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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Pinças magnéticas de alta velocidade para medições nanomecânicas em elementos sensíveis à força

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65137
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 2,3, 1,4
1Department of Physics, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2School of Biological Sciences, Seoul National University, 3Institute for Molecular Biology and Genetics, Seoul National University, 4School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH)
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, descrevemos uma configuração de pinça magnética de alta velocidade que realiza medições nanomecânicas em biomoléculas sensíveis à força na taxa máxima de 1,2 kHz. Apresentamos sua aplicação a pinos de DNA e complexos SNARE como sistemas modelo, mas também será aplicável a outras moléculas envolvidas em eventos mecanobiológicos.

Abstract

Pinças magnéticas de molécula única (MTs) têm servido como ferramentas poderosas para interrogar com força biomoléculas, como ácidos nucléicos e proteínas, e, portanto, estão prontas para serem úteis no campo da mecanobiologia. Uma vez que o método geralmente se baseia no rastreamento baseado em imagens de esferas magnéticas, o limite de velocidade no registro e análise de imagens, bem como as flutuações térmicas das contas, há muito tempo dificultam sua aplicação na observação de pequenas e rápidas mudanças estruturais em moléculas-alvo. Este artigo descreve métodos detalhados para a construção e operação de uma configuração MT de alta resolução que pode resolver a dinâmica de nanoescala e milissegundos de biomoléculas e seus complexos. Como exemplos de aplicação, experimentos com pinos de cabelo de DNA e complexos SNARE (máquinas de fusão por membrana) são demonstrados, com foco em como seus estados transitórios e transições podem ser detectados na presença de forças em escala de piconewton. Esperamos que as MTs de alta velocidade continuem a permitir medições nanomecânicas de alta precisão em moléculas que detectam, transmitem e geram forças nas células e, assim, aprofundam nossa compreensão em nível molecular da mecanobiologia.

Introduction

As células sentem e respondem ativamente a estímulos mecânicos. Ao fazer isso, muitas biomoléculas exibem propriedades dependentes da força que permitem mudanças estruturais dinâmicas. Exemplos bem apreciados incluem canais iônicos mecanossensíveis e elementos citoesqueléticos que fornecem às células informações mecânicas importantes de seu ambiente circundante.

Além disso, moléculas que mostram uma natureza única de suporte de força também podem ser consideradas mecanossensíveis em um sentido mais amplo. Por exemplo, a formação local e o derretimento de duplexes de ácidos nucleicos, bem como estruturas de ordem superior, como G-quadruplexes, desempenham papéis cruciais na replicação, transcrição, recombinação e, mais recentemente, edição do genoma. Além disso, algumas proteínas neuronais envolvidas nas comunicações sinápticas desempenham suas funções gerando forças físicas que excedem os níveis de interações intermoleculares típicas. Não importa qual exemplo se estude, investigar a nanomecânica das biomoléculas envolvidas com alta precisão espaço-temporal será altamente útil na revelação de mecanismos moleculares dos processos mecanobiológicosassociados1,2,3.

Métodos de espectroscopia de força de molécula única têm servido como ferramentas poderosas para examinar as propriedades mecânicas de biomoléculas 2,4,5,6. Eles podem monitorar mudanças estruturais em ácidos nucleicos e proteínas simultaneamente com a aplicação de força, examinando assim propriedades dependentes da força. Duas configurações bem conhecidas são as pinças ópticas e as pinças magnéticas (MTs), que empregam esferas do tamanho de mícrons para manipular moléculas 5,6,7,8. Nessas plataformas, o poliestireno (para pinças ópticas) ou esferas magnéticas (para MTs) são amarrados a moléculas-alvo (por exemplo, ácidos nucléicos e proteínas) por meio de "alças" moleculares, tipicamente feitas de fragmentos curtos de DNA de fita dupla (dsDNA). As contas são então movidas para exercer força e fotografadas para rastrear suas localizações que relatam mudanças estruturais nas moléculas-alvo. Pinças ópticas e magnéticas são amplamente intercambiáveis em suas aplicações, mas existem diferenças importantes em suas abordagens para controlar a força. Pinças ópticas são instrumentos de fixação intrinsecamente posicionados que aprisionam contas na posição, por causa das quais a força aplicada flutua quando uma construção alvo sofre mudanças de forma; aumento de extensão, como de desdobramento, afrouxa a amarração e reduz a tensão, e vice-versa. Embora a realimentação ativa possa ser implementada para controlar a força em pinças ópticas, as MTs, em contraste, operam naturalmente como um dispositivo de fixação de força, aproveitando as forças magnéticas estáveis e de campo distante por ímãs permanentes, que também podem resistir à perturbação ambiental.

Apesar de sua longa história e design simples, as MTs ficaram atrás das pinças ópticas em suas aplicações para medições de alta precisão, em grande parte devido aos desafios técnicos no rastreamento rápido de contas. Recentemente, entretanto, vários grupos têm liderado conjuntamente um aprimoramento multifacetado tanto do hardware quanto do software para instrumentos de MT2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Neste trabalho, apresentamos um exemplo de tal configuração rodando a 1,2 kHz e descrevemos como usá-lo para realizar medições nanomecânicas em biomoléculas sensíveis à força. Como sistemas modelo, empregamos pinos de cabelo de DNA e complexos SNARE neuronais e examinamos suas rápidas mudanças estruturais no regime de piconewton. Pinos de DNA exibem transições simples de dois estados em uma faixa de força bem definida20,21 e, portanto, servem como modelos de brinquedo para verificar o desempenho de uma pinça. À medida que as proteínas SNARE se agrupam em um complexo sensível à força que impulsiona a fusão da membrana22, elas também têm sido extensivamente estudadas por espectroscopia de força de molécula única 14,23,24,25. Abordagens padrão para analisar dados e extrair informações úteis sobre termodinâmica e cinética são apresentadas. Esperamos que este artigo possa facilitar a adoção de MTs de alta precisão em estudos mecanobiológicos e motivar os leitores a explorar seus próprios sistemas sensíveis à força de interesse.

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Protocol

Todos os materiais e equipamentos descritos neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais. O software LabVIEW para operar a configuração MT de alta velocidade descrita abaixo, bem como os scripts MATLAB para analisar dados de amostra, são depositados no GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) e disponibilizados publicamente.

1. Construção de aparelhos

NOTA: O princípio geral da construção MT de alta velocidade é semelhante aos sistemas MT convencionais padrão, exceto pelo uso de uma câmera de semicondutor de óxido metálico complementar (CMOS) de alta velocidade e uma fonte de luz coerente e de alta potência (Figura 1). Consulte outras fontes para obter mais descrições de instrumentos padrão de TM 5,26,27.

  1. Configure um microscópio invertido em uma mesa óptica antivibração. Instale uma câmera CMOS de alta velocidade e um frame grabber.
  2. Construa um estágio de tradução para manipular ímãs em 3D. Monte um estágio linear motorizado (>20 mm de curso) verticalmente sobre um estágio XY manual.
    NOTA: O movimento vertical controla a força, enquanto o estágio XY é para o alinhamento manual dos ímãs ao eixo óptico para a construção inicial do setup.
  3. Instale um motor de passo rotativo e um sistema de correia e polia para ímãs rotativos.
    NOTA: A correia transmite o movimento rotativo entre o eixo do motor e ímãs que estão a poucos centímetros de distância. A rotação dos ímãs é interna à manipulação translacional.
  4. Monte os ímãs. Use um suporte de acrílico (encomendado a uma empresa de fabricação; veja Figura Suplementar S1) que possa abrigar firmemente dois ímãs idênticos em paralelo, com um espaço bem definido de 1 mm entre os ímãs (Figura 1B). Para utilizar a força máxima obtida com um determinado par de ímãs, ajuste a posição vertical do estágio de translação para que a superfície inferior dos ímãs se alinhe com o plano da amostra quando ele for movido para a posição mais baixa.
    NOTA: Consulte Lipfert e colaboradores para obter mais informações sobre o projeto e a configuração do suporte de ímãs28. A altura e a orientação dos ímãs são controladas pelo software LabVIEW em conjunto com a aquisição de dados.
  5. Visualizando com uma lente objetiva de baixa ampliação, alinhe os ímãs ao centro do campo de visão. Verifique se a rotação dos ímãs não causa um grande deslocamento do centro do par de ímãs.
    NOTA: Se o ponto médio entre os ímãs girar em torno do eixo de rotação, é provável que os ímãs estejam descentrados devido a um suporte imperfeito. Um pequeno nível de desalinhamento em relação ao tamanho da folga é tolerável, já que a rotação do ímã é apenas para verificar amarras e aplicar torques em aplicações específicas.
  6. Instale um diodo superluminescente (SLD) para a iluminação de contas. Passe o feixe através do espaço de 1 mm entre os dois ímãs. Certifique-se de que o feixe está devidamente colimado para caber na lacuna e a iluminação não é sombreada pelos ímãs.
  7. Instale um scanner de lente piezo na peça nasal e monte uma lente objetiva de imersão em óleo de 100x (abertura numérica [NA]: 1,45) para rastreamento de contas. Para evitar possíveis artefatos no rastreamento de resultados, certifique-se de que a iluminação seja mantida uniformemente quando os ímãs forem movidos. Finalmente, ajuste o nível de luz para o brilho máximo sem saturar pixels.
    NOTA: Para a comparação de diferentes fontes de luz para o rastreamento de alta velocidade de contas, consulte Dulin et al.29.

