, die dynamische Strukturveränderungen ermöglichen. Bekannte Beispiele sind mechanosensitive Ionenkanäle und Zytoskelettelemente, die den Zellen wichtige mechanische Informationen aus ihrer Umgebung liefern.

Darüber hinaus können Moleküle, die eine einzigartige krafttragende Natur aufweisen, auch als mechanosensitiv im weiteren Sinne angesehen werden. Zum Beispiel spielen die lokale Bildung und das Schmelzen von Nukleinsäure-Duplexen sowie Strukturen höherer Ordnung wie G-Quadruplexe eine entscheidende Rolle bei der Replikation, Transkription, Rekombination und neuerdings auch bei der Genom-Editierung. Darüber hinaus erfüllen einige neuronale Proteine, die an der synaptischen Kommunikation beteiligt sind, ihre Funktionen, indem sie physikalische Kräfte erzeugen, die über das Niveau typischer intermolekularer Interaktionen hinausgehen. Unabhängig davon, welches Beispiel man untersucht, wird sich die Untersuchung der Nanomechanik der beteiligten Biomoleküle mit hoher raumzeitlicher Präzision als äußerst nützlich erweisen, um molekulare Mechanismen der damit verbundenen mechanobiologischen Prozesse aufzudecken ^1,2,3.

Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Methoden haben sich als leistungsstarke Werkzeuge erwiesen, um die mechanischen Eigenschaften der Biomoleküle 2,4,5,6 zu untersuchen. Sie können strukturelle Veränderungen in Nukleinsäuren und Proteinen gleichzeitig mit Krafteinwirkung beobachten und so kraftabhängige Eigenschaften untersuchen. Zwei bekannte Aufbauten sind optische Pinzetten und magnetische Pinzetten (MTs), die mikrometergroße Kügelchen verwenden, um die Moleküle 5,6,7,8 zu manipulieren. In diesen Plattformen werden Polystyrol (für optische Pinzetten) oder magnetische Kügelchen (für MTs) über molekulare "Griffe", die typischerweise aus kurzen Fragmenten doppelsträngiger DNA (dsDNA) bestehen, an Zielmoleküle (z. B. Nukleinsäuren und Proteine) gebunden. Die Kügelchen werden dann bewegt, um Kraft auszuüben, und abgebildet, um ihre Positionen zu verfolgen, die über strukturelle Veränderungen in den Zielmolekülen berichten. Optische und magnetische Pinzetten sind in ihren Anwendungen weitgehend austauschbar, aber es gibt wichtige Unterschiede in ihren Ansätzen zur Kraftkontrolle. Optische Pinzetten sind intrinsische Positionsklemminstrumente, die Perlen in Position halten, wodurch die aufgebrachte Kraft schwankt, wenn sich die Form eines Zielkonstrukts ändert. Eine Verlängerungserhöhung, z. B. durch Entfaltung, lockert das Seil und verringert die Spannung und umgekehrt. Obwohl aktives Feedback implementiert werden kann, um die Kraft in optischen Pinzetten zu steuern, arbeiten MTs im Gegensatz dazu natürlich als Kraftklemmvorrichtung und nutzen die stabilen Fernfeld-Magnetkräfte von Permanentmagneten, die auch Umgebungsstörungen standhalten können.

Trotz ihrer langen Geschichte und ihres einfachen Designs sind MTs bei ihren Anwendungen für hochpräzise Messungen hinter optischen Pinzetten zurückgeblieben, was vor allem auf die technischen Herausforderungen bei der schnellen Perlenverfolgung zurückzuführen ist. In jüngster Zeit haben jedoch mehrere Gruppen gemeinsam eine vielschichtige Verbesserung sowohl der Hard- als auch der Software für MT-Instrumente 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 durchgeführt . In dieser Arbeit stellen wir ein Beispiel für einen solchen Aufbau vor, der bei 1,2 kHz läuft, und beschreiben, wie man damit nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Biomolekülen durchführen kann. Als Modellsysteme verwenden wir DNA-Haarnadeln und neuronale SNARE-Komplexe und untersuchen deren schnelle, strukturelle Veränderungen im Piconewton-Regime. DNA-Haarnadeln weisen einfache Zwei-Zustands-Übergänge in einem genau definierten Kraftbereich^20,21 auf und dienen daher als Spielzeugmodelle^, um die Leistung eines Pinzettenaufbaus zu überprüfen. Da sich die SNARE-Proteine zu einem kraftsensitiven Komplex zusammenfügen, der die Membranfusion^{antreibt 22}, wurden sie auch ausgiebig mittels Einzelmolekül-Kraftspektroskopie untersucht 14,23,24,25. Es werden Standardansätze zur Analyse von Daten und zur Extraktion nützlicher Informationen über Thermodynamik und Kinetik vorgestellt. Wir hoffen, dass dieser Artikel die Einführung hochpräziser MTs in mechanobiologischen Studien erleichtern und die Leser motivieren kann, ihre eigenen kraftsensitiven Systeme zu erforschen.

Protocol

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Materialien und Ausrüstungen sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die LabVIEW-Software für den Betrieb des unten beschriebenen Hochgeschwindigkeits-MT-Setups sowie die MATLAB-Skripte zur Analyse von Beispieldaten sind auf GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) hinterlegt und öffentlich verfügbar.

1. Apparatebau

HINWEIS: Das allgemeine Prinzip der Hochgeschwindigkeits-MT-Konstruktion ähnelt den herkömmlichen Standard-MT-Systemen, mit Ausnahme der Verwendung einer Hochgeschwindigkeits-CMOS-Kamera (Complementary Metal Oxide Semiconductor) und einer kohärenten Hochleistungslichtquelle (Abbildung 1). Weitere Beschreibungen der Standard-MT-Instrumente 5,26,27 finden Sie in anderen Quellen.

1. Stellen Sie ein inverses Mikroskop auf einem schwingungsdämpfenden optischen Tisch auf. Installieren Sie eine Hochgeschwindigkeits-CMOS-Kamera und einen Framegrabber.
2. Erstellen Sie einen Translationstisch für die Manipulation von Magneten in 3D. Montieren Sie einen motorisierten Lineartisch (>20 mm Verfahrweg) vertikal auf einem manuellen XY-Tisch.
   Anmerkungen: Die vertikale Bewegung steuert die Kraft, während der XY-Tisch für die manuelle Ausrichtung der Magnete auf die optische Achse für die anfängliche Konstruktion des Aufbaus vorgesehen ist.
3. Installieren Sie einen rotierenden Schrittmotor und ein Riemen- und Flaschenzugsystem für rotierende Magnete.
   Anmerkungen: Der Riemen überträgt die Drehbewegung zwischen der Motorwelle und den Magneten, die einige Zentimeter voneinander entfernt sind. Die Rotation von Magneten ist Teil der Translationsmanipulation.
4. Montieren Sie die Magnete. Verwenden Sie einen Acrylhalter (der bei einem Hersteller bestellt wurde; siehe ergänzende Abbildung S1), der zwei identische Magnete parallel mit einem genau definierten Abstand von 1 mm zwischen den Magneten fest aufnehmen kann (Abbildung 1B). Um die maximale Kraft zu nutzen, die mit einem bestimmten Magnetpaar erreicht werden kann, stellen Sie die vertikale Position des Translationstages so ein, dass die Unterseite der Magnete mit der Probenebene ausgerichtet ist, wenn sie in die niedrigste Position bewegt wird.
   ANMERKUNG: Siehe Lipfert et al. für weitere Informationen über das Halterdesign und die Konfiguration der Magnete²⁸. Die Höhe und Ausrichtung von Magneten wird von der LabVIEW-Software in Verbindung mit der Datenerfassung gesteuert.
5. Wenn Sie mit einer Objektivlinse mit geringer Vergrößerung betrachten, richten Sie die Magnete in der Mitte des Sichtfelds aus. Stellen Sie sicher, dass das Drehen der Magnete nicht zu einer großen Verschiebung der Mitte des Magnetpaares führt.
   Anmerkungen: Wenn sich der Mittelpunkt zwischen den Magneten um die Drehachse dreht, ist es wahrscheinlich, dass die Magnete aufgrund eines unvollkommenen Halters nicht zentriert sind. Eine geringe Fehlausrichtung im Verhältnis zur Spaltgröße ist tolerierbar, da die Magnetdrehung nur zur Überprüfung der Halteseile und zum Aufbringen von Drehmomenten in bestimmten Anwendungen dient.
6. Installieren Sie eine Superlumineszenzdiode (SLD) für die Beleuchtung von Perlen. Führen Sie den Strahl durch den 1 mm großen Spalt zwischen den beiden Magneten. Stellen Sie sicher, dass der Strahl richtig kollimiert ist, um in den Spalt zu passen, und die Beleuchtung nicht von den Magneten abgeschattet wird.
7. Installieren Sie einen Piezo-Linsenscanner am Objektivrevolver und montieren Sie ein 100-faches Ölimmersionsobjektiv (numerische Apertur [NA]: 1,45) für die Perlenverfolgung. Um mögliche Artefakte in den Tracking-Ergebnissen zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Beleuchtung gleichmäßig beibehalten wird, wenn die Magnete bewegt werden. Stellen Sie abschließend die Lichtstärke auf die maximale Helligkeit ein, ohne Pixel zu sättigen.
   HINWEIS: Für den Vergleich verschiedener Lichtquellen für die Hochgeschwindigkeitsverfolgung von Perlen siehe Dulin et ^al.29.

