Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Høyhastighets magnetisk pinsett for nanomekaniske målinger på kraftfølsomme elementer

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65137
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 2,3, 1,4
1Department of Physics, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2School of Biological Sciences, Seoul National University, 3Institute for Molecular Biology and Genetics, Seoul National University, 4School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH)
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi et høyhastighets magnetisk pinsettoppsett som utfører nanomekaniske målinger på kraftfølsomme biomolekyler med maksimal hastighet på 1,2 kHz. Vi introduserer applikasjonen til DNA-hårnåler og SNARE-komplekser som modellsystemer, men det vil også gjelde for andre molekyler involvert i mekanobiologiske hendelser.

Abstract

Enkeltmolekylære magnetiske pinsetter (MT) har tjent som kraftige verktøy for å forhøre biomolekyler, som nukleinsyrer og proteiner, og er derfor klare til å være nyttige innen mekanobiologi. Siden metoden vanligvis er avhengig av bildebasert sporing av magnetiske perler, har fartsgrensen for opptak og analyse av bilder, samt termiske fluktuasjoner av perlene, lenge hindret anvendelsen i å observere små og raske strukturelle endringer i målmolekyler. Denne artikkelen beskriver detaljerte metoder for konstruksjon og drift av et høyoppløselig MT-oppsett som kan løse nanoskala, millisekunddynamikk av biomolekyler og deres komplekser. Som applikasjonseksempler demonstreres eksperimenter med DNA-hårnåler og SNARE-komplekser (membranfusjonsmaskineri), med fokus på hvordan deres forbigående tilstander og overganger kan detekteres i nærvær av piconewton-skalakrefter. Vi forventer at høyhastighets MT vil fortsette å muliggjøre nanomekaniske målinger med høy presisjon på molekyler som registrerer, overfører og genererer krefter i celler, og derved utdyper vår molekylære forståelse av mekanobiologi.

Introduction

Celler fornemmer og reagerer aktivt på mekaniske stimuli. På den måten viser mange biomolekyler kraftavhengige egenskaper som muliggjør dynamiske strukturelle endringer. Velkjente eksempler inkluderer mekanosensitive ionekanaler og cytoskjelettelementer som gir cellene viktig mekanisk informasjon fra omgivelsene.

I tillegg kan molekyler som viser en unik kraftbærende natur også betraktes som mekanosensitive i bredere forstand. For eksempel spiller lokal dannelse og smelting av nukleinsyreduplekser, samt høyere ordens strukturer som G-quadruplexes, avgjørende roller i replikering, transkripsjon, rekombinasjon og mer nylig genomredigering. Videre utfører noen nevrale proteiner involvert i synaptisk kommunikasjon sine funksjoner ved å generere fysiske krefter som overskrider nivåene av typiske intermolekylære interaksjoner. Uansett hvilket eksempel man studerer, vil undersøkelse av nanomekanikk av de involverte biomolekylene med høy spatiotemporal presisjon vise seg å være svært nyttig for å avsløre molekylære mekanismer for de tilknyttede mekanobiologiske prosessene 1,2,3.

Enkeltmolekylære kraftspektroskopimetoder har tjent som kraftige verktøy for å undersøke de mekaniske egenskapene til biomolekyler 2,4,5,6. De kan overvåke strukturelle endringer i nukleinsyrer og proteiner samtidig med kraftanvendelse, og dermed undersøke kraftavhengige egenskaper. To kjente oppsett er optisk pinsett og magnetisk pinsett (MT), som bruker perler i mikronstørrelse for å manipulere molekyler 5,6,7,8. I disse plattformene er polystyren (for optisk pinsett) eller magnetiske perler (for MT) bundet til målmolekyler (f.eks. Nukleinsyrer og proteiner) via molekylære "håndtak", vanligvis laget av korte fragmenter av dobbeltstrenget DNA (dsDNA). Perlene blir deretter flyttet for å utøve kraft og avbildet for å spore deres steder som rapporterer om strukturelle endringer i målmolekyler. Optisk og magnetisk pinsett er i stor grad utskiftbare i sine applikasjoner, men det eksisterer viktige forskjeller i deres tilnærminger til å kontrollere kraft. Optisk pinsett er iboende posisjonsklemmeinstrumenter som fanger perler på plass, på grunn av hvilken den påførte kraften svinger når en målkonstruksjon gjennomgår formendringer; Forlengelsesøkning, for eksempel fra utfolding, løsner båndet og reduserer spenningen, og omvendt. Selv om aktiv tilbakemelding kan implementeres for å kontrollere kraften i optisk pinsett, fungerer MT-er derimot naturlig som en kraftklemmeenhet, og utnytter stabile, fjernfeltmagnetiske krefter med permanente magneter, som også tåler forstyrrelser i omgivelsene.

Til tross for sin lange historie og enkle design, har MT-er hengt etter optisk pinsett i sine applikasjoner til høypresisjonsmålinger, hovedsakelig på grunn av tekniske utfordringer i rask dråpesporing. Nylig har imidlertid flere grupper i fellesskap ledet en mangesidig forbedring av både maskinvare og programvare for MT-instrumenter 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . I dette arbeidet introduserer vi et eksempel på et slikt oppsett som kjører ved 1,2 kHz og beskriver hvordan du bruker det til å utføre nanomekaniske målinger på kraftfølsomme biomolekyler. Som modellsystemer bruker vi DNA-hårnåler og nevrale SNARE-komplekser og undersøker deres raske, strukturelle endringer i piconewton-regimet. DNA-hårnåler viser enkle to-tilstandsoverganger i et veldefinert kraftområde20,21, og fungerer derfor som leketøymodeller for å verifisere ytelsen til et pinsettoppsett. Når SNARE-proteinene samles i et kraftfølsomt kompleks som driver membranfusjon22, har de også blitt grundig studert ved enkeltmolekylkraftspektroskopi 14,23,24,25. Standard tilnærminger til å analysere data og trekke ut nyttig informasjon om termodynamikk og kinetikk presenteres. Vi håper denne artikkelen kan lette adopsjonen av høypresisjons MTs i mekanobiologiske studier og motivere leserne til å utforske sine egne kraftfølsomme systemer av interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle materialer og utstyr som er beskrevet i denne protokollen, er oppført i materialfortegnelsen. LabVIEW-programvare for å betjene høyhastighets MT-oppsettet beskrevet nedenfor, samt MATLAB-skriptene for å analysere eksempeldata, deponeres på GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) og er offentlig tilgjengelig.

1. Bygging av apparater

MERK: Det generelle prinsippet for høyhastighets MT-konstruksjon ligner standard, konvensjonelle MT-systemer, bortsett fra bruken av et høyhastighets CMOS-kamera (Complementary Metal Oxide Semiconductor) og en sammenhengende lyskilde med høy effekt (figur 1). Se andre kilder for flere beskrivelser av standard MT-instrumenter 5,26,27.

  1. Sett opp et omvendt mikroskop på et anti-vibrasjons optisk bord. Installer et høyhastighets CMOS-kamera og en rammefanger.
  2. Bygg et oversettelsestrinn for å manipulere magneter i 3D. Monter et motorisert lineært trinn (>20 mm vandring) vertikalt på toppen av et manuelt XY-trinn.
    MERK: Den vertikale bevegelsen kontrollerer kraften, mens XY-trinnet er for manuell justering av magneter til den optiske aksen for den første konstruksjonen av oppsettet.
  3. Installer en roterende stepper motor og et belte- og remskivesystem for roterende magneter.
    MERK: Beltet overfører rotasjonsbevegelsen mellom motorakselen og magneter som er noen få centimeter fra hverandre. Rotasjonen av magneter er intern i translasjonsmanipulasjonen.
  4. Monter magneter. Bruk en akrylholder (bestilt fra et produksjonsfirma; se tilleggsfigur S1) som kan huse to identiske magneter parallelt, med et veldefinert 1 mm mellomrom mellom magnetene (figur 1B). For å utnytte den maksimale kraften som kan oppnås med et gitt par magneter, juster den vertikale posisjonen til oversettelsestrinnet slik at magnetens bunnflate justerer seg med prøveplanet når den flyttes til laveste posisjon.
    MERK: Se Lipfert et al. for mer informasjon om holderdesign og konfigurasjon av magneter28. Høyden og orienteringen til magneter styres av LabVIEW-programvaren i forbindelse med datainnsamling.
  5. Se med en objektivlinse med lav forstørrelse, juster magneter til midten av synsfeltet. Kontroller at rotering av magneter ikke forårsaker en stor forskyvning av midten av magnetparet.
    MERK: Hvis midtpunktet mellom magnetene roterer om rotasjonsaksen, er det sannsynlig at magnetene er off-sentrert på grunn av en ufullkommen holder. Et lite nivå av feiljustering i forhold til gapstørrelsen er tolerabelt, da magnetrotasjonen bare er for å kontrollere tethers og bruke dreiemoment i spesifikke applikasjoner.
  6. Installer en superluminescerende diode (SLD) for belysning av perler. Før strålen gjennom 1 mm gapet mellom de to magneter. Forsikre deg om at strålen er riktig kollimert for å passe inn i gapet, og belysningen blir ikke skygget av magneter.
  7. Installer en piezo-linseskanner på nesestykket og monter en 100x objektivlinse med olje-nedsenking (numerisk blenderåpning [NA]: 1,45) for perlesporing. For å unngå potensielle artefakter i sporingsresultater, må du sørge for at belysningen opprettholdes jevnt når magnetene flyttes. Til slutt justerer du lysnivået til maksimal lysstyrke uten å mette piksler.
    MERK: For sammenligning av forskjellige lyskilder for høyhastighetssporing av perler, se Dulin et al.29.