2. Calibração da força magnética

  1. Usando a reação em cadeia da polimerase (PCR; ver Tabela 1), prepare fragmentos de dsDNA de 5 kbp (usando o Primer B, o Primer Z_5k e o λ-DNA) que são marcados com biotina em uma extremidade (para fixação à superfície) e azida na outra extremidade (para fixação do talão).
  2. Após a seção 6, prepare uma célula de fluxo com as moléculas de 5 kbp.
  3. Após a seção 7, identifique uma boa construção de cordão de contas verificando sua extensão e rotação. Em particular, certifique-se de escolher um talão com uma trajetória rotacional mínima (ou seja, com um raio <200 nm) para minimizar o deslocamento da altura do cordão devido à fixação descentralizada30,31. Uma vez que uma boa amarração é identificada, inicie o rastreamento de contas, referindo-se à seção 9.
  4. Se a configuração for nova, caracterize seu ruído e estabilidade para medições confiáveis de alta resolução. Coloque o ímã a ~3 mm da superfície da célula de fluxo (para aplicar >10 pN e suprimir o movimento browniano de um talão), rastreie a posição z do talão em 1,2 kHz e calcule o desvio de Allan (AD) da série temporal de coordenadas z 32,33 (Figura 2C). Verifique se os valores de AD de alguns nanômetros são alcançáveis no regime de alta velocidade (<0,1 s) e se o rastreamento diferencial (posição do cordão magnético em relação a um cordão de referência) reduz o AD na escala de tempo mais longa.
    NOTA: Normalmente, obtemos um AD de <3 nm na taxa máxima (resolução de 1,2 kHz ou 0,83 ms), e o AD continua diminuindo pelo menos até 10 s, implicando uma deriva mínima. Outros relataram valores semelhantes em configurações semelhantes9,10,11,12,34.
  5. Com ímãs na posição de repouso (F ~ 0 pN), registre as coordenadas x e y do talão amarrado em 1,2 kHz. Registrar a posição por um período suficientemente longo (isto é, suficientemente longo do que o tempo de relaxamento característico da flutuação35) para que o movimento browniano seja suficientemente amostrado.
    NOTA: Aqui, a direção x é ao longo da direção do campo magnético, enquanto o movimento em y representa o movimento transversal perpendicular ao campo.
  6. Aproxime os ímãs da célula de fluxo e repita as medições da posição do talão até que os ímãs toquem suavemente a parte superior da célula de fluxo. Mova-se em passos grandes (por exemplo, 1-2 mm) quando os ímãs estiverem a mais de 7 mm de distância do plano da amostra (já que a força aplicada aumenta lentamente no campo distante dos ímãs), mas reduza o tamanho do passo gradualmente (por exemplo, 0,1-0,5 mm) à medida que se aproximam para uma calibração mais fina em níveis de força mais altos (Figura 2B).
  7. Calcule a força em cada posição do ímã, d, usando um dos dois métodos alternativos (um script MATLAB "force calibration.m" incluindo ambos os métodos é fornecido; veja Arquivo Suplementar 1).
    1. Meça a variância das coordenadas Equation 1 y do talão (Figura 2D) e a posição Equation 2 z média do talão em relação à posição mais baixa (Figura 2B, abaixo). Em seguida, use a equação (1)7,27,36 para estimar a força (com raio fixo do cordão R = 1.400 nm e energia térmica kR T = 4,11 pN∙nm):
      Equation 3(1º)
    2. Alternativamente, calcule a densidade espectral de potência (PSD) das coordenadas y, Sy(Figura 2E). Determinar a força aplicada F ajustando um modelo duplo-lorentziano37 ao Sy medido usando a equação (2).
      Equation 4(2º)
      Aqui, , R é o raio do talão, γye γ φ são os coeficientes de arrasto translacional e rotacional, respectivamente (estimados a partir da equação de Stokes-Einstein), kRT é a energia térmica, Equation 5f+ e f- são duas frequências características obtidas pela equação (3).
      Equation 6 (3º)
      NOTA: Como a extensão de amarração L é uma função de força que segue o modelo de cadeia semelhante a worm (WLC) bem estabelecido, as expressões acima deixam F como o único parâmetro de ajuste (fixamos R como sendo 1.400 nm para simplificar, porque ele é compartilhado entre todos os níveis de força e o valor exato não influencia os resultados sensivelmente). Quando necessário, o desfoque de movimento e o aliasing da aquisição de imagens baseadas em câmera devem ser considerados38,39, mas esse efeito é desprezível em nossas medições de alta velocidade acima de 1 kHz com amarras de 5 kbp.
  8. Repita as etapas 2.4-2.7 para mais algumas construções. Sonda de três a cinco contas diferentes para calcular a média da variabilidade de força entre as esferas magnéticas.
    NOTA: A variação de força entre as esferas magnéticas em uso deve ser considerada para determinar o número adequado de construtos para a média. Essa variabilidade é pequena, mas pode levar a mais de 1 pN de erro na força medida, mesmo para produtos comerciais31. Para a maioria das aplicações, onde a determinação absoluta das forças envolvidas não é crucial, a média dos resultados de calibração de três a cinco esferas é geralmente suficiente. Uma abordagem alternativa para explicar essa variação é medir a força com amarras individuais no início do experimento, o que pode ser demorado. Outra opção é incorporar estruturas hairpin que se descompactam em níveis de força conhecidos em cada construto31.
  9. Plotar a força medida em função da distância do ímã e ajustar uma função exponencial dupla aos dados (Figura 2F) usando a equação (4).
    Equation 7(4º)
    Aqui, F0 (linha de base), A 1 e A 2 (amplitudes) e d 1 e d 2 (constantes de decaimento) são parâmetros de ajuste. Certifique-se de que os valores de força dos dois métodos, bem como os ajustes duplo-exponenciais resultantes, estejam amplamente de acordo (Figura 2F,G).
    NOTA: Para confirmar se a calibração da força é conduzida corretamente, verifique a relação força-extensão das construções sondadas plotando a extensão versus a força medida.
  10. Para corrigir o deslocamento z off da altura do cordão resultante da inclinação dependente da força das esferas magnéticas30,31, estime z off a partir do offset lateral x off, considerando a geometria de uma corda descentralizada com raio do cordão usando a equação (5), e aplique os valores aos valores de extensão medidos. Esta etapa é implementada no script MATLAB "force calibration.m" (linhas 252-254).
    Equation 8(5º)
    NOTA: Embora essa correção faça pequenas alterações na extensão, especialmente para as esferas com um pequeno raio de rotação (<200 nm), esse deslocamento geralmente afeta criticamente a resposta elástica, como visto na mudança da Figura 2H para a Figura 2I30,31.
  11. Verifique o comprimento de persistência Lp ajustando um modelo WLC extensível aos dados usando a equação (6).
    Equation 9(6)
    Aqui, L 0 é o comprimento do contorno (1,7 μm por 5 kbp) e K0 é o módulo para o alongamento entálico.
    NOTA: Embora o L p do dsDNA seja bem aceito como sendo 40-50 nm em um tampão típico como o fosfato tamponada salino (PBS), a fórmula WLC aplicada a moléculas curtas (<5 kbp) subestima sistematicamente L p à medida que L0 diminui31,40. Isso ocorre porque o modelo WLC clássico presume um polímero cujo comprimento de cadeia é suficientemente maior do que seu comprimento de persistência. Aqui, obtivemos L p = 40 ± 3 nm para a construção de 5 kbp (Figura 2H), e a correção da extensão resultou em um K0 homogêneo de 1.100 ± 200 pN (Figura 2I). A aplicação de um modelo WLC finito 31,40, bem como uma correção para não-Gaussianidade na distribuição de extensão 41, aumentará ligeiramente Lp.
  12. Uma vez verificada a calibração da força, aplique os parâmetros de ajuste obtidos do modelo duplo-exponencial ao software LabVIEW fornecido (Supplemental File 2) e aguarde que o software calcule a força atual em tempo real a partir das leituras do motor (ou seja, posição do ímã). Como uma expressão analítica para a função inversa d(F) não está disponível, prepare uma tabela de pesquisa de d versus F em passos de 0,1 pN por estimativa numérica dos níveis de força alvo d. Armazene esta tabela no software também para comandar o controle de força.

3. Síntese de pinos de DNA

NOTA: As construções hairpin de DNA para experimentos de MT são preparadas por amplificação por PCR de uma região de 510 pb em λ-DNA com dois primers personalizados, um dos quais contém uma estrutura hairpin em sua extremidade 5′ (Figura 3A). Desta forma, um motivo hairpin é colocado em uma extremidade do produto PCR.

  1. Prepare os primers.
    1. Primer para frente: O primer B_hp que é marcado com 5′-biotina para fixação da superfície de vidro e se liga ao λ-DNA. Este primer contém um motivo hairpin com uma haste de 8 pb e um laço de 6 nt, 5′ para a região de ligação λ.
    2. Primer reverso: O primer Z_hp marcado com 5′-azida para fixação do cordão magnético e liga-se ao λ-DNA a 1 kbp de distância do primer dianteiro.
  2. Configure e execute a PCR com λ-DNA (modelo), nTaq polimerase e condições padrão de PCR (consulte a Tabela 1). Limpe o produto com um kit de purificação comercial.
  3. Medir a concentração de ADN por absorção de UV a 260 nm (A260) e realizar electroforese em gel de agarose (gel a 2%) (ver Tabela 2) para verificar o tamanho do produto. Um rendimento típico é de ~35 μL de ~600 nM solução.