2. Kalibrierung der Magnetkraft

1. Mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR; siehe Tabelle 1) werden 5 kbp dsDNA-Fragmente (unter Verwendung von Primer B, Primer Z_5k und λ-DNA) hergestellt, die an einem Ende mit Biotin (für die Oberflächenanhaftung) und am anderen Ende mit Azid (für die Bead-Anhaftung) markiert sind.
2. Bereiten Sie gemäß Abschnitt 6 eine Durchflusszelle mit den 5 kbp-Molekülen vor.
3. Identifizieren Sie gemäß Abschnitt 7 ein gutes Bead-Tether-Konstrukt, indem Sie seine Ausdehnung und Drehung überprüfen. Achten Sie insbesondere darauf, eine Wulst mit einer minimalen Rotationsbahn (d. h. mit einem Radius <200 nm) zu wählen, um den Wulsthöhenversatz aufgrund der dezentrierten Befestigung^30,31 zu minimieren. Sobald ein guter Haltegurt identifiziert ist, beginnen Sie mit der Perlenverfolgung gemäß Abschnitt 9.
4. Wenn der Aufbau neu ist, charakterisieren Sie sein Rauschen und seine Stabilität für zuverlässige hochauflösende Messungen. Platzieren Sie den Magneten ~3 mm von der Oberfläche der Durchflusszelle entfernt (um >10 pN aufzubringen und die Brownsche Bewegung einer Perle zu unterdrücken), verfolgen Sie die z-Position der Perle bei 1,2 kHz und berechnen Sie die Allan-Abweichung (AD) von der z-Koordinaten-Zeitreihe^32,33 (Abbildung 2C). Prüfen Sie, ob AD-Werte von wenigen Nanometern im Hochgeschwindigkeitsbereich (<0,1 s) erreichbar sind und dass die differentielle Nachführung (magnetische Perlenposition relativ zu einer Referenzperle) die AD auf der längeren Zeitskala reduziert.
   HINWEIS: Wir erhalten in der Regel einen AD von <3 nm bei maximaler Rate (1,2 kHz oder 0,83 ms Auflösung), und der AD nimmt mindestens bis zu 10 s ab, was eine minimale Drift impliziert. Andere haben ähnliche Werte bei ähnlichen Setups berichtet 9,10,11,12,34.
5. Wenn sich die Magnete in der Ruheposition (F ~ 0 pN) befinden, zeichnen Sie die x- und y-Koordinaten der angebundenen Perle bei 1,2 kHz auf. Zeichnen Sie die Position für einen ausreichend langen Zeitraum auf (d. h. ausreichend länger als die charakteristische Relaxationszeit der Fluktuation³⁵), damit die Brownsche Bewegung ausreichend abgetastet wird.
   HINWEIS: Hier verläuft die x-Richtung entlang der Richtung des Magnetfelds, während die Bewegung in y die transversale Bewegung senkrecht zum Feld darstellt.
6. Bewegen Sie die Magnete näher an die Durchflusszelle heran und wiederholen Sie die Messungen der Perlenposition, bis die Magnete sanft die Oberseite der Durchflusszelle berühren. Bewegen Sie sich in großen Schritten (z. B. 1-2 mm), wenn die Magnete mehr als 7 mm von der Probenebene entfernt sind (da die aufgebrachte Kraft im Fernfeld der Magnete langsam zunimmt), aber reduzieren Sie die Schrittweite allmählich (z. B. 0,1-0,5 mm), wenn sie sich nähern, um eine feinere Kalibrierung bei höheren Kraftniveaus zu erzielen (Abbildung 2B).
7. Berechnen Sie die Kraft an jeder Magnetposition d mit einer der beiden alternativen Methoden (ein MATLAB-Skript "force calibration.m" mit beiden Methoden wird bereitgestellt; siehe Ergänzungsdatei 1).
   1. Messen Sie die Varianz der y-Koordinaten der Perle (Abbildung 2D) und die mittlere z-Position der Perle relativ zur niedrigsten Position (Abbildung 2B, unten). Verwenden Sie dann Gleichung (1)7,27,36, um die Kraft abzuschätzen (mit einem festen Wulstradius R = 1.400 nm und thermischer Energie k_RT = ^4,11 pN∙nm):
      (1)
   2. Alternativ können Sie die spektrale Leistungsdichte (PSD) der y-Koordinaten S_y berechnen (Abbildung 2E). Bestimmen Sie die aufgebrachte Kraft F, indem Sie ein Doppel-Lorentz-Modell³⁷ mit Gleichung (2) an das gemessene S_y anpassen.
      (2)
      Hier ist , R der Wulstradius, γ_yund _{γ φ} sind die Translations- bzw. Rotationswiderstandsbeiwerte (geschätzt aus der Stokes-Einstein-Gleichung), k_RT ist die thermische Energie, f₊ und f_- sind zwei charakteristische Frequenzen, die mit Gleichung (3) erhalten werden.
      (3)
      HINWEIS: Da die Halteverlängerung L eine Funktion der Kraft ist, die dem etablierten WLC-Modell (Worm-like Chain) folgt, lassen die obigen Ausdrücke F als einzigen Anpassungsparameter übrig (wir legen der Einfachheit halber fest, dass R 1.400 nm beträgt, da er über alle Kraftstufen hinweg geteilt wird und der genaue Wert die Ergebnisse nicht nennenswert beeinflusst). Bei Bedarf müssen Bewegungsunschärfe und Aliasing aus der kamerabasierten Bildaufnahme berücksichtigt werden^38,39, aber dieser Effekt ist bei unseren Hochgeschwindigkeitsmessungen über 1 kHz mit 5 kbp Tethers vernachlässigbar.
8. Wiederholen Sie die Schritte 2.4-2.7 für einige weitere Konstrukte. Untersuchen Sie drei bis fünf verschiedene Perlen, um die Kraftvariabilität zwischen den magnetischen Perlen zu ermitteln.
   HINWEIS: Die Kraftvariation zwischen den verwendeten magnetischen Perlen sollte berücksichtigt werden, um die richtige Anzahl von Konstrukten für die Mittelwertbildung zu bestimmen. Diese Variabilität ist gering, kann aber selbst bei handelsüblichen Produkten zu einem Fehler von mehr als 1 pN in der gemessenen Kraft führen³¹. Für die meisten Anwendungen, bei denen die absolute Bestimmung der beteiligten Kräfte nicht entscheidend ist, ist die Mittelung der Kalibrierergebnisse von drei bis fünf Perlen in der Regel ausreichend. Ein alternativer Ansatz, um diese Variation zu berücksichtigen, besteht darin, die Kraft zu Beginn des Experiments mit einzelnen Seilen zu messen, was zeitaufwändig sein kann. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, Haarnadelstrukturen einzubetten, die sich bei bekannten Kraftniveaus in jedem Konstrukt³¹ entpacken.
9. Zeichnen Sie die gemessene Kraft als Funktion des Magnetabstands auf und passen Sie mit Gleichung (4) eine doppelte Exponentialfunktion an die Daten an (Abbildung 2F).
   (4)
   Hier sind F₀ (Basislinie), A 1 und A 2 (Amplituden) sowie d ₁ und d₂ (Zerfallskonstanten) Anpassungsparameter. Stellen Sie sicher, dass die Kraftwerte aus den beiden Methoden sowie die resultierenden doppelt-exponentiellen Anpassungen weitgehend übereinstimmen (Abbildung 2F,G).
   HINWEIS: Um zu bestätigen, dass die Kraftkalibrierung ordnungsgemäß durchgeführt wird, überprüfen Sie die Kraft-Dehnungs-Beziehung der untersuchten Konstrukte, indem Sie die Ausdehnung im Vergleich zur gemessenen Kraft darstellen.
10. Um den Wulsthöhenversatz z off zu korrigieren, der sich aus dem kraftabhängigen Verkippen der Magnetperlen^30,31 ergibt^, schätzen Sie z_vom seitlichen Versatz x_off unter Berücksichtigung der Geometrie eines außermittigen Seils mit einem Wulstradius unter Verwendung von Gleichung (5) ab und wenden Sie die Werte auf die gemessenen Dehnungswerte an. Dieser Schritt ist im MATLAB-Skript "force calibration.m" (Zeilen 252-254) implementiert.
    (5)
    ANMERKUNG: Obwohl diese Korrektur kleine Änderungen an der Dehnung vornimmt, insbesondere bei den Perlen mit einem kleinen Rotationsradius (<200 nm), wirkt sich dieser Versatz oft kritisch auf die elastische Reaktion aus, wie in der Änderung von Abbildung 2H zu Abbildung 2I^30,31 zu sehen ist.
11. Überprüfen Sie die Persistenzlänge L_p, indem Sie ein erweiterbares WLC-Modell mit Gleichung (6) an die Daten anpassen.
    (6)
    Dabei ist L 0 die Konturlänge (1,7 μm für 5 kbp) und K₀ der Modul für die enthalpische Streckung.
    HINWEIS: Obwohl angenommen wird, dass das L p der dsDNA in einem typischen Puffer wie der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) 40-50 nm beträgt, unterschätzt die WLC-Formel, die auf kurze Moleküle (<5 kbp) angewendet wird, systematisch L _p, da L₀ um ^31,40 abnimmt. Dies liegt daran, dass das klassische WLC-Modell von einem Polymer ausgeht, dessen Kettenlänge ausreichend länger ist als seine Persistenzlänge. Hier erhielten wir L p = 40 ± 3 nm für das 5 kbp-Konstrukt (Abbildung 2H), und die Verlängerungskorrektur ergab weiterhin ein homogenes K₀ von 1.100 ± 200 _pN (Abbildung 2I). Die Anwendung eines endlichen WLC-Modells ^31,40 sowie einer Korrektur für Nicht-Gaußianität in der Erweiterungsverteilung ⁴¹ führt zu einer leichten Erhöhung von L_p.
12. Sobald die Kraftkalibrierung verifiziert ist, wenden Sie die erhaltenen Anpassungsparameter des Doppelexponentialmodells auf die mitgelieferte LabVIEW-Software (Supplemental File 2) an und warten Sie, bis die Software die aktuelle Kraft in Echtzeit aus den Motormesswerten (d. h. der Magnetposition) berechnet. Da kein analytischer Ausdruck für die Umkehrfunktion d(F) verfügbar ist, erstellen Sie eine Nachschlagetabelle von d versus F in 0,1 pN-Schritten durch numerische Schätzung von für die d Zielkraftniveaus. Speichern Sie diese Tabelle auch in der Software, um die Kraftsteuerung zu steuern.

3. Synthese von DNA-Haarnadeln

HINWEIS: DNA-Haarnadelkonstrukte für MT-Experimente werden durch PCR-Amplifikation einer 510 bp-Region in λ-DNA mit zwei kundenspezifischen Primern hergestellt, von denen einer eine Haarnadelstruktur an seinem 5′-Ende enthält (Abbildung 3A). Auf diese Weise wird ein Haarnadelmotiv an einem Ende des PCR-Produkts platziert.

1. Bereiten Sie die Grundierungen vor.
   1. Forward Primer: Primer B_hp, der für die Anhaftung an Glasoberflächen mit 5′-Biotin markiert ist und an λ-DNA bindet. Dieser Primer enthält ein Haarnadelmotiv mit einem 8-bp-Stiel und einer 6-n-Schlaufe, 5′ zur λ-Bindungsregion.
   2. Reverse-Primer: Primer Z_hp, der für die magnetische Bead-Befestigung mit 5′-Azid markiert ist und 1 kbp vom Vorwärts-Primer entfernt an λ-DNA bindet.
2. Richten Sie die PCR mit λ-DNA (Vorlage), nTaq-Polymerase und Standard-PCR-Bedingungen ein und führen Sie sie durch (siehe Tabelle 1). Reinigen Sie das Produkt mit einem handelsüblichen Reinigungsset.
3. Messen Sie die DNA-Konzentration durch UV-Absorption bei 260 nm (A260) und führen Sie eine Agarose-Gelelektrophorese (2 % Gel) durch (siehe Tabelle 2), um die Produktgröße zu überprüfen. Eine typische Ausbeute beträgt ~35 μl einer ~600 nM Lösung.

4. Herstellung von SNARE-Proteinen

HINWEIS: Neuronale SNARE-Komplexe werden durch die Kombination von drei gereinigten Rattenproteinen zusammengesetzt, die aus E. coli exprimiert werden: VAMP2/Synaptobrevin-2, Syntaxin-1A und SNAP-25 (Abbildung 3B). Um ihre Assemblierung zu erleichtern, werden Syntaxin und SNAP-25 zusammen mit einem VAMP2-Fragment (ohne die N-terminale Region; als "ΔN-VAMP2" bezeichnet) zu einer Struktur namens "ΔN-Komplex" exprimiert und dann nach der Anheftung des DNA-Griffs mit VAMP2 in voller Länge gemischt, um vollständige Komplexe zu bilden.