2. Kalibrering av magnetisk kraft

  1. Bruk polymerasekjedereaksjon (PCR; se tabell 1), klargjør 5 kbp dsDNA-fragmenter (ved bruk av Primer B, Primer Z_5k og λ-DNA) som er merket med biotin i den ene enden (for overflatefeste) og azid i den andre enden (for perlefeste).
  2. Etter avsnitt 6, klargjør du en flytcelle med 5 kbp-molekylene.
  3. Etter avsnitt 7, identifiser en god perle-tether-konstruksjon ved å verifisere utvidelsen og rotasjonen. Sørg spesielt for å velge en perle med en minimal rotasjonsbane (dvs. med en radius <200 nm) for å minimere dråpehøydeforskyvningen på grunn av off-sentrert vedlegg30,31. Når en god tether er identifisert, start perlesporing, med henvisning til avsnitt 9.
  4. Hvis oppsettet er nytt, karakteriser støy og stabilitet for pålitelige høyoppløselige målinger. Plasser magneten ~3 mm fra strømningscelleoverflaten (for å påføre >10 pN og undertrykke den brownske bevegelsen til en perle), spore perlens z-posisjon ved 1,2 kHz, og beregne Allan-avviket (AD) fra z-koordinattidsserien32,33 (figur 2C). Kontroller at AD-verdier på noen få nanometer er oppnåelige i høyhastighetsregimet (<0,1 s), og at differensialsporing (magnetisk perleposisjon i forhold til en referanseperle) reduserer AD i lengre tidsskala.
    MERK: Vi oppnår vanligvis en AD på <3 nm ved maksimal hastighet (1, 2 kHz eller 0, 83 ms oppløsning), og AD fortsetter å redusere minst opptil 10 s, noe som innebærer en minimal drift. Andre har rapportert lignende verdier på lignende oppsett 9,10,11,12,34.
  5. Med magneter i hvilestilling (F ~ 0 pN), registrer x- og y-koordinatene til den bundne perlen ved 1,2 kHz. Registrer posisjonen i en tilstrekkelig lang periode (det vil si tilstrekkelig lengre enn den karakteristiske avslapningstiden for svingninger35) slik at den brownske bevegelsen er tilstrekkelig samplet.
    MERK: Her er x-retningen langs magnetfeltets retning, mens bevegelsen i y representerer den tverrgående bevegelsen vinkelrett på feltet.
  6. Flytt magnetene nærmere flytcellen og gjenta målingene av perleposisjonen til magnetene forsiktig berører toppen av flytcellen. Beveg deg i store trinn (f.eks. 1-2 mm) når magnetene er mer enn 7 mm unna prøveplanet (siden den påførte kraften øker sakte i magnetens fjerne felt), men reduser trinnstørrelsen gradvis (f.eks. 0,1-0,5 mm) når de nærmer seg nærmere for finere kalibrering ved høyere kraftnivåer (figur 2B).
  7. Beregn kraften ved hver magnetposisjon, d, ved hjelp av en av de to alternative metodene (et MATLAB-skript "kraftkalibrering.m" inkludert begge metodene er gitt; se tilleggsfil 1).
    1. Mål variansen til perlens y-koordinater, (figur 2D) og den gjennomsnittlige z-posisjonenEquation 2 til perlen i forhold til laveste posisjon (figur 2B,Equation 1 nederst). Bruk deretter ligning (1) 7,27,36 for å estimere kraften (med en fast perleradius R = 1,400 nm og termisk energi kR T = 4,11 pN ∙nm):
      Equation 3(1)
    2. Alternativt kan du beregne effektspektraltettheten (PSD) til y-koordinatene, Sy (figur 2E). Bestem den påførte kraften F ved å montere en dobbel-Lorentzian-modell37 til den målte Sy ved hjelp av ligning (2).
      Equation 4(2)
      Equation 5Her er , R perleradius, γ yog γφ er henholdsvis translasjons- og rotasjonsdragkoeffisientene (estimert fra Stokes-Einstein-ligningen), kRT er termisk energi, f + og f- er to karakteristiske frekvenser oppnådd ved ligning (3).
      Equation 6 (3)
      MERK: Siden tetherforlengelsen L er en funksjon av kraft som følger den veletablerte ormlignende kjedemodellen (WLC), lar uttrykkene ovenfor F være den eneste passende parameteren (vi fikser R til å være 1,400 nm for enkelhets skyld fordi den deles på tvers av alle kraftnivåer og den nøyaktige verdien påvirker ikke resultatene nevneverdig). Når det er nødvendig, må bevegelsesuskarphet og aliasing fra kamerabasert bildeopptak vurderes38,39, men denne effekten er ubetydelig i våre høyhastighetsmålinger over 1 kHz med 5 kbp-bånd.
  8. Gjenta trinn 2.4-2.7 for noen flere konstruksjoner. Undersøk tre til fem forskjellige perler for å gjennomsnittliggjøre kraftvariabiliteten blant magnetkulene.
    MERK: Kraftvariasjon blant magnetkulene i bruk bør vurderes for å bestemme riktig antall konstruksjoner for gjennomsnitt. Denne variasjonen er liten, men kan føre til mer enn 1 pN feil i den målte kraften, selv for kommersielle produkter31. For de fleste bruksområder, der den absolutte bestemmelsen av de involverte kreftene ikke er avgjørende, er gjennomsnittet av kalibreringsresultatene for tre til fem perler generelt tilstrekkelig. En alternativ tilnærming for å ta hensyn til denne variasjonen er å måle kraften med individuelle bånd i begynnelsen av eksperimentet, noe som kan være tidkrevende. Et annet alternativ er å legge inn hårnålsstrukturer som pakker ut på kjente kraftnivåer i hver konstruksjon31.
  9. Plott den målte kraften som en funksjon av magnetavstanden og tilpass en dobbel eksponentialfunksjon til dataene (figur 2F) ved hjelp av ligning (4).
    Equation 7(4)
    Her er F0 (baseline), A 1 og A 2 (amplituder) og d 1 og d2 (henfallskonstanter) passende parametere. Forsikre deg om at kraftverdiene fra de to metodene, så vel som de resulterende dobbelteksponentielle tilpasningene, stort sett er enige (figur 2F,G).
    MERK: For å bekrefte at kraftkalibreringen utføres riktig, må du verifisere kraftforlengelsesforholdet mellom de undersøkte konstruksjonene ved å plotte forlengelsen i forhold til den målte kraften.
  10. For å korrigere for perlehøydeforskyvningen z av som følge av kraftavhengig tilting av magnetkulene30,31, estimere z off fra sideforskyvningen x av, ta hensyn til geometrien til enoff-sentrert tether med en perleradius ved hjelpav ligning (5), og bruk verdiene på de målte forlengelsesverdiene. Dette trinnet er implementert i MATLAB-skriptet "force calibration.m" (linje 252-254).
    Equation 8(5)
    MERK: Selv om denne korreksjonen gjør små endringer i forlengelsen, spesielt for perlene med en liten rotasjonsradius (<200 nm), påvirker denne forskyvningen ofte den elastiske responsen kritisk, som vist i endringen fra figur 2H til figur 2I30,31.
  11. Kontroller persistenslengden Lp ved å tilpasse en utvidbar WLC-modell til dataene ved hjelp av ligning (6).
    Equation 9(6)
    Her er L 0 konturlengden (1,7 μm for 5 kbp) og K0 er modulen for entalpisk strekking.
    MERK: Selv om L p av dsDNA er godt akseptert å være 40-50 nm i en typisk buffer som fosfatbufret saltvann (PBS), undervurderer WLC-formelen som brukes på korte molekyler (<5 kbp) systematisk L p da L0 reduseres31,40. Dette skyldes at den klassiske WLC-modellen antar en polymer hvis kjedelengde er tilstrekkelig lengre enn utholdenhetslengden. Her fikk vi Lp = 40 ± 3 nm for 5 kbp-konstruksjonen (figur 2H), og forlengelseskorreksjonen ga videre en homogen K0 på 1 100 ± 200 pN (figur 2I). Bruk av en endelig WLC-modell 31,40, samt en korreksjon for ikke-Gaussianitet i forlengelsesfordeling 41, vil øke Lp.
  12. Når kraftkalibreringen er verifisert, bruker du de oppnådde tilpasningsparametrene til den dobbelteksponentielle modellen på den medfølgende LabVIEW-programvaren (tilleggsfil 2) og venter på at programvaren beregner strømkraften i sanntid fra motoravlesninger (dvs. magnetposisjon). Siden et analyseuttrykk for den inverse funksjonen d(F) ikke er tilgjengelig, utarbeide en oppslagstabell med d versus F i 0,1 pN trinn ved numerisk estimering av for d-målkraftnivåene. Lagre denne tabellen i programvaren også for å kommandere kraftkontrollen.

3. Syntese av DNA-hårnåler

MERK: DNA-hårnålskonstruksjoner for MT-eksperimenter fremstilles ved PCR-amplifisering av en 510 bp-region i λ-DNA med to tilpassede primere, hvorav den ene inneholder en hårnålsstruktur på 5'-enden (figur 3A). På denne måten plasseres et hårnålsmotiv i den ene enden av PCR-produktet.

  1. Forbered primerne.
    1. Forward primer: Primer B_hp som er 5'-biotin-merket for glassoverflatefeste og binder seg til λ-DNA. Denne primeren inneholder et hårnålsmotiv med en 8 bp-stamme og en 6 nt løkke, 5 'til λ-bindende regionen.
    2. Omvendt primer: Primer Z_hp som er 5'-azid-merket for magnetisk perlefeste og binder seg til λ-DNA 1 kbp vekk fra den fremre primeren.
  2. Sett opp og kjør PCR med λ-DNA (mal), nTaq-polymerase og standard PCR-betingelser (se tabell 1). Rengjør produktet med et kommersielt rensesett.
  3. Mål DNA-konsentrasjonen ved UV-absorpsjon ved 260 nm (A260) og utfør agarosegelelektroforese (2 % gel) (se tabell 2) for å verifisere produktstørrelsen. Et typisk utbytte er ~ 35 μL av ~ 600 nM løsning.

4. Fremstilling av SNARE-proteiner

MERK: Neuronale SNARE-komplekser settes sammen ved å kombinere tre rensede rotteproteiner uttrykt fra E. coli: VAMP2/synaptobrevin-2, syntaxin-1A og SNAP-25 (figur 3B). For å lette monteringen blir syntaksin og SNAP-25 uttrykt sammen med et VAMP2-fragment (mangler N-terminalområdet; kalt "ΔN-VAMP2") i en struktur kalt "ΔN-komplekset", og blandes deretter med full lengde VAMP2 etter DNA-håndtaksvedlegg for å danne fulle komplekser.

  1. Forbered plasmider som inneholder cDNA for ekspresjon av SNARE-proteiner (DNA-sekvenser for alle plasmider er gitt i materialtabellen).
    1. Forbered 6×His-merket VAMP2 som mangler transmembrandomenet (2-97; L32C/I97C for disulfidkoblinger) klonet til en pET28a-vektor.
    2. Forbered syntaksin-1A som mangler Habc og transmembrandomenet (191-267, I202C/I266C-substitusjoner for disulfidbindinger) klonet sammen med 6×His-merket ΔN-VAMP2 (49-96) til en pETDuet-1-vektor.
    3. Forbered full lengde SNAP-25 isoform b (2-206, alle C til A) klonet inn i en pET28a vektor. Dette vil bli brukt til å forberede ΔN-komplekser.
    4. Forbered 6×His-tagget full lengde SNAP-25 isoform b (1-206, alle C til A) klonet inn i en pET28a-vektor for direkte tillegg til MT-analysebufferen for å sette sammen SNARE-kompleksene etter utfoldelse.
  2. Forbered to rør av Rosetta (DE3) E. coli-celler. Transformer en gruppe med VAMP2-plasmider (fra trinn 4.1.1), en med både syntaksin-1A/ΔN-VAMP2 og ukodede SNAP-25-plasmider (fra trinn 4.1.2 og 4.1.3) for å uttrykke ΔN-komplekset, og den andre med His-merkede SNAP-25-plasmider (fra trinn 4.1.4).
  3. Overfør de transformerte cellene til Luria-Bertani buljong (LB) med passende antibiotika (her kanamycin og kloramfenikol for VAMP2 og His-merket SNAP-25; kanamycin, kloramfenikol og ampicillin for ΔN-kompleks). Dyrk dem ved 37 ° C i en ristende inkubator (220 rpm) til den optiske tettheten (OD) av buljongen når 0,7-0,9.
  4. Tilsett 1 mM isopropyl β-d-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) for å indusere proteinuttrykk og inkubere cellene i 3-4 timer ved 37 °C i en ristende inkubator (220 rpm).
  5. Pellet ned cellene ved å sentrifugere kulturen ved 4 500 × g i 15 minutter ved 4 °C.
  6. Forbered buffere for proteinrensing (se tabell 2).
  7. Suspender SNARE-uttrykkende cellepellets i 40 ml iskald lysisbuffer og lyse cellene ved sonikering på is (15% amplitude, 5 s på og 5 s av, 30 minutter totalt).
  8. Sentrifuger lysatet ved 15 000 × g i 30 minutter ved 4 °C for å fjerne uoppløselige materialer.
  9. Før supernatanten gjennom en gravitasjonskolonne fylt med 1 ml Ni-NTA-harpiks. Vask harpiksen med vaskebuffer A, deretter med vaskebuffer B, og eluer proteinene med 10 ml elueringsbuffer.
  10. Fjern tris(2-karboksyetyl)fosfin (TCEP) og imidazol fra eluenten ved å bruke en avsaltingskolonne (følg produsentens instruksjoner). Elute prøven med PBS.
  11. Konsentrer proteinene med sentrifugalfiltre (10 kDa cutoff) til ~ 70 μM mens du opprettholder proteinene i PBS (vanligvis gir 2 ml). Mål proteinkonsentrasjonen enten ved ultrafiolett (UV) absorpsjon ved 280 nm (A280) eller ved Bradford-analysen.
  12. Forbered små alikoter, frys i flytende nitrogen, og oppbevar ved -80 °C til bruk.
    MERK: Full SNARE-komplekser vil bli montert etter konjugering av ΔN-kompleks på et DNA-håndtak (se nedenfor).

5. Vedlegg av DNA-håndtak

MERK: To 510 bp dsDNA-håndtak som inneholder primære amingrupper i den ene enden fremstilles først ved PCR, og amingruppene konverteres deretter til maleimidgrupper ved hjelp av en bifunksjonell kryssbinder, SM (PEG) 2. De to håndtakene kobles deretter kovalent til SNARE-komplekser via cysteingruppene for stedsspesifikk konjugering (figur 3B).