4. Preparação de proteínas SNARE

NOTA: Os complexos SNARE neuronais são montados pela combinação de três proteínas purificadas de rato expressas de E. coli: VAMP2/synaptobrevin-2, syntaxin-1A e SNAP-25 (Figura 3B). Para facilitar sua montagem, a sintaxe e o SNAP-25 são co-expressos com um fragmento VAMP2 (sem a região N-terminal; denominado "ΔN-VAMP2") em uma estrutura chamada "complexo ΔN", e então misturados com VAMP2 de comprimento total após a ligação do DNA para formar complexos completos.

  1. Preparar plasmídeos contendo cDNA para a expressão de proteínas SNARE (sequências de DNA para todos os plasmídeos são dadas na Tabela de Materiais).
    1. Preparar 6×His-tagged VAMP2 sem o domínio transmembrana (2-97; L32C/I97C para ligações dissulfeto) clonado em um vetor pET28a.
    2. Prepare a sintaxina-1A sem o domínio Habc e transmembrana (substituições 191-267, I202C/I266C para ligações dissulfeto) clonadas juntamente com 6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49-96) em um vetor pETDuet-1.
    3. Prepare a isoforma b SNAP-25 de comprimento total (2-206, todos C a A) clonada em um vetor pET28a. Isso será usado para preparar complexos ΔN.
    4. Prepare a isoforma b (1-206, todos C a A) de 6×His-tagged SNAP-25 clonada em um vetor pET28a para adição direta ao buffer de ensaio MT para remontar os complexos SNARE após o desdobramento.
  2. Preparar dois tubos de células de E. coli Rosetta (DE3). Transformar um grupo com plasmídeos VAMP2 (da etapa 4.1.1), um com plasmídeos SNAP-25 marcados com sintaxe 1A/ΔN-VAMP2 e não marcados (da etapa 4.1.2 e 4.1.3) para expressar o complexo ΔN, e o outro com plasmídeos SNAP-25 marcados com His (da etapa 4.1.4).
  3. Transferir as células transformadas para o caldo Luria-Bertani (LB) com antibióticos apropriados (aqui, canamicina e cloranfenicol para VAMP2 e SNAP-25; canamicina, cloranfenicol e ampicilina para o complexo ΔN). Cultivá-los a 37 °C em incubadora de agitação (220 rpm) até que a densidade óptica (DO) do caldo atinja 0,7-0,9.
  4. Adicionar 1 mM de isopropil β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) para induzir a expressão proteica e incubar as células por 3-4 h a 37 °C em uma incubadora de agitação (220 rpm).
  5. Pellet down das células centrifugando a cultura a 4.500 × g por 15 min a 4 °C.
  6. Preparar tampões para a purificação de proteínas (ver Tabela 2).
  7. Suspender os pellets de células que expressam SNARE em 40 mL de tampão de lise gelado e lisar as células por sonicação no gelo (15% de amplitude, 5 s on e 5 s off, 30 min total).
  8. Centrifugar o lisado a 15.000 × g durante 30 min a 4 °C para remover materiais insolúveis.
  9. Passar o sobrenadante através de uma coluna de gravidade preenchida com 1 mL de resina Ni-NTA. Lavar a resina com tampão de lavagem A, depois com tampão de lavagem B e eluir as proteínas com 10 mL de tampão de eluição.
  10. Remova tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) e imidazol do eluente usando uma coluna de dessalinização (siga as instruções do fabricante). Eluir a amostra com PBS.
  11. Concentrar as proteínas com filtros centrífugos (ponto de corte de 10 kDa) até ~70 μM, mantendo as proteínas em PBS (tipicamente produzindo 2 mL). Medir a concentração de proteínas por absorção ultravioleta (UV) a 280 nm (A280) ou pelo ensaio de Bradford.
  12. Prepare alíquotas pequenas, congele em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C até o uso.
    NOTA: Complexos SNARE completos serão montados após a conjugação do complexo ΔN em um identificador de DNA (veja abaixo).

5. Fixação de alças de DNA

NOTA: Duas alças de dsDNA de 510 pb contendo grupos amina primária em uma extremidade são primeiramente preparadas por PCR, e os grupos amina são então convertidos em grupos maleimida usando um reticulador bifuncional, SM(PEG)2. As duas alças são então ligadas covalentemente aos complexos SNARE através de seus grupos cisteína para conjugação sítio-específica (Figura 3B).

  1. Prepare primers.
    1. Preparar primers para a frente: Primer B (para amplificar o punho B) que é marcado com 5′-biotina para fixação da superfície de vidro e se liga ao λ-DNA; Primer Z (para amplificar o Handle Z) que é marcado com 5′-azida para fixação de esferas magnéticas e tem a mesma sequência do Primer B.
    2. Prepare um primer reverso: Primer N (compartilhado para Handle B e Handle Z) que é marcado com 5′-amina para conjugação de proteínas e se liga ao λ-DNA 510 pb longe do primer dianteiro.
  2. Configurar e executar dois conjuntos de reações de PCR (18 tubos de reação de 200 μL para cada alça) com λ-DNA (modelo), nTaq polimerase e condições padrão de PCR (ver Tabela 1). Limpe o produto com um kit de limpeza PCR e elimine cada cabo com 45 μL de água ultrapura. Use um volume mínimo de água para obter altas concentrações de alças para uma reação eficaz em etapas posteriores.
  3. Medir a concentração de ADN por A260. O rendimento típico é de ~650 μL de ~2 μM de solução para cada alça. Manter pequenas amostras separadas para posterior verificação em eletroforese em gel de agarose.
  4. Reaja cada alça (1 μM em PBS) com 5 mM SM(PEG)2. Incubar à temperatura ambiente com rotação suave. Após 1 h, use um kit de purificação de DNA para remover SM(PEG)2 não reagido. Eluir cada cabo com 250 μL de PBS para obter soluções de ~2 μM.
  5. Misturar as soluções do Handle B e do complexo ΔN a uma razão molar de 1:16 (por exemplo, 1 μM Handle B e 16 μM ΔN-complex) em PBS e incubar por 2 h à temperatura ambiente com agitação. Separe uma pequena amostra para eletroforese em gel de agarose.
  6. Adicionar uma solução de VAMP2 em um excesso molar de 2,5 vezes sobre o complexo ΔN usado na etapa anterior. Incubar a mistura por mais 1 h à temperatura ambiente com agitação. Complexos SNARE completos são montados nesta etapa.
  7. Remover as proteínas livres por troca de tampão com PBS fresco e um filtro centrífugo (ponto de corte de 100 kDa): centrifugar a 14.000 × g por 5 min a 4 °C, repetir pelo menos 6x e executar por 15 min para o último giro. Medir o aumento da relação A260/A280 para monitorar a remoção de proteínas livres. Separe uma pequena amostra para eletroforese em gel de agarose.
  8. Adicione a Alça Z à solução em um excesso molar de 15 vezes sobre a Alça B. Mantenha a concentração da Alça Z pelo menos acima de 1 μM para facilitar a reação. Incubar a mistura durante a noite a 4 °C com agitação.
  9. Verificar os intermediários (alça B e seus conjugados proteicos) e o produto final (complexo SNARE com duas alças) por eletroforese em gel de agarose (Figura 3B, inset) (ver Tabela 2).
    NOTA: Se as proteínas forem conectadas com êxito à alça B, uma mudança de mobilidade será detectada. Em particular, a formação de complexos SNARE completos em manipuladores de DNA pode ser confirmada por sua resistência ao dodecil sulfato de sódio (SDS), ao contrário dos complexos ΔN, que são desmontados em SDS e deixam apenas a sintaxe ligada ao DNA (compare b e c na Figura 3B).
  10. Prepare alíquotas pequenas, congele em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C até o uso.
    NOTA: Embora a solução final contenha alças não reagidas, somente a construção desejada que é duplamente marcada com biotina e azida será selecionada durante a montagem da amostra em uma célula de fluxo.

6. Fabricação de células de fluxo

NOTA: As células de fluxo para medições de MT são construídas a partir de duas lamínulas de vidro unidas por fita dupla face (Figura 3C). Uma lamínula é revestida com uma mistura de PEG e polietilenoglicol biotinilado (PEG) para evitar a ligação inespecífica e permitir a ligação específica de moléculas-alvo via ligação biotina-NeutrAvidin (Figura 3D). Em seguida, as soluções dos materiais para experimentos de MT são infundidas sequencialmente em uma célula de fluxo usando uma bomba de seringa (Figura 3C,D).

  1. Prepare duas lamínulas de vidro, uma para cada uma das superfícies superior (24 mm × 50 mm, espessura nº 1,5) e inferior (24 mm × 60 mm, espessura nº 1,5). Limpe as lamínulas por sonicação em 1 M KOH por 30 min. Após a sonicação, enxágue as lamínulas com água destilada e mantenha em água até o passo seguinte.
  2. PEGilato a lamínula inferior seguindo protocolos publicados42,43. Use N-[3-(trimetoxisilil)propil]etilenodiamina para silanização e uma mistura 1:100 (ww) de biotina-PEG-SVA e mPEG-SVA em tampão bicarbonato 100 mM. Mantenha as lamínulas PEGylated secas a -20 °C e guarde-as por algumas semanas.
  3. No dia dos experimentos, retire as tampas PEGylated e seque-as com uma pistola de nitrogênio. Inspecione-os visualmente em busca de sujeira para se certificar de que estão limpos.
  4. Para fazer os canais de amostra, prepare tiras de fita dupla face de ~2 mm de largura e coloque quatro tiras em uma lamínula inferior (superfície PEGylated para cima), paralelas e separadas umas das outras por ~5 mm (Figura 3C).
    NOTA: Dessa forma, três canais de amostra de 5 mm de largura podem ser criados em uma única célula de fluxo.
  5. Coloque uma tampa superior no centro da tampa inferior, deixando ~5 mm de espaço nas bordas curtas para entradas e saídas de canal. Pressione suavemente a parte de trás da tampa superior com uma pinça para selar firmemente os canais.
  6. Para fazer um reservatório de entrada, apague a borda de uma ponta de pipeta de 200 μL. Recorte ~10 mm da abertura mais larga para permitir a retenção de ~200 μL de solução. Faça três deles para os três canais de fluxo. Para configurar as tomadas, prepare três agulhas de seringa que se encaixam na tubulação para a bomba de seringa.
  7. Usando 5 min de epóxi, cole os reservatórios e cubos da agulha na célula de fluxo. Certifique-se de que uma vedação completa seja formada para evitar vazamentos e que os canais não sejam bloqueados com excesso de cola. Deixe secar por pelo menos 30 min.