1. Herstellung von cDNA-haltigen Plasmiden für die Expression von SNARE-Proteinen (DNA-Sequenzen für alle Plasmide sind in der Materialtabelle angegeben).
   1. Präparation von 6×His-markiertem VAMP2 ohne Transmembrandomäne (2-97; L32C/I97C für Disulfidbindungen), kloniert in einen pET28a-Vektor.
   2. Präparation von Syntaxin-1A ohne Habc und Transmembrandomäne (191-267, I202C/I266C-Substitutionen für Disulfidbindungen) zusammen mit 6×His-markiertem ΔN-VAMP2 (49-96) in einen pETDuet-1-Vektor.
   3. Bereiten Sie die SNAP-25-Isoform b (2-206, alle C bis A) in voller Länge vor, die in einen pET28a-Vektor kloniert wurde. Dies wird für die Herstellung von ΔN-Komplexen verwendet.
   4. Bereiten Sie die 6×His-markierte SNAP-25-Isoform b (1-206, alle C bis A) in voller Länge vor, die in einen pET28a-Vektor kloniert wurde, um sie direkt in den MT-Assay-Puffer zu geben, um die SNARE-Komplexe nach der Entfaltung wieder zusammenzusetzen.
2. Bereiten Sie zwei Röhrchen Rosetta (DE3) E. coli-Zellen vor. Transformation einer Gruppe mit VAMP2-Plasmiden (aus Schritt 4.1.1), eine Gruppe mit Syntaxin-1A/ΔN-VAMP2 und unmarkierten SNAP-25-Plasmiden (aus den Schritten 4.1.2 und 4.1.3) zur Expression des ΔN-Komplexes und die andere mit His-markierten SNAP-25-Plasmiden (aus Schritt 4.1.4).
3. Die transformierten Zellen werden mit geeigneten Antibiotika (hier Kanamycin und Chloramphenicol für VAMP2 und His-markiertes SNAP-25; Kanamycin, Chloramphenicol und Ampicillin für den ΔN-Komplex) in Luria-Bertani-Brühe (LB) überführt. Bauen Sie sie bei 37 °C in einem Schüttelbrutschrank (220 U/min) an, bis die optische Dichte (OD) der Brühe 0,7-0,9 erreicht.
4. Fügen Sie 1 mM Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) hinzu, um die Proteinexpression zu induzieren, und inkubieren Sie die Zellen für 3-4 h bei 37 °C in einem Schüttelinkubator (220 U/min).
5. Pelletieren Sie die Zellen, indem Sie die Kultur bei 4.500 × g für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugieren.
6. Bereiten Sie Puffer für die Proteinreinigung vor (siehe Tabelle 2).
7. SNARE-exprimierende Zellpellets werden in 40 ml eiskaltem Lysepuffer suspendiert und die Zellen durch Beschallung auf Eis lysiert (15 % Amplitude, 5 s an und 5 s aus, insgesamt 30 Minuten).
8. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 15.000 × g für 30 min bei 4 °C, um unlösliche Stoffe zu entfernen.
9. Führen Sie den Überstand durch eine Schwerkraftsäule, die mit 1 ml Ni-NTA-Harz gefüllt ist. Waschen Sie das Harz mit Waschpuffer A, dann mit Waschpuffer B und eluieren Sie die Proteine mit 10 ml Elutionspuffer.
10. Entfernen Sie Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) und Imidazol mit Hilfe einer Entsalzungssäule aus dem Eluenten (befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers). Elute die Probe mit PBS.
11. Konzentrieren Sie die Proteine mit Zentrifugalfiltern (10 kDa Cutoff) auf ~70 μM, während die Proteine in PBS erhalten bleiben (typischerweise 2 ml). Messen Sie die Proteinkonzentration entweder durch ultraviolette (UV) Absorption bei 280 nm (A280) oder mit dem Bradford-Assay.
12. Bereiten Sie kleine Aliquots vor, frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -80 °C.
    HINWEIS: Vollständige SNARE-Komplexe werden nach der Konjugation des ΔN-Komplexes an einem DNA-Griff (siehe unten) zusammengesetzt.

5. Befestigung von DNA-Griffen

HINWEIS: Zwei 510 bp dsDNA-Henkel, die an einem Ende primäre Amingruppen enthalten, werden zuerst durch PCR hergestellt, und die Amingruppen werden dann unter Verwendung eines bifunktionellen Vernetzers, SM(PEG)₂, in Maleimidgruppen umgewandelt. Die beiden Henkel werden dann über ihre Cysteingruppen kovalent mit SNARE-Komplexen verknüpft, um eine ortsspezifische Konjugation zu ermöglichen (Abbildung 3B).

1. Bereiten Sie Grundierungen vor.
   1. Vorbereiten von Vorwärts-Primern: Primer B (zur Amplifikation von Griff B), der für die Anhaftung an Glasoberflächen mit 5′-Biotin markiert ist und an λ-DNA bindet; Primer Z (zur Verstärkung von Griff Z), der für die magnetische Perlenbefestigung mit 5′-Azid markiert ist und die gleiche Reihenfolge wie Primer B hat.
   2. Bereiten Sie einen Reverse-Primer vor: Primer N (gemeinsam für Handle B und Handle Z), der für die Proteinkonjugation 5′-Amin-markiert ist und 510 bp vom Forward-Primer entfernt an λ-DNA bindet.
2. Richten Sie zwei Sätze von PCR-Reaktionen (18 Röhrchen mit 200 μl-Reaktion für jeden Griff) mit λ-DNA (Vorlage), nTaq-Polymerase und Standard-PCR-Bedingungen ein und führen Sie sie durch (siehe Tabelle 1). Reinigen Sie das Produkt mit einem PCR-Reinigungskit und eluieren Sie jeden Griff mit 45 μl Reinstwasser. Verwenden Sie eine minimale Menge Wasser, um hohe Konzentrationen von Griffen für eine effektive Reaktion in späteren Schritten zu erhalten.
3. Messen Sie die DNA-Konzentration mit A260. Die typische Ausbeute beträgt ~650 μl ~2 μM Lösung für jeden Griff. Halten Sie kleine Proben für eine spätere Überprüfung in der Agarose-Gelelektrophorese auseinander.
4. Reagieren Sie jeden Griff (1 μM in PBS) mit 5 mM SM(PEG₎₂. Bei Raumtemperatur mit sanfter Rotation inkubieren. Verwenden Sie nach 1 Stunde ein DNA-Aufreinigungskit, um nicht umgesetztes SM(PEG)₂ zu entfernen. Elute jeden Henkel mit 250 μL PBS, um ~2 μM Lösungen zu erhalten.
5. Die Lösungen von Handle B und ΔN-Komplex werden im molaren Verhältnis 1:16 (z. B. 1 μM Handle B und 16 μM ΔN-Komplex) in PBS gemischt und 2 h bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert. Bewahren Sie eine kleine Probe für die Agarose-Gelelektrophorese auf.
6. Fügen Sie eine Lösung von VAMP2 in einem 2,5-fachen molaren Überschuss über den im vorherigen Schritt verwendeten ΔN-Komplex hinzu. Die Mischung weitere 1 h bei Raumtemperatur unter Rühren inkubieren. In diesem Schritt werden vollständige SNARE-Komplexe zusammengesetzt.
7. Freie Proteine durch Pufferaustausch mit frischem PBS und einem Zentrifugalfilter (100 kDa Cutoff) entfernen: 5 min bei 4 °C bei 14.000 × g zentrifugieren, mindestens 6x wiederholen und 15 min für den letzten Schleudergang laufen lassen. Messen Sie den Anstieg des A260/A280-Verhältnisses, um die Entfernung freier Proteine zu überwachen. Bewahren Sie eine kleine Probe für die Agarose-Gelelektrophorese auf.
8. Geben Sie Griff Z in einem 15-fachen molaren Überschuss über Griff B in die Lösung. Halten Sie die Konzentration von Griff Z mindestens über 1 μM, um die Reaktion zu erleichtern. Die Mischung über Nacht bei 4 °C unter Rühren inkubieren.
9. Verifizieren Sie die Zwischenprodukte (Griff B und seine Proteinkonjugate) und das Endprodukt (SNARE-Komplex mit zwei Griffen) durch Agarose-Gelelektrophorese (Abbildung 3B, Ausschnitt) (siehe Tabelle 2).
   HINWEIS: Wenn die Proteine erfolgreich an Griff B angeheftet werden, wird eine Mobilitätsverschiebung festgestellt. Insbesondere kann die Bildung von vollständigen SNARE-Komplexen auf DNA-Griffen durch ihre Resistenz gegen Natriumdodecylsulfat (SDS) bestätigt werden, im Gegensatz zu ΔN-Komplexen, die in SDS zerlegt werden und nur Syntaxin an die DNA gebunden lassen (vgl. b und c in Abbildung 3B).
10. Bereiten Sie kleine Aliquots vor, frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -80 °C.
    HINWEIS: Obwohl die endgültige Lösung nicht umgesetzte Griffe enthält, wird bei der Probenassemblierung in einer Durchflusszelle nur das gewünschte Konstrukt ausgewählt, das doppelt mit Biotin und Azid markiert ist.

6. Herstellung von Durchflusszellen

HINWEIS: Durchflusszellen für MT-Messungen bestehen aus zwei Glasdeckgläsern, die mit doppelseitigem Klebeband miteinander verbunden sind (Abbildung 3C). Ein Deckglas wird mit einer Mischung aus PEG und biotinyliertem Polyethylenglykol (PEG) beschichtet, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden und eine spezifische Anbindung der Zielmoleküle über eine Biotin-NeutrAvidin-Bindung zu ermöglichen (Abbildung 3D). Anschließend werden die Materiallösungen für MT-Experimente mit Hilfe einer Spritzenpumpe sequenziell in eine Durchflusszelle infundiert (Abbildung 3C,D).

1. Bereiten Sie zwei Glasdeckgläser vor, je eines für die Oberseite (24 mm × 50 mm, Stärke Nr. 1,5) und die Unterseite (24 mm × 60 mm, Dicke Nr. 1,5). Reinigen Sie die Deckgläser durch Beschallung in 1 M KOH für 30 Minuten. Spülen Sie die Deckgläser nach der Beschallung mit destilliertem Wasser ab und bewahren Sie sie bis zum nächsten Schritt in Wasser auf.
2. PEGylieren Sie das untere Deckglas gemäß den veröffentlichten Protokollen^42,43. Verwenden Sie N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylendiamin zur Silanisierung und ein 1:100 (ww) Gemisch aus Biotin-PEG-SVA und mPEG-SVA in 100 mM Bicarbonatpuffer. Halten Sie die PEGylated-Deckgläser bei -20 °C trocken und lagern Sie sie einige Wochen.
3. Nehmen Sie am Tag der Experimente die PEGylated-Deckgläser heraus und föhnen Sie sie mit einer Stickstoffpistole. Untersuchen Sie sie visuell auf Schmutz, um sicherzustellen, dass sie sauber sind.
4. Um die Probenkanäle herzustellen, bereiten Sie ~2 mm breite Streifen doppelseitiges Klebeband vor und legen Sie vier Streifen auf ein unteres Deckglas (PEGylierte Oberfläche nach oben), parallel zueinander und durch ~5 mm voneinander getrennt (Abbildung 3C).
   HINWEIS: Auf diese Weise können drei 5 mm breite Probenkanäle in einer einzigen Durchflusszelle erstellt werden.
5. Platzieren Sie ein oberes Deckglas in der Mitte des unteren Deckglases und lassen Sie an den kurzen Kanten ~5 mm Platz für Kanalein- und -auslässe. Drücken Sie vorsichtig mit einer Pinzette auf die Rückseite des oberen Deckglases, um die Kanäle fest zu verschließen.
6. Um ein Einlassreservoir herzustellen, schneiden Sie den Rand einer 200-μl-Pipettenspitze ab. Schneiden Sie ~10 mm aus der breiteren Öffnung aus, um ~200 μl Lösung aufnehmen zu können. Machen Sie drei davon für die drei Strömungskanäle. Um die Auslässe zu konfigurieren, bereiten Sie drei Spritzennadeln vor, die in den Schlauch für die Spritzenpumpe passen.
7. Kleben Sie die Behälter und Nadelnaben mit 5 Minuten Epoxidharz auf die Durchflusszelle. Stellen Sie sicher, dass eine vollständige Abdichtung gebildet ist, um Leckagen zu vermeiden, und dass die Kanäle nicht mit überschüssigem Klebstoff blockiert werden. Mindestens 30 Minuten trocknen lassen.

7. Montage von Bead-Tether-Konstruktionen

HINWEIS: Die Materiallösungen für MT-Experimente, einschließlich der Lösungen für Bead-Tether-Konstrukte, werden nacheinander mit Hilfe einer Spritzenpumpe in Durchflusszellen eingebracht (Abbildung 3C,D).

1. Bereiten Sie magnetische Perlen vor. Nehmen Sie 5 mg M270-Epoxidkügelchen aus einer Stammlösung (~3,3 × 10 8 Kügelchen in 167,5 μl Dimethylformamid) und ersetzen Sie das Lösungsmittel durch Phosphatpuffer (siehe Tabelle 2) durch magnetische Trennung^{der Kügelchen}.
2. Die Kügelchen werden bei ~1,1 × 10⁹ Kügelchen ^mL−1 in einem Phosphatpuffer mit 1 M Ammoniumsulfat hergestellt und mit 2 mM Dibenzocyclooctin (DBCO)-_NH2 umgesetzt. Die Mischung 3 h auf einem rotierenden Mischer bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Kügelchen nach der Reaktion 3x mit frischem Phosphatpuffer, um nicht umgesetzte Moleküle zu entfernen.
   HINWEIS: Die gewaschenen Perlen können vor der Verwendung ohne zusätzliche Rotation bei 4 °C mehrere Wochen gelagert werden.
3. Verbinden Sie eine Nadel am Ausgang des Durchflusszellenkanals mit der Spritzenpumpe mit einem Polyethylenschlauch. Gleichen Sie die Kanäle mit PBS aus.
4. Die folgenden Lösungen werden nacheinander durch Ansaugen mit der Pumpe in den Kanal eingebracht: NeutrAvidin, Target-Konstrukte (DNA-Haarnadeln oder SNARE-Komplexe mit DNA-Griffen), Referenz-Polystyrol-Beads und DBCO-beschichtete Magnet-Beads. Vor der Verwendung die Perlenlösungen gründlich verwirbeln, um potenzielle Perlenaggregate zu dispergieren.
5. Waschen Sie ungebundene Perlen mit einer Kraft von 0,1 pN ab.
   HINWEIS: Die Aufbringung einer kleinen Aufwärtskraft erleichtert das Entfernen von ungebundenen Perlen und hilft, den Bruch von speziell gebundenen Perlen-Tether-Konstrukten zu vermeiden.
6. Für Experimente mit SNARE-Komplexen wird 1,5 μM SNAP-25 in den Endpuffer gegeben.
   HINWEIS: Die freien SNAP-25-Moleküle können SNARE-Komplexe nach der Entfaltung wieder binden und ermöglichen wiederholte Messungen an einem einzelnen Komplex.

8. Identifizierung von Zielkonstrukten

1. Suchen Sie auf der Oberfläche eines Flusszellenkanals nach den magnetischen Kügelchen, die von einzelnen Molekülen des Zielkonstrukts angebunden sind. Stellen Sie sicher, dass sich eine Referenzperle in der Nähe befindet.
2. Drehen Sie eine Kandidatenperle und prüfen Sie, ob sie sich frei drehen lässt. Wenn die Perle von mehreren Molekülen angebunden ist, zeigt sie eine eingeschränkte Bewegung.
3. Drehen Sie die Wulst für ein paar komplette Umdrehungen und ermitteln Sie den Rotationsradius (diese Funktion ist in der mitgelieferten Software implementiert). Wählen Sie vorzugsweise eine Perle mit kleinem Rotationsradius.
   ANMERKUNG: Dieser Radius gibt an, wie stark die Perle von der Halteachse entfernt ist, was während der Perlen-Haltevorrichtung^30,31 zufällig bestimmt wird. In allen Experimenten mildert die minimale Dezentrierung einer Perle viele Artefakte, die mit dem von uns verwendeten hohen Verhältnis von Perlenradius zu Halterdehnung verbunden sind.
4. Erhöhen Sie die Kraft von 0 auf 5 pN, um gute einfach angebundene Perlen zu identifizieren. Achten Sie auf eine große Änderung im Beugungsmuster einer Perle, die sich aus der Dehnung eines 1-kbp-Halteseils (oder der entsprechenden zwei 510-bp-Griffe) ergibt. Wenn sich das Beugungsmuster nicht signifikant ändert, verringern Sie die Kraft auf Null und suchen Sie nach einer anderen Kandidatenperle.
   HINWEIS: Die ~300 nm Abhebung einer Perle kann aus den Rohbildern leicht bemerkt werden, ohne dass der Tracking-Prozess tatsächlich gestartet werden muss.

9. Wulstverfolgung für Dehnungsmessungen

HINWEIS: Die Nachverfolgung von Perlen erfolgt durch die Analyse von Perlenbildern in Echtzeit in der LabVIEW-Software, die in diesem Artikel enthalten ist. Die Tracking-Methode und ihre Varianten wurden in den meisten konventionellen MT-Systemen verwendet und werden in der bisherigen Literatur 2,5,7,26 erläutert. Durch die Messung der Position einer magnetischen Perle relativ zu einer festen Referenzperle (d. h. differentielles Tracking) werden die Positionsmessungen extrem robust gegenüber einer externen Störung.

1. Sobald sich eine geeignete magnetische Perle zusammen mit einer Referenzperle befindet, klicken Sie auf die Schaltfläche Kalibrieren , um mit den Vorbereitungen für die Perlenverfolgung zu beginnen.
2. Klicken Sie auf die Perlen im Bild, um die Positionen der Perlen zu definieren. Die Bilder werden dann auf Regions of Interest (ROIs) zugeschnitten (z. B. 150 x 150 Pixel für eine 3-μm-Perle) um die Perlen herum und dann weiter analysiert, um die genauen Perlenkoordinaten zu extrahieren.
3. Warten Sie, bis die Magnetdrehung abgeschlossen ist. Bei diesem Verfahren werden die x- und y-Koordinaten der Wulst aufgezeichnet (durch Berechnung der 2D-Kreuzkorrelation 44 oder durch Verwendung der radialen Symmetrie ⁴⁵ der Wulstbilder mit vergleichbarer Leistung), während die Magnete gedreht werden, um die außermittige Anbringung der Wulst³¹ zu dokumentieren.
4. Warten Sie für das Tracking in z-Richtung, bis die Software eine Lookup-Tabelle mit Beugungsbildern der Beads in unterschiedlichen Abständen von der Fokusebene generiert hat. Dies geschieht, indem die Objektivlinse mit einem Piezoscanner in äquidistanten Schritten abgestuft wird und an jeder Position schwankungsgemittelte Perlenbilder aufgenommen werden. Anschließend werden die z-Koordinaten der Perlen in tatsächlichen Experimenten bestimmt, indem die Echtzeit-Perlenbilder mit der Lookup-Tabelle mit Interpolation⁷ verglichen werden.
5. Wenn die Generierung der Lookup-Tabelle abgeschlossen ist, aktivieren Sie Tracking und Autofokus (drücken Sie die Tasten Track ? und AF? Schaltflächen) und klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen , um die Aufzeichnung der Perlenpositionen zu starten.
   HINWEIS: Der Autofokus ist optional, wird aber empfohlen, um die Stufendrift in z während der Aufnahme zu korrigieren.

10. Anwendungsschemata erzwingen

1. Kraft-Rampen-Experimente: Um die Kraft-Dehnungs-Beziehung des Konstrukts zu überprüfen, wenden Sie einen Kraftanstieg nach oben und unten bei konstanter Belastungsrate (± 1,0 pN s⁻¹) an (Abbildung 4A). Wenden Sie z. B. drei Runden eines 0-20-0 pN-Zyklus an, um die Gesamtlänge der Konstruktion und die Kraft-Dehnungs-Kurve der Griffe zu überprüfen.
2. Durch die Angabe der Tether-Parameter in der Software wird eine WLC-Kraft-Dehnungs-Kurve über die Messdaten gelegt und festgestellt, ob die Zielperle durch ein echtes Probenkonstrukt mit geeigneten DNA-Griffen angebunden ist. Verwenden Sie die bekannte Konturlänge (z. B. ~340 nm für 1 kbp dsDNA) und die WLC-Persistenzlänge (30-45 nm für kurz dsDNA³¹) des Konstrukts als Ausgangspunkt. Wenden Sie bei Bedarf die in Schritt 2.11 beschriebene Erweiterungskorrekturmethode an.
3. Wenn das Konstrukt verifiziert ist, untersuchen Sie die Kraft-Dehnungs-Reaktion im Detail, um nach zusätzlicher Ausdehnung zu suchen, die sich aus den Zielmolekülen-Haarnadeln oder SNARE-Komplexen ergibt.
4. Experimente mit konstanter Kraft: Variieren Sie die aufgebrachte Kraft schrittweise in diskreten Schritten, um die Kraftempfindlichkeit der Zielmoleküle zu untersuchen (Abbildung 4B).
   Anmerkungen: MTs ermöglichen einfache und effektive Experimente mit konstanter Kraft, da die aufgebrachte Kraft konstant gehalten wird, wenn die Magnete stillgehalten werden.
   1. Wenden Sie für DNA-Haarnadeln eine Kraft von 4-8 pN in Schritten von 0,2-0,5 pN an und messen Sie die Perlenposition für ~10 s auf jeder Kraftstufe.
   2. Wenden Sie bei SNARE-Komplexen eine Kraft von 14-16 pN in Schritten von 0,1-0,2 pN an und messen Sie die Wulstposition für ~10 s auf jeder Kraftstufe.
5. Kraftsprung-Experimente: Beobachten Sie die Übergangsereignisse von SNARE-Komplexen.
   HINWEIS: Kraftsprungexperimente beinhalten wie Experimente mit konstanter Kraft Änderungen der Kraftniveaus. Kraftsprünge nutzen jedoch abruptere Änderungen der ausgeübten Kraft, was die Überwachung von kraftausgelösten Ereignissen in den untersuchten Molekülen ermöglicht, wie z. B. einem plötzlichen Bruch von Proteinkomplexen. Da SNARE-Komplexe beispielsweise eine strukturelle Hysterese im Kraftzyklus²³ aufweisen, ist es aufschlussreich, Kraftsprungexperimente durchzuführen und die Latenz bis zum Übergang zu messen (Abbildung 4C).
   1. Entpacken: Ablösen eines VAMP2-Moleküls von einem intakten, ternären SNARE-Komplex, wobei ein binärer Komplex aus Syntaxin-1A und SNAP-25 übrig bleibt.
   2. Rezipieren: Reißverschluss des entpackten VAMP2-Moleküls zur Regeneration eines intakten SNARE-Komplexes.
      1. Entfaltung: Vollständige Demontage eines SNARE-Komplexes mit vollständiger Dissoziation von SNAP-25. Nur VAMP2- und Syntaxin-Moleküle verbleiben nach der Entfaltung im Konstrukt.
      2. Neu faltend: Regeneration eines SNARE-Komplexes nach Bindung eines freien SNAP-25-Moleküls aus dem Puffer.
6. Bei 2 pN induzieren Sie die Assemblierung eines intakten SNARE-Komplexes, indem Sie (~30 s) auf die Assoziation eines freien SNAP25-Moleküls warten. Eine plötzliche Abnahme der Ausdehnung wird bei der Bildung eines SNARE-Komplexes beobachtet.
7. Um das Entpacken zu beobachten, warten Sie einige Sekunden bei 10-12 pN und wechseln Sie dann abrupt zu 14-15 pN mit der maximal möglichen Motordrehzahl. Abhängig von der Zielkraft zeigt der SNARE-Komplex entweder einen reversiblen Übergang zwischen teilweise entzippten Zwischenprodukten (wie in Experimenten mit konstanter Kraft) oder einen ~25 nm Sprung in einen höheren, entzippten Zustand nach einer zufälligen Wartezeit (oder Latenz).
8. Um das Rezipping zu beobachten, verringern Sie die Kraft unmittelbar nach dem Öffnen des Entpackens auf 10-12 pN. Auch hier zeigt der SNARE-Komplex nach einer zufälligen Latenz einen stochastischen Übergang in den unteren, mit Reißverschluss versehenen Zustand. Wenn die Entfaltung nach dem Entpacken stattgefunden hat, kann der Komplex nicht wieder komprimiert werden, da ein SNAP-25-Molekül fehlt.
9. Um die sich entfaltenden Ereignisse zu beobachten, warten Sie nach dem Entpacken einen längeren Zeitraum, um eine weitere Zunahme der Ausdehnung (~2 nm) zu erkennen.

11. Datenanalyse

HINWEIS: Die Arten von Analysen, die mit MT-Daten durchgeführt werden können, hängen vom Zielsystem ab. Es gibt jedoch gängige Ansätze, um nützliche Informationen aus den jeweiligen Experimenten zu extrahieren, die in Abbildung 4 beschrieben sind. Alle Analysen werden mit MATLAB (R2021a) unter Verwendung der in diesem Artikel bereitgestellten benutzerdefinierten Codes durchgeführt. Diese Codes generieren Diagramme unter Verwendung der gleichen Daten, die in diesem Artikel vorgestellt wurden. Beachten Sie, dass Rohdaten aus dem 100-Hz-Tracking direkt für die Analyse verwendet wurden, während Daten aus dem 1,2-kHz-Tracking vor der Analyse in der Regel mediangefiltert wurden (mit einem gleitenden Fünf-Punkt-Fenster), um das Rauschen zu reduzieren (mit Ausnahme der Rauschanalyse).

1. Kraft-Rampen-Experimente: Analysieren Sie die Kraft-Dehnungs-Beziehung (z. B. Elastizität von Polymeren) und übertragen Sie die Kraft, um Informationen über nanomechanische Eigenschaften zu extrahieren.
2. Experimente mit konstanter Kraft: Analysieren Sie die Zustandspopulationen und die Verweildauer (oder Übergangsrate) als Funktion der Kraft, um strukturelle (z. B. am Übergang beteiligte Regionen), thermodynamische (z. B. freie Energiedifferenz) und kinetische (z. B. Energiebarriere) Parameter der Konformationsänderungen zu extrahieren.
3. Kraftsprung-Experimente: Analysieren Sie die Bruchkinetik (z. B. Protein-Protein-Interaktionen und Rezeptor-Ligand-Bindung) oder die Lebensdauer von transienten Zwischenprodukten (z. B. Entfaltung von Biomolekülen), um die Stabilität von Zielmolekülen und ihre Zustände zu extrahieren.
4. Stellvertretende Anwendungen sind die Analyse der Probendaten für DNA-Haarnadeln und SNARE-Komplexe:
   1. Zwei-Zustands-Übergänge einer DNA-Haarnadel: Entpackkraft, Öffnungsabstand, Kraftabhängigkeit der Populationsverschiebung sowie Zustandszuweisungs- und Übergangsratenmessungen mit einem versteckten Markov-Modell (HMM) (MATLAB-Codes zur Verfügung gestellt).
   2. Konformationsänderungen von SNARE-Komplexen: Entpackkraft, Kraftabhängigkeit von Zwischenzuständen und Entpacklatenz, Hysterese beim Rezipping und Entfaltungs-/Rückfaltungsverhalten.
      ANMERKUNG: Kraftverlängerungsmodelle für DNA-Griffe, DNA-Haarnadeln und SNARE-Komplex-Konformationen sind in früheren Referenzen^14,31 angegeben.

Representative Results

Kalibrierung erzwingen
Die Ergebnisse der beiden Kraftmessmethoden (seitliche Verschiebungsvarianz der Perlen und Leistungsspektrumanalyse) unterschieden sich um 0-2 pN (Abbildung 2G). Nach den Ergebnissen in Abbildung 2F können wir mit normalen Neodym-Magneten zuverlässig bis zu 30 pN erreichen.

Zwei-Zustands-Übergänge einer 8 bp DNA-Haarnadel
Wir untersuchten zunächst die Nanomechanik einer kurzen DNA-Haarnadel (Abbildung 5). DNA-Haarnadeln wurden durch konventionelle Einzelmolekül-Kraftspektroskopie umfassend charakterisiert, und daher steht eine große Quelle von Referenzen zur Verfügung, mit denen verglichen werden kann. Das Entzippen einer kurzen Haarnadel ist in der Regel reversibel, so dass seine Rezipping-Ereignisse auch im gleichen Kraftbereich beobachtet werden, in dem das Entpacken stattfindet (Abbildung 5A). Durch Anlegen einer Kraftrampe zwischen 0 pN und 20 pN (Abbildung 5B) konnte die kraftinduzierte Verlängerung des Haarnadelkonstrukts nach einem WLC-Modell nachgewiesen werden, das ausschließlich auf die Elastizität von DNA-Griffen zurückgeführt werden kann (Abbildung 5C, "geschlossen"). Bei etwa 6 pN zeigte das Konstrukt zusätzliche Fluktuationen in der Ausdehnung, die mit dem reversiblen Entzippen der Haarnadelstruktur verbunden waren (Abbildung 5C, Ausschnitt). Schließlich, bei ~8 pN, verschwand der Übergang schließlich und die Verlängerung setzte sich im oberen Zustand fest, der um ~7 nm weiter verlängert wurde. Folglich rastet das gemessene Kraft-Dehnungs-Profil oberhalb von 8 pN auf eine neue Modellkurve (Abbildung 5C, "offen") ein, die die Länge des einzelsträngigen Bereichs der entzippten Haarnadel enthält.

Anschließend führten wir Experimente mit konstanter Kraft durch, um den Haarnadelübergang systematisch zu untersuchen. Die Wulstposition wurde im Kraftbereich von 4-8 pN mit 0,5 pN-Schritten für ~10 s auf jeder Ebene gemessen; Anschließend wurden die Ausdehnungswerte gesammelt und analysiert, um ihre Gleichgewichtsverteilung in Abhängigkeit von der Kraft zu messen. Die Ergebnisse des 100-Hz-Trackings deuteten auf eine allmähliche Verschiebung hin zu einem ausgedehnteren Zustand in diesem Kraftbereich hin (Abbildung 5D), aber die erhaltenen Histogramme der Ausdehnung waren nicht klar genug, um unterschiedliche Populationen aufzulösen (Abbildung 5E). Im krassen Gegensatz dazu zeigten die Hochgeschwindigkeitstrajektorien der Ausdehnungsänderungen nach sanfter Filterung (Fünf-Punkt-Medianfilter) zwei unterschiedliche Populationen, die durch eine Mischung aus zwei Gauß-Verteilungen gut beschrieben werden (Abbildung 5G). Der Abstand zwischen den beiden Populationen, der den Öffnungsabstand der Haarnadel anzeigt, blieb unverändert bei ~7 nm im Öffnungskraftbereich (Abbildung 5H). Die Abweichung in den Extremitäten (4 pN und 8 pN) war auf die ungenaue Lokalisierung eines Zustands aufgrund seiner Seltenheit zurückzuführen.

Die Daten zeigten, dass die mittlere Kraft für das Entpacken des Übergangs (die Kraft, mit der die geschlossenen und offenen Populationen gleich werden) F_1/2 ~6 pN betrug und der obere, offene Zustand allmählich dominant wurde, als wir die Kraft über 4-8 pN erhöhten (Abbildung 5I). Mit einer Boltzmann-Relation für die Öffnungswahrscheinlichkeit wurden die exakten Werte von F 1_/2 = 5,9 pN und Δz = 7,1 nm erhalten, die mit den obigen Beobachtungen übereinstimmen. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Öffnungskraft, die aus einem einzelnen Konstrukt erhalten wird, aufgrund der Sicken-zu-Wulst-Variabilität bei der Krafterzeugung, die für die kommerziellen M270-Perlen³¹ mit ~4% gemessen wurde, möglicherweise nicht genau ist. Da die Schaftlänge (8 bp) kurz ist, kann die Ground-Truth-Öffnungskraft anderer 8 bp-Haarnadeln mit unterschiedlicher Nukleotidzusammensetzung stark variieren²⁰. Schließlich haben wir das HMM auf die Extensionsspuren angewendet, um den Zustandsübergang abzubilden und dabei die Übergangsraten gemessen (Abbildung 5F, rote Kurve). Sowohl die Entpack- als auch die Rezipping-Rate variierten exponentiell mit der ausgeübten Kraft (Abbildung 5J), so dass die Kraft das Entpacken fördert und das erneute Rezippen hemmt. Bei Bedarf kann man den klassischen Bell-Ausdruck weiter verwenden, um die Parameter der Energielandschaft (z. B. Barrierehöhe und -abstand) zu ^{extrahieren46}.

Charakterisierung thermischer Fluktuation bei Ausdehnungsmessungen
Mit Hilfe des Hairpin-Konstrukts wurde das kraftabhängige Rauschen in Dehnungsmessungen profiliert. Zunächst wurden die thermischen Fluktuationen einer angebundenen Perle aus Gleichungen unter Verwendung der für^{diese Experimente} geeigneten Parameter (z.B. Wulstradius, Haltelänge) berechnet 2,5 (Abbildung 5K^, durchgezogene Kurven). Wir haben auch die Standardabweichung der Ausdehnung aufgetragen, die aus der Zeitspur eines Haarnadelkonstrukts bei unterschiedlichen Kraftniveaus gemessen wurde. Da dieses Molekül ein Haarnadelmotiv hatte, wurde seine Reaktion unter 4 pN (geschlossener Zustand) für die Messung des intrinsischen Rauschens verwendet, während die Haarnadeldynamik erwartungsgemäß mit ~6 pN detektiert wurde und als Überprüfung diente. Die kraftabhängige Unterdrückung der Fluktuation wurde auch nach der weitestgehenden Öffnung der Haarnadel beobachtet (vgl. 8 pN vs. 4 pN). Der Vergleich mit dem thermischen Grenzwert zeigt, dass es Raum für Verbesserungen gibt, aber dieses verbleibende Rauschen ist oft mit der Rotationsschwankung einer magnetischen Perle³⁰ verbunden, die zufällig und schwer aufzulösen ist. Für eine systematischere Analyse des Brownschen Rauschens über die Beobachtungszeit wird häufig die Berechnung der Allan-Abweichung verwendet^32,33. Wir berechneten die Allan-Varianz für die in Abbildung 5F dargestellten Haarnadeldaten, ähnlich wie bei den 5-kbp-Messungen in Abbildung 2C. Die Ergebnisse in Abbildung 5L zeigen, dass wir im mittleren Kraftbereich von 4-8 pN eine Allan-Abweichung von 2-3 nm bei der maximalen Geschwindigkeit (1,2 kHz) erhielten, und dieser Wert fiel für die Beobachtungszeit (τ) länger als 0,1 s auf unter 1 nm. Interessanterweise ergab sich die Haarnadeldynamik um 5-7 pN für ~ 0,01 s (Abbildung 5L, Einschub), was mit der gemessenen Übergangskraft und den gemessenen Raten in Abbildung 5I,J übereinstimmt.

Konformationsänderungen neuronaler SNARE-Komplexe
Anschließend haben wir neuronale SNARE-Komplexe als Proteinmodell verwendet und ihre kraftabhängigen mechanischen Eigenschaften untersucht. Im Gegensatz zum Hairpin-Konstrukt wurden einzelne SNARE-Komplexe zwischen zwei 510 bp dDNA-Griffen gehalten (Abbildung 6A). Es sollte beachtet werden, dass die Termini von Syntaxin-1A und VAMP2, distal von den Griffen, durch eine Disulfidbindung zwischen künstlichen Cysteinresten vernetzt waren, um einen Bruch zu vermeiden und mehrere Pinzettenrunden eines bestimmten Konstrukts zu ermöglichen.

Wir haben zunächst eine Kraftrampe angewendet, sowohl mit zunehmenden als auch mit abnehmenden Kraftniveaus (± 1 pN s⁻¹), um das Zielkonstrukt zu dehnen bzw. zu entspannen. Im niedrigen bis mittleren Kraftbereich (0-10 pN) verhielten sich die beiden Griffe unabhängig voneinander als WLC-Polymere, wodurch die Kraft-Dehnungs-Kurve insgesamt nicht von der von 1 kbp dsDNA zu unterscheiden war (Abbildung 6B, schwarz). Wenn die Kraft jedoch auf über 10 pN erhöht wurde, wichen die Dehnungswerte deutlich vom WLC-Modell ab, was darauf hindeutet, dass der eingebettete SNARE-Komplex eine zusätzliche Zunahme der Dehnung aufwies. Genauer gesagt kann die Extensionserhöhung in drei verschiedenen Stufen zusammengefasst werden: (a) eine leichte, allmähliche Zunahme von 11-13 pN, (b) schnelle und größere (~10 nm) Fluktuationen von 14-16 pN und (c) das letzte, irreversible Entzippen von etwa ~20 nm. Wenn die Kraft verringert wurde, um das Konstrukt zu entspannen, kehrte die Dehnung entweder mit einer geringeren Kraft (<15 pN) auf die ursprüngliche Kraft-Dehnungs-Kurve zurück oder folgte einer neuen Modellkurve mit einer größeren Dehnung (Abbildung 6B, blau). Die Gesamtausdehnung wurde schließlich auf die niedrigeren Werte (von blau nach schwarz in Abbildung 6B) unter 5 pN zurückgesetzt, und es konnten die gleichen Kraft-Rampen-Zyklen angewendet werden, die einen ähnlichen Trend zeigten.

Aus dem molekularen Modell der SNARE-Komplexkonformation können wir die möglichen Ausdehnungswerte potenzieller Zwischenprodukte genau berechnen (Abbildung 6C). Darüber hinaus können unter der Annahme des WLC-Verhaltens für die abgewickelten Polypeptide die Verlängerungen als Funktion der Kraft geschätzt werden, wodurch die vollständigen Kraft-Dehnungs-Modelle für die verschiedenen Konformationen generiert werden (Abbildung 6B, gestrichelte Linien). Ausgehend von diesen Werten haben wir die obigen Übergänge wie folgt interpretiert 14,23: (a) ein allmählicher Wechsel vom vollständig gezippten Zustand (FZ) zum Linker-Open-Zustand (LO) in 11-13 pN^, was die Öffnung der Linkerregionen von Syntaxin-1A und VAMP2 impliziert; (b) schneller Übergang zwischen LO und dem halben Reißverschlusszustand (HZ), der die Öffnung eines SNARE-Komplexes bis zur nullten ionischen Schicht impliziert; und (c) der endgültige Übergang entweder in den entpackten (UZ) oder in den entfalteten Zustand (UF), was eine vollständige Auflösung von VAMP2 vom Rest des Komplexes impliziert. Der UZ-Zustand unterscheidet sich von UF dadurch, dass das zugehörige Molekül von SNAP-25 immer noch an Syntaxin-1A gebunden ist und einen binären Komplex beibehält. Im Fall von UF (ohne SNAP-25) kann der vollständige SNARE-Komplex erst regeneriert werden, nachdem ein freies SNAP-25-Molekül aus der Lösung rekombiniert wurde, wobei die Verringerung der ausgeübten Kraft, um eine solche Rebindung zu ermöglichen, entscheidend ist.

Um die Konformationsänderungen von SNARE-Komplexen systematischer zu verifizieren, führten wir dann Kraftsprungexperimente im Kraftbereich durch, bei denen Konformationsfluktuationen häufig bei 14-15 pN beobachtet wurden (Abbildung 6D). In der Regel begannen wir zunächst mit der Messung der Wulstposition bei 10 pN und überprüften die stabile Ausdehnung, was auf das Fehlen von SNARE-bedingten Änderungen hinweist. Dann wurde das Kraftniveau abrupt auf 14-15 pN erhöht, bei dem die Verlängerung überwacht wurde, bis das Entpacken erfolgte, falls vorhanden. Schließlich wurde die Kraft wieder auf 10 pN reduziert, um zu überprüfen, ob eine anhaltende Zunahme der Ausdehnung mit der Entfaltung verbunden ist. Bei 14 pN blieben die Extensionsspuren meist im LO-Zustand, mit gelegentlichen Spitzen in den HZ-Zustand. Es sollte beachtet werden, dass diese kurzen Exkursionen in den HZ-Zustand bei der 100-Hz-Nachführung wahrscheinlich übersehen werden, bei der die Perlenbilder um den Faktor 12 gemittelt und abgetastet werden. Trotz der deutlichen und häufigen Besuche im HZ-Zustand gelang es dem Komplex nicht, einen vollständigen Übergang in den UZ-Zustand zu vollziehen (Abbildung 6E), was darauf hindeutet, dass die äußere Kraft nicht stark genug war, um die Energiebarriere für das Öffnen des Reißverschlusses zu überwinden. Im Gegensatz dazu machte bereits eine geringe Krafterhöhung (auf 14,3 pN) den Übergang sehr effizient, so dass der UZ-Zustand meist innerhalb weniger Sekunden erreicht wurde (Abbildung 6F). Konsequenterweise war das Entpacken meist innerhalb von 1 s abgeschlossen, wenn wir 14,5 pN auf den Komplex aufbrachten (Abbildung 6G,H). Bemerkenswert ist, dass das Entzippen bei höheren Kräften häufig zur vollständigen Entfaltung des gesamten Komplexes führte (begleitet von der Entfernung von SNAP-25), was durch die geringfügige zusätzliche Zunahme der Ausdehnung über UZ (Abbildung 6H) und durch die bei 2 pN beobachtete Rückfaltungssignatur (Abbildung 6I) belegt wird. Insgesamt zeigen diese Daten das klassische Slip-Bond-Verhalten⁴⁷ für die Entfaltung von SNARE-Komplexen, in Übereinstimmung mit früheren Berichten 14,23,48.

Abbildung 1: Geräte-Setup. Schaltplan (A) und Foto (B) eines Hochgeschwindigkeits-MT-Setups. Magnete, die von einem Linear- und einem Rotationsmotor gesteuert werden, befinden sich über dem Probentisch eines inversen Mikroskops, das mit einer 100-fachen Ölimmersionslinse und einer Hochgeschwindigkeits-CMOS-Kamera ausgestattet ist. Der Lichtstrahl einer Superlumineszenzdiode durchdringt die Magnete und beleuchtet das Feld. Einschub: Repräsentative Beugungsbilder von Beads, die sich in unterschiedlichen Abständen von der Brennebene befinden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Kraftkalibrierung. (A) Schematische Darstellung eines Kraftkalibrierungsmusters. Die Größe der Kraft, die von einem antiparallelen Magnetpaar mit einem Abstand von 1 mm ausgeübt wird, wird als Funktion des Magnetabstands d von den Verschiebungen einer magnetischen Perle (M270) gemessen, die mit einem 5 kbp dsDNA-Fragment verbunden ist. (B) Repräsentative Daten aus dem Kraftkalibrierungsverfahren. Farbige Pfeile kennzeichnen Regionen, die in (D) erweitert sind (übereinstimmende Farben). (C) Allan-Abweichung für die z-Position einer 5 kbp Tethered Bead, gemessen mit 15-20 pN. Es werden Kurven für die z-Koordinaten der magnetischen Perle vor (blau) und nach (rot) unter Subtraktion der Referenzperlenposition angezeigt. (D) Repräsentative Zeitreihe der y-Position, gemessen bei dem angegebenen Magnetabstand d. Das entsprechende Histogramm der y-Koordinatenverteilung ist rechts mit einer Gaußschen Anpassung (rot) dargestellt. (E) Repräsentative PSD aus den in (D) dargestellten Daten. Die Kraftwerte, die durch die Anpassung eines Modells (rot) an die jeweiligen PSDs erhalten werden, sind oben angegeben. (F) Kalibrierung der Magnetkraft in Abhängigkeit vom Magnetabstand. Die Kräfte wurden entweder mit der Varianz (links) oder mit der PSD-Methode (rechts) gemessen. Die Anpassung (rot) zeigt ein Doppelexponentialmodell mit der annotierten Gleichung an. (G) Differenz der gemessenen Kraft, die sich aus Varianz und PSD ergibt. Für die in (F) dargestellten Anpassungen wird eine rote Kurve berechnet. (H,I) Überprüfung der Kraft-Dehnungs-Beziehung des 5 kbp Kalibrierkonstrukts. Die mittleren Dehnungswerte bei unterschiedlichen Kraftniveaus (gemessen an der Varianz) wurden entweder direkt (H) oder nach Korrektur des Wulsthöhenversatzes (I) aufgrund der Verkippung eines dezentrierten Wulstes³¹ verwendet. Die Kraft-Dehnungs-Daten für n = 5 Moleküle wurden mit einem erweiterbaren WLC-Modell angepasst und die angepassten Parameter (Persistenzlänge L, _p und Dehnungsmodul K_{, o}) darüber annotiert (Mittelwert ± s.d.). Abkürzung: PSD = spektrale Leistungsdichte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Probenvorbereitung . (A) Herstellung von 8 bp DNA-Haarnadelkonstrukten durch PCR-Amplifikation einer 1 kbp Region der λ-DNA. (B) Herstellung von SNARE-Komplexkonstrukten mit zwei 510 bp DNA-Henkeln. Inset: Nachweis von DNA-Griffen und deren Bindung an Proteine mittels Agarose-Gelelektrophorese (2% Gel). Pfeile zeigen die Mobilitätsverschiebung (farbkodiert) der Produktarten an: freie 510-bp-Griffe (magenta); Griff B an Syntaxin (rot), an ΔN-Komplex (grün) und an SNARE-Komplex (blau) angehängt; und der letzte SNARE-Komplex mit zwei Griffen (grün). Die Zugabe von SDS stört die ΔN-Komplexe (in b vorhanden), aber nicht die vollständigen SNARE-Komplexe, die durch das VAMP2 in voller Länge (in c vorhanden) gebildet werden. (C) Entwurf und Foto einer Durchflusszelle für MT-Experimente. (D) Schematische Darstellung des sequentiellen Einbringens von Probenlösungen in einen Flusszellenkanal. Abkürzung: MT = magnetische Pinzette. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Typen repräsentativer Experimente. (A-C) Schematische Darstellung von Kraftrampen-, Kraftklemm- und Kraftsprungexperimenten (oben) mit repräsentativen zeitlichen Dehnungsspuren aus den entsprechenden Messungen (Mitte). Die Arten der Analysen, die durchgeführt werden können, werden unten angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Zwei-Zustands-Übergang einer 8 bp DNA-Haarnadel. (A) Schematische Darstellung von MT-Experimenten an einer DNA-Haarnadel mit dem erwarteten Übergang zum Entzippen und Rezippen. (B) Repräsentative Spur der Konstruktausdehnung aus Kraftrampenexperimenten mit zunehmenden (~0,25 pN s⁻¹) Kraftniveaus. (C) Repräsentative Kraft-Dehnungs-Kurve, rekonstruiert aus den Daten in (B). Gelbe Kurven zeigen WLC-Modelle für das Haarnadelkonstrukt mit der Haarnadel in der geschlossenen (durchgezogenen) und offenen (gestrichelten) Konformation. (D) Repräsentative Ausdehnungsspur aus Experimenten mit konstanter Kraft und zunehmenden Kraftniveaus, gemessen bei 100 Hz. (E) Histogramme der Ausdehnungsdaten in (D). (F,G) Ergebnisse für die gleichen Experimente in (D) und (E), aber mit 1,2 kHz Tracking. Die rohe 1,2-kHz-Zeitreihe wurde durch Anwendung eines Fünf-Punkt-Medianfilters geglättet. Rote Spuren in der erweiterten Ansicht von (F) wurden von einem HMM erhalten. Rote Linien in (G) zeigen die Positionen der Gaußschen Populationen an. (H) Entfernung zwischen den beiden Populationen in (G). (I) Wahrscheinlichkeit im geöffneten Zustand als Funktion der ausgeübten Kraft. Die rote Kurve ist ein angepasstes Boltzmann-Modell ( ) mit der mittleren Kraft F_1/2 = 5,9 pN. (J) Übergangsraten beim Entpacken und erneuten Komprimieren, gemessen anhand der HMM-Ergebnisse. Durchgezogene Linien zeigen eine exponentielle Abhängigkeit von der Kraft an. (K) Thermische Fluktuation bei Ausdehnungsmessungen. Standardabweichungen der Hairpin-Extensionsdaten (ohne Filterung) werden als Funktion der Kraft angezeigt. Die thermische Auflösungsgrenze, die die theoretische Größenordnung der thermischen Fluktuationen darstellt, wurde in der Arbeit von Choi et al.2 aus Gl. 9 für eine ^2,8 μm Bead mit einem 1 kbp Tether geschätzt. (L) Allan-Abweichungen, die aus den 1,2-kHz-Haarnadeldaten in (F) berechnet wurden (ohne Filterung). Der Ausschnitt zeigt die Allan-Abweichung bei 0,01 s als Funktion der Kraft, die eine allmähliche Zunahme und Abnahme der Fluktuation aufgrund der Haarnadeldynamik zeigt. Abkürzung: MT = magnetische Pinzette. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Konformationsänderungen neuronaler SNARE-Komplexe. (A) Schematische Darstellung von MT-Experimenten an SNARE-Komplexen. (B) Repräsentative Kraft-Dehnungs-Kurven für das SNARE-Konstrukt. Schwarze und blaue Spuren (100 Hz) wurden aus Dehnungs- bzw. Entspannungsphasen in Kraftrampenexperimenten erhalten. Gestrichelte Linien zeigen Erweiterungsmodelle an, die die verschiedenen Konformationen von SNARE-Komplexen in (C) berücksichtigen. (C) Molekulare Modelle von SNARE-Komplexkonformationen mit den entsprechenden berechneten Erweiterungen. Die Werte wurden aus den geometrischen Parametern der helikalen Bündel und einem WLC-Modell für die Polypeptidregion¹⁴ geschätzt. (D) Schematische Darstellung von Kraftsprungexperimenten zur Untersuchung von SNARE-Komplexkonformationen. (E-H) Repräsentative Ausdehnungsspuren von Kraft-Sprung-Experimenten, die bei den angegebenen Kraftniveaus durchgeführt wurden. In (E) wurde das Entpacken nicht beobachtet. In (F) und (G) wurde ein Entpacken mit anschließendem Rezipping bei 10 pN beobachtet. In (H) folgte auf das Entpacken ein weiteres sich entfaltendes Ereignis. (I) Rückfaltung eines SNARE-Komplexes bei 2 pN. Eine deutliche Reduktion der Ausdehnung vom UF- in den FZ-Zustand wurde bei 5 pN beobachtet. Abkürzung: MT = magnetische Pinzette. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

PCR-Einstellung	Zustand
Materialien	1,25 μg/ml λ-DNA (Template), 1 μM Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 0,2 mM dNTP, 0,05 U/μL nTaq, 1x nTaq-Puffer
Denaturierung	95 °C für 30 s
Glühen	Kalibrierkonstrukt: 55 °C für 30 s
	DNA-Haarnadel: 57 °C für 30 s
	DNA-Griffe: 50 °C für 30 s
Erweiterung	DNA-Haarnadel und Griffe: 72 °C für 1 Minute
	Kalibrierkonstrukt: 72 °C für 5 min
Zyklus	30–34
Agarose-Gelelektrophorese
Gel	2% Agarose in 0,5x Trisborat-EDTA (TBE, pH 8,3) mit 1x SYBR Safe
Ausgeführte	Volle Leistung (108 V im Durchschnitt) auf Mupid-2plus (Advance), 40-50 min

Tabelle 1: Bedingungen für PCR-Reaktionen und Agarose-Gelelektrophorese. Reaktionsparameter für die PCR von DNA-Konstrukten, einschließlich 5 kbp dsDNA für die Kraftkalibrierung, DNA-Haarnadelkonstrukt und DNA-Griffe zum Anhängen von SNAREs. Die Primersequenzen sind in der Materialtabelle angegeben.

Puffer für die Proteinreinigung	Zusammensetzung
Waschpuffer A	50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCl, 7 mM β-Mercaptoethanol (BME), 10 % Glycerin und 20 mM Imidazol
Waschpuffer B	50 mM HEPES (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10 % Glycerin und 20 mM Imidazol
Lyse-Puffer	Waschpuffer A, ergänzt mit 1 % Triton X-100, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 1x Proteaseinhibitor-Cocktail
Elutions-Puffer	Waschpuffer B ergänzt mit 400 mM Imidazol
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	81 mM dibasisches Natriumphosphat (Na2HPO4), 19 mM Natriumphosphat monobasisch (NaH2PO4) (pH 7,2), 150 mM NaCl
Phosphat-Puffer	81 mMNa2HPO 4, 19 mM NaH2PO 4, pH7,4

Tabelle 2: Puffer und ihre Zusammensetzung. Zusammensetzung von Puffern, die für die Proteinreinigung verwendet werden.

Ergänzende Abbildung S1: Zeichnung eines Magnethalters. Dargestellt sind die Maße einer Acrylhalterung für zwei 10 mm x 10 mm x 12 mm große Magnete mit einem Spalt von 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Eine gezippte Datei mit MATLAB-Codes. MATLAB-Skripte zur Analyse von Daten, die bei den Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzettenexperimenten erzeugt werden, einschließlich Kraftkalibrierung, Haarnadel- und SNARE-Komplexanalyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Gezippte Datei des LabVIEW-Softwarepakets. Ein komplettes Paket von LabVIEW-Codes für den Betrieb einer Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzette und die damit verbundene Datenerfassung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

In dieser Arbeit haben wir einen Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Aufbau vorgestellt, der strukturelle Veränderungen von Biomolekülen mit hoher raumzeitlicher Präzision beobachten kann. Die verwendete Hochgeschwindigkeits-CMOS-Kamera erfasst 1.200 Bilder s⁻¹ bei einer Auflösung von 1.280 x 1.024 und ermöglicht so eine Perlenverfolgung von 1,2 kHz. Die Geschwindigkeit der Messungen ist jedoch derzeit durch die Bead-Tracking-Software begrenzt, so dass der ROI bei Hochgeschwindigkeitsmessungen in der Regel auf kleinere Bereiche reduziert wird. Die hohe Leistung des SLD sorgt für eine helle Beleuchtung, die für eine schnelle Bead-Bildgebung bis zu einer Bandbreite von wenigen kHz entscheidend ist. Darüber hinaus erzeugt die räumliche Kohärenz des Strahls kontrastreiche, konzentrische Beugungsringe um die Kügelchen (Abbildung 1A, Einschub), die eine präzise Bestimmung der Wulstposition auf Basis der Symmetrie ermöglichen.

Die magnetische Kraft, die auf ein Bead-Tether-Konstrukt ausgeübt wird, kann durch Messung der Brownschen Fluktuationen des angebundenen Beads^35,37,38 bestimmt werden. Da die Echtzeit-Kraftanalyse rechenintensiv ist, wird die aufgebrachte Kraft in der Regel vorher mit einem Referenzkonstrukt gemessen. Beispielsweise werden die zu verwendenden magnetischen Beads durch lange (>5 kbp) dsDNA-Fragmente angebunden und die entsprechenden thermischen Fluktuationen in der Bead-Position als Funktion des Magnetabstands gemessen (Abbildung 2A). Die Kraftkalibrierung wird in der Regel einmal nach dem Aufbau des Setups durchgeführt, muss jedoch nicht regelmäßig wiederholt werden, es sei denn, das Setup wird geändert, z. B. durch Austausch der Magnete. Da die charakteristische Frequenz der Wulstfluktuation mit der aufgebrachten Kraft² zunimmt, ist ein Hochgeschwindigkeitsaufbau besonders nützlich, um die schnelle Dynamik in einem Hochkraftbereich zu erfassen und die Kraft genau zu messen. Die Kraftschätzung aus Varianz ist in ihrer Implementierung viel einfacher als die Spektralanalyse im Frequenzbereich, aber sie ist anfällig für Artefakte aus Drift, kamerabasierter Erfassung und den Ausdehnungsänderungen aufgrund eines dezentrierten Perlenanhangs^31,37,38. Die Ergebnisse der beiden Methoden unterscheiden sich jedoch nur um 0-2 pN, wenn sie richtig erhalten werden (Abbildung 2G); Die Varianzmethode ist also zuverlässig genug, wenn die absolute Bestimmung der Kraft nicht kritisch ist.

Für höhere Kräfte oberhalb von 30 pN und bei etwa 65 pN (bei denen die dsDNA-Überdehnung als Benchmark dient) müssen entweder handelsübliche hochwertige (N50-N52) Magnete installiert werden, der Abstand zwischen den Magneten muss verringert oder das Magnetfeld weiter konstruiert werden^28,49. In diesem Aufbau beträgt die schnellste Geschwindigkeit des vertikalen Motors 30 mm/s, was einen Kraftsprung von 0 pN auf 20 pN in ~0,6 s ermöglicht. Einige schnelle kraftabhängige Strukturänderungen können übersehen werden, wenn die Motorbewegung die Kraftbelastungsrate begrenzt. Je nach Anwendung kann es notwendig sein, die Art und Weise, wie Magnete bewegt werden, zu ändern und weiter zu optimieren. Ein Beispiel ist die kreative Verwendung eines Magnetbandkopfes¹⁵.

Für hochauflösende Messungen mit MTs ist es wichtig, den Rauschpegel aus verschiedenen Quellen zu bewerten. Sobald die optischen Komponenten (ein Mikroskop mit einem Objektiv mit hoher Vergrößerung, einer hellen Lichtquelle und einer schnellen Kamera) richtig konfiguriert sind, kann eine Präzision im Sub-Nanometer-Bereich bei der Perlenverfolgung erreicht werden. Dann wird die Hauptquelle des Rauschens die Brownsche Bewegung einer Perle, die zur Messung der ausgeübten Kraft verwendet wird. Die thermische Fluktuation einer angebundenen Perle hängt von ihrem Radius, ihrer Haltelänge und der ausgeübten Kraft ab. Obwohl die intrinsische Fluktuation in z-Richtung (d.h. Dehnungsänderungen) ausschließlich von der thermischen Energie und der Steifigkeit der Tether abhängt, filtern die Bead-Tether-Dynamik und die Geschwindigkeit der kamerabasierten Erfassung die Bewegung der Bead und damit die Überwachung der Ziel-Biomoleküle wiederum. Daher müssen die Perlengröße und die Abtastrate strategisch gewählt werden, um eine gute räumlich-zeitliche Auflösung zu erreichen. Als Alternative zu den von uns verwendeten 2,8-μm-Kügelchen sind auch kleinere 1-μm-Kügelchen beliebt und können aufgrund ihres schnellen Ansprechverhaltens für schnelle Messungen von Vorteil sein. Eine kritische Schwachstelle ist jedoch der geringe magnetische Anteil, der die maximal zu erzeugende Kraft begrenzt ( ). Da kleinere Kügelchen noch mindestens bis zu 10 pN Kraft ausüben können, könnten sie sich für die Untersuchung von Phänomenen schwacher Kräfte eignen, wie z. B. beim DNA-Supercoiling. Im Gegensatz dazu erfordern Untersuchungen von molekularen Motoren, der Proteinfaltung (z. B. SNAREs, hier gezeigt) oder der Zellmechanik⁵⁰ die Anwendung höherer Kräfte, in welchem Fall eine Änderung der Magnetkonfiguration (z. B. Verringerung des Spalts oder Abstands) in Betracht gezogen werden kann, um den Bereich der anwendbaren Kraft ^28,51 zu erweitern.

Da die Technik die nanomechanischen Reaktionen von Zielmolekülen unter Anwendung einer Kraft auf der biophysikalisch relevanten Skala untersucht, eignet sie sich ideal für die Untersuchung kraftempfindlicher Elemente, die in mechanobiologischen Prozessen eine zentrale Rolle spielen. Um die breite Anwendbarkeit des hochpräzisen MT-Assays zu veranschaulichen, haben wir sowohl ein Nukleinsäure- als auch ein Proteinmodell verwendet, die dynamische und schnelle Konformationsänderungen bei Anwendung einer Kraft auf der Piconewton-Skala aufweisen. Eine Einschränkung der Technik ist der Bedarf an gereinigten Nukleinsäuren und Proteinen, was insbesondere ihre breite Ausdehnung auf ein breites Spektrum von Proteinen verhindert hat. Die Weiterentwicklung von In-vitro-Proteinexpressions- und Konjugationstechnologien wird weiterhin den Zugang zu weniger erforschten Proteinen ermöglichen. Ein damit verbundenes Problem ist, dass a priori Wissen über die Zielstruktur oft entscheidend für Designexperimente ist (z. B. Anbringen von Griffen). Wir gehen davon aus, dass das Aufkommen von Einzelpartikel-Kryo-EM 52 und^{AlphaFold2 53} das Design und die Analyse mechanischer Messungen an einzelnen Proteinmolekülen stark unterstützen und leistungsfähigere Anwendungen der hochauflösenden maschinellen Übersetzung ermöglichen wird.

Die Entpackkraft von DNA-Haarnadeln hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich Sequenz, Struktur und Pufferzusammensetzung, aber vor allem von der Stammlänge und dem Guanin-Cytosin-Gehalt (GC)²⁰. Um die Leistungsfähigkeit des High-Speed-Trackings zu demonstrieren, haben wir absichtlich einen 8-bp-Vorbau (mit drei GC-Basenpaaren) entwickelt, von dem erwartet wurde, dass er sich mit geringer Kraft und schneller Dynamik entfaltet. In der Tat zeigen die Ergebnisse in Abbildung 5 , dass eine solche schnelle Dynamik mit Standardtechniken mit einer Auflösung von 10 ms oder weniger schwer zu lösen gewesen wäre. Dieser Aspekt wird auch durch die mit der HMM-Analyse gemessenen Übergangsraten bestätigt, deren hohe Raten zwischen 100 und 200 s⁻¹ lagen (Abbildung 5J).

Es wird angenommen, dass neuronale SNAREs die synaptische Vesikelexozytose vorantreiben. Insbesondere katalysieren die SNARE-Proteine die Membranfusion, indem sie die damit verbundene Energiebarriere senken, wie z. B. die elektrostatische Abstoßung zwischen Vesikel- und Plasmamembranen. Dementsprechend treten Konformationsfluktuationen der SNARE-Komplexe in einem engen Kraftbereich von 12-15 pN auf, was dem erwarteten Niveau der abstoßenden Kräfte entspricht^14,23. Mit Hilfe der hier beschriebenen Hochgeschwindigkeits-MTs rekapitulierten wir die wichtigsten Erkenntnisse über das kraftabhängige Verhalten neuronaler SNARE-Komplexe. Die Krafthysterese beim Entpacken und Rezippen (Abbildung 6B) weist darauf hin, dass das Rezipping mit einer geringeren Kraft als das Entpacken erfolgt und daher während dieses Zyklus gearbeitet wird. Solche Nichtgleichgewichtsübergänge lassen sich besser durch Kraftsprungexperimente angehen, bei denen die Latenz bis zum Übergang unter Last (ähnlich wie bei einem Bindungsbruch) oder Konformationsfluktuationen vor dem Entzippen gemessen werden können. Beide Fälle profitieren von Hochgeschwindigkeitsaufbauten, wie neuere Studien zu den transienten Zuständen von Biomolekülen und ihren Komplexen zeigen 15,17,54,55,56.

Zusammenfassend stimmen diese Ergebnisse mit den charakteristischen kraftabhängigen Veränderungen von DNA-Haarnadeln und neuronalen SNARE-Komplexen überein, die mit konventioneller Einzelmolekül-Kraftspektroskopie beschrieben wurden. Gleichzeitig unterstreichen sie den Nutzen hochpräziser mechanischer Messungen, um die Kraftempfindlichkeit von Biomolekülen und ihren Anordnungen aufzudecken. Wir hoffen, dass dieser Artikel mehr Menschen aus dem Bereich der Mechanobiologie anzieht und Forscher dazu motiviert, Hochgeschwindigkeits-MTs bei der Untersuchung ihrer einzigartigen Systeme einzusetzen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials for construct synthesis
Agarose gel electrophoresis system	Advance	Mupid-2plus
DNA ladder	Bioneer	D-1037
nTaq polymerase	Enzynomics	P050A
PCR purification kit	LaboPass	CMR0112
PEGylated SMCC crosslinker / SM(PEG)2	ThermoFisher Scientific	22102	For SNARE–DNA coupling
Primer B	Bioneer	5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3'	For 5-kbp force calibration construct and DNA handles
Primer B_hp	IDT	5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'	For hairpin construct
Primer N	Bioneer	5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3'	For DNA handles
Primer Z	Bioneer	5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3'	For DNA handles
Primer Z_5k	Bioneer	5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA TCG-3'	For 5-kbp force calibration construct
Primer Z_hp	Bioneer	5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3'	For hairpin construct
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher Scientific	S33102
λ-DNA	Bioneer	D-2510	Template strand for PCR
DNA sequences for SNARE proteins
6×His-tagged SNAP-25b (2-206; capitalized) in pET28a	homemade	tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa 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6×His-tagged VAMP2 (2-97, L32C/I97C; capitalized) in pET28a	homemade	tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa 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6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49–96; capitalized) and Syntaxin-1A (191–267, I202C/I266C; capitalized) in pETDuet-1	homemade	ggggaattgtgagcggataacaattcccctc tagaaataattttgtttaactttaagaagga gatataccATGGGCAGCAGCCATCA TCATCATCATCACAGCAGCGG CCTGGAAGTTCTGTTCCAGGG GCCCGGTAATGTGGACAAGGT CCTGGAGCGAGACCAGAAGCT ATCGGAACTGGATGATCGCGC AGATGCCCTCCAGGCAGGGGC CTCCCAGTTTGAAACAAGTGC AGCCAAGCTCAAGCGCAAATAC TGGTGGAAAAACCTCAAGATGAT GTAAgcggccgcataatgcttaagtcgaaca gaaagtaatcgtattgtacacggccgcataa tcgaaattaatacgactcactataggggaat tgtgagcggataacaattccccatcttagta tattagttaagtataagaaggagatatacat ATGGCCCTCAGTGAGATCGAGA CCAGGCACAGTGAGTGCATC AAGTTGGAGAACAGCATCCG GGAGCTACACGATATGTTCAT GGACATGGCCATGCTGGTGG AGAGCCAGGGGGAGATGATT GACAGGATCGAGTACAATGTG GAACACGCTGTGGACTACGTG GAGAGGGCCGTGTCTGACACC AAGAAGGCCGTCAAGTACCAG AGCAAGGCACGCAGGAAGAA GTGCATGATCTAActcgagtc tggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaa cgccagcacatggactcgtctactagcgcag cttaattaacctaggctgctgccaccgctga gcaataactagcataaccccttggggcctct aaacgggtcttgaggggttttttgctgaaag 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SNAP-25b (1–206, all C to A; capitalized) in pET28a	homemade	tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa 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Materials for protein purificaiton
2-Mercaptoethanol	SIGMA	M3148-25ML
Agar	LPS Solution	AGA500
Ampicillin, Sodium salt	PLS	AC1043-005-00
Chloramphenicol	PLS	CR1023-050-00
Competent cells (E. coli)	Novagen	70956	Rosetta(DE3)pLysS
Glycerol	SIGMA	G5516-500ML
HEPES	SIGMA	H4034-100G
Hydrochloric acid / HCl	SIGMA	320331-500ML
Imidazole	SIGMA	I2399-100G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside / IPTG	SIGMA	10724815001
Kanamycin Sulfate	PLS	KC1001-005-02
Luria-Bertani (LB) Broth	LPS Solution	LB-05
Ni-NTA resin	Qiagen	30210
PD MiniTrap G-25 (desalting column)	Cytiva	GE28-9180-07	For instructions, see: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174
Phenylmethylsulfonyl fluoride / PMSF	ThermoFisher Scientific	36978
Plasmids for SNARE proteins	cloned in house	N/A	Available upon request
Protease inhibitor cocktail	genDEPOT	P3100
Sodium chloride	SIGMA	S5886-500G
Sodium phosphate dibasic / Na2HPO4	SIGMA	S7907-100G
Sodium phosphate monobasic / NaH2PO4	SIGMA	S3139-250G
Tris(2-carboxyethyl)phosphine / TCEP	SIGMA	C4706-2G
Trizma base	SIGMA	T1503-250G
Materials for sample assembly
Biotin-PEG-SVA	LAYSAN BIO	BIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1g	For PEGylation
Dibenzocyclooctyne-amine / DBCO-NH2	SIGMA	761540-10MG	For bead coating
Double-sided tape	3M	136	For flow cell assembly
Epoxy glue	DEVCON	S-208	For flow cell assembly
Glass coverslip for bottom surface	VWR	48393-251	Rectangular, 60×24 mm, #1.5
Glass coverslip for top surface	VWR	48393-241	Rectangular, 50×24 mm, #1.5
Magnetic bead	ThermoFisher Scientific	14301	Dynabeads M-270 Epoxy, 2.8 μm
mPEG-SVA	LAYSAN BIO	mPEG-SVA 1g	For PEGylation
N,N-Dimethylformamide / DMF	SIGMA	D4551-250ML	For bead coating
N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine	SIGMA	104884-100ML	For PEGylation
Neutravidin	ThermoFisher Scientific	31000	For sample tethering
Phosphate buffered saline / PBS, pH 7.2	PLS	PR2007-100-00
Plastic syringe	Norm-ject	A5	5 ml, luer tip
Polyethylene Tubing	SCI	BB31695-PE/4	PE-60
Reference bead	SPHEROTECH	SVP-30-5	Streptavidin-coated Polystyrene Particles; 3.0-3.4 µm
Syringe needle	Kovax	21G-1 1/4''	21 G
Syringe pump	KD SCIENTIFIC	788210
Equipment for magnetic tweezer instrument
1-axis motorized microtranslation stage	PI	M-126.PD1	For vertical positioning of magnets
2-axis manual translation stage	ST1	LEE400	For alignment of magnets to the optical axis
Acrylic holder for magnets	DaiKwang Precision	custum order	Drawing available upon request
Frame grabber	Active Silicon	AS-FBD-4XCXP6-2PE8
High-speed CMOS camera	Mikrotron	EoSens 3CXP
Inverted microscope	Olympus	IX73P2F-1-2
Neodymium magnets	LG magnet	ND 10x10x12t	Dimension: 10 mm × 10 mm × 12 mm; two needed
Objective lens	Olympus	UPLXAPO100XO	Oil-immersion, NA 1.45
Objective lens nanopositioner	Mad City Labs	Nano-F100S
Rotation stepper motor	AUTONICS	A3K-S545W	For rotating magnets
Superluminescent diode	QPHOTONICS	QSDM-680-2	680 nm
Software
LabVIEW	National Instruments	v20.0f1
MATLAB	MathWorks	v2021a