  1. Forbered primere.
    1. Forbered fremoverprimere: Primer B (for å forsterke håndtak B) som er 5'-biotin-merket for glassoverflatefeste og binder seg til λ-DNA; Primer Z (for å forsterke håndtak Z) som er 5'-azid-merket for magnetisk perlefeste og har samme sekvens som primer B.
    2. Forbered en omvendt primer: Primer N (delt for håndtak B og håndtak Z) som er 5'-aminmerket for proteinkonjugering og binder seg til λ-DNA 510 bp vekk fra den fremre primeren.
  2. Sett opp og kjør to sett med PCR-reaksjoner (18 rør med 200 μL reaksjon for hvert håndtak) med λ-DNA (mal), nTaq-polymerase og standard PCR-betingelser (se tabell 1). Rengjør produktet med et PCR-rengjøringssett og eluer hvert håndtak med 45 μL ultrarent vann. Bruk et minimalt volum vann for å oppnå høye konsentrasjoner av håndtak for en effektiv reaksjon i senere trinn.
  3. Mål DNA-konsentrasjonen med A260. Det typiske utbyttet er ~650 μL ~2 μM løsning for hvert håndtak. Hold små prøver fra hverandre for senere verifisering i agarosegelelektroforese.
  4. Reager hvert håndtak (1 μM i PBS) med 5 mM SM(PEG)2. Inkuber ved romtemperatur med forsiktig rotasjon. Etter 1 time, bruk et DNA-rensesett for å fjerne uomsatt SM (PEG)2. Elute hvert håndtak med 250 μL PBS for å oppnå ~ 2 μM løsninger.
  5. Bland løsningene av håndtak B og ΔN-kompleks ved et molforhold på 1:16 (f.eks. 1 μM håndtak B og 16 μM ΔN-kompleks) i PBS og inkuber i 2 timer ved romtemperatur med omrøring. Hold fra hverandre en liten prøve for agarosegelelektroforese.
  6. Legg til en løsning av VAMP2 i et 2,5 ganger molært overskudd over ΔN-komplekset som ble brukt i forrige trinn. Inkuber blandingen i ytterligere 1 time ved romtemperatur under omrøring. Full SNARE-komplekser er samlet i dette trinnet.
  7. Fjern frie proteiner ved bufferbytte med fersk PBS og et sentrifugalfilter (100 kDa cutoff): sentrifuge ved 14 000 × g i 5 minutter ved 4 °C, gjenta minst 6x og kjør i 15 minutter for siste spinn. Mål økningen i forholdet A260/A280 for å overvåke fjerning av frie proteiner. Hold fra hverandre en liten prøve for agarosegelelektroforese.
  8. Legg håndtak Z til løsningen i et 15 ganger molært overskudd over håndtak B. Hold konsentrasjonen av håndtak Z minst over 1 μM for å lette reaksjonen. Inkuber blandingen over natten ved 4 °C under omrøring.
  9. Kontroller mellomproduktene (håndtak B og dets proteinkonjugater) og sluttproduktet (SNARE-kompleks med to håndtak) ved agarosegelelektroforese (figur 3B, innfelt) (se tabell 2).
    MERK: Hvis proteinene er vellykket festet til håndtak B, vil et mobilitetsskifte bli oppdaget. Spesielt kan dannelsen av fulle SNARE-komplekser på DNA-håndtak bekreftes av deres motstand mot natriumdodecylsulfat (SDS), i motsetning til ΔN-komplekser, som demonteres i SDS og bare lar syntaksin være bundet til DNA (sammenlign b og c i figur 3B).
  10. Forbered små alikoter, frys i flytende nitrogen, og oppbevar ved -80 °C til bruk.
    MERK: Selv om den endelige løsningen inneholder uomsatte håndtak, vil bare den ønskede konstruksjonen som er dobbeltmerket med biotin og azid bli valgt under prøvemonteringen i en flytcelle.

6. Fabrikasjon av flytceller

MERK: Flytceller for MT-målinger er konstruert av to glassdeksler bundet sammen med dobbeltsidig tape (figur 3C). En dekkseddel er belagt med en blanding av PEG og biotinylert polyetylenglykol (PEG) for å unngå uspesifikk binding og for å muliggjøre spesifikk tethering av målmolekyler via biotin-NeutrAvidin-kobling (figur 3D). Deretter blir materialløsningene for MT-eksperimenter sekvensielt infundert i en strømningscelle ved hjelp av en sprøytepumpe (figur 3C,D).

  1. Forbered to glassdeksler, en hver for den øverste (24 mm × 50 mm, nr. 1,5 tykkelse) og bunnflaten (24 mm × 60 mm, nr. 1,5 tykkelse). Rengjør dekslene ved sonikering i 1 M KOH i 30 minutter. Etter sonikering, skyll dekslene med destillert vann og hold i vann til neste trinn.
  2. PEGylate bunndekselet etter publiserte protokoller42,43. Bruk N-[3-(trimetoksysilyl)propyl]etylendiamin til silanisering og en 1:100 (ww) blanding av biotin-PEG-SVA og mPEG-SVA i 100 mM bikarbonatbuffer. Hold PEGylerte deksler tørre ved -20 °C og oppbevar dem i noen uker.
  3. På dagen for forsøkene, ta ut PEGylated coverslips og tørk dem med en nitrogenpistol. Inspiser dem visuelt for smuss for å sikre at de er rene.
  4. For å lage prøvekanalene, klargjør ~2 mm brede strimler av dobbeltsidig tape og legg ned fire strimler på et bunndeksel (PEGylert overflate opp), parallelt med og skilt fra hverandre med ~5 mm (figur 3C).
    MERK: På denne måten kan tre 5 mm brede prøvekanaler opprettes i en enkelt flytcelle.
  5. Plasser et toppdeksel i midten av bunndekselet, og la ~ 5 mm plass på kortkantene for kanalinntak og utløp. Trykk forsiktig på baksiden av toppdekselet med pinsett for å forsegle kanalene godt.
  6. For å lage et innløpsreservoar, trim kanten på en 200 μL pipettespiss. Skjær ut ~ 10 mm fra den bredere åpningen for å tillate å holde ~ 200 μL løsning. Lag tre av dem for de tre flytkanalene. For å konfigurere utløpene, klargjør tre sprøytenåler som passer til slangen til sprøytepumpen.
  7. Bruk 5 min epoksy til å lime reservoarene og nålenavene til strømningscellen. Sørg for at det dannes en fullstendig tetning for å unngå lekkasje, og at kanalene ikke blokkeres med overflødig lim. La det tørke i minst 30 min.

7. Montering av perle-tether-konstruksjoner

MERK: Løsningene av materialer for MT-eksperimenter, inkludert de for perle-tether-konstruksjoner, blir sekvensielt introdusert i strømningsceller ved hjelp av en sprøytepumpe (figur 3C, D).

  1. Forbered magnetiske perler. Ta 5 mg M270-epoksyperler fra en stamløsning (~3,3 × 108 perler i 167,5 μL dimetylformamid) og erstatt løsningsmidlet med fosfatbuffer (se tabell 2) ved magnetisk separasjon av perlene.
  2. Forbered kulene ved ~1,1 × 109 perler ml-1 i en fosfatbuffer med 1 M ammoniumsulfat og reager dem med 2 mM dibenzocyklooktin (DBCO)- NH2. Inkuber blandingen i 3 timer på en roterende mikser ved romtemperatur. Etter reaksjonen, vask perlene 3x med fersk fosfatbuffer for å fjerne uomsatte molekyler.
    MERK: De vaskede perlene kan oppbevares uten ekstra rotasjon ved 4 °C i flere uker før bruk.
  3. Koble en nål på strømningscellekanalutgangen til sprøytepumpen med polyetylenrøre. Balanser kanalene med PBS.
  4. Introduser følgende løsninger sekvensielt i kanalen ved å suge med pumpen: NeutrAvidin, målkonstruksjoner (DNA-hårnåler eller SNARE-komplekser med DNA-håndtak), referansepolystyrenperler og DBCO-belagte magnetiske perler. Før bruk, virvel dråpeløsningene grundig for å spre potensielle dråpeaggregater.
  5. Vask bort ubundne perler mens du påfører 0,1 pN kraft.
    MERK: Påføring av en liten oppadgående kraft letter fjerning av ubundne perler og bidrar til å unngå brudd på spesifikt bundne perlebåndkonstruksjoner.
  6. For eksperimenter med SNARE-komplekser, inkluder 1, 5 μM SNAP-25 i den endelige bufferen.
    MERK: De frie SNAP-25-molekylene kan binde SNARE-komplekser etter utfoldelse og tillate gjentatte målinger på et enkelt kompleks.

8. Identifisering av målkonstruksjoner

  1. På overflaten av en strømningscellekanal, søk etter de magnetiske perlene som er bundet av enkeltmolekyler av målkonstruksjonen. Sørg for at en referanseperle er plassert i nærheten.
  2. Roter en kandidatperle og kontroller at den svinger fritt. Hvis perlen er bundet av flere molekyler, viser den en begrenset bevegelse.
  3. Roter perlen for noen få komplette svinger og finn ut rotasjonsradiusen (denne funksjonen er implementert i den medfølgende programvaren). Velg helst en perle med liten rotasjonsradius.
    MERK: Denne radiusen indikerer hvor mye perlen er off-sentrert fra tether-aksen, som er tilfeldig bestemt under perle-tether-enheten30,31. I alle eksperimenter lindrer minimal off-sentrering av en perle mange gjenstander forbundet med den høye perleradiusen til tether-forlengelsesforholdet vi bruker.
  4. Øk kraften fra 0 til 5 pN for å identifisere gode enkeltbundne perler. Se etter en stor endring i diffraksjonsmønsteret til en perle som følge av strekking av en 1 kbp-bånd (eller tilsvarende to 510 bp-håndtak). Hvis diffraksjonsmønsteret ikke endres vesentlig, senk kraften til null og skann etter en annen kandidatperle.
    MERK: Løftingen av en perle på ~ 300 nm kan lett legges merke til fra råbildene uten å starte sporingsprosessen.

9. Perlesporing for utvidelsesmålinger

MERK: Sporing av perler utføres ved å analysere perlebilder i sanntid i LabVIEW-programvaren som følger med denne artikkelen. Sporingsmetoden og dens varianter har blitt brukt i de fleste konvensjonelle MT-systemer og er forklart i tidligere litteratur 2,5,7,26. Ved å måle posisjonen til en magnetisk perle i forhold til en fast referanseperle (dvs. differensialsporing), blir posisjonsmålingene ekstremt robuste mot en ekstern forstyrrelse.

  1. Når en riktig magnetisk perle er plassert sammen med en referanseperle, klikker du på Kalibrer-knappen for å begynne å forberede deg på perlesporing.
  2. Klikk på perlene i bildet for å definere plasseringen av perlene. Bildene vil deretter bli beskåret til regioner av interesse (ROI) (f.eks. 150 x 150 piksler for en 3 μm perle) rundt perlene og deretter analysert videre for å trekke ut de nøyaktige perlekoordinatene.
  3. Vent til magnetrotasjonen er fullført. Denne prosessen registrerer x- og y-koordinatene til perlen (ved å beregne 2D-krysskorrelasjon 44 eller ved å bruke radial symmetri 45 av perlebildene, med sammenlignbar ytelse) mens magnetene roteres for å dokumentere det off-sentrerte vedlegget til perlen31.
  4. For sporing i z-retningen, vent til programvaren genererer en oppslagstabell med diffraksjonsbilder av perlene i forskjellige avstander fra fokalplanet. Dette utføres ved å gå objektivlinsen med en piezoskanner i like fjerne trinn og registrere svingningsgjennomsnittlige perlebilder i hver posisjon. Deretter bestemmes z-koordinatene til perlene i faktiske eksperimenter ved å sammenligne sanntids perlebilder med oppslagstabellen med interpolering7.
  5. Når oppslagstabellgenereringen er ferdig, aktiverer du sporing og autofokus (trykk på Spor ? og AF? Knapper) og klikk på Oppkjøp-knappen for å starte innspillingen av perleposisjoner.
    MERK: Autofokus er valgfritt, men anbefales å korrigere for trinnavvik i z under anskaffelsen.