7. Montagem de construções de talão-cordão

NOTA: As soluções de materiais para experimentos de MT, incluindo as de construção de cordas, são introduzidas sequencialmente em células de fluxo usando uma bomba de seringa (Figura 3C,D).

  1. Prepare contas magnéticas. Tome 5 mg de contas M270-epóxi de uma solução-mãe (~3,3 × 108 contas em 167,5 μL de dimetilformamida) e substitua o solvente por tampão fosfato (ver Tabela 2) por separação magnética das contas.
  2. Preparar as contas a ~1,1 × 109 contas mL−1 em tampão fosfato com sulfato de amônio 1 M e reagir com 2 mM de dibenzociclooctyne (DBCO)-NH2. Incubar a mistura durante 3 h num misturador rotativo à temperatura ambiente. Após a reação, lave as esferas 3x com tampão fosfato fresco para remover moléculas não reagidas.
    NOTA: As contas lavadas podem ser armazenadas sem rotação extra a 4 °C durante várias semanas antes da utilização.
  3. Conecte uma agulha na saída do canal da célula de fluxo à bomba de seringa com tubulação de polietileno. Equilibre os canais com PBS.
  4. Introduza as seguintes soluções sequencialmente no canal por sucção com a bomba: NeutrAvidin, construções-alvo (pinos de cabelo de DNA ou complexos SNARE com alças de DNA), contas de poliestireno de referência e contas magnéticas revestidas com DBCO. Antes de usar, vórtice as soluções de contas completamente para dispersar potenciais agregados de contas.
  5. Lave as contas não acopladas enquanto aplica 0,1 pN de força.
    NOTA: A aplicação de uma pequena força ascendente facilita a remoção de contas não ligadas e ajuda a evitar a ruptura de construções de cordão especificamente ligadas.
  6. Para experimentos com complexos SNARE, incluir 1,5 μM SNAP-25 no buffer final.
    NOTA: As moléculas SNAP-25 livres podem religar complexos SNARE após o desdobramento e permitir medições repetidas em um único complexo.

8. Identificação dos construtos-alvo

  1. Na superfície de um canal de célula de fluxo, procure as esferas magnéticas que são amarradas por moléculas únicas da construção alvo. Certifique-se de que um talão de referência esteja localizado nas proximidades.
  2. Gire uma conta candidata e verifique se ela gira livremente. Se o talão é amarrado por várias moléculas, ele exibe um movimento restrito.
  3. Gire o talão por algumas voltas completas e descubra o raio de rotação (esta função é implementada no software fornecido). De preferência, escolha um talão com um pequeno raio de rotação.
    NOTA: Este raio indica quanto o talão está descentralizado do eixo de amarração, que é determinado aleatoriamente durante a montagem do talão30,31. Em todos os experimentos, a descentralização mínima de um talão alivia muitos artefatos associados à alta relação raio do talão para a extensão do cordão que usamos.
  4. Aumente a força de 0 para 5 pN para identificar boas contas de amarração única. Procure uma grande mudança no padrão de difração de um talão resultante do alongamento de um cabo de 1 kbp (ou o equivalente a duas alças de 510 pb). Se o padrão de difração não mudar significativamente, reduza a força para zero e procure outro talão candidato.
    NOTA: O levantamento de ~300 nm de um talão pode ser facilmente notado a partir das imagens brutas sem realmente iniciar o processo de rastreamento.

9. Rastreamento de contas para medições de extensão

NOTA: O rastreamento de contas é realizado através da análise de imagens de contas em tempo real no software LabVIEW fornecido com este artigo. O método de rastreamento e suas variantes têm sido utilizados na maioria dos sistemas convencionais de MT e são explicados na literatura anterior2,5,7,26. Ao medir a posição de um cordão magnético em relação a um cordão de referência fixo (isto é, rastreamento diferencial), as medições de posição tornam-se extremamente robustas a uma perturbação externa.

  1. Uma vez que um talão magnético adequado esteja localizado junto com um talão de referência, clique no botão Calibrar para começar a se preparar para o rastreamento de contas.
  2. Clique nas contas na imagem para definir a localização das contas. As imagens serão então cortadas para regiões de interesse (ROIs) (por exemplo, 150 x 150 pixels para um talão de 3 μm) ao redor das contas e, em seguida, analisadas para extrair as coordenadas precisas das contas.
  3. Aguarde a rotação do ímã ser concluída. Esse processo registra as coordenadas x e y do talão (calculando a correlação cruzada 2D44 ou usando simetria radial45 das imagens do talão, com desempenho comparável) enquanto gira os ímãs para documentar a fixação descentralizada do talão31.
  4. Para rastreamento na direção z, aguarde até que o software gere uma tabela de pesquisa de imagens de difração das contas a diferentes distâncias do plano focal. Isso é realizado pisando a lente objetiva com um scanner piezo em passos equidistantes e registrando imagens de contas de flutuação média em cada posição. Em seguida, as coordenadas z das contas em experimentos reais são determinadas comparando-se as imagens de contas em tempo real com a tabela de pesquisa com interpolação7.
  5. Quando a geração da tabela de pesquisa terminar, habilite o rastreamento e o foco automático (pressione a tecla Track ? e AF? Buttons) e clique no botão Adquirir para começar a gravar as posições das contas.
    NOTA: O foco automático é opcional, mas recomendado para corrigir o desvio de estágio em z durante a aquisição.

10. Forçar esquemas de aplicação

  1. Experimentos de rampa de força: Para verificar a relação força-extensão do construto, aplique uma rampa de força para cima e para baixo a uma taxa de carregamento constante (± 1,0 pN s−1) (Figura 4A). Por exemplo, aplique três rodadas de um ciclo 0-20-0 pN para verificar o comprimento total da construção e a curva de extensão de força das alças.
  2. Especificando os parâmetros de amarração no software, sobreponha uma curva de extensão de força WLC sobre os dados medidos e determine se o talão alvo está preso por uma construção de amostra genuína com alças de DNA adequadas. Use o comprimento de contorno conhecido (por exemplo, ~340 nm para dsDNA de 1 kbp) e o comprimento de persistência WLC (30-45 nm para dsDNA31 curto) da construção como ponto de partida. Se necessário, aplique o método de correção de extensão descrito na etapa 2.11.
  3. Se a construção for verificada, examine a resposta de extensão de força em detalhes para procurar extensão adicional resultante das moléculas-pinos de cabelo alvo ou complexos SNARE.
  4. Experimentos de força constante: Variar gradualmente a força aplicada em passos discretos para sondar a sensibilidade à força das moléculas alvo (Figura 4B).
    NOTA: As MTs permitem experimentos de força constante simples e eficazes porque a força aplicada é mantida constante quando os ímãs são mantidos imóveis.
    1. Para pinos de DNA, aplique 4-8 pN de força com passos de 0,2-0,5 pN e meça a posição do talão por ~10 s em cada nível de força.
    2. Para complexos SNARE, aplique 14-16 pN de força com passos de 0,1-0,2 pN e meça a posição do talão para ~10 s em cada nível de força.
  5. Experimentos de salto de força: Observe os eventos de transição dos complexos SNARE.
    NOTA: Experimentos de salto de força, como experimentos de força constante, envolvem mudanças nos níveis de força. No entanto, os saltos de força empregam mudanças mais abruptas na força aplicada, permitindo o monitoramento de eventos desencadeados por força nas moléculas sondadas, como uma ruptura súbita de complexos proteicos. Por exemplo, como os complexos SNARE exibem histerese estrutural em ciclagem de força23, é informativo realizar experimentos de salto de força e medir a latência para transição (Figura 4C).
    1. Descompactar: Descascamento de uma molécula VAMP2 de um complexo SNARE ternário intacto, deixando um complexo binário de sintaxina-1A e SNAP-25.
    2. Recompactando: Zipping da molécula VAMP2 descompactada para regenerar um complexo SNARE intacto.
      1. Desdobramento: Desmontagem completa de um complexo SNARE acompanhada por dissociação completa do SNAP-25. Apenas as moléculas VAMP2 e sintaxina permanecem na construção após o desdobramento.
      2. Redobramento: Regeneração de um complexo SNARE após a ligação de uma molécula SNAP-25 livre do tampão.
  6. Em 2 pN, induzir a montagem de um complexo SNARE intacto aguardando (~30 s) a associação de uma molécula livre de SNAP25. Uma diminuição súbita na extensão é observada na formação de um complexo SNARE.
  7. Para observar eventos de descompactação, aguarde alguns segundos em 10-12 pN e, em seguida, passe para 14-15 pN abruptamente com a velocidade máxima do motor possível. Dependendo da força alvo, o complexo SNARE exibirá uma transição reversível entre intermediários parcialmente descompactados (como em experimentos de força constante) ou um salto de ~25 nm para um estado mais alto e descompactado após um tempo de espera aleatório (ou latência).
  8. Para observar eventos de rezipping, diminua a força para 10-12 pN imediatamente após o descompactamento. Novamente, o complexo SNARE exibe uma transição estocástica para o estado inferior com zíper após alguma latência aleatória. Se o desdobramento tiver ocorrido após o descompactamento, o complexo não conseguirá recompactar, pois uma molécula SNAP-25 estará faltando.
  9. Para observar o desdobramento dos eventos, aguarde um período mais longo após o descompactamento para detectar um novo aumento na extensão (~2 nm).