10. Force søknadsordninger

  1. Eksperimenter med kraftrampe: For å verifisere kraftforlengelsesforholdet til konstruksjonen, bruk en kraftrampe opp og ned med en konstant belastningshastighet (± 1,0 pN s−1) (figur 4A). Bruk for eksempel tre runder av en 0-20-0 pN-syklus for å kontrollere den totale lengden på konstruksjonen og kraftforlengelseskurven til håndtakene.
  2. Ved å spesifisere tetherparametrene i programvaren, legg over en WLC-kraftforlengelseskurve på toppen av de målte dataene, og bestem om målperlen er bundet av en ekte prøvekonstruksjon med riktige DNA-håndtak. Bruk den kjente konturlengden (f.eks. ~340 nm for 1 kbp dsDNA) og WLC persistenslengde (30-45 nm for kort dsDNA31) av konstruksjonen som utgangspunkt. Bruk om nødvendig utvidelseskorrigeringsmetoden som er beskrevet i trinn 2.11.
  3. Hvis konstruksjonen er verifisert, undersøk kraftforlengelsesresponsen i detalj for å se etter ytterligere forlengelse som følge av målmolekylene-hårnåler eller SNARE-komplekser.
  4. Eksperimenter med konstant kraft: Varier gradvis den påførte kraften i diskrete trinn for å undersøke kraftfølsomheten til målmolekylene (figur 4B).
    MERK: MT-er muliggjør enkle og effektive eksperimenter med konstant kraft fordi den påførte kraften holdes konstant når magnetene holdes stille.
    1. For DNA-hårnåler, bruk 4-8 pN kraft med 0,2-0,5 pN trinn, og mål perleposisjonen for ~ 10 s på hvert kraftnivå.
    2. For SNARE-komplekser, bruk 14-16 pN kraft med 0,1-0,2 pN trinn, og mål perleposisjonen for ~ 10 s på hvert kraftnivå.
  5. Krafthopp-eksperimenter: Vær oppmerksom på overgangshendelsene til SNARE-komplekser.
    MERK: Krafthoppeksperimenter, som eksperimenter med konstant kraft, innebærer endringer i kraftnivåer. Imidlertid bruker krafthopp mer brå endringer i den påførte kraften, noe som muliggjør overvåking av kraftutløste hendelser i de undersøkte molekylene, for eksempel et plutselig brudd på proteinkomplekser. For eksempel, siden SNARE-komplekser utviser strukturell hysterese i kraftsykling23, er det informativt å utføre krafthoppeksperimenter og måle latensen til overgang (figur 4C).
    1. Unzipping: Peeling av et VAMP2-molekyl fra et intakt, ternært SNARE-kompleks, og etterlater et binært kompleks av syntaxin-1A og SNAP-25.
    2. Rezipping: Glidelås av det utpakkede VAMP2-molekylet for å regenerere et intakt SNARE-kompleks.
      1. Unfolding: Full demontering av et SNARE-kompleks ledsaget av fullstendig dissosiasjon av SNAP-25. Bare VAMP2- og syntaksinmolekyler forblir i konstruksjonen etter utfoldelse.
      2. Refolding: Regenerering av et SNARE-kompleks ved binding av et fritt SNAP-25-molekyl fra bufferen.
  6. Ved 2 pN, indusere montering av et intakt SNARE-kompleks ved å vente (~ 30 s) for foreningen av et fritt SNAP25-molekyl. En plutselig reduksjon i forlengelsen observeres ved dannelsen av et SNARE-kompleks.
  7. For å observere unzipping-hendelser, vent noen sekunder ved 10-12 pN, og flytt deretter til 14-15 pN brått med maksimal motorhastighet mulig. Avhengig av målstyrken vil SNARE-komplekset vise enten en reversibel overgang mellom delvis utpakkede mellomprodukter (som i eksperimenter med konstant kraft) eller et ~ 25 nm hopp til en høyere, utpakket tilstand etter en tilfeldig ventetid (eller ventetid).
  8. For å observere rezipping-hendelser, senk kraften til 10-12 pN umiddelbart etter at unzipping er observert. Igjen viser SNARE-komplekset en stokastisk overgang til den lavere, glidelåsede tilstanden etter litt tilfeldig ventetid. Hvis utfoldelse har skjedd etter unzipping, vil komplekset ikke klare å rezip, da et SNAP-25-molekyl mangler.
  9. For å observere hendelser som utfolder seg, vent i en lengre periode etter at unzipping er observert for å oppdage en ytterligere økning i forlengelsen (~ 2 nm).

11. Analyse av data

MERK: Hvilke typer analyser man kan utføre med MT-data, avhenger av målsystemet. Det er imidlertid vanlige tilnærminger for å trekke ut nyttig informasjon fra de respektive eksperimentene beskrevet i figur 4. Alle analyser utføres med MATLAB (R2021a) ved hjelp av de egendefinerte kodene som følger med denne artikkelen. Disse kodene genererer plott ved hjelp av de samme dataene som presenteres i denne artikkelen. Merk at mens rådata fra 100 Hz-sporing ble tatt direkte for analyse, ble data fra 1,2 kHz-sporing vanligvis medianfiltrert (med et fempunkts skyvevindu) før analyse for å redusere støy (unntatt støyanalyse).

  1. Eksperimenter med kraftrampe: Analysere kraft-forlengelsesforholdet (f.eks. Elastisitet av polymerer) og overføre kraften for å trekke ut informasjon om nanomekaniske egenskaper.
  2. Eksperimenter med konstant kraft: Analyser tilstandspopulasjoner og oppholdstid (eller overgangshastighet) som en funksjon av kraft for å trekke ut strukturelle (f.eks. Regioner involvert i overgang), termodynamiske (f.eks. Fri energiforskjell) og kinetiske (f.eks. Energibarriere) parametere for konformasjonsendringene.
  3. Krafthopp-eksperimenter: Analyser bruddkinetikk (f.eks. Protein-protein-interaksjoner og reseptor-ligandbinding) eller levetiden til forbigående mellomprodukter (f.eks. Utfoldelse av biomolekyler) for å trekke ut stabiliteten til målmolekyler og deres tilstander.
  4. Som representative applikasjoner, analyser prøvedataene for DNA-hårnåler og SNARE-komplekser:
    1. To-tilstandsoverganger av en DNA-hårnål: unzipping kraft, åpningsavstand, kraftavhengighet av befolkningsforskyvning, og tilstandstildeling og overgangshastighetsmålinger med en skjult Markov-modell (HMM) (MATLAB-koder oppgitt).
    2. Konformasjonelle endringer av SNARE-komplekser: unzipping kraft, kraftavhengighet av mellomtilstander og unzipping latens, hysterese i rezipping og utfolding / refolding oppførsel.
      MERK: Kraftforlengelsesmodeller for DNA-håndtak, DNA-hårnåler og SNARE-komplekse konformasjoner er gitt i tidligere referanser14,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kraftkalibrering
Resultatene fra de to kraftmålingsmetodene (perlenes laterale forskyvningsvarians og effektspektrumanalyse) varierte med 0-2 pN (figur 2G). Ifølge resultatene i figur 2F kan vi pålitelig nå opptil 30 pN med vanlige neodymmagneter.

To-statsoverganger av en 8 bp DNA-hårnål
Vi undersøkte først nanomekanikken til en kort DNA-hårnål (figur 5). DNA-hårnåler har i stor grad blitt preget av konvensjonell enkeltmolekylkraftspektroskopi, og derfor er en stor kilde til referanser å sammenligne med tilgjengelig. Unzipping av en kort hårnål er vanligvis reversibel, så dens rezipping hendelser observeres også i samme kraftområde der unzipping skjer (figur 5A). Ved å påføre en kraftrampe mellom 0 pN og 20 pN (figur 5B) ble den kraftinduserte forlengelsen av hårnålskonstruksjonen verifisert for å følge en WLC-modell, som utelukkende kan tilskrives elastisiteten til DNA-håndtak (figur 5C, "lukket"). Ved rundt 6 pN viste konstruksjonen ytterligere svingninger i forlengelse, assosiert med reversibel unzipping av hårnålsstrukturen (figur 5C, innfelt). Til slutt, ved ~ 8 pN, forsvant overgangen til slutt og utvidelsen slo seg på den øvre tilstanden som ble ytterligere utvidet med ~ 7 nm. Følgelig ble den målte kraftforlengelsesprofilen over 8 pN festet på en ny modellkurve (figur 5C, "åpen") som inkluderer lengden på det enkeltstrengede området av den åpne hårnålen.

Vi utførte deretter konstante krafteksperimenter for å undersøke hårnålsovergangen systematisk. Perleposisjonen ble målt i kraftområdet 4-8 pN med 0,5 pN trinn for ~10 s på hvert nivå; Deretter ble forlengelsesverdiene samlet og analysert for å måle likevektsfordelingen som en funksjon av kraft. Resultatene fra 100 Hz-sporing antydet en gradvis forskyvning mot en mer utvidet tilstand i dette styrkeregimet (figur 5D), men de oppnådde histogrammene for utvidelsen var ikke klare nok til å løse distinkte populasjoner (figur 5E). I sterk kontrast, da de samme eksperimentene ble utført ved 1,2 kHz (figur 5F), avslørte høyhastighetsbanene for forlengelsesendringer etter mild filtrering (fempunkts medianfilter) to distinkte populasjoner som er godt beskrevet av en blanding av to gaussiske fordelinger (figur 5G). Separasjonen mellom de to populasjonene, som indikerer åpningsavstanden til hårnålen, forble uendret på ~ 7 nm i unzipping force-regimet (figur 5H). Avviket i ekstremiteter (4 pN og 8 pN) skyldtes den unøyaktige lokaliseringen av en stat på grunn av dens knapphet.

Dataene viste at midtkraften for unzipping-overgangen (kraften der de lukkede og åpne populasjonene blir like) F1/2 var ~ 6 pN, og den øvre, åpne tilstanden ble gradvis dominerende da vi økte kraften over 4-8 pN (figur 5I). Når det ble utstyrt med en Boltzmann-relasjon for den åpne sannsynligheten, Equation 10ble de eksakte verdiene av F 1/2 = 5,9 pN og Δz = 7,1 nm oppnådd, i samsvar med observasjonene ovenfor. Det skal imidlertid bemerkes at åpningskraften oppnådd fra en enkelt konstruksjon kanskje ikke er nøyaktig på grunn av perle-til-perle-variabiliteten i kraftgenerering, som ble målt til å være ~ 4% for de kommersielle M270-perlene31. Videre, siden stammelengden (8 bp) er kort, kan åpningskraften til andre 8 bp-hårnåler med forskjellig nukleotidsammensetning variere mye20. Til slutt brukte vi HMM på forlengelsessporene for å kartlegge tilstandsovergangen og målte dermed overgangsratene (figur 5F, rødt spor). Både unzipping og rezipping hastigheter varierte eksponentielt med påført kraft (figur 5J), på en slik måte at kraften fremmer unzipping og hemmer rezipping. Om nødvendig kan man videre bruke det klassiske Bell-uttrykket til å trekke ut parametrene i energilandskapet (f.eks. barrierehøyde og avstand)46.

Karakterisering av termisk fluktuasjon i forlengelsesmålinger
Ved hjelp av hårnålskonstruksjonen profilerte vi den kraftavhengige støyen i forlengelsesmålinger. Først ble de termiske fluktuasjonene til en bundet perle beregnet fra ligninger ved hjelp av parametrene (f.eks. perleradius, tetherlengde) som passer for disse eksperimentene2,5 (figur 5K, faste kurver). Vi plottet også standardavviket til forlengelse Equation 11 målt fra tidssporet av en hårnålskonstruksjon på distinkte kraftnivåer. Siden dette molekylet hadde et hårnålsmotiv, ble dets respons under 4 pN (lukket tilstand) brukt til måling av egen støy, mens hårnålsdynamikken ble detektert ~ 6 pN, som forventet, og fungerte som en sjekk. Den kraftavhengige undertrykkelsen av fluktuasjon ble også observert etter at hårnålen ble mest åpen (sammenlign 8 pN vs. 4 pN). Sammenligning med den termiske grensen indikerer at det er rom for forbedring, men denne gjenværende støyen er ofte forbundet med rotasjonsfluktuasjonen til en magnetisk perle30, som er tilfeldig og utfordrende å løse. For mer systematiske analyser av den brownske støyen over observasjonstiden benyttes ofte beregning av Allan-avviket32,33. Vi beregnet Allan-variansen for hårnålsdataene presentert i figur 5F, på samme måte som 5 kbp-målingene i figur 2C. Resultatene i figur 5L viser at vi i mellomkraftområdet 4-8 pN oppnådde 2-3 nm Allan-avvik ved maksimal hastighet (1,2 kHz), og denne verdien falt til under 1 nm for observasjonstiden (τ) lengre enn 0,1 s. Interessant nok oppsto hårnålsdynamikken rundt 5-7 pN for ~ 0,01 s (figur 5L, innfelt), i samsvar med den målte overgangskraften og hastighetene i figur 5I,J.