11. Análise dos dados

NOTA: Os tipos de análise que se pode realizar com dados MT dependem do sistema de destino. No entanto, existem abordagens comuns para extrair informações úteis dos respectivos experimentos descritos na Figura 4. Todas as análises são realizadas com o MATLAB (R2021a) usando os códigos personalizados fornecidos com este artigo. Esses códigos geram gráficos usando os mesmos dados apresentados neste artigo. Observe que, enquanto os dados brutos do rastreamento de 100 Hz foram levados diretamente para análise, os dados do rastreamento de 1,2 kHz foram tipicamente filtrados por mediana (com uma janela deslizante de cinco pontos) antes da análise para reduzir o ruído (exceto para análise de ruído).

  1. Experimentos de rampa de força: Analisar a relação força-extensão (por exemplo, elasticidade de polímeros) e fazer a transição da força para extrair informações sobre propriedades nanomecânicas.
  2. Experimentos de força constante: Analise as populações de estado e o tempo de permanência (ou taxa de transição) em função da força para extrair parâmetros estruturais (por exemplo, regiões envolvidas na transição), termodinâmicos (por exemplo, diferença de energia livre) e cinéticos (por exemplo, barreira de energia) das mudanças conformacionais.
  3. Experimentos de salto de força: Analise a cinética de ruptura (por exemplo, interações proteína-proteína e ligação receptor-ligante) ou o tempo de vida de intermediários transitórios (por exemplo, desdobramento de biomoléculas) para extrair a estabilidade das moléculas alvo e seus estados.
  4. Como aplicações representativas, analise os dados de amostra para pinos de cabelo de DNA e complexos SNARE:
    1. Transições de dois estados de um pino de cabelo de DNA: força de descompactação, distância de abertura, dependência de força de deslocamento populacional e atribuição de estado e medidas de taxa de transição com um modelo de Markov oculto (HMM) (códigos MATLAB fornecidos).
    2. Mudanças conformacionais dos complexos SNARE: força de descompactação, dependência de força de estados intermediários e latência de descompactação, histerese no rezipping e comportamento de desdobramento/redobramento.
      NOTA: Modelos de força-extensão para alças de DNA, pinos de cabelo de DNA e conformações do complexo SNARE são dados em referências anteriores14,31.

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Representative Results

Calibração da força
Os resultados dos dois métodos de medição de força (variância do deslocamento lateral das contas e análise do espectro de potência) diferiram em 0-2 pN (Figura 2G). De acordo com os resultados da Figura 2F, podemos alcançar de forma confiável até 30 pN com ímãs regulares de neodímio.

Transições de dois estados de um hairpin de DNA de 8 pb
Primeiramente, investigamos a nanomecânica de um hairpin curto de DNA (Figura 5). Pinos de DNA têm sido extensivamente caracterizados por espectroscopia de força convencional de molécula única e, portanto, uma vasta fonte de referências para comparação está disponível. O descompactamento de um grampo curto é geralmente reversível, de modo que seus eventos de rezipagem também são observados na mesma faixa de força em que o descompactamento ocorre (Figura 5A). Aplicando-se uma rampa de força entre 0 pN e 20 pN (Figura 5B), verificou-se que a extensão induzida pela força da construção hairpin segue um modelo WLC, que pode ser atribuído exclusivamente à elasticidade dos cabos do DNA (Figura 5C, "fechado"). Em torno de 6 pN, o construto apresentou flutuações adicionais na extensão, associadas ao descompactamento reversível da estrutura do hairpin (Figura 5C, inset). Finalmente, em ~8 pN, a transição eventualmente desapareceu e a extensão se estabeleceu no estado superior que foi estendido em ~7 nm. Consequentemente, o perfil de força-extensão medido acima de 8 pN encaixou-se em uma nova curva de modelo (Figura 5C, "aberta") que inclui o comprimento da região de fita simples do pino de cabelo não compactado.

Em seguida, realizamos experimentos de força constante para examinar a transição hairpin sistematicamente. A posição do cordão foi medida na faixa de força de 4-8 pN com passos de 0,5 pN para ~10 s em cada nível; Em seguida, os valores de extensão foram coletados e analisados para medir sua distribuição de equilíbrio em função da força. Os resultados do rastreamento de 100 Hz sugeriram uma mudança gradual em direção a um estado mais estendido nesse regime de força (Figura 5D), mas os histogramas obtidos da extensão não foram claros o suficiente para resolver populações distintas (Figura 5E). Em contraste, quando os mesmos experimentos foram realizados em 1,2 kHz (Figura 5F), as trajetórias de alta velocidade das mudanças de extensão após filtragem suave (filtro mediano de cinco pontos) revelaram duas populações distintas que são bem descritas por uma mistura de duas distribuições gaussianas (Figura 5G). A separação entre as duas populações, indicando a distância de abertura do grampo, permaneceu inalterada em ~7 nm no regime de força de descompactação (Figura 5H). O desvio nas extremidades (4 pN e 8 pN) deveu-se à localização imprecisa de um estado devido à sua escassez.

Os dados revelaram que a força média para a transição de descompactação (a força na qual as populações fechadas e abertas se tornam iguais) F1/2 foi ~6 pN, e o estado aberto superior tornou-se gradualmente dominante à medida que aumentamos a força em 4-8 pN (Figura 5I). Quando ajustados com uma relação de Boltzmann para a probabilidade aberta, os valores exatos de F 1/2 = 5,9 pN e Δz = 7,1 nm foram obtidos, Equation 10consistentes com as observações acima. Deve-se notar, no entanto, que a força de abertura obtida a partir de um único construto pode não ser precisa devido à variabilidade do talão na geração de força, que foi medida em ~4% para os grânulos M270 comerciais31. Além disso, como o comprimento do caule (8 pb) é curto, a força de abertura terra-verdade de outros pinos de cabelo de 8 pb com composição nucleotídica diferente pode variar muito20. Finalmente, aplicamos o HMM aos traços de extensão para mapear a transição de estado e, assim, medimos as taxas de transição (Figura 5F, traço vermelho). Tanto as taxas de descompactação quanto de rezipagem variaram exponencialmente com a força aplicada (Figura 5J), de tal forma que a força promove o descompactamento e inibe o rezipagem. Se necessário, pode-se ainda usar a expressão clássica de Bell para extrair os parâmetros da paisagem energética (por exemplo, altura e distância da barreira)46.

Caracterização da flutuação térmica em medidas de extensão
Usando o construto hairpin, traçamos o perfil do ruído dependente de força em medidas de extensão. Primeiro, as flutuações térmicas de um cordão cativo foram calculadas a partir de equações usando os parâmetros (por exemplo, raio do cordão, comprimento do cordão) apropriados para esses experimentos2,5 (Figura 5K, curvas sólidas). Nós também plotamos o desvio padrão da extensão Equation 11 medido a partir do traço de tempo de uma construção hairpin em níveis de força distintos. Como essa molécula possuía um motivo hairpin, sua resposta sob 4 pN (estado fechado) foi utilizada para a medição do ruído intrínseco, enquanto a dinâmica hairpin foi detectada ~6 pN, como esperado, e serviu como uma verificação. A supressão da flutuação dependente da força também foi observada depois que o hairpin tornou-se mais aberto (compare 8 pN vs. 4 pN). A comparação com o limite térmico indica que há espaço para melhorias, mas esse ruído remanescente está frequentemente associado à flutuação rotacional de um cordão magnético30, que é aleatória e difícil de resolver. Para análises mais sistemáticas do ruído browniano ao longo do tempo de observação, o cálculo do desvio de Allan é frequentemente empregado32,33. Calculamos a variância de Allan para os dados de hairpin apresentados na Figura 5F, de forma semelhante às medidas de 5 kbp da Figura 2C. Os resultados da Figura 5L mostram que, na faixa de força intermediária de 4-8 pN, obteve-se 2-3 nm de desvio de Allan na velocidade máxima (1,2 kHz), sendo que esse valor caiu para menos de 1 nm para o tempo de observação (τ) maior que 0,1 s. Curiosamente, a dinâmica hairpin emergiu em torno de 5-7 pN para ~ 0,01 s (Figura 5L, inset), consistente com a força de transição medida e taxas na Figura 5I,J.

Alterações conformacionais dos complexos SNARE neuronais
Em seguida, empregamos complexos neuronais SNARE como um modelo proteico e examinamos suas propriedades mecânicas dependentes da força. Ao contrário da construção hairpin, complexos SNARE únicos foram mantidos entre duas alças de dsDNA de 510 pb (Figura 6A). Deve-se notar que os termini da sintaxina-1A e VAMP2, distais das alças, foram reticulados por uma ligação dissulfeto entre resíduos artificiais de cisteína para evitar ruptura e permitir múltiplas rodadas de pinça de um determinado construto.