Konformasjonelle endringer av neuronale SNARE-komplekser
Vi brukte deretter neuronale SNARE-komplekser som en proteinmodell og undersøkte deres kraftavhengige mekaniske egenskaper. I motsetning til hårnålskonstruksjonen ble enkle SNARE-komplekser holdt mellom to 510 bp dsDNA-håndtak (figur 6A). Det skal bemerkes at endepunktene til syntaksin-1A og VAMP2, distale fra håndtakene, ble kryssbundet av en disulfidbinding mellom kunstige cysteinrester for å unngå brudd og muliggjøre flere runder med pinsett av en gitt konstruksjon.

Vi brukte først en kraftrampe, både med økende og synkende kraftnivåer (± 1 pN s-1) for å strekke og slappe av målkonstruksjonen, henholdsvis. I lav- til midtkraftregimet (0-10 pN) oppførte de to håndtakene seg uavhengig av hverandre som WLC-polymerer, og formet generelt kraftforlengelseskurven som ikke kunne skilles fra 1 kbp dsDNA (figur 6B, svart). Men da kraften ble økt til over 10 pN, avvek forlengelsesverdiene betydelig fra WLC-modellen, noe som indikerer at det innebygde SNARE-komplekset viste en ytterligere økning i forlengelse. Mer spesifikt kan utvidelsesøkningen oppsummeres i tre forskjellige trinn: (a) en liten, gradvis økning i 11-13 pN, (b) raske og større (~ 10 nm) svingninger i 14-16 pN, og (c) den endelige, irreversible unzipping på ca ~ 20 nm. I tillegg, når kraften ble senket for å slappe av konstruksjonen, klikket forlengelsen enten tilbake til den opprinnelige kraftforlengelseskurven ved en lavere kraft (<15 pN) eller fulgte en ny modellkurve med større forlengelse (figur 6B, blå). Den totale utvidelsen ble til slutt gjenopprettet til de lavere verdiene (fra blå til svart i figur 6B) under 5 pN, og de samme kraftrampesyklusene kunne brukes, noe som viste en lignende trend.

Fra den molekylære modellen av SNARE-komplekskonformasjon kan vi nøyaktig beregne mulige forlengelsesverdier for potensielle mellomprodukter (figur 6C). Videre, forutsatt WLC-oppførselen for de ikke-kveilede polypeptidene, kan utvidelsene estimeres som en funksjon av kraft, og dermed generere de fulle kraftforlengelsesmodellene for de forskjellige konformasjonene (figur 6B, stiplede linjer). Ved å ta disse verdiene som referanse, tolket vi de ovennevnte overgangene som følger 14,23: (a) et gradvis skifte fra full glidelås (FZ) til linker-åpen tilstand (LO) i 11-13 pN, noe som innebærer åpningen av linkerregionene til syntaxin-1A og VAMP2; (b) rask overgang mellom LO og halvglidelås (HZ), noe som innebærer åpning av et SNARE-kompleks opp til null-ionelaget; og (c) den endelige overgangen til enten unzipped (UZ) eller unfolded state (UF), noe som innebærer en fullstendig oppløsning av VAMP2 fra resten av komplekset. UZ-tilstanden er forskjellig fra UF ved at det tilknyttede molekylet av SNAP-25 fortsatt er bundet til syntaksin-1A, og opprettholder et binært kompleks. I tilfelle av UF (uten SNAP-25) kan hele SNARE-komplekset bare regenereres etter et fritt SNAP-25-molekyl fra løsningen rekombinerer, hvor senking av den påførte kraften for å tillate slik ombinding er kritisk.

For å verifisere konformasjonsendringene i SNARE-komplekser på en mer systematisk måte, utførte vi deretter krafthoppeksperimenter i kraftregimet, hvor konformasjonsfluktuasjoner ofte ble observert ved 14-15 pN (figur 6D). Vanligvis startet vi først med å måle dråpeposisjonen ved 10 pN og sjekket for den stabile forlengelsen, noe som indikerer fravær av SNARE-relaterte endringer. Deretter ble kraftnivået brått økt til 14-15 pN, hvor forlengelsen ble overvåket til utpakking skjedde, hvis noen. Til slutt ble kraften redusert tilbake til 10 pN for å se etter vedvarende økning i forlengelse forbundet med utfoldelse. Ved 14 pN holdt forlengelsessporene seg stort sett i LO-staten, med sporadiske pigger til HZ-staten. Det skal bemerkes at disse korte utfluktene til HZ-tilstanden sannsynligvis vil bli savnet i 100 Hz-sporing, som gjennomsnitt og ned-sampler perlebilder med en faktor på 12. Til tross for de klare og hyppige besøkene til HZ-staten, klarte komplekset ikke å gjøre en fullstendig overgang til UZ-tilstanden (figur 6E), noe som tyder på at den eksterne kraften ikke var sterk nok til å overvinne energibarrieren for å pakke ut. I motsetning til dette gjorde selv en liten økning i kraft (til 14, 3 pN) overgangen svært effektiv, slik at UZ-tilstanden ble nådd for det meste innen få sekunder (figur 6F). Konsekvent var unzipping ferdig for det meste innen 1 s da vi påførte 14,5 pN på komplekset (figur 6G,H). Spesielt førte utpakking ved høyere krefter ofte til fullstendig utfoldelse av hele komplekset (ledsaget av fjerning av SNAP-25), noe som gjenspeiles av den lille ekstra økningen i forlengelse over UZ (figur 6H) og av omfoldingssignaturen observert ved 2 pN (figur 6I). Samlet sett viser disse dataene den klassiske slip-bond-oppførselen47 for utfoldelse av SNARE-komplekser, i samsvar med tidligere rapporter 14,23,48.

Figure 1
Figur 1: Instrumentoppsett. Skjematisk (A) og fotografi (B) av et høyhastighets MT-oppsett. Magneter styrt av en lineær og en rotasjonsmotor er plassert over prøvetrinnet til et invertert mikroskop utstyrt med en 100x olje-nedsenkingslinse og et høyhastighets CMOS-kamera. Lysstrålen fra en superluminescerende diode passerer gjennom magneter og belyser feltet. Innfelt: Representative diffraksjonsbilder av perler som befinner seg i forskjellige avstander fra fokalplanet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kraftkalibrering. (A) Skjematisk fremstilling av en kraftkalibreringsprøve. Størrelsene på kraften som utøves av et antiparallelt par magneter med 1 mm separasjon, måles som en funksjon av magnetavstand d fra forskyvningene av en magnetisk perle (M270) bundet av et 5 kbp dsDNA-fragment. (B) Representative data fra kraftkalibreringsprosedyren. Fargede piler angir områder som er utvidet i (D) (samsvarende farger). (C) Allan-avvik for z-posisjonen til en 5 kbp bundet perle målt med 15-20 pN. Kurver for den magnetiske perlens z-koordinater før (blå) og etter (rød) fratrekk av referansedråpeposisjonen vises. (D) Representativ tidsserie for y-posisjonen målt ved den angitte magnetavstanden d. Det korresponderende histogrammet for y-koordinatfordeling er vist til høyre med et gaussisk anfall (rødt). (E) Representativ PSD fra dataene vist i (D). Kraftverdiene oppnådd ved å montere en modell (rød) til de respektive PSD-ene er gitt øverst. (F) Kalibrering av magnetisk kraft som funksjon av magnetavstand. Krefter ble målt enten fra variansen (venstre) eller fra PSD-metoden (høyre). Tilpasningen (rød) indikerer en dobbel eksponentiell modell med den kommenterte ligningen. (G) Forskjell i målt kraft oppnådd fra varians og PSD. En rød kurve beregnes for tilpasningene vist i (F). (H,I) Verifikasjon av kraftutvidelsesforholdet til 5 kbp-kalibreringskonstruksjonen. De gjennomsnittlige ekstensjonsverdiene ved distinkte kraftnivåer (målt fra varians) ble brukt enten direkte (H) eller etter korrigering for perlehøydeforskyvningen (I) på grunn av helling av en off-centered perle31. Kraftforlengelsesdataene for n = 5 molekyler ble montert av en utvidbar WLC-modell, og de tilpassede parametrene (persistenslengde Lp og strekkmodul Ko) er kommentert øverst (gjennomsnittlig ± s.d.). Forkortelse: PSD = effektspektral tetthet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Prøvepreparering . (A) Fremstilling av 8 bp DNA-hårnålskonstruksjoner ved PCR-amplifisering av et 1 kbp-område av λ-DNA. (B) Fremstilling av SNARE-komplekskonstruksjoner med to 510 bp DNA-håndtak. Innfelt: Verifisering av DNA-håndtak og deres vedlegg til proteiner ved agarosegelelektroforese (2% gel). Pilene indikerer mobilitetsskiftet (fargekodet) av produktarter: frie 510 bp-håndtak (magenta); Håndtak B festet til syntaksin (rød), til ΔN-kompleks (grønn) og til SNARE-kompleks (blå); og det siste tohåndterte SNARE-komplekset (grønt). Tilsetningen av SDS forstyrrer ΔN-kompleksene (tilstede i b), men ikke de fulle SNARE-kompleksene dannet av VAMP2 i full lengde (tilstede i c). (C) Design og fotografi av en flytcelle for MT-eksperimenter. (D) Skjematisk fremstilling av sekvensiell innføring av prøveløsninger i en flytcellekanal. Forkortelse: MT = magnetisk pinsett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Typer representative eksperimenter. (A-C) Skjemaer over kraftrampe-, kraftklemme- og krafthoppeksperimenter (øverst) med representative tidsspor av forlengelse fra de tilsvarende målingene (midten). Hvilke typer analyser som kan utføres er vist nederst. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: To-statlig overgang av en 8 bp DNA-hårnål. (A) Skjematisk fremstilling av MT-eksperimenter på en DNA-hårnål med forventet unzipping og rezipping overgang. (B) Representativt spor av konstruksjonsforlengelse fra kraftrampeeksperimenter med økende (~0,25 pN s−1) kraftnivåer. (C) Representativ kraftforlengelseskurve rekonstruert fra dataene i (B). Gule kurver indikerer WLC-modeller for hårnålskonstruksjonen med hårnålen i den lukkede (heldekkende) og åpne (stiplede) konformasjonen. (D) Representativt forlengelsesspor fra konstantkrafteksperimenter med økende kraftnivåer, målt ved 100 Hz. (E) Histogrammer av forlengelsesdata i (D). (F,G) Resultater for de samme eksperimentene i (D) og (E), men med 1,2 kHz sporing. Den rå tidsserien på 1,2 kHz ble jevnet ut ved å bruke et fempunkts medianfilter. Røde spor i det utvidede bildet av (F) ble hentet fra en HMM. Røde linjer i (G) angir plasseringen av gaussiske populasjoner. (H) Avstand mellom de to populasjonene i (G). (I) Sannsynlighet i åpen tilstand som en funksjon av den påførte kraften. Den røde kurven er en tilpasset Boltzmann-modell (Equation 10 ) med midtkraften F1/2 = 5,9 pN. (J) Overgangshastigheter for utpakking og glidelås målt fra HMM-resultatene. Heltrukne linjer indikerer eksponentiell avhengighet av kraft. (K) Termisk fluktuasjon i forlengelsesmålinger. Standardavvik for hårnålsforlengelsesdata (uten filtrering) vises som en funksjon av kraft. Den termiske oppløsningsgrensen som representerer den teoretiske størrelsen på termiske fluktuasjoner ble estimert fra Eq. 9 i arbeidet av Choi et al.2 for en 2.8 μm perle med en 1 kbp tether. (L) Allan-avvik beregnet fra 1,2 kHz hårnålsdata i (F) (uten filtrering). Innfelt viser Allan-avviket ved 0,01 s som en funksjon av kraft, som demonstrerer en gradvis økning og reduksjon av svingninger på grunn av hårnålsdynamikken. Forkortelse: MT = magnetisk pinsett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Konformasjonelle endringer av nevronale SNARE-komplekser. (A) Skjematisk fremstilling av MT-eksperimenter på SNARE-komplekser. (B) Representative kraftforlengelseskurver for SNARE-konstruksjonen. Svarte og blå spor (100 Hz) ble oppnådd fra henholdsvis strekk og avslappende perioder i kraft-rampe-eksperimenter. Stiplede linjer indikerer forlengelsesmodeller, som tar hensyn til de forskjellige konformasjonene av SNARE-komplekser vist i (C). (C) Molekylære modeller av SNARE-komplekskonformasjoner med tilsvarende beregnede utvidelser. Verdiene ble estimert fra de geometriske parametrene til spiralformede bunter og en WLC-modell for polypeptidregionen14. (D) Skjematisk av krafthoppeksperimenter for å undersøke SNARE-komplekse konformasjoner. (E-H) Representative forlengelsesspor fra krafthoppeksperimenter utført på de angitte kraftnivåene. I (E) ble det ikke observert utpakking. I (F) og (G) ble det observert unzipping etterfulgt av rezipping ved 10 pN. I (H) ble utpakking etterfulgt av en ytterligere utfoldelse. (I) Refolding av et SNARE-kompleks ved 2 pN. En klar reduksjon i forlengelse fra UF til FZ tilstand ble observert ved 5 pN. Forkortelse: MT = magnetisk pinsett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

PCR-innstilling Betingelse
Materialer 1,25 μg/ml λ-DNA (mal), 1 μM forover og bakover, 0,2 mM dNTP, 0,05 U/μL nTaq, 1x nTaq-buffer
Denaturering 95 °C i 30 s
Annealing Kalibreringskonstruksjon: 55 °C i 30 s
DNA-hårnål: 57 °C i 30 s
DNA-håndtak: 50 °C i 30 s
Forlengelse DNA-hårnål og håndtak: 72 °C i 1 min
Kalibreringskonstruksjon: 72 °C i 5 min
Sykkel 30–34
Agarosegel elektroforese
Gel 2 % agarose i 0,5x trisborat-EDTA (TBE, pH 8,3) inneholdende 1x SYBR Safe
Løping Full effekt (108 V gjennomsnitt) på Mupid-2plus (Advance), 40-50 min

Tabell 1: Betingelser for PCR-reaksjoner og agarosegelelektroforese. Reaksjonsparametere for PCR av DNA-konstruksjoner, inkludert 5 kbp dsDNA for kraftkalibrering, DNA-hårnålskonstruksjon og DNA-håndtak for å feste SNAREer. Primersekvenser er gitt i materialfortegnelsen.

Protein rensing buffer Komposisjon
Vask buffer A 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCl, 7 mM β-merkaptoetanol (BME), 10% glyserol og 20 mM imidazol
Vask buffer B 50 mM HEPES (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10 % glyserol og 20 mM imidazol
Lysis Buffer Vaskebuffer A supplert med 1% Triton X-100, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) og 1x proteasehemmercocktail
Elution Buffer Vaskebuffer B supplert med 400 mM imidazol
Fosfatbufret saltvann (PBS) 81 mM natriumfosfatdibasisk (Na 2 HPO 4), 19 mM natriumfosfat monobasisk (NaH 2 PO4) (pH7,2), 150 mM NaCl
fosfat buffer 81 mM Na 2 HPO4, 19 mM NaH2PO 4, pH7,4

Tabell 2: Buffere og deres sammensetning. Sammensetning av buffere som brukes til proteinrensing.

Tilleggsfigur S1: Tegning av magnetholder. Dimensjoner på en akrylholder for to 10 mm x 10 mm x 12 mm magneter med et 1 mm gap er vist. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 1: En zippet fil som inneholder MATLAB-koder. MATLAB-skript for analyse av data produsert av høyhastighets magnetisk pinsetteksperimenter, inkludert kraftkalibrering, hårnål og SNARE-kompleksanalyse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: LabVIEW programvarepakke zippet fil. En komplett pakke med LabVIEW-koder for å betjene et høyhastighets magnetisk pinsettoppsett og skaffe data med det. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbeidet introduserte vi et enkeltmolekylært kraftspektroskopioppsett som kan observere strukturelle endringer av biomolekyler ved høy spatiotemporal presisjon. Det høyhastighets CMOS-kameraet som brukes, får 1,200 bilder s-1 ved 1,280 x 1,024 oppløsning, noe som muliggjør 1.2 kHz perlesporing. Imidlertid er hastigheten på målingene for øyeblikket begrenset av perlesporingsprogramvaren, så avkastningen reduseres vanligvis til mindre områder i høyhastighetsmålinger. Den høye effekten til SLD gir en lys belysning som er kritisk for rask dråpeavbildning opp til noen få kHz båndbredde. Videre genererer strålens romlige sammenheng konsentriske diffraksjonsringer med høy kontrast rundt perlene (figur 1A, innfelt), som muliggjør presis bestemmelse av dråpeposisjonen basert på symmetri.

Den magnetiske kraften som utøves på en perle-tether-konstruksjon kan bestemmes ved å måle de brownske fluktuasjonene til den bundne perlen35,37,38. Siden sanntids kraftanalyse er beregningstung, måles den påførte kraften vanligvis på forhånd ved hjelp av en referansekonstruksjon. For eksempel er de magnetiske kulene som skal brukes bundet av lange (>5 kbp) dsDNA-fragmenter, og de tilsvarende termiske fluktuasjonene i perleposisjon måles som en funksjon av magnetavstanden (figur 2A). Kraftkalibreringen utføres vanligvis en gang etter at oppsettet er bygget, men det er ikke nødvendig å gjenta det regelmessig med mindre oppsettet endres, for eksempel ved å erstatte magneter. Siden den karakteristiske frekvensen av dråpefluktuasjon øker med den påførte kraften2, er et høyhastighetsoppsett spesielt nyttig for å fange den raske dynamikken i et høykraftsregime og måle kraften nøyaktig. Kraftestimering fra varians er mye enklere i implementeringen enn spektralanalysen i frekvensdomenet, men den er utsatt for artefakter fra drift, kamerabasert oppkjøp og forlengelsesendringene på grunn av off-sentrert perlefeste31,37,38. Likevel varierer resultatene fra de to metodene med bare 0-2 pN hvis de er riktig oppnådd (figur 2G); Så variansmetoden er pålitelig nok når den absolutte bestemmelsen av kraft ikke er kritisk.

For høyere krefter over 30 pN og rundt 65 pN (hvor dsDNA-overstrekking fungerer som referanse), må enten kommersielt tilgjengelige høyverdige (N50-N52) magneter installeres, gapet mellom magnetene må reduseres, eller magnetfeltet må konstrueres ytterligere28,49. I dette oppsettet er den raskeste hastigheten til den vertikale motoren 30 mm / s, noe som tillater et krafthopp fra 0 pN til 20 pN i ~ 0.6 s. Noen raske kraftavhengige strukturelle endringer kan gå glipp av hvis motorbevegelsen begrenser kraftbelastningshastigheten. Avhengig av applikasjonen, kan det være nødvendig med endringer i og ytterligere optimalisering av måten magneter flyttes på. Et eksempel er kreativ bruk av magnetbåndhode15.

For høyoppløselige målinger med MT-er er det viktig å evaluere støynivået fra forskjellige kilder. Når de optiske komponentene (et mikroskop med en høy forstørrelseslinse, lyskilde og raskt kamera) er riktig konfigurert, kan sub-nanometer presisjon i perlesporing oppnås. Deretter blir den viktigste støykilden den brownske bevegelsen til en perle, som brukes til å måle den påførte kraften. Den termiske svingningen til en bundet perle avhenger av dens radius, tetherlengde og den påførte kraften. Selv om den inneboende svingningen i z-retning (dvs. forlengelsesendringer) bare avhenger av termisk energi og tether-stivhet, filtrerer perle-tether-dynamikken og hastigheten på kamerabasert oppkjøp perlens bevegelse og dermed overvåking av målbiomolekyler i sin tur. Derfor må dråpestørrelse og samplingsrate velges strategisk for å oppnå god spatiotemporal oppløsning. Som et alternativ til 2,8 μm perlen vi brukte, er mindre 1 μm perler også populære og kan være fordelaktige for raske målinger på grunn av deres raske respons. En kritisk svakhet er imidlertid det lille magnetiske innholdet, som begrenser den maksimale kraften som kan genereres (Equation 12 ). Siden mindre perler fortsatt kan utøve kraft minst opp til 10 pN, kan de være egnet for å studere svake kraftfenomener, for eksempel i DNA-supercoiling. I motsetning til dette krever undersøkelser av molekylære motorer, proteinfolding (f.eks. SNAREs, vist her) eller cellemekanikk50 anvendelse av høyere krefter, i så fall kan man vurdere å endre magnetkonfigurasjonen (f.eks. redusere gapet eller avstanden) for å utvide rekkevidden av gjeldende kraft 28,51.

Fordi teknikken undersøker de nanomekaniske responsene til målmolekyler mens den påfører en kraft på biofysisk relevant skala, er den ideell for å studere kraftfølsomme elementer som spiller sentrale roller i mekanobiologiske prosesser. For å illustrere den brede anvendeligheten av den høypresisjons MT-analysen, benyttet vi både en nukleinsyre og en proteinmodell som viser dynamiske og raske konformasjonsendringer ved bruk av en piconewton-skalakraft. En begrensning av teknikken er kravet om rensede nukleinsyrer og proteiner, noe som spesielt har motvirket sin brede utvidelse til et bredt spekter av proteiner. Utviklingen av in vitro proteinekspresjon og konjugasjonsteknologier vil fortsette å gi tilgang til mindre studerte proteiner. Et beslektet problem er at a priori kunnskap om målstrukturen ofte er kritisk for designeksperimenter (f.eks. Vedlegg av håndtak). Vi forventer at ankomsten av enkeltpartikkelkryo-EM 52 ogAlphaFold2 53 vil sterkt støtte design og analyse av mekaniske målinger på enkeltproteinmolekyler og frigjøre kraftigere applikasjoner av høyoppløselig MT.

Utpakkingskraften til DNA-hårnåler avhenger av mange faktorer, inkludert sekvens, struktur og buffersammensetning, men mest kritisk på stammelengde og guanin-cytosin (GC) innhold20. For å demonstrere kraften i høyhastighetssporing, designet vi med vilje en 8 bp-stamme (med tre GC-basepar) som var forventet å utfolde seg med lav kraft med rask dynamikk. Faktisk viser resultatene i figur 5 at en slik rask dynamikk ville vært vanskelig å løse med standardteknikker med en oppløsning på 10 ms eller lavere. Dette aspektet bekreftes ytterligere av overgangsratene målt fra HMM-analyse, hvor de høye hastighetene varierte mellom 100 og 200 s-1 (figur 5J).

Neuronale SNAREs antas å drive synaptisk vesikkeleksocytose. Spesielt katalyserer SNARE-proteinene membranfusjon ved å senke den tilhørende energibarrieren, slik som elektrostatisk frastøtning mellom vesikkel og plasmamembraner. Følgelig er konformasjonelle fluktuasjoner av SNARE-kompleksene funnet å forekomme i et smalt kraftområde på 12-15 pN, som tilsvarer det forventede nivået av frastøtende krefter14,23. Ved å bruke høyhastighets MT som er beskrevet her, rekapitulerte vi de viktigste funnene om den kraftavhengige oppførselen til neuronale SNARE-komplekser. Krafthysteresen ved utpakking og rezipping (figur 6B) indikerer at rezipping skjer ved en lavere kraft enn unzipping, og derfor arbeides det i løpet av denne syklusen. Slike ikke-likevektsoverganger nærmer seg bedre ved krafthoppeksperimenter, der latensen til overgang under belastning (ligner en bindingsbruddhendelse) eller konformasjonsfluktuasjoner før unzipping kan måles. Begge tilfellene drar nytte av høyhastighetsoppsett, som illustrert av nyere studier på de forbigående tilstandene til biomolekyler og deres komplekser 15,17,54,55,56.