Primeiramente, aplicamos uma rampa de força, tanto com níveis de força crescentes quanto decrescentes (± 1 pN s−1) para alongar e relaxar a construção alvo, respectivamente. No regime de baixa a média força (0-10 pN), as duas alças comportaram-se independentemente como polímeros WLC, moldando globalmente a curva força-extensão indistinguível daquela de 1 kbp dsDNA (Figura 6B, preto). No entanto, quando a força foi aumentada para acima de 10 pN, os valores de extensão se desviaram sensivelmente do modelo WLC, indicando que o complexo SNARE embutido apresentou um aumento adicional na extensão. Mais especificamente, o aumento da extensão pode ser resumido em três estágios distintos: (a) um ligeiro aumento gradual em 11-13 pN, (b) flutuações rápidas e maiores (~10 nm) em 14-16 pN, e (c) o descompactamento final e irreversível de cerca de ~20 nm. Além disso, quando a força foi reduzida para relaxar a construção, a extensão retornou à curva de força-extensão original com uma força menor (<15 pN) ou seguiu uma nova curva de modelo com uma extensão maior (Figura 6B, azul). A extensão total foi eventualmente restaurada para os valores mais baixos (do azul para o preto na Figura 6B) abaixo de 5 pN e os mesmos ciclos força-rampa puderam ser aplicados, o que mostrou uma tendência semelhante.

A partir do modelo molecular de conformação do complexo SNARE, podemos calcular com precisão os possíveis valores de extensão dos potenciais intermediários (Figura 6C). Além disso, assumindo o comportamento do WLC para os polipeptídeos não enrolados, as extensões podem ser estimadas em função da força, gerando assim os modelos de força-extensão total para as diversas conformações (Figura 6B, linhas pontilhadas). Tomando esses valores como referência, interpretamos as transições acima da seguinteforma14,23: (a) um deslocamento gradual do estado totalmente zippered (FZ) para o estado linker-open (LO) em 11-13 pN, implicando a abertura das regiões ligantes da sintaxina-1A e VAMP2; (b) transição rápida entre o LO e o estado semi-zíper (HZ), implicando a abertura de um complexo SNARE até a camada iônica zero; e (c) a transição final para o estado descompactado (UZ) ou desdobrado (UF), implicando um desdobramento completo do VAMP2 do resto do complexo. O estado UZ é diferente do UF em que a molécula associada de SNAP-25 ainda está ligada à sintaxina-1A, mantendo um complexo binário. No caso da UF (sem SNAP-25), o complexo SNARE completo só pode ser regenerado depois que uma molécula SNAP-25 livre da solução se recombina, na qual a redução da força aplicada para permitir essa religação é crítica.

Para verificar as mudanças conformacionais dos complexos SNARE de forma mais sistemática, realizamos então experimentos de salto de força no regime de força, onde flutuações conformacionais foram frequentemente observadas em 14-15 pN (Figura 6D). Tipicamente, começamos medindo a posição do cordão a 10 pN e verificamos a extensão estável, indicando a ausência de alterações relacionadas ao SNARE. Em seguida, o nível de força foi abruptamente aumentado para 14-15 pN, no qual a extensão foi monitorada até que ocorresse o descompactamento, se houvesse. Finalmente, a força foi reduzida de volta para 10 pN para verificar qualquer aumento persistente na extensão associado ao desdobramento. Em 14 pN, os traços de extensão permaneceram principalmente no estado LO, com picos ocasionais para o estado HZ. Deve-se notar que essas breves excursões ao estado HZ provavelmente serão perdidas no rastreamento de 100 Hz, que faz a média e diminui as amostras das imagens de contas por um fator de 12. Apesar das visitas claras e frequentes ao estado HZ, o complexo não conseguiu fazer uma transição completa para o estado UZ (Figura 6E), sugerindo que a força externa não foi forte o suficiente para superar a barreira de energia para descompactar. Em contraste, mesmo um pequeno aumento na força (para 14,3 pN) tornou a transição muito eficiente, de modo que o estado UZ foi atingido principalmente em poucos segundos (Figura 6F). Consistentemente, o descompactamento foi finalizado principalmente dentro de 1 s quando aplicamos 14,5 pN ao complexo (Figura 6G,H). Notavelmente, o descompactamento em forças mais altas frequentemente levou ao desdobramento completo de todo o complexo (acompanhado pela remoção do SNAP-25), como evidenciado pelo pequeno aumento adicional na extensão acima de UZ (Figura 6H) e pela assinatura de redobramento observada em 2 pN (Figura 6I). De modo geral, esses dados mostram o comportamento clássico de slip-bond47 para o desdobramento dos complexos SNARE, consistente com relatos anteriores 14,23,48.

Figure 1
Figura 1: Configuração do instrumento. Esquema (A) e fotografia (B) de uma configuração MT de alta velocidade. Ímãs controlados por um motor linear e um motor de rotação estão localizados acima do estágio de amostra de um microscópio invertido equipado com uma lente de imersão em óleo de 100x e uma câmera CMOS de alta velocidade. O feixe de luz de um diodo superluminescente passa através dos ímãs e ilumina o campo. Inset: Imagens representativas de difração de contas localizadas a diferentes distâncias do plano focal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Calibração da força. (A) Esquema de uma amostra de calibração de força. As magnitudes da força exercida por um par antiparalelo de ímãs com separação de 1 mm são medidas em função da distância do ímã d dos deslocamentos de um cordão magnético (M270) preso por um fragmento de dsDNA de 5 kbp. (B) Dados representativos do procedimento de calibração da força. As setas coloridas indicam regiões que são expandidas em (D) (cores correspondentes). (C) Desvio de Allan para a posição z de um cordão cativo de 5 kbp medido com 15-20 pN. Curvas para as coordenadas z do cordão magnético antes (azul) e depois (vermelho) subtraindo a posição do cordão de referência são mostradas. (D) Série temporal representativa da posição y medida à distância indicada do ímã d. O histograma correspondente da distribuição de coordenadas y é mostrado à direita com um ajuste gaussiano (vermelho). (E) Representante do PSD a partir dos dados mostrados em (D). Os valores de força obtidos pelo ajuste de um modelo (vermelho) aos respectivos PSDs são dados em cima. (F) Calibração da força magnética em função da distância do ímã. As forças foram medidas a partir da variância (esquerda) ou do método PSD (direita). O ajuste (vermelho) indica um modelo duplo-exponencial com a equação anotada. (G) Diferença na força medida obtida da variância e PSD. Uma curva vermelha é calculada para os ajustes mostrados em (F). (H,I) Verificação da relação força-extensão do construto de calibração de 5 kbp. Os valores médios de extensão em diferentes níveis de força (medidos a partir da variância) foram utilizados diretamente (H) ou após correção para o deslocamento altura do cordão (I) devido à inclinação de um cordão descentrado31. Os dados de força-extensão para n = 5 moléculas foram ajustados por um modelo WLC extensível e os parâmetros ajustados (comprimento de persistência L, p e módulo de estiramento Ko) são anotados no topo (média ± d.p.). Abreviação: PSD = densidade espectral de potência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Preparação da amostra . (A) Preparação de construções hairpin de DNA de 8 pb por amplificação por PCR de uma região de 1 kbp de λ-DNA. (B) Preparação de construções complexas SNARE com duas alças de DNA de 510 pb. Inset: Verificação das alças do DNA e sua ligação às proteínas por eletroforese em gel de agarose (gel 2%). As setas indicam o deslocamento de mobilidade (codificado por cores) das espécies de produtos: alças livres de 510 pb (magenta); Alça B ligada à sintaxe (vermelho), ao complexo ΔN (verde) e ao complexo SNARE (azul); e o último complexo SNARE de duas manipulações (verde). A adição de SDS interrompe os complexos ΔN (presentes em b), mas não os complexos SNARE completos formados pelo VAMP2 de comprimento total (presente em c). (C) Desenho e fotografia de uma célula de fluxo para experimentos de MT. (D) Esquema da introdução sequencial de soluções de amostra em um canal de célula de fluxo. Abreviação: MT = tweezer magnético. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Tipos de experimentos representativos. (A-C) Esquemas de experimentos de rampa de força, pinça de força e salto de força (topo) com traços de tempo representativos de extensão das medidas correspondentes (meio). Os tipos de análise que podem ser realizados são mostrados na parte inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Transição de dois estados de um hairpin de DNA de 8 pb. (A) Esquema de experimentos de MT em um hairpin de DNA com a transição esperada de descompactação e rezipagem. (B) Traço representativo da extensão do construto a partir de experimentos de rampa de força com níveis de força crescentes (~0,25 pN s−1). (C) Curva representativa de força-extensão reconstruída a partir dos dados de (B). Curvas amarelas indicam modelos de CPI para a construção hairpin com o hairpin na conformação fechada (sólida) e aberta (tracejada). (D) Traçado de extensão representativo de experimentos de força constante com níveis de força crescentes, medidos a 100 Hz. (E) Histogramas de dados de extensão em (D). (F,G) Resultados para os mesmos experimentos em (D) e (E), porém com rastreamento de 1,2 kHz. A série temporal bruta de 1,2 kHz foi suavizada aplicando-se um filtro de mediana de cinco pontos. Traços vermelhos na visão expandida de (F) foram obtidos de um HMM. As linhas vermelhas em (G) indicam a localização das populações gaussianas. (H) Distância entre as duas populações em (G). (I) Probabilidade no estado aberto em função da força aplicada. A curva vermelha é um modelo de Boltzmann ajustado (Equation 10 ) com a força média F1/2 = 5,9 pN. (J) Taxas de transição de descompactação e recompactação medidas a partir dos resultados do HMM. Linhas sólidas indicam dependência exponencial da força. (K) Flutuação térmica em medições de extensão. Os desvios padrão dos dados de extensão do hairpin (sem filtragem) são mostrados em função da força. O limite de resolução térmica que representa a magnitude teórica das flutuações térmicas foi estimado a partir da Eq.9 no trabalho de Choi et al.2 para um cordão de 2,8 μm com amarração de 1 kbp. (L) Desvios de Allan calculados a partir dos dados do hairpin de 1,2 kHz em (F) (sem filtragem). Inset mostra o desvio de Allan em 0,01 s em função da força, o que demonstra um aumento e diminuição gradual da flutuação devido à dinâmica hairpin. Abreviação: MT = tweezer magnético. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Alterações conformacionais dos complexos neuronais do SNARE. (A) Esquema de experimentos de MT em complexos SNARE. (B) Curvas representativas de força-extensão para o construto SNARE. Traços preto e azul (100 Hz) foram obtidos a partir de períodos de alongamento e relaxamento em experimentos de rampa de força, respectivamente. Linhas tracejadas indicam modelos de extensão, contabilizando as várias conformações de complexos SNARE mostradas em (C). (C) Modelos moleculares de conformações complexas SNARE com as extensões calculadas correspondentes. Os valores foram estimados a partir dos parâmetros geométricos dos feixes helicoidais e de um modelo de CPI para a região polipeptídica14. (D) Esquema de experimentos de salto de força para investigar conformações complexas do SNARE. (E-H) Traços representativos de extensão de experimentos de salto de força realizados nos níveis de força indicados. Em (E), não foi observado descompactação. Em (F) e (G), observou-se descompactação seguida de rezipagem a 10 pN. Em (H), o descompactamento foi seguido por um novo evento de desdobramento. (I) Redobramento de um complexo SNARE a 2 pN. Uma nítida redução na extensão do estado UF para FZ foi observada em 5 pN. Abreviação: MT = tweezer magnético. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Configuração de PCR Condição
Materiais 1,25 μg/mL λ-DNA (modelo), 1 μM de primers para frente e para trás, 0,2 mM dNTP, 0,05 U/μL nTaq, 1x tampão nTaq
Desnaturação 95 °C por 30 s
Recozimento Construção da calibração: 55 °C por 30 s
Pino de cabelo de DNA: 57 °C por 30 s
Cabos de DNA: 50 °C por 30 s
Extensão Pino e alças de DNA: 72 °C por 1 min
Construção da calibração: 72 °C por 5 min
Ciclo 30–34
Eletroforese em gel de agarose
Gel 2% de agarose em 0,5x tris-borato-EDTA (TBE, pH 8,3) contendo 1x SYBR Safe
Executando Potência máxima (108 V méd) no Mupid-2plus (Advance), 40-50 min

Tabela 1: Condições para reações de PCR e eletroforese em gel de agarose. Parâmetros de reação para PCR de construções de DNA, incluindo dsDNA de 5 kbp para calibração de força, construção de hairpin de DNA e alças de DNA para anexação de SNAREs. As sequências de primers são apresentadas na Tabela de Materiais.

Tampão de purificação de proteínas Composição
Lavagem Buffer A Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 500 mM, β-mercaptoetanol (BME) 7 mM, glicerol 10% e imidazol 20 mM
Lavagem Tampão B 50 mM HEPES (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10% glicerol e 20 mM imidazol
Buffer de lise Wash Buffer A suplementado com 1% de Triton X-100, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) e 1x coquetel inibidor de protease
Buffer de eluição Wash Buffer B suplementado com imidazol 400 mM
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 81 mM fosfato de sódio dibásico (Na 2 HPO 4), 19 mM fosfato de sódio monobásico (NaH 2 PO4) (pH7,2), NaCl 150 mM
tampão fosfato 81 mM Na 2 HPO 4, 19 mM NaH2PO 4, pH7,4

Tabela 2: Buffers e sua composição. Composição dos tampões utilizados para purificação de proteínas.

Figura suplementar S1: Desenho de um suporte magnético. As dimensões de um suporte de acrílico para dois ímãs de 10 mm x 10 mm x 12 mm com uma folga de 1 mm são mostradas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 1: Um arquivo compactado contendo códigos MATLAB. Scripts MATLAB para analisar dados produzidos pelos experimentos de pinça magnética de alta velocidade, incluindo calibração de força, hairpin, e análise complexa SNARE. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: arquivo compactado do pacote de software LabVIEW. Um pacote completo de códigos LabVIEW para operar uma pinça magnética de alta velocidade e adquirir dados com ela. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Neste trabalho, introduzimos uma configuração de espectroscopia de força de molécula única que pode observar mudanças estruturais de biomoléculas com alta precisão espaço-temporal. A câmera CMOS de alta velocidade usada adquire 1.200 quadros s−1 com resolução de 1.280 x 1.024, permitindo o rastreamento de contas de 1,2 kHz. No entanto, a velocidade das medições é atualmente limitada pelo software de rastreamento de contas, de modo que o ROI é normalmente reduzido a áreas menores em medições de alta velocidade. A alta potência do SLD fornece uma iluminação brilhante que é fundamental para imagens rápidas de contas de até alguns kHz de largura de banda. Além disso, a coerência espacial do feixe gera anéis de difração concêntricos de alto contraste ao redor dos cordões (Figura 1A, inset), que permitem a determinação precisa da posição do cordão com base na simetria.

A força magnética exercida sobre uma construção de cordão pode ser determinada medindo-se as flutuações brownianas do cordão cativo35,37,38. Como a análise de força em tempo real é pesada em termos computacionais, a força aplicada é tipicamente medida de antemão usando uma construção de referência. Por exemplo, as esferas magnéticas a serem usadas são amarradas por longos fragmentos de dsDNA (>5 kbp), e as flutuações térmicas correspondentes na posição do talão são medidas em função da distância do ímã (Figura 2A). A calibração da força é normalmente realizada uma vez após a configuração ser construída, mas não é necessário repeti-la regularmente, a menos que a configuração seja modificada, por exemplo, substituindo os ímãs. Uma vez que a frequência característica da flutuação do cordão aumenta com a força aplicada2, uma configuração de alta velocidade é particularmente útil para capturar a dinâmica rápida em um regime de alta força e medir a força com precisão. A estimativa da força a partir da variância é muito mais simples em sua implementação do que a análise espectral no domínio da frequência, mas é suscetível a artefatos de deriva, aquisição baseada em câmera e mudanças de extensão devido à fixação descentralizada do cordão31,37,38. No entanto, os resultados dos dois métodos diferem em apenas 0-2 pN se obtidos corretamente (Figura 2G); Assim, o método de variância é confiável o suficiente quando a determinação absoluta da força não é crítica.

Para forças mais altas acima de 30 pN e em torno de 65 pN (nas quais o estiramento excessivo do dsDNA serve como referência), ou ímãs de alto grau (N50-N52) disponíveis comercialmente devem ser instalados, o espaço entre os ímãs deve ser reduzido ou o campo magnético deve ser projetado28,49. Nesta configuração, a velocidade mais rápida do motor vertical é de 30 mm/s, o que permite um salto de força de 0 pN para 20 pN em ~0,6 s. Algumas mudanças estruturais rápidas dependentes da força podem ser perdidas se o movimento do motor limitar a taxa de carregamento da força. Dependendo da aplicação, podem ser necessárias mudanças e otimização adicional da maneira como os ímãs são movidos. Um exemplo envolve o uso criativo de uma cabeça de fita magnética15.

Para medições de alta resolução com MTs, é importante avaliar o nível de ruído de várias fontes. Uma vez que os componentes ópticos (um microscópio com uma lente de alta ampliação, fonte de luz brilhante e câmera rápida) estejam devidamente configurados, a precisão subnanométrica no rastreamento de contas pode ser alcançada. Então, a principal fonte de ruído torna-se o movimento browniano de um talão, que é utilizado para medir a força aplicada. A flutuação térmica de um cordão amarrado depende de seu raio, comprimento de amarração e força aplicada. Embora a flutuação intrínseca na direção z (isto é, mudanças de extensão) dependa exclusivamente da energia térmica e da rigidez do cabo, a dinâmica do talão-cordão e a taxa de aquisição baseada em câmera filtram o movimento do cordão e, portanto, o monitoramento das biomoléculas alvo por sua vez. Portanto, o tamanho do cordão e a taxa de amostragem devem ser escolhidos estrategicamente para alcançar uma boa resolução espaço-temporal. Como alternativa ao cordão de 2,8 μm que empregamos, esferas menores de 1 μm também são populares e podem ser vantajosas para medições rápidas devido à sua resposta rápida. No entanto, uma fraqueza crítica é o pequeno conteúdo magnético, que limita a força máxima que pode ser gerada (Equation 12 ). Uma vez que esferas menores ainda podem exercer força pelo menos até 10 pN, elas podem ser adequadas para estudar fenômenos de força fraca, como no superenrolamento de DNA. Em contraste, investigações de motores moleculares, enovelamento de proteínas (por exemplo, SNAREs, mostrado aqui) ou mecânica celular50 requerem a aplicação de forças mais altas, caso em que pode-se considerar modificar a configuração do ímã (por exemplo, reduzir a folga ou a distância) para estender a faixa de força aplicável28,51.

Como a técnica sonda as respostas nanomecânicas de moléculas-alvo enquanto aplica uma força na escala biofisicamente relevante, ela é ideal para estudar elementos sensíveis à força que desempenham papéis fundamentais em processos mecanobiológicos. Para ilustrar a ampla aplicabilidade do ensaio de MT de alta precisão, empregamos um modelo de ácido nucleico e um modelo proteico que exibem mudanças conformacionais dinâmicas e rápidas após a aplicação de uma força em escala de piconewton. Uma limitação da técnica é a exigência de ácidos nucleicos e proteínas purificados, o que desencorajou particularmente sua ampla extensão a uma ampla gama de proteínas. O avanço das tecnologias de expressão e conjugação de proteínas in vitro continuará a fornecer acesso a proteínas menos estudadas. Uma questão relacionada é que o conhecimento a priori sobre a estrutura alvo é muitas vezes crítico para experimentos de projeto (por exemplo, fixação de alças). Esperamos que o advento do crio-EM 52 de partícula única e doAlphaFold2 53 apoie fortemente o projeto e a análise de medições mecânicas em moléculas de proteína única e desencadeie aplicações mais poderosas de MT de alta resolução.

A força de descompactação dos pinos capilares de DNA depende de muitos fatores, incluindo sequência, estrutura e composição do tampão, mas mais criticamente do comprimento do caule e do conteúdo de guanina-citosina (GC)20. Para demonstrar o poder do rastreamento de alta velocidade, projetamos intencionalmente uma haste de 8 pb (com três pares de bases GC) que deveria se desdobrar a uma força baixa com dinâmica rápida. De fato, os resultados da Figura 5 mostram que essa dinâmica rápida teria sido difícil de resolver com técnicas padrão com resolução de 10 ms ou menos. Esse aspecto é confirmado pelas taxas de transição medidas a partir da análise do HMM, cujas altas taxas variaram entre 100 e 200 s−1 (Figura 5J).

Acredita-se que os SNAREs neuronais conduzam a exocitose da vesícula sináptica. Em particular, as proteínas SNARE catalisam a fusão de membranas através da redução da barreira energética associada, como a repulsão eletrostática entre a vesícula e as membranas plasmáticas. Nesse sentido, as flutuações conformacionais dos complexos SNARE ocorrem em uma estreita faixa de força de 12-15 pN, que corresponde ao nível esperado de forças repulsivas14,23. Usando as MTs de alta velocidade aqui descritas, recapitulamos os principais achados sobre o comportamento dependente de força dos complexos SNARE neuronais. A histerese de força no descompactamento e no rezipping (Figura 6B) indica que o rezipping ocorre com uma força menor do que o descompactamento e, portanto, o trabalho é feito durante esse ciclo. Tais transições fora do equilíbrio são mais bem abordadas por experimentos de salto de força, nos quais a latência para a transição sob carga (semelhante a um evento de ruptura de ligação) ou flutuações conformacionais antes do descompactamento podem ser medidas. Ambos os casos se beneficiam de setups de alta velocidade, como ilustrado por estudos recentes sobre os estados transitórios de biomoléculas e seus complexos 15,17,54,55,56.

Coletivamente, esses resultados concordam com as mudanças dependentes de força características de pinos de cabelo de DNA e complexos SNARE neuronais relatadas com espectroscopia de força convencional de molécula única. Simultaneamente, eles ressaltam a utilidade de medições mecânicas de alta precisão para revelar a sensibilidade à força de biomoléculas e seus conjuntos. Esperamos que este artigo possa atrair mais pessoas do campo da mecanobiologia, motivando pesquisadores a empregar MTs de alta velocidade na investigação de seus sistemas únicos de interesse.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela bolsa da National Research Foundation of Korea (NRF) financiada pelo governo coreano (MSIT) (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 e NRF- 2021R1A6A1A10042944). S.-H.R. foi apoiado pela subvenção NRF (2021R1C1C2009717).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for construct synthesis
Agarose gel electrophoresis system Advance Mupid-2plus
DNA ladder Bioneer D-1037
nTaq polymerase Enzynomics P050A
PCR purification kit LaboPass CMR0112
PEGylated SMCC crosslinker / SM(PEG)2 ThermoFisher Scientific 22102 For SNARE–DNA coupling
Primer B Bioneer 5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For 5-kbp force calibration construct and DNA handles
Primer B_hp IDT 5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT
TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'		 For hairpin construct
Primer N Bioneer 5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3' For DNA handles
Primer Z Bioneer 5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For DNA handles
Primer Z_5k Bioneer 5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA
TCG-3'		 For 5-kbp force calibration construct
Primer Z_hp Bioneer 5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3' For hairpin construct
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher Scientific S33102
λ-DNA Bioneer D-2510 Template strand for PCR
DNA sequences for SNARE proteins
6×His-tagged SNAP-25b (2-206; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
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GGACGCAGACATGCGCAATG
AGCTGGAGGAGATGCAGAGG
AGGGCTGACCAGCTGGCTGA
TGAGTCCCTGGAAAGCACCC
GTCGCATGCTGCAGCTGGTT
GAAGAGAGTAAAGATGCTGG
CATCAGGACTTTGGTTATGTT
GGATGAGCAAGGCGAACAAC
TGGAACGCATTGAGGAAGGG
ATGGACCAAATCAATAAGGAC
ATGAAAGAAGCAGAAAAGAAT
TTGACGGACCTAGGAAAATTC
GCCGGCCTTGCCGTGGCCCC
CGCCAACAAGCTTAAATCCAG
TGATGCTTACAAAAAAGCCTG
GGGCAATAATCAGGATGGAGT
AGTGGCCAGCCAGCCTGCCC
GTGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTGGC
TTCATCCGCAGGGTAACAAAT
GATGCCCGGGAAAATGAGATG
GATGAGAACCTGGAGCAGGT
GAGCGGCATCATCGGAAACCT
CCGCCACATGGCTCTAGACAT
GGGCAATGAGATTGACACCCA
GAATCGCCAGATCGACAGGAT
CATGGAGAAGGCTGATTCCAA
CAAAACCAGAATTGATGAAGC
CAACCAACGTGCAACAAAGAT
GCTGGGAAGTGGTTAA
ctcgagcaccaccaccaccaccactgag
atccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgagc
aataactagcataaccccttggggcctc
taaacgggtcttgaggggttttttgctgaa
aggaggaactatatccggat
Materials for protein purificaiton
2-Mercaptoethanol SIGMA M3148-25ML
Agar LPS Solution AGA500
Ampicillin, Sodium salt PLS AC1043-005-00
Chloramphenicol PLS CR1023-050-00
Competent cells (E. coli) Novagen 70956 Rosetta(DE3)pLysS
Glycerol SIGMA G5516-500ML
HEPES SIGMA H4034-100G
Hydrochloric acid / HCl SIGMA 320331-500ML
Imidazole SIGMA I2399-100G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside / IPTG SIGMA 10724815001
Kanamycin Sulfate PLS KC1001-005-02
Luria-Bertani (LB) Broth LPS Solution LB-05
Ni-NTA resin Qiagen 30210
PD MiniTrap G-25 (desalting column) Cytiva GE28-9180-07 For instructions, see: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174
Phenylmethylsulfonyl fluoride / PMSF ThermoFisher Scientific 36978
Plasmids for SNARE proteins cloned in house N/A Available upon request
Protease inhibitor cocktail genDEPOT P3100
Sodium chloride SIGMA S5886-500G
Sodium phosphate dibasic / Na2HPO4 SIGMA S7907-100G
Sodium phosphate monobasic / NaH2PO4 SIGMA S3139-250G
Tris(2-carboxyethyl)phosphine / TCEP SIGMA C4706-2G
Trizma base SIGMA T1503-250G
Materials for sample assembly
Biotin-PEG-SVA LAYSAN BIO BIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1g For PEGylation
Dibenzocyclooctyne-amine / DBCO-NH2 SIGMA 761540-10MG For bead coating
Double-sided tape 3M 136 For flow cell assembly
Epoxy glue DEVCON S-208 For flow cell assembly
Glass coverslip for bottom surface VWR 48393-251 Rectangular, 60×24 mm, #1.5
Glass coverslip for top surface VWR 48393-241 Rectangular, 50×24 mm, #1.5
Magnetic bead ThermoFisher Scientific 14301 Dynabeads M-270 Epoxy, 2.8 μm
mPEG-SVA LAYSAN BIO mPEG-SVA 1g For PEGylation
N,N-Dimethylformamide / DMF SIGMA D4551-250ML For bead coating
N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine SIGMA 104884-100ML For PEGylation
Neutravidin ThermoFisher Scientific 31000 For sample tethering
Phosphate buffered saline / PBS, pH 7.2 PLS PR2007-100-00
Plastic syringe Norm-ject A5 5 ml, luer tip
Polyethylene Tubing SCI BB31695-PE/4 PE-60
Reference bead SPHEROTECH SVP-30-5 Streptavidin-coated Polystyrene Particles; 3.0-3.4 µm
Syringe needle Kovax 21G-1 1/4'' 21 G
Syringe pump KD SCIENTIFIC 788210
Equipment for magnetic tweezer instrument
1-axis motorized microtranslation stage PI M-126.PD1 For vertical positioning of magnets
2-axis manual translation stage ST1 LEE400 For alignment of magnets to the optical axis
Acrylic holder for magnets DaiKwang Precision custum order Drawing available upon request
Frame grabber Active Silicon AS-FBD-4XCXP6-2PE8
High-speed CMOS camera Mikrotron EoSens 3CXP
Inverted microscope Olympus IX73P2F-1-2
Neodymium magnets LG magnet ND 10x10x12t Dimension: 10 mm × 10 mm × 12 mm; two needed
Objective lens Olympus UPLXAPO100XO Oil-immersion, NA 1.45
Objective lens nanopositioner Mad City Labs Nano-F100S
Rotation stepper motor AUTONICS A3K-S545W For rotating magnets
Superluminescent diode QPHOTONICS QSDM-680-2 680 nm
Software
LabVIEW National Instruments v20.0f1
MATLAB MathWorks v2021a

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References

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