Samlet stemmer disse resultatene med de karakteristiske kraftavhengige endringene av DNA-hårnåler og neuronale SNARE-komplekser rapportert med konvensjonell enkeltmolekylkraftspektroskopi. Samtidig understreker de nytten av mekaniske målinger med høy presisjon for å avsløre kraftfølsomheten til biomolekyler og deres samlinger. Vi håper denne artikkelen kan tiltrekke seg flere mennesker fra mekanobiologi, og motivere forskere til å ansette høyhastighets MT-er for å undersøke deres unike interessesystemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation of Korea (NRF) tilskudd finansiert av den koreanske regjeringen (MSIT) (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 og NRF- 2021R1A6A1A10042944). S.-H.R. ble støttet av NRF-stipendet (2021R1C1C2009717).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for construct synthesis
Agarose gel electrophoresis system Advance Mupid-2plus
DNA ladder Bioneer D-1037
nTaq polymerase Enzynomics P050A
PCR purification kit LaboPass CMR0112
PEGylated SMCC crosslinker / SM(PEG)2 ThermoFisher Scientific 22102 For SNARE–DNA coupling
Primer B Bioneer 5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For 5-kbp force calibration construct and DNA handles
Primer B_hp IDT 5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT
TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'		 For hairpin construct
Primer N Bioneer 5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3' For DNA handles
Primer Z Bioneer 5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For DNA handles
Primer Z_5k Bioneer 5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA
TCG-3'		 For 5-kbp force calibration construct
Primer Z_hp Bioneer 5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3' For hairpin construct
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher Scientific S33102
λ-DNA Bioneer D-2510 Template strand for PCR
DNA sequences for SNARE proteins
6×His-tagged SNAP-25b (2-206; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctat
gagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca
gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcgg
aagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGGCAGC
AGCCATCATCATCATCATCACA
GCAGCGGCCTGGTGCCGCGC
GGCAGCCATACTAGCGGAGAT
ATCGCCGAGGACGCAGACAT
GCGCAATGAGCTGGAGGAGA
TGCAGAGGAGGGCTGACCAG
CTGGCTGATGAGTCCCTGGA
AAGCACCCGTCGCATGCTGC
AGCTGGTTGAAGAGAGTAAA
GATGCTGGCATCAGGACTTT
GGTTATGTTGGATGAGCAAG
GCGAACAACTGGAACGCATT
GAGGAAGGGATGGACCAAAT
CAATAAGGACATGAAAGAAG
CAGAAAAGAATTTGACGGAC
CTAGGAAAATTCGCCGGCCT
TGCCGTGGCCCCCGCCAAC
AAGCTTAAATCCAGTGATGC
TTACAAAAAAGCCTGGGGC
AATAATCAGGATGGAGTAGT
GGCCAGCCAGCCTGCCCG
TGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTG
GCTTCATCCGCAGGGTAAC
AAATGATGCCCGGGAAAAT
GAGATGGATGAGAACCTG
GAGCAGGTGAGCGGCATC
ATCGGAAACCTCCGCCAC
ATGGCTCTAGACATGGGCA
ATGAGATTGACACCCAGA
ATCGCCAGATCGACAGGA
TCATGGAGAAGGCTGATT
CCAACAAAACCAGAATTG
ATGAAGCCAACCAACGTG
CAACAAAGATGCTGGGAA
GTGGTTAAggatccgaattcgag
ctccgtcgacaagcttgcggccgcactc
gagcaccaccaccaccaccactgagat
ccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgag
caataactagcataaccccttggggcct
ctaaacgggtcttgaggggttttttgctga
aaggaggaactatatccggat
6×His-tagged VAMP2 (2-97, L32C/I97C; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca
gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc
ggaagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGGCAGC
AGCCATCATCATCATCATCAC
AGCAGCGGCCTGGTGCCGC
GCGGCAGCCATATGGCAGAT
CTCTCGGCTACCGCTGCCAC
CGTCCCGCCTGCCGCCCCG
GCCGGCGAGGGTGGCCCCC
CTGCACCTCCTCCAAATCTTA
CCAGTAACAGGAGATGCCAG
CAGACCCAGGCCCAGGTGG
ATGAGGTGGTGGACATCATG
AGGGTGAATGTGGACAAGGT
CCTGGAGCGAGACCAGAAG
CTATCGGAACTGGATGATCG
CGCAGATGCCCTCCAGGCA
GGGGCCTCCCAGTTTGAAA
CAAGTGCAGCCAAGCTCAA
GCGCAAATACTGGTGGAAA
AACCTCAAGATGATGTGCTA
Aggatccgaattcgagctccgtcg
acaagcttgcggccgcactcgagcaccacca
ccaccaccactgagatccggctgctaacaaa
gcccgaaaggaagctgagttggctgctgcca
ccgctgagcaataactagcataaccccttgg
ggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg
ctgaaaggaggaactatatccggat
6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49–96; capitalized) and Syntaxin-1A (191–267, I202C/I266C; capitalized) in pETDuet-1 homemade ggggaattgtgagcggataacaattcccctc
tagaaataattttgtttaactttaagaagga
gatataccATGGGCAGCAGCCATCA
TCATCATCATCACAGCAGCGG
CCTGGAAGTTCTGTTCCAGGG
GCCCGGTAATGTGGACAAGGT
CCTGGAGCGAGACCAGAAGCT
ATCGGAACTGGATGATCGCGC
AGATGCCCTCCAGGCAGGGGC
CTCCCAGTTTGAAACAAGTGC
AGCCAAGCTCAAGCGCAAATAC
TGGTGGAAAAACCTCAAGATGAT
GTAAgcggccgcataatgcttaagtcgaaca
gaaagtaatcgtattgtacacggccgcataa
tcgaaattaatacgactcactataggggaat
tgtgagcggataacaattccccatcttagta
tattagttaagtataagaaggagatatacat
ATGGCCCTCAGTGAGATCGAGA
CCAGGCACAGTGAGTGCATC
AAGTTGGAGAACAGCATCCG
GGAGCTACACGATATGTTCAT
GGACATGGCCATGCTGGTGG
AGAGCCAGGGGGAGATGATT
GACAGGATCGAGTACAATGTG
GAACACGCTGTGGACTACGTG
GAGAGGGCCGTGTCTGACACC
AAGAAGGCCGTCAAGTACCAG
AGCAAGGCACGCAGGAAGAA
GTGCATGATCTAActcgagtc
tggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaa
cgccagcacatggactcgtctactagcgcag
cttaattaacctaggctgctgccaccgctga
gcaataactagcataaccccttggggcctct
aaacgggtcttgaggggttttttgctgaaag
gaggaactatatccggattggcgaatgggac
gcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgg
gtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac
acttgccagcgccctagcgcccgctcctttc
gctttcttcccttcctttctcgccacgttcg
ccggctttccccgtcaagctctaaatcgggg
gctccctttagggttccgatttagtgcttta
cggcacctcgaccccaaaaaacttgattagg
gtgatggttcacgtagtgggccatcgccctg
atagacggtttttcgccctttgacgttggag
tccacgttctttaatagtggactcttgttcc
aaactggaacaacactcaaccctatctcggt
ctattcttttgatttataagggattttgccg
atttcggcctattggttaaaaaatgagctga
tttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaa
aatattaacgtttacaatttctggcggcacg
atggcatgagattatcaaaaaggatcttcac
ctagatccttttaaattaaaaatgaagtttt
aaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtga
ggcacctatctcagcgatctgtctatttcgt
tcatccatagttgcctgactccccgtcgtgt
agataactacgatacgggagggcttaccatc
tggccccagtgctgcaatgataccgcgagac
ccacgctcaccggctccagatttatcagcaa
taaaccagccagccggaagggccgagcgca
gaagtggtcctgcaactttatccgcctccatc
cagtctattaattgttgccgggaagctagag
taagtagttcgccagttaatagtttgcgcaa
cgttgttgccattgctacaggcatcgtggtg
tcacgctcgtcgtttggtatggcttcattca
gctccggttcccaacgatcaaggcgagttac
atgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggtt
agctccttcggtcctccgatcgttgtcagaa
gtaagttggccgcagtgttatcactcatggt
tatggcagcactgcataattctcttactgtc
atgccatccgtaagatgcttttctgtgactg
gtgagtactcaaccaagtcattctgagaata
gtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccg
gcgtcaatacgggataataccgcgccacata
gcagaactttaaaagtgctcatcattggaaa
acgttcttcggggcgaaaactctcaaggatc
ttaccgctgttgagatccagttcgatgtaac
ccactcgtgcacccaactgatcttcagcatc
ttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaa
aacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagg
gaataagggcgacacggaaatgttgaatact
catactcttcctttttcaatcatgattgaag
catttatcagggttattgtctcatgagcgga
tacatatttgaatgtatttagaaaaataaac
aaataggtcatgaccaaaatcccttaacgtg
agttttcgttccactgagcgtcagaccccgt
agaaaagatcaaaggatcttcttgagatcct
ttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaa
caaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttg
tttgccggatcaagagctaccaactcttttt
ccgaaggtaactggcttcagcagagcgcaga
taccaaatactgtccttctagtgtagccgta
gttaggccaccacttcaagaactctgtagca
ccgcctacatacctcgctctgctaatcctgt
taccagtggctgctgccagtggcgataagtc
gtgtcttaccgggttggactcaagacgatag
ttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaa
cggggggttcgtgcacacagcccagcttgga
gcgaacgacctacaccgaactgagataccta
cagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttccc
gaagggagaaaggcggacaggtatccggta
agcggcagggtcggaacaggagagcgcac
gagggagcttccagggggaaacgcctggtatc
tttatagtcctgtcgggtttcgccacctctg
acttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtca
ggggggcggagcctatggaaaaacgccagc
aacgcggcctttttacggttcctggccttttg
ctggccttttgctcacatgttctttcctgcg
ttatcccctgattctgtggataaccgtatta
ccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgc
agccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtg
agcgaggaagcggaagagcgcctgatgcgg
tattttctccttacgcatctgtgcggtatttc
acaccgcatatatggtgcactctcagtacaa
tctgctctgatgccgcatagttaagccagta
tacactccgctatcgctacgtgactgggtca
tggctgcgccccgacacccgccaacacccgc
tgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccg
gcatccgcttacagacaagctgtgaccgtct
ccgggagctgcatgtgtcagaggttttcacc
gtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcgg
taaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgatt
cacagatgtctgcctgttcatccgcgtccag
ctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtc
tggcttctgataaagcgggccatgttaaggg
cggttttttcctgtttggtcactgatgcctc
cgtgtaagggggatttctgttcatgggggta
atgataccgatgaaacgagagaggatgctca
cgatacgggttactgatgatgaacatgcccg
gttactggaacgttgtgagggtaaacaactg
gcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaa
tcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaa
tacagatgtaggtgttccacagggtagccag
cagcatcctgcgatgcagatccggaacataa
tggtgcagggcgctgacttccgcgtttccag
actttacgaaacacggaaaccgaagaccatt
catgttgttgctcaggtcgcagacgttttgc
agcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtat
cggtgattcattctgctaaccagtaaggcaa
ccccgccagcctagccgggtcctcaacgaca
ggagcacgatcatgctagtcatgccccgcgc
ccaccggaaggagctgactgggttgaaggct
ctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcct
aatgagtgagctaacttacattaattgcgtt
gcgctcactgcccgctttccagtcgggaaac
ctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggcc
aacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgg
gcgccagggtggtttttcttttcaccagtga
gacgggcaacagctgattgcccttcaccgcc
tggccctgagagagttgcagcaagcggtcca
cgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctg
tttgatggtggttaacggcgggatataacat
gagctgtcttcggtatcgtcgtatcccacta
ccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccgga
ctcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgcc
atctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgg
gaacgatgccctcattcagcatttgcatggt
ttgttgaaaaccggacatggcactccagtcg
ccttcccgttccgctatcggctgaatttgat
tgcgagtgagatatttatgccagccagccag
acgcagacgcgccgagacagaacttaatggg
cccgctaacagcgcgatttgctggtgaccca
atgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgt
accgtcttcatgggagaaaataatactgttg
atgggtgtctggtcagagacatcaagaaata
acgccggaacattagtgcaggcagcttccac
agcaatggcatcctggtcatccagcggatag
ttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcga
gaagattgtgcaccgccgctttacaggcttc
gacgccgcttcgttctaccatcgacaccacc
acgctggcacccagttgatcggcgcgagatt
taatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtg
cagggccagactggaggtggcaacgccaatc
agcaacgactgtttgcccgccagttgttgtg
ccacgcggttgggaatgtaattcagctccgc
catcgccgcttccactttttcccgcgttttc
gcagaaacgtggctggcctggttcaccacgc
gggaaacggtctgataagagacaccggcata
ctctgcgacatcgtataacgttactggtttc
acattcaccaccctgaattgactctcttccg
ggcgctatcatgccataccgcgaaaggtttt
gcgccattcgatggtgtccgggatctcgacg
ctctcccttatgcgactcctgcattaggaag
cagcccagtagtaggttgaggccgttgagca
ccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaagga
gatggcgcccaacagtcccccggccacgggg
cctgccaccatacccacgccgaaacaagcgc
tcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttc
cccatcggtgatgtcggcgatataggcgcca
gcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccgg
ccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagat
cgatctcgatcccgcgaaattaatacgactc
actata
SNAP-25b (1–206, all C to A; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcc
agggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc
ggaagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGCCGA
GGACGCAGACATGCGCAATG
AGCTGGAGGAGATGCAGAGG
AGGGCTGACCAGCTGGCTGA
TGAGTCCCTGGAAAGCACCC
GTCGCATGCTGCAGCTGGTT
GAAGAGAGTAAAGATGCTGG
CATCAGGACTTTGGTTATGTT
GGATGAGCAAGGCGAACAAC
TGGAACGCATTGAGGAAGGG
ATGGACCAAATCAATAAGGAC
ATGAAAGAAGCAGAAAAGAAT
TTGACGGACCTAGGAAAATTC
GCCGGCCTTGCCGTGGCCCC
CGCCAACAAGCTTAAATCCAG
TGATGCTTACAAAAAAGCCTG
GGGCAATAATCAGGATGGAGT
AGTGGCCAGCCAGCCTGCCC
GTGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTGGC
TTCATCCGCAGGGTAACAAAT
GATGCCCGGGAAAATGAGATG
GATGAGAACCTGGAGCAGGT
GAGCGGCATCATCGGAAACCT
CCGCCACATGGCTCTAGACAT
GGGCAATGAGATTGACACCCA
GAATCGCCAGATCGACAGGAT
CATGGAGAAGGCTGATTCCAA
CAAAACCAGAATTGATGAAGC
CAACCAACGTGCAACAAAGAT
GCTGGGAAGTGGTTAA
ctcgagcaccaccaccaccaccactgag
atccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgagc
aataactagcataaccccttggggcctc
taaacgggtcttgaggggttttttgctgaa
aggaggaactatatccggat
Materials for protein purificaiton
2-Mercaptoethanol SIGMA M3148-25ML
Agar LPS Solution AGA500
Ampicillin, Sodium salt PLS AC1043-005-00
Chloramphenicol PLS CR1023-050-00
Competent cells (E. coli) Novagen 70956 Rosetta(DE3)pLysS
Glycerol SIGMA G5516-500ML
HEPES SIGMA H4034-100G
Hydrochloric acid / HCl SIGMA 320331-500ML
Imidazole SIGMA I2399-100G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside / IPTG SIGMA 10724815001
Kanamycin Sulfate PLS KC1001-005-02
Luria-Bertani (LB) Broth LPS Solution LB-05
Ni-NTA resin Qiagen 30210
PD MiniTrap G-25 (desalting column) Cytiva GE28-9180-07 For instructions, see: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174
Phenylmethylsulfonyl fluoride / PMSF ThermoFisher Scientific 36978
Plasmids for SNARE proteins cloned in house N/A Available upon request
Protease inhibitor cocktail genDEPOT P3100
Sodium chloride SIGMA S5886-500G
Sodium phosphate dibasic / Na2HPO4 SIGMA S7907-100G
Sodium phosphate monobasic / NaH2PO4 SIGMA S3139-250G
Tris(2-carboxyethyl)phosphine / TCEP SIGMA C4706-2G
Trizma base SIGMA T1503-250G
Materials for sample assembly
Biotin-PEG-SVA LAYSAN BIO BIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1g For PEGylation
Dibenzocyclooctyne-amine / DBCO-NH2 SIGMA 761540-10MG For bead coating
Double-sided tape 3M 136 For flow cell assembly
Epoxy glue DEVCON S-208 For flow cell assembly
Glass coverslip for bottom surface VWR 48393-251 Rectangular, 60×24 mm, #1.5
Glass coverslip for top surface VWR 48393-241 Rectangular, 50×24 mm, #1.5
Magnetic bead ThermoFisher Scientific 14301 Dynabeads M-270 Epoxy, 2.8 μm
mPEG-SVA LAYSAN BIO mPEG-SVA 1g For PEGylation
N,N-Dimethylformamide / DMF SIGMA D4551-250ML For bead coating
N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine SIGMA 104884-100ML For PEGylation
Neutravidin ThermoFisher Scientific 31000 For sample tethering
Phosphate buffered saline / PBS, pH 7.2 PLS PR2007-100-00
Plastic syringe Norm-ject A5 5 ml, luer tip
Polyethylene Tubing SCI BB31695-PE/4 PE-60
Reference bead SPHEROTECH SVP-30-5 Streptavidin-coated Polystyrene Particles; 3.0-3.4 µm
Syringe needle Kovax 21G-1 1/4'' 21 G
Syringe pump KD SCIENTIFIC 788210
Equipment for magnetic tweezer instrument
1-axis motorized microtranslation stage PI M-126.PD1 For vertical positioning of magnets
2-axis manual translation stage ST1 LEE400 For alignment of magnets to the optical axis
Acrylic holder for magnets DaiKwang Precision custum order Drawing available upon request
Frame grabber Active Silicon AS-FBD-4XCXP6-2PE8
High-speed CMOS camera Mikrotron EoSens 3CXP
Inverted microscope Olympus IX73P2F-1-2
Neodymium magnets LG magnet ND 10x10x12t Dimension: 10 mm × 10 mm × 12 mm; two needed
Objective lens Olympus UPLXAPO100XO Oil-immersion, NA 1.45
Objective lens nanopositioner Mad City Labs Nano-F100S
Rotation stepper motor AUTONICS A3K-S545W For rotating magnets
Superluminescent diode QPHOTONICS QSDM-680-2 680 nm
Software
LabVIEW National Instruments v20.0f1
MATLAB MathWorks v2021a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le, S., Liu, R., Lim, C. T., Yan, J. Uncovering mechanosensing mechanisms at the single protein level using magnetic tweezers. Methods. 94, 13-18 (2016).
  2. Choi, H. -K., Kim, H. G., Shon, M. J., Yoon, T. -Y. High-resolution single-molecule magnetic tweezers. Annual Review of Biochemistry. 91 (1), 33-59 (2022).
  3. Yang, T., Park, C., Rah, S. -H., Shon, M. J. Nano-precision tweezers for mechanosensitive proteins and beyond. Molecules and Cells. 45 (1), 16-25 (2022).
  4. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  5. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annual Review of Biophysics. 41 (1), 453-472 (2012).
  6. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nature Reviews Methods Primers. 1, 25 (2021).
  7. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical Journal. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  8. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
  9. Lansdorp, B. M., Tabrizi, S. J., Dittmore, A., Saleh, O. A. A high-speed magnetic tweezer beyond 10,000 frames per second. Review of Scientific Instruments. 84 (4), 044301 (2013).
  10. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Review of Scientific Instruments. 85 (10), 103712 (2014).
  11. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: calibration and applications for DNA dynamics. Biophysical Journal. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  12. Huhle, A., et al. Camera-based three-dimensional real-time particle tracking at kHz rates and Ångström accuracy. Nature Communications. 6 (1), 5885 (2015).
  13. Popa, I., et al. A HaloTag anchored ruler for week-long studies of protein dynamics. Journal of the American Chemical Society. 138 (33), 10546-10553 (2016).
  14. Shon, M. J., Kim, H., Yoon, T. -Y. Focused clamping of a single neuronal SNARE complex by complexin under high mechanical tension. Nature Communications. 9 (1), 3639 (2018).
  15. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Tapia-Rojo, R., Alonso-Caballero, A., Fernandez, J. M. Direct observation of a coil-to-helix contraction triggered by vinculin binding to talin. Science Advances. 6 (21), (2020).
  18. Rieu, M., et al. Parallel, linear, and subnanometric 3D tracking of microparticles with Stereo Darkfield Interferometry. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Rieu, M., Valle-Orero, J., Ducos, B., Allemand, J. -F., Croquette, V. Single-molecule kinetic locking allows fluorescence-free quantification of protein/nucleic-acid binding. Communications Biology. 4 (1), 1083 (2021).
  20. Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (16), 6190-6195 (2006).
  21. Camunas-Soler, J., Ribezzi-Crivellari, M., Ritort, F. Elastic properties of nucleic acids by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 45 (1), 65-84 (2016).
  22. Südhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323 (5913), 474-477 (2009).
  23. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).
  24. Zorman, S., et al. Common intermediates and kinetics, but different energetics, in the assembly of SNARE proteins. eLife. 3, e03348 (2014).
  25. Zhang, Y., Hughson, F. M. Chaperoning SNARE folding and assembly. Annual Review of Biochemistry. 90 (1), 581-603 (2021).
  26. Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for single-molecule experiments. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , Springer. New York, NY. 371-395 (2009).
  27. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of G-quadruplexes by magnetic tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  28. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophysical Journal. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  29. Dulin, D., Barland, S., Hachair, X., Pedaci, F. Efficient illumination for microsecond tracking microscopy. PLoS One. 9 (9), e107335 (2014).
  30. Klaue, D., Seidel, R. Torsional stiffness of single superparamagnetic microspheres in an external magnetic field. Physical Review Letters. 102 (2), 028302 (2009).
  31. Shon, M. J., Rah, S. -H., Yoon, T. -Y. Submicrometer elasticity of double-stranded DNA revealed by precision force-extension measurements with magnetic tweezers. Science Advances. 5 (6), 1697 (2019).
  32. Czerwinski, F., Richardson, A. C., Oddershede, L. B. Quantifying noise in optical tweezers by Allan variance. Optics Express. 17 (15), 13255-13269 (2009).
  33. Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments. Review of Scientific Instruments. 83 (2), 025115 (2012).
  34. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. High spatiotemporal resolution data from a custom magnetic tweezers instrument. Data in Brief. 30, 105397 (2020).
  35. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 123114 (2014).
  36. Strick, T. R., Allemand, J. -F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science. 271 (5257), 1835-1837 (1996).
  37. Daldrop, P., Brutzer, H., Huhle, A., Kauert, D. J., Seidel, R. Extending the range for force calibration in magnetic tweezers. Biophysical Journal. 108 (10), 2550-2561 (2015).
  38. te Velthuis, A. J. W., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophysical Journal. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  39. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. Correction-free force calibration for magnetic tweezers experiments. Scientific Reports. 8 (1), 15920 (2018).
  40. Seol, Y., Li, J., Nelson, P. C., Perkins, T. T., Betterton, M. D. Elasticity of short DNA molecules: theory and experiment for contour lengths of 0.6-7 µm. Biophysical Journal. 93 (12), 4360-4373 (2007).
  41. Burnham, D. R., Vlaminck, I. D., Henighan, T., Dekker, C. Skewed Brownian fluctuations in single-molecule magnetic tweezers. PLoS One. 9 (9), 108271 (2014).
  42. Paul, T., Myong, S. Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements. STAR Protocols. 3 (1), 101152 (2022).
  43. Lee, H. -W., et al. Profiling of protein-protein interactions via single-molecule techniques predicts the dependence of cancers on growth-factor receptors. Nature Biomedical Engineering. 2 (4), 239-253 (2018).
  44. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).
  45. Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nature Methods. 9 (7), 724-726 (2012).
  46. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 19-39 (2014).
  47. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophysical Journal. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  48. Zhang, Y. Energetics, kinetics, and pathway of SNARE folding and assembly revealed by optical tweezers. Protein Science. 26 (7), 1252-1265 (2017).
  49. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophysical Journal. 100 (2), 517-523 (2011).
  50. Cho, S., et al. Tension exerted on cells by magnetic nanoparticles regulates differentiation of human mesenchymal stem cells. Biomaterials Advances. 139, 213028 (2022).
  51. Shon, M. J., Cohen, A. E. Nano-mechanical measurements of protein-DNA interactions with a silicon nitride pulley. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7 (2016).
  52. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  53. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  54. Neupane, K., et al. Direct observation of transition paths during the folding of proteins and nucleic acids. Science. 352 (6282), 239-242 (2016).
  55. Choi, H. -K., et al. Watching helical membrane proteins fold reveals a common N-to-C-terminal folding pathway. Science. 366 (6469), 1150-1156 (2019).
  56. Kim, C., et al. Extreme parsimony in ATP consumption by 20S complexes in the global disassembly of single SNARE complexes. Nature Communications. 12 (1), 3206 (2021).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 195 høyhastighets magnetisk pinsett enkeltmolekylær kraftspektroskopi DNA-hårnål SNARE-kompleks
Høyhastighets magnetisk pinsett for nanomekaniske målinger på kraftfølsomme elementer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, C., Yang, T., Rah, S. H., Kim, … More

Park, C., Yang, T., Rah, S. H., Kim, H. G., Yoon, T. Y., Shon, M. J. High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements. J. Vis. Exp. (195), e65137, doi:10.3791/65137 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter