Summary
ここでは、力に敏感な生体分子を最大1.2kHzの速度でナノメカニカル測定を行う高速磁気ピンセットのセットアップについて説明します。モデル系としてDNAヘアピンやSNARE複合体への応用を紹介しますが、メカノバイオイベントに関与する他の分子にも応用できます。
Abstract
1分子磁気ピンセット(MT)は、核酸やタンパク質などの生体分子を強制的に調べるための強力なツールとして機能しており、メカノバイオロジーの分野で役立つ態勢を整えています。この方法は一般に磁気ビーズの画像ベースの追跡に依存しているため、画像の記録と分析の速度制限、およびビーズの熱変動は、標的分子の小さくて速い構造変化を観察するためのその応用を長い間妨げてきました。本稿では、生体分子とその複合体のナノスケール、ミリ秒のダイナミクスを解析できる高分解能MTセットアップの構築と操作の詳細な方法について説明します。応用例として、DNAヘアピンやSNARE複合体(膜融合機構)を用いた実験を、ピコノートンスケールの力の存在下でそれらの過渡状態や遷移をどのように検出できるかに焦点を当てて説明します。今後も高速MTにより、細胞内の力を感知・伝達・発生する分子の高精度なナノメカニカル計測が可能となり、メカノバイオロジーの分子レベルでの理解が深まることが期待されます。
Introduction
細胞は機械的刺激を積極的に感知し、反応します。そうすることで、多くの生体分子は力に依存する特性を示し、動的な構造変化を可能にします。よく知られている例としては、機械感受性イオンチャネルや細胞骨格要素があり、周囲の環境から細胞に重要な機械的情報を提供します。
また、独特の力を持つ性質を示す分子も、より広い意味で機械感受性と見なすことができます。例えば、核酸二本鎖の局所的な形成と融解、およびG-quadruplexなどの高次構造は、複製、転写、組換え、そして最近ではゲノム編集において重要な役割を果たします。さらに、シナプスコミュニケーションに関与するいくつかのニューロンタンパク質は、典型的な分子間相互作用のレベルを超える物理的な力を生成することによってそれらの機能を果たす。いずれの例を用いても、関与する生体分子のナノメカニクスを高い時空間精度で調べることは、関連するメカノバイオロジカルプロセスの分子メカニズムを明らかにする上で非常に有用であることがわかります1,2,3。
単一分子力分光法は、生体分子の機械的特性を調べるための強力なツールとして役立っています2,4,5,6。核酸やタンパク質の構造変化を力を加えると同時にモニタリングし、力依存性を調べることができます。よく知られている2つのセットアップは、光ピンセットと磁気ピンセット(MT)で、ミクロンサイズのビーズを使用して分子を操作します5,6,7,8。これらのプラットフォームでは、ポリスチレン(光ピンセット用)または磁気ビーズ(MT用)は、通常は二本鎖DNA(dsDNA)の短い断片でできている分子「ハンドル」を介して標的分子(核酸やタンパク質など)につながれています。次に、ビーズを動かして力を加え、画像化して、標的分子の構造変化を報告するビーズの位置を追跡します。光ピンセットと磁気ピンセットは、その用途ではほぼ互換性がありますが、力を制御するためのアプローチには重要な違いがあります。光ピンセットは、ビーズを所定の位置にトラップする本質的に位置クランプ装置であり、ターゲット構造の形状が変化すると、加えられる力が変動します。展開などによる伸展の増加は、テザーを緩めて張力を低下させ、逆もまた同様です。光ピンセットの力を制御するためにアクティブフィードバックを実装することができますが、MTは自然にフォースクランプデバイスとして動作し、永久磁石による安定した遠方界磁力を利用して、環境の摂動にも耐えることができます。
MTは、その長い歴史とシンプルな設計にもかかわらず、主に高速ビードトラッキングの技術的課題のために、高精度測定へのアプリケーションにおいて光ピンセットに遅れをとっています。しかし、最近では、いくつかのグループが共同でMT機器のハードウェアとソフトウェアの両方の多面的な改善を主導しています2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 .本研究では、1.2kHzで動作するこのようなセットアップの例を紹介し、それを使用して力に敏感な生体分子のナノメカニカル測定を実行する方法について説明します。モデルシステムとして、DNAヘアピンと神経細胞SNARE複合体を用いて、ピコニュートンレジームにおけるそれらの速い構造変化を調べます。DNAヘアピンは、明確に定義された力範囲20,21で単純な2状態遷移を示すため、ピンセットセットアップの性能を検証するためのおもちゃモデルとして機能します。SNAREタンパク質は、膜融合22を駆動する力に敏感な複合体に集合するため、単一分子力分光法14、23、24、25によっても広く研究されています。データを分析し、熱力学と動力学に関する有用な情報を抽出するための標準的なアプローチが提示されています。この記事が、メカノバイオロジー研究における高精度MTの採用を促進し、読者が関心のある独自の力に敏感なシステムを探求するように動機付けることを願っています。
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Protocol
このプロトコルに記載されているすべての材料と機器は、 材料の表に記載されています。以下に説明する高速MTセットアップを操作するためのLabVIEWソフトウェア、およびサンプルデータを解析するためのMATLABスクリプトは、GitHub(https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers)に公開されています。
1. 装置構成
注:高速MT構造の一般原理は、高速相補型金属酸化膜半導体(CMOS)カメラと高出力のコヒーレント光源を使用する点を除いて、標準の従来のMTシステムと同様です(図1)。標準MT機器5,26,27の詳細については、他のソースを参照してください。
- 防振光学テーブルに倒立顕微鏡を設置します。高速CMOSカメラとフレームグラバーを取り付けます。
- 磁石を3Dで操作するための平行移動ステージを構築します。電動リニアステージ(トラベル>20 mm)を手動XYステージの上に垂直に取り付けます。
注意: 垂直方向の動きは力を制御しますが、XYステージはセットアップの初期構築のために磁石を光軸に手動で位置合わせするためのものです。 - 回転ステッピングモーターと回転磁石用のベルトとプーリーシステムを取り付けます。
注意: ベルトは、モーターシャフトと数センチ離れた磁石の間の回転運動を伝達します。磁石の回転は並進操作の内部にあります。 - 磁石を取り付けます。2つの同一の磁石を並列にしっかりと収納できるアクリルホルダー(製造会社から注文、 補足図S1を参照)を使用し、磁石間に1mmのギャップを明確にします(図1B)。所定の磁石のペアで得られる最大の力を利用するには、平行移動ステージの垂直位置を調整して、磁石の底面がサンプル平面に最も低い位置に移動したときに位置が揃うようにします。
注:磁石28のホルダーの設計と構成の詳細については、Lipfertらを参照してください。磁石の高さと向きは、LabVIEWソフトウェアとデータ集録によって制御されます。 - 低倍率の対物レンズで見る場合は、磁石を視野の中心に合わせます。磁石を回転させても、磁石ペアの中心が大きくずれないことを確認してください。
注意: 磁石間の中点が回転軸を中心に回転する場合は、ホルダーが不完全であるために磁石の中心がずれている可能性があります。磁石の回転はテザーをチェックし、特定のアプリケーションでトルクを適用するためだけであるため、ギャップサイズに対するわずかなレベルのミスアライメントは許容されます。 - ビーズの照明用のスーパールミネッセントダイオード(SLD)を取り付けます。2つの磁石の間の1mmのギャップにビームを通します。ビームがギャップに収まるように適切にコリメートされ、照明が磁石によって影を落とされていないことを確認してください。
- ノーズピースにピエゾレンズスキャナーを取り付け、ビーズトラッキング用の100倍油浸対物レンズ(開口数[NA]:1.45)を取り付けます。結果の追跡で潜在的なアーチファクトを回避するには、磁石を移動したときに照明が均一に維持されるようにしてください。最後に、ピクセルを飽和させずに、光のレベルを最大輝度に調整します。
注:ビーズの高速トラッキングのためのさまざまな光源の比較については、Dulinら29を参照してください。
2. 磁力の校正
- ポリメラーゼ連鎖反応(PCR; 表1参照)を用いて、一方の端がビオチン(表面付着用)で標識され、他方の端がアジ化物(ビーズ付着用)で標識された5 kbp dsDNAフラグメント(プライマーB、プライマー Z_5k、およびλ-DNAを使用)を調製します。
- セクション6に続いて、5 kbp分子を含むフローセルを準備します。
- セクション7に続いて、その伸長と回転を検証して、適切なビーズテザー構造を特定します。特に、中心から外れたアタッチメント30,31によるビードの高さオフセットを最小限に抑えるために、回転軌道が最小のビード(半径<200 nm)のビードを選択してください。良好なテザーが特定されたら、セクション9を参照してビードトラッキングを開始します。
- セットアップが新しい場合は、信頼性の高い高分解能測定のためにノイズと安定性を特徴付けます。フローセル表面から磁石~3mmを置き(>10pNを印加し、ビーズのブラウン運動を抑制するため)、1.2kHzでビーズのz位置を追跡し、z座標時系列32,33からアラン偏差(AD)を計算します(図2C)。高速領域(<0.1秒)で数ナノメートルのAD値が達成可能であり、差動トラッキング(基準ビーズに対する磁気ビーズ位置)が長いタイムスケールでADを減少させることを確認します。
注:通常、最大レート(1.2kHzまたは0.83msの分解能)で<3nmのADが得られ、ADは少なくとも最大10秒まで減少し続け、ドリフトが最小限であることを意味します。他の人は、同様のセットアップ9、10、11、12、34で同様の値を報告しています。 - 磁石を静止位置(F ~ 0 pN)にして、テザービードの x座標と y座標を1.2kHzで記録します。ブラウン運動が十分にサンプリングされるように、十分に長い期間(すなわち、変動の特性緩和時間35よりも十分に長い)位置を記録する。
注: ここで、x方向は磁場の方向に沿っていますが、 y 方向の動きは磁場に垂直な横方向の動きを表しています。 - 磁石をフローセルに近づけ、磁石がフローセルの上部に軽く触れるまでビード位置の測定を繰り返します。磁石がサンプル面から7 mm以上離れている場合は大きなステップ(たとえば、1〜2 mm)で移動しますが(磁石の遠方界では加えられる力がゆっくりと増加するため)、ステップサイズを徐々に小さくします(例:0.1〜0.5 mm)より高い力レベルでより細かいキャリブレーションのために(図2B)。
- 2つの代替方法のいずれかを使用して、各磁石位置 dでの力を計算します(両方の方法を含むMATLABスクリプト「force calibration.m」が提供されます; 補足ファイル1を参照)。
- ビーズのy座標
(図2D)と最低位置に対するビードの平均z位置
(図2B、下)の分散を測定します。次に、式 (1)7,27,36 を使用して力を推定します (固定ビーズ半径 R = 1,400 nm、熱エネルギー kRT = 4.11 pN∙nm の場合)。
(1) - または、y座標Syのパワースペクトル密度(PSD)を計算します(図2E)。式(2)を用いて測定されたSyに二重ローレンツモデル37を当てはめて、加えられた力Fを求める。
(2)
ここで、Rはビード半径、
γyおよびγφはそれぞれ並進抗力係数および回転抗力係数(ストークス・アインシュタイン式から推定)、kRTは熱エネルギー、f+およびf-は式(3)を用いて求められる2つの特性周波数である。 
(3)
注:テザー延長Lは、確立されたワームライクチェーン(WLC)モデルに従う力の関数であるため、上記の式ではFを唯一のフィッティングパラメータとして残します(Rはすべての力レベルで共有され、正確な値は結果に大きく影響しないため、簡単にするためにRを1,400 nmに固定します)。必要に応じて、カメラベースの画像取得によるモーションブラーとエイリアシングを考慮する必要がありますが38,39ですが、5 kbpテザーを使用した1 kHzを超える高速測定では、この影響はごくわずかです。
- ビーズのy座標
- さらにいくつかのコンストラクトについて、手順2.4〜2.7を繰り返します。3〜5種類のビーズを調べて、磁気ビーズ間の力の変動を平均化します。
注:平均化のための適切な構成数を決定するために、使用中の磁気ビーズ間の力の変動を考慮する必要があります。このばらつきは小さいが、市販品31であっても、測定力に1pN以上の誤差を生じ得る。関係する力の絶対的な決定が重要ではないほとんどのアプリケーションでは、3〜5個のビーズのキャリブレーション結果を平均するだけで十分です。この変動を説明する別の方法は、実験の開始時に個々のテザーで力を測定することですが、これには時間がかかる場合があります。別の選択肢は、既知の力レベルで解凍するヘアピン構造を各構成体31に埋め込むことである。 - 測定された力を磁石の距離の関数としてプロットし、式(2)を使用してデータ(図4F)に二重指数関数を当てはめます。
(4)
ここで、F0(ベースライン)、A1とA2(振幅)、およびd1とd2(減衰定数)はフィッティングパラメータです。2つの方法の力の値と、結果として得られる二重指数適合がほぼ一致することを確認します(図2F、G)。
注意: 力のキャリブレーションが適切に行われていることを確認するには、伸張と測定された力をプロットして、プローブされた構成の力と伸長の関係を確認します。 - 磁気ビーズ30,31の力依存的な傾きに起因するビード高さオフセットzoffを補正するには、式(5)を用いてビード半径を有する中心外れテザーの形状を考慮して、横方向オフセットxoffからzoffを推定し、その値を測定された延長値に適用する。この手順は、MATLAB スクリプト "force calibration.m" (252 行目から 254 行目) に実装されています。
(5)
注:この補正は、特に回転半径が小さい(<200 nm)ビーズの場合、伸長に小さな変更を加えますが、図2Hから図2I30,31への変化に見られるように、このオフセットは弾性応答に重大な影響を与えることがよくあります。 - 永続性の長さ Lp を確認するには、拡張可能な WLC モデルを式 (6) を使用してデータに適合させます。
(6)
ここで、L0は輪郭長(5kbpの場合は1.7μm)、K0はエンタルピー延伸の弾性率である。
注:dsDNAのLpは、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの典型的な緩衝液では40〜50 nmであることが広く受け入れられていますが、短分子(<5 kbp)に適用されるWLC式は、L0が31,40減少するにつれてLpを体系的に過小評価します。これは、従来の WLC モデルでは、鎖長が持続長よりも十分に長いポリマーを想定しているためです。ここでは、5 kbpコンストラクトについてLp = 40 ± 3 nmが得られ(図2H)、伸長補正によりさらに1,100 ± 200 pNの均質なK0が得られました(図2I)。有限WLCモデル31,40を適用し、拡張分布41における非ガウス性の補正を適用すると、Lpがわずかに増加します。 - 力のキャリブレーションが検証されたら、得られた二重指数モデルのフィットパラメータを付属のLabVIEWソフトウェア(補足ファイル2)に適用し、ソフトウェアがモータの読み取り値(磁石の位置など)からリアルタイムで電流を計算するのを待ちます。逆関数 d(F) の解析式は利用できないため、d目標力水準の数値推定により、0.1 pNステップで d 対 F のルックアップ表を用意する。このテーブルをソフトウェアにも保存して、力制御を指揮します。
(図2D)と最低位置に対するビードの平均z位置
(図2B、下)の分散を測定します。次に、式 (1)7,27,36 を使用して力を推定します (固定ビーズ半径 R = 1,400 nm、熱エネルギー kRT = 4.11 pN∙nm の場合)。
(1)
(2)
γyおよびγφはそれぞれ並進抗力係数および回転抗力係数(ストークス・アインシュタイン式から推定)、kRTは熱エネルギー、f+およびf-は式(3)を用いて求められる2つの特性周波数である。 
(3)
(4)
(5)
(6)3. DNAヘアピンの合成
注:MT実験用のDNAヘアピンコンストラクトは、λ-DNAの510 bp領域を2つのカスタムプライマーでPCR増幅することによって調製され、そのうちの1つは5'末端にヘアピン構造を含みます(図3A)。このようにして、ヘアピンモチーフがPCR産物の一端に配置される。
- プライマーを準備します。
- フォワードプライマー:ガラス表面付着用に5′-ビオチン標識され、λ-DNAに結合するプライマー B_hp。このプライマーは、8 bpのステムと6 ntのループ(λ結合領域に5')を持つヘアピンモチーフを含んでいます。
- リバースプライマー:磁気ビーズ付着用に5′-アジド標識され、フォワードプライマーから1 kbp離れたλ-DNAに結合するプライマー Z_hp。
- λ-DNA(テンプレート)、nTaqポリメラーゼ、および標準PCR条件でPCRをセットアップして実行します( 表1を参照)。市販の精製キットで製品をクリーンアップします。
- 260 nm(A260)でのUV吸収によりDNA濃度を測定し、アガロースゲル電気泳動(2%ゲル)( 表2参照)を行い、製品サイズを検証します。標準的な収率は、~35 μLの~600 nM溶液です。
4. SNAREタンパク質の調製
注:ニューロンSNARE複合体は、 大腸菌から発現した3つの精製ラットタンパク質(VAMP2/シナプトブレビン-2、シンタキシン-1A、およびSNAP-25)を組み合わせることによって組み立てられます(図3B)。それらの組み立てを容易にするために、シンタキシンとSNAP-25はVAMP2フラグメント(N末端領域を欠く、「ΔN-VAMP2」と呼ばれる)と「ΔN-複合体」と呼ばれる構造に共発現され、DNAハンドル付着後に完全長VAMP2と混合されて完全な複合体を形成します。
- SNAREタンパク質を発現させるためのcDNAを含むプラスミドを調製します(すべてのプラスミドのDNA配列は 材料表に記載されています)。
- 膜貫通ドメインを欠く6×Hisタグ付きVAMP2を調製する(2-97;ジスルフィド結合のL32C/I97C)をpET28aベクターにクローニングした。
- Habcおよび膜貫通ドメイン(ジスルフィド結合の191-267、I202C/I266C置換)を欠失したシンタキシン-1Aを、6×Hisタグ付きΔN-VAMP2(49-96)とともにpETDuet-1ベクターに調製します。
- 完全長SNAP-25アイソフォームb(2-206、全てのCからA)をpET28aベクターにクローニングして調製する。これはΔN錯体の調製に使用されます。
- 6×Hisタグ付き完全長SNAP-25アイソフォームb(1-206、すべてのCからA)をpET28aベクターにクローニングして、MTアッセイバッファーに直接添加し、展開後にSNARE複合体を再構成できるように調製します。
- ロゼッタ(DE3)大腸菌細胞の2本のチューブを準備し ます。 1つのグループをVAMP2プラスミドで形質転換し(ステップ4.1.1から)、1つのグループをシンタキシン-1A/ΔN-VAMP2とタグなしSNAP-25プラスミド(ステップ4.1.2および4.1.3から)の両方でΔN複合体を発現させ、もう1つのグループをHisタグ付きSNAP-25プラスミドで形質転換します(ステップ4.1.4から)。
- 形質転換細胞を適切な抗生物質(ここでは、VAMP2およびHisタグ付きSNAP-25の場合はカナマイシンおよびクロラムフェニコール、ΔN複合体の場合はカナマイシン、クロラムフェニコール、およびアンピシリン)を用いてLuria-Bertaniブロス(LB)に移します。ブロスの光学密度(OD)が0.7〜0.9に達するまで、振とうインキュベーター(220 rpm)で37°Cでそれらを成長させます。
- 1 mMイソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えてタンパク質発現を誘導し、細胞を振とうインキュベーター(220 rpm)で37°Cで3〜4時間インキュベートします。
- 培養物を4,500 × g で4°Cで15分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。
- タンパク質精製用のバッファーを調製します( 表2を参照)。
- SNARE発現細胞ペレットを40mLの氷冷溶解バッファーに懸濁し、氷上で超音波処理することによって細胞を溶解する(15%振幅、5秒オンおよび5秒オフ、合計30分)。
- ライセートを15,000 × g で4°Cで30分間遠心分離し、不溶性物質を除去します。
- 上清を1 mLのNi-NTA樹脂を充填した重力カラムに通します。レジンを洗浄バッファーAで洗浄し、次に洗浄バッファーBで洗浄し、10 mLの溶出バッファーでタンパク質を溶出します。
- 脱塩カラムを使用して、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)とイミダゾールを溶離液から除去します(製造元の指示に従ってください)。サンプルをPBSで溶出します。
- 遠心フィルター(カットオフ 10 kDa)でタンパク質を PBS (通常 2 mL 生成) に維持しながら、~70 μM まで濃縮します。タンパク質濃度は、280 nm(A280)での紫外線(UV)吸収またはブラッドフォードアッセイのいずれかによって測定します。
- 少量のアリコートを準備し、液体窒素で瞬間凍結し、使用するまで-80°Cで保存します。
注:完全なSNARE複合体は、DNAハンドル上でΔN複合体を結合させた後に組み立てられます(下記参照)。
5. DNAハンドルの付着
注:片末端に第一級アミン基を含む2つの510 bp dsDNAハンドルを最初にPCRによって調製し、次に二官能性架橋剤SM(PEG)2を使用してアミン基をマレイミド基に変換します。次に、2つのハンドルは、部位特異的結合のためにシステイン基 を介して SNARE複合体に共有結合で結合されます(図3B)。
- プライマーを準備します。
- フォワードプライマーの準備:ガラス表面付着用に5′-ビオチン標識され、λ-DNAに結合するプライマーB(ハンドルBを増幅するため)。プライマーZ(ハンドルZを増幅用)は、磁気ビーズ付着用に5′-アジド標識され、プライマーBと同じ配列を有する。
- リバースプライマーを準備します:タンパク質結合用に5′-アミン標識され、フォワード プライマーから510 bp離れたλ-DNAに結合するプライマーN(ハンドルBとハンドルZで共有)。
- λ-DNA(テンプレート)、nTaqポリメラーゼ、および標準PCR条件( 表1を参照)を使用して、2セットのPCR反応(各ハンドルに200 μL反応の18チューブ)をセットアップして実行します。PCRクリーンアップキットで製品をクリーンアップし、各ハンドルを45 μLの超純水で溶出します。後のステップで効果的な反応のために高濃度のハンドルを得るために、最小限の量の水を使用してください。
- A260によりDNA濃度を測定する。標準的な収率は、各ハンドルあたり~650 μLの~2 μM溶液です。アガロースゲル電気泳動で後で検証できるように、少量のサンプルを離して保管してください。
- 各ハンドル (PBS 中 1 μM) を 5 mMM(PEG)2 と反応させます。穏やかに回転しながら室温でインキュベートします。1時間後、DNA精製キットを使用して未反応のSM(PEG)2を除去します。各ハンドルを250 μLのPBSで溶出して、~2 μMの溶液を得ます。
- ハンドルBとΔN複合体の溶液を1:16のモル比で混合し(例:1 μMハンドルBと16 μMのΔN複合体)、撹拌しながら室温で2時間インキュベートします。アガロースゲル電気泳動用の少量のサンプルを離してください。
- 前のステップで使用したΔN錯体に対して2.5倍のモル過剰量のVAMP2の溶液を追加します。混合物を撹拌しながら室温でさらに1時間インキュベートする。フルSNARE複合体は、このステップで組み立てられます。
- 新鮮なPBSおよび遠心フィルター(100 kDaカットオフ)とのバッファー交換により遊離タンパク質を除去します:14,000 × g で4°Cで5分間遠心分離し、少なくとも6回繰り返し、最後のスピンのために15分間実行します。A260/A280比の増加を測定して、遊離タンパク質の除去を監視します。アガロースゲル電気泳動用の少量のサンプルを離してください。
- ハンドルZをハンドルBの15倍モル過剰で溶液に加え、反応を促進するためにハンドルZの濃度を少なくとも1μM以上に保ちます。混合物を撹拌しながら4°Cで一晩インキュベートします。
- 中間体(ハンドルBとそのタンパク質コンジュゲート)と最終生成物(2つのハンドルを持つSNARE複合体)をアガロースゲル電気泳動(図3B、挿入図)で確認します( 表2を参照)。
注:タンパク質がハンドルBに正常に結合すると、移動度シフトが検出されます。特に、DNAハンドル上での完全なSNARE複合体の形成は、SDSで分解され、DNAにシンタキシンのみが結合したままになるΔN複合体とは異なり、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に対する耐性によって確認できます( 図3Bのbとcを比較してください)。 - 少量のアリコートを準備し、液体窒素で瞬間凍結し、使用するまで-80°Cで保存します。
注:最終溶液には未反応のハンドルが含まれていますが、フローセルでのサンプルアセンブリ中に、ビオチンとアジドで二重に標識された目的のコンストラクトのみが選択されます。
6. フローセルの製作
注:MT測定用のフローセルは、両面テープで接着された2つのガラスカバースリップで構成されています(図3C)。1つのカバーガラスは、PEGとビオチン化ポリエチレングリコール(PEG)の混合物でコーティングされており、非特異的結合を回避し、ビオチン-ニュートラアビジン結合 を介した 標的分子の特異的テザリングを可能にします(図3D)。次に、MT実験用材料の溶液をシリンジポンプを用いてフローセルに順次注入します(図3C、D)。
- ガラスカバーガラスを上面(24mm×50mm、厚さ1.5番)と底面(24mm×60mm、厚さ1.5番)にそれぞれ1枚ずつ用意します。30分間1 M KOHで超音波処理によってカバーガラスをきれいにします。超音波処理後、カバーガラスを蒸留水ですすぎ、次のステップまで水中に保ちます。
- PEGylateは、公開されているプロトコル42,43に従って下部カバースリップを塗ります。シラン化にはN-[3-(トリメトキシシリル)プロピル]エチレンジアミンを使用し、100 mM重炭酸塩バッファー中のビオチン-PEG-SVAとmPEG-SVAの1:100(ww)混合物を使用します。PEG化カバーガラスを-20°Cで乾いた状態に保ち、数週間保管します。
- 実験当日、PEG化カバーガラスを取り出し、窒素ガンでブロー乾燥します。汚れがないか目視検査して、汚れがないことを確認します。
- サンプルチャンネルを作成するには、~2 mm幅の両面テープを用意し、4つのストリップを下部カバースリップ(PEG化面を上にして)に平行に、互いに~5 mm離して置きます(図3C)。
注:このようにして、1つのフローセルに3つの5 mm幅のサンプルチャンネルを作成できます。 - 下部カバースリップの中央に上部カバースリップを置き、短い方の端にチャネルの入口と出口用のスペースを~5 mm残します。トップカバースリップの背面をピンセットでそっと押して、チャネルをしっかりと密閉します。
- インレットリザーバーを作成するには、200 μLのピペットチップの端を切り取ります。広い開口部から~10 mmを切り取り、~200 μLの溶液を保持できるようにします。3つの流路用に3つ作成します。出口を構成するには、シリンジポンプのチューブに適合する3本のシリンジ針を準備します。
- 5分間のエポキシを使用して、リザーバーとニードルハブをフローセルに接着します。漏れを防ぐために完全なシールが形成されていること、およびチャネルが余分な接着剤で塞がれていないことを確認してください。少なくとも30分間乾燥させます。
7.ビーズテザー構造の組み立て
注:ビーズテザーコンストラクト用のものを含むMT実験用の材料の溶液は、シリンジポンプを使用してフローセルに順次導入されます(図3C、D)。
- 磁気ビーズを準備します。ストック溶液から5 mgのM270-エポキシビーズ(167.5 μLのジメチルホルムアミド中の~3.3 ×10 8 ビーズ)を取り出し、ビーズの磁気分離により溶媒をリン酸緩衝液( 表2参照)と交換します。
- 1 M硫酸アンモニウムを含むリン酸緩衝液中で、ビーズを~1.1 × 109 mL−1 で調製し、2 mMジベンゾシクロオクチン(DBCO)-NH2と反応させます。混合物を室温の回転ミキサーで3時間インキュベートします。反応後、ビーズを新鮮なリン酸緩衝液で3倍洗浄し、未反応分子を除去します。
注:洗浄されたビーズは、使用前に数週間、4°Cで余分な回転なしで保管できます。 - フローセルチャネル出口の針をポリエチレンチューブでシリンジポンプに接続します。PBSでチャネルを平衡化します。
- ポンプで吸引することにより、次の溶液をチャネルに順次導入します:ニュートラアビジン、ターゲットコンストラクト(DNAヘアピンまたはDNAハンドルを持つSNARE複合体)、リファレンスポリスチレンビーズ、およびDBCOコーティングされた磁気ビーズ。使用前に、ビーズ溶液を完全にボルテックスして、潜在的なビーズ凝集体を分散させます。
- 0.1pNの力を加えながら、結合していないビーズを洗い流します。
注意: 小さな上向きの力を加えると、結合していないビーズの除去が容易になり、特別に結合したビーズテザー構造の破裂を回避するのに役立ちます。 - SNARE複合体を用いた実験では、最終バッファーに1.5 μM SNAP-25を含めます。
注:遊離SNAP-25分子は、アンフォールディング後にSNARE複合体を再結合し、単一の複合体で繰り返し測定することができます。
8. ターゲットコンストラクトの同定
- フローセルチャネルの表面で、ターゲット構築物の単一分子によってつながれている磁気ビーズを検索します。参照ビーズが近くにあることを確認してください。
- 候補ビードを回転させ、自由に回転することを確認します。ビーズが複数の分子によってつながれている場合、ビーズは拘束された動きを示します。
- ビードを数回回転させ、回転半径を調べます(この機能は付属のソフトウェアに実装されています)。好ましくは、回転半径の小さいビードを選択する。
注:この半径は、ビード−テザーアセンブリ30,31の間にランダムに決定されるテザー軸からビードがどれだけ中心からずれているかを示す。すべての実験において、ビードの最小限のオフセンタリングは、使用する高いビード半径対テザー伸長比に関連する多くのアーティファクトを軽減します。 - 力を0から5 pNに増やして、良好なシングルテザービーズを特定します。1 kbpのテザー(または同等の2つの510 bpハンドル)の伸張に起因するビーズの回折パターンの大きな変化を探します。回折パターンが大きく変化しない場合は、力をゼロに下げて、別の候補ビーズをスキャンします。
注:ビードの~300 nmの浮き上がりは、実際にトラッキングプロセスを開始しなくても、生の画像からすぐにわかります。
9. 伸展測定のためのビードトラッキング
メモ: ビーズの追跡は、この記事に付属のLabVIEWソフトウェアでビーズ画像をリアルタイムで解析することによって実行されます。追跡方法およびその変形は、従来のMTシステムのほとんどで使用されており、以前の文献2、5、7、26で説明されている。固定基準ビーズに対する磁気ビーズの位置を測定する(すなわち、差動トラッキング)ことにより、位置測定は外部摂動に対して非常にロバストになります。
- 適切な磁気ビーズが基準ビーズと一緒に配置されたら、[ キャリブレーション ]ボタンをクリックしてビードトラッキングの準備を開始します。
- 画像内のビーズをクリックして、ビーズの位置を定義します。次に、画像をビーズの周囲の関心領域(ROI)(たとえば、3 μmビーズの場合は150 x 150ピクセル)にトリミングし、さらに分析して正確なビード座標を抽出します。
- 磁石の回転が完了するのを待ちます。このプロセスは、ビーズ31の中心から外れた取り付けを記録するために磁石を回転させながら、ビーズのx座標およびy座標を(2D相互相関44を計算することによって、またはビード画像の半径方向対称性45を使用することによって、同等の性能で)記録する。
- z方向でトラッキングするには、焦点面から異なる距離にあるビーズの回折画像のルックアップテーブルがソフトウェアによって生成されるのを待ちます。これは、対物レンズをピエゾスキャナーで等距離にステップアップし、各位置で変動平均ビード画像を記録することによって行われます。次に、実際の実験におけるビーズのz座標は、リアルタイムのビーズ画像を補間7でルックアップテーブルと比較することによって決定されます。
- ルックアップテーブルの生成が終了したら、トラッキングとオートフォーカスを有効にします(トラックとAFを押しますか?ボタン)をクリックし、[取得]ボタンをクリックしてビード位置の記録を開始します。
メモ:オートフォーカスはオプションですが、集録中の z 単位のステージドリフトを補正することをお勧めします。
10.強制適用スキーム
- フォースランプ実験: 構成体の力と伸展の関係を確認するには、一定の荷重速度(± 1.0 pN s−1)で力ランプを上下に適用します(図4A)。たとえば、0-20-0 pN サイクルを 3 回適用して、構成の全長とハンドルの力-伸展曲線を確認します。
- ソフトウェアでテザーパラメータを指定することで、測定データの上にWLC力延長曲線を重ね合わせ、ターゲットビーズが適切なDNAハンドルを備えた本物のサンプルコンストラクトによってつながれているかどうかを判断します。コンストラクトの既知の輪郭長(例:1 kbp dsDNAの場合は~340 nm)およびWLC持続長(短いdsDNA31の場合は30〜45 nm)を開始点として使用します。必要に応じて、手順2.11で説明した拡張子の修正方法を適用します。
- コンストラクトが検証されたら、力伸長応答を詳細に調べて、標的分子-ヘアピンまたはSNARE複合体に起因する追加の伸長を探します。
- コンスタントフォース実験: 加えられる力を個別のステップで徐々に変化させて、標的分子の力感度を調べます(図4B)。
注:MTは、磁石が静止しているときに加えられた力が一定に保たれるため、簡単で効果的な定力実験を可能にします。- DNAヘアピンの場合、0.2〜0.5 pNステップで4〜8 pNの力を加え、各力レベルで~10秒間ビーズの位置を測定します。
- SNARE複合体の場合は、0.1〜0.2 pNステップで14〜16 pNの力を加え、各力レベルで~10秒間ビード位置を測定します。
- フォースジャンプ実験: SNARE複合体の遷移事象を観察する。
注:フォースジャンプ実験は、コンスタントフォース実験と同様に、フォースレベルの変化を伴います。ただし、フォースジャンプは、加えられた力のより急激な変化を採用し、タンパク質複合体の突然の破裂など、プローブされた分子内の力によって引き起こされるイベントを監視できます。例えば、SNARE複合体はフォースサイクル23において構造ヒステリシスを示すので、フォースジャンプ実験を行い、遷移までの潜時を測定することは有益である(図4C)。- 解凍： 無傷の三元SNARE複合体からVAMP2分子を剥離し、シンタキシン-1AおよびSNAP-25のバイナリ複合体を残す。
- 再圧縮: 解凍したVAMP2分子をジッピングして、無傷のSNARE複合体を再生します。
- 展開： SNAP-25の完全な解離を伴うSNARE複合体の完全な分解。VAMP2およびシンタキシン分子のみが、展開後にコンストラクトに残ります。
- リフォールディング： バッファーからの遊離SNAP-25分子の結合によるSNARE複合体の再生。
- 2 pNで、遊離SNAP25分子の会合を待機(~30秒)することにより、無傷のSNARE複合体の集合を誘導します。SNARE複合体の形成時に伸長の急激な減少が観察される。
- 解凍イベントを観察するには、10〜12 pNで数秒待ってから、可能な限り最大モーター速度で突然14〜15 pNに移動します。ターゲットの力に応じて、SNARE複合体は、部分的に解凍された中間体間の可逆的な遷移(一定の力の実験のように)またはランダムな待機時間(または遅延)の後に~25nmのより高い解凍状態へのジャンプのいずれかを示します。
- 再圧縮イベントを観察するには、解凍が観察された直後に力を10〜12pNに下げます。ここでも、SNAREコンプレックスは、ランダムなレイテンシーの後、より低いジッパー状態への確率的遷移を示します。解凍後に展開が発生した場合、SNAP-25分子が失われるため、複合体は再圧縮に失敗します。
- 展開イベントを観察するには、解凍が観察された後、さらに長い期間待って、伸展のさらなる増加(~2 nm)を検出します。
11.データ分析
注:MTデータを使用して実行できる分析の種類は、ターゲットシステムによって異なります。ただし、 図 4 で説明したそれぞれの実験から有用な情報を抽出するには、一般的な方法があります。すべての分析は、この記事で提供されているカスタムコードを使用してMATLAB(R2021a)で実行されます。これらのコードは、この記事で紹介したのと同じデータを使用してプロットを生成します。100 Hzトラッキングの生データは分析のために直接取得されましたが、1.2 kHzトラッキングからのデータは通常、ノイズを低減するために分析前に中央値フィルタリング(5ポイントのスライディングウィンドウを使用)されたことに注意してください(ノイズ分析を除く)。
- フォースランプ実験: 力と伸長の関係(ポリマーの弾性など)を解析し、力を遷移させてナノメカニカル特性の情報を抽出します。
- コンスタントフォース実験: 状態集団と滞留時間(または遷移率)を力の関数として分析し、構造変化の構造(遷移に関与する領域など)、熱力学的(自由エネルギー差など)、および運動(エネルギー障壁など)パラメータを抽出します。
- フォースジャンプ実験: 破裂速度論(タンパク質間相互作用や受容体-リガンド結合など)や一過性中間体の寿命(生体分子のアンフォールディングなど)を分析して、標的分子の安定性とその状態を抽出します。
- 代表的なアプリケーションとして、DNAヘアピンおよびSNARE複合体のサンプルデータを分析します。
- DNAヘアピンの2状態遷移: 解凍力、開口距離、集団シフトの力依存性、隠れマルコフモデル(HMM)による状態割り当てと遷移率の測定(MATLABコードを提供)。
- SNARE複合体のコンフォメーション変化: アンジップ力、中間状態の力依存性とアンジップ待ち時間、リジップのヒステリシス、アンフォールド/リフォールディング挙動。
注:DNAハンドル、DNAヘアピン、およびSNARE複合体立体配座の力拡張モデルは、以前の参考文献14,31に記載されています。
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Representative Results
力のキャリブレーション
2つの力測定方法(ビーズの横方向変位分散とパワースペクトル分析)の結果は、0〜2pN異なりました(図2G)。 図2Fの結果によると、通常のネオジム磁石で最大30pNまで確実に到達できます。
8 bp DNAヘアピンの2状態遷移
まず、短いDNAヘアピンのナノメカニクスを調べました(図5)。DNAヘアピンは、従来の単一分子力分光法によって広範囲に特徴付けられているため、比較するための膨大な参照ソースが利用可能です。短いヘアピンの解凍は通常可逆的であるため、その再圧縮イベントは、解凍が発生するのと同じ力の範囲でも観察されます(図5A)。0 pNと20 pNの間のフォースランプを適用することにより(図5B)、ヘアピンコンストラクトの力による伸展は、DNAハンドルの弾力性にのみ起因するWLCモデルに従うことが確認されました(図5C、「閉じた」)。約6pNで、コンストラクトは、ヘアピン構造の可逆的な解凍に関連して、伸展の追加の変動を示しました(図5C、挿入図)。最後に、~8 pNで、遷移は最終的に消え、伸長はさらに~7 nm延長された上部状態に落ち着きました。その結果、8pNを超える測定された力の伸長プロファイルは、解凍されたヘアピンの一本鎖領域の長さを含む新しいモデル曲線(図5C、「オープン」)にスナップしました。
次に、ヘアピン遷移を系統的に調べるために定力実験を行いました。ビード位置は、4〜8 pNの力の範囲で、各レベルで~10秒間、0.5 pNステップで測定されました。次に、伸張値を収集して分析し、力の関数として平衡分布を測定しました。100 Hz追跡の結果は、この力レジームでより拡張状態への段階的なシフトを示唆しましたが(図5D)、得られた伸長のヒストグラムは、明確な集団を解決するのに十分明確ではありませんでした(図5E)。これとは対照的に、同じ実験を1.2kHzで行った場合(図5F)、穏やかなフィルタリング(5点メディアンフィルタ)後の伸長変化の高速軌跡は、2つのガウス分布の混合によってよく記述される2つの異なる集団を明らかにしました(図5G)。ヘアピンの開口距離を示す2つの集団間の分離は、解凍力レジームで~7 nmで変化しませんでした(図5H)。四肢の偏差(4 pNと8 pN)は、その希少性のために1つの状態の不正確な局在化によるものでした。
その結果、解き放つ遷移の中間力(閉集団と開放集団が等しくなる力)F1/2は~6 pNであり、4-8 pNの力が増加するにつれて、上部の開放状態が徐々に支配的になることが明らかになりました(図5I)。オープン確率にボルツマン関係を当てはめると、
F 1/2 = 5.9 pN、Δz = 7.1 nmの正確な値が得られ、上記の観測値と一致した。ただし、単一の構造から得られる開口力は、市販のM270ビーズ31では~4%と測定された力生成におけるビーズ間の変動性のために正確ではない可能性があることに注意してください。また、ステム長(8bp)が短いため、ヌクレオチド組成の異なる他の8bpヘアピンのグラウンドトゥルース開口力は20と大きく変動し得る。最後に、HMMを伸長トレースに適用して状態遷移をマッピングし、遷移速度を測定しました(図5F、赤いトレース)。解凍速度と再圧縮速度の両方が、加えられた力によって指数関数的に変化し(図5J)、力が解凍を促進し、再圧縮を阻害します。必要に応じて、古典的なベル式をさらに使用して、エネルギーランドスケープのパラメータ(バリアの高さや距離など)を抽出することができます46。
伸張測定における熱ゆらぎの特性評価
ヘアピン構造を使用して、伸展測定における力依存ノイズのプロファイルを作成しました。まず、テザービーズの熱ゆらぎを、これらの実験に適したパラメータ(ビード半径、テザー長など)を用いた式から計算した2,5(図5K、実線曲線)。また、異なる力レベルでヘアピン構造の時間トレースから測定された伸張
の標準偏差をプロットしました。この分子はヘアピンモチーフを持っていたため、固有ノイズの測定には4 pN(閉状態)での応答を使用し、ヘアピンダイナミクスは予想通り~6 pN検出され、チェックとして機能しました。力依存的な変動の抑制は、ヘアピンがほとんど開いた後も観察されました(8 pNと4 pNを比較)。熱限界との比較は、改善の余地があることを示しているが、この残留ノイズは、磁気ビーズ30の回転変動と関連していることが多く、これはランダムで解決が困難なものである。観測時間にわたるブラウン雑音のより体系的な解析のために、アラン偏差の計算が頻繁に採用されています32,33。図5Fに示すヘアピンデータのアラン分散を、図2Cの5kbp測定値と同様に計算しました。図5Lの結果から、4-8pNの中間力範囲では、最高速度(1.2kHz)で2-3nmのアラン偏差が得られ、0.1秒より長い観測時間(τ)では1nm以下に低下したことがわかります。興味深いことに、ヘアピンダイナミクスは5-7 pN付近で~0.01秒(図5L、挿入図)で現れ、図5I、Jで測定された遷移力と速度と一致しています。
神経細胞SNARE複合体の立体構造変化
次に、ニューロンのSNARE複合体をタンパク質モデルとして使用し、それらの力依存的な機械的特性を調べました。ヘアピンコンストラクトとは異なり、単一のSNARE複合体を2つの510 bp dsDNAハンドルの間に保持しました(図6A)。ハンドルから遠位にあるシンタキシン-1AおよびVAMP2の末端は、人工システイン残基間のジスルフィド結合によって架橋され、破裂を回避し、所与のコンストラクトの複数回のピンセットを可能にした。
まず、力レベル(± 1 pN s−1)の増加と減少の両方で力のランプを適用して、ターゲット構造をそれぞれ伸ばしたり弛緩させたりしました。低力から中力領域(0-10 pN)では、2つのハンドルは独立してWLCポリマーとして振る舞い、全体的に1 kbp dsDNAの力伸長曲線と見分けがつかない形をしました(図6B、黒)。ただし、力が 10 pN を超えるまで増加すると、拡張値は WLC モデルから大きく逸脱し、組み込み SNARE コンプレックスがさらに拡張の増加を示したことを示しています。より具体的には、伸長の増加は、(a)11-13 pNのわずかな緩やかな増加、(b)14-16 pNの急速かつ大きな(~10 nm)変動、および(c)約~20 nmの最終的な不可逆的な解凍の3つの異なる段階に要約できます。さらに、構造を緩和するために力を下げた場合、延長はより低い力(<15 pN)で元の力-延長曲線に戻るか、より大きな延長を伴う新しいモデル曲線に従いました(図6B、青)。最終的に、全体の伸びは5pN未満の低い値( 図6Bの青から黒)に復元され、同じ力ランプサイクルを適用できましたが、同様の傾向を示しました。
SNARE複素配座の分子モデルから、潜在的な中間体の可能な拡張値を正確に計算することができます(図6C)。さらに、巻き取られていないポリペプチドのWLC挙動を仮定すると、伸長は力の関数として推定することができ、したがって、様々な立体配座の完全な力伸長モデルを生成することができる(図6B、点線)。これらの値を基準として、上記の遷移を次のように解釈しました14,23:(a)11-13pNで完全ジッパー状態(FZ)からリンカーオープン状態(LO)に徐々にシフトし、シンタキシン-1AおよびVAMP2のリンカー領域の開放を意味します。(b)LOとハーフジッパー状態(HZ)との間の急速な遷移、ゼロ番目のイオン層までのSNARE複合体の開口部を意味する。(c)解凍状態(UZ)または展開状態(UF)のいずれかへの最終的な移行であり、複合体の残りの部分からのVAMP2の完全な解明を意味します。UZ状態は、SNAP-25の会合分子が依然としてシンタキシン-1Aに結合し、バイナリ複合体を維持しているという点でUFとは異なります。UF(SNAP-25なし)の場合、完全なSNARE複合体は、溶液からの遊離SNAP-25分子が再結合した後にのみ再生することができ、そのような再結合を可能にするために加えられた力を下げることが重要である。
SNARE複合体の立体構造変化をより体系的に検証するために、14-15pNで高次的に立体構造変動が観測された力レジームでフォースジャンプ実験を行いました(図6D)。通常、まずビード位置を10pNで測定し、安定した伸展を確認し、SNAREに関連する変化がないことを示しました。次に、力のレベルを突然14〜15 pNに増加させ、解凍が発生するまで延長を監視しました。最後に、力を10pNに戻し、展開に関連する伸長の持続的な増加を確認しました。14pNでは、拡張トレースはほとんどLO状態にとどまり、時折HZ状態にスパイクしました。HZ状態へのこれらの短いエクスカーションは、ビーズ画像を12倍に平均化およびダウンサンプリングする100Hzトラッキングでは見逃される可能性が高いことに注意してください。HZ状態への明確で頻繁な訪問にもかかわらず、複合体はUZ状態への完全な移行を行うことができず(図6E)、外力が解凍に対するエネルギー障壁を克服するのに十分な強さではなかったことを示唆しています。対照的に、力のわずかな増加(14.3pNまで)でさえ、遷移を非常に効率的にし、ほとんど数秒以内にUZ状態に到達しました(図6F)。一貫して、複合体に14.5pNを適用した場合、解凍はほぼ1秒以内に完了しました(図6G、H)。特に、UZを超える伸長のわずかな追加の増加(図6H)および2pNで観察されたリフォールディングシグネチャ(図6I)によって証明されるように、より高い力での解凍は、しばしば複合体全体の完全な展開(SNAP-25の除去を伴う)につながりました。全体として、これらのデータは、SNARE複合体の展開に対する古典的なスリップ結合挙動47を示しており、以前の報告14、23、48と一致している。
図1:機器のセットアップ。 高速MTセットアップの概略図(A)と写真(B)。リニアモーターと回転モーターで制御される磁石は、100倍の油浸レンズと高速CMOSカメラを備えた倒立顕微鏡のサンプルステージの上に配置されています。超発光ダイオードからの光ビームは磁石を通過し、フィールドを照らします。挿入図:焦点面から異なる距離にあるビーズの代表的な回折画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:力のキャリブレーション。 (A)力校正サンプルの概略図。1 mm離れた逆平行磁石のペアによって加えられる力の大きさは、5 kbp dsDNAフラグメントによってつながれた磁気ビーズ(M270)の変位からの磁石距離dの関数として測定されます。(B)力校正手順からの代表的なデータ。色付きの矢印は、(D)で展開された領域(一致する色)を示します。(C)15-20pNで測定した5kbpテザービーズのz位置のアラン偏差。基準ビード位置を差し引く前(青)と後(赤)の磁気ビーズのz座標の曲線が示されています。(d)示された磁石間距離dで測定したy位置の代表時系列。対応するy座標分布のヒストグラムが、ガウス適合(赤)で右側に表示されます。(E)(D)に示すデータから代表的なPSD。モデル(赤)をそれぞれのPSDにフィッティングして得られた力値が上部に表示されます。(F)磁石の距離の関数としての磁力の校正。力は、分散(左)またはPSD法(右)のいずれかから測定されました。適合値 (赤) は、注釈付き方程式を持つ二重指数モデルを示します。(G)分散とPSDから得られる測定力の差。赤い曲線は、(F)に示す適合値に対して計算されます。(H,I)5 kbpキャリブレーション構成の力-伸長関係の検証。異なる力レベル(分散から測定)での平均伸張値は、直接(H)または中心から外れたビード31の傾きによるビード高さオフセット(I)を補正した後に使用しました。n = 5分子の力伸長データは、拡張可能なWLCモデルによって適合され、適合されたパラメータ(持続長Lpおよび伸張弾性率Ko)が上部に注釈が付けられる(平均± s.d.)。略語:PSD =パワースペクトル密度。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:サンプル調製 。 (A)λ-DNAの1 kbp領域のPCR増幅による8 bp DNAヘアピンコンストラクトの調製。(B)2つの510 bp DNAハンドルを有するSNARE複合体コンストラクトの調製。挿入図:アガロースゲル電気泳動(2%ゲル)によるDNAハンドルとそのタンパク質への付着の検証。矢印は、製品種の移動性シフト(色分け)を示します:無料の510 bpハンドル(マゼンタ)。シンタキシン(赤)、ΔN複素数(緑)、およびSNARE複素数(青)に取り付けられたハンドルB。最後の 2 ハンドル SNARE コンプレックス (緑)。SDSの添加は、ΔN複合体(bに存在する)を破壊しますが、完全長VAMP2(cに存在する)によって形成される完全なSNARE複合体は破壊しません。(C)MT実験用フローセルの設計と写真。(D)フローセル流路へのサンプル溶液の順次導入の概略図。略称:MT =磁気ピンセット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:代表的な実験の種類。 (A-C)フォースランプ、フォースクランプ、フォースジャンプ実験の概略図(上)と、対応する測定値からの拡張の代表的な時間トレース(中央)。実行できる分析の種類は下部に示されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:8 bp DNAヘアピンの2状態遷移。 (A)予想される解凍および再圧縮遷移を伴うDNAヘアピンでのMT実験の概略図。(B)力レベルが増加する(~0.25 pN s−1)力ランプ実験からの構成要素拡張の代表的なトレース。(C)(B)のデータから再構成した代表的な力伸張曲線。黄色の曲線は、ヘアピンが閉じた(実線)および開いた(破線の)立体配座にあるヘアピン構成の WLC モデルを示しています。(D)100Hzで測定された、力レベルが増加する定力実験からの代表的な伸長トレース。 (E)(D)の伸長データのヒストグラム。(F,G)(D)と(E)の同じ実験の結果ですが、1.2kHzのトラッキングがあります。生の1.2kHzの時系列は、5点の中央値フィルターを適用して平滑化しました。(F)の拡大図における赤色の痕跡は、HMMから得られた。(G)の赤い線はガウス集団の位置を示す。(H)(G)の2つの集団間の距離。(I)加えられた力の関数としての開放状態での確率。赤い曲線は、中央力F1/2 = 5.9 pNの適合ボルツマンモデル( )です。(J)HMMの結果から測定された解凍および再圧縮の移行率。実線は力への指数関数的依存性を示す。(K)伸張測定における熱変動。ヘアピン伸展データの標準偏差(フィルタリングなし)は、力の関数として表示されます。熱ゆらぎの理論的な大きさを表す熱分解能限界は、1 kbpのテザーを備えた2.8 μmビーズのChoiらの研究の式9から推定されました。(L)(F)の1.2kHzヘアピンデータから計算されたアラン偏差(フィルタリングなし)。挿入図は、0.01秒でのアラン偏差を力の関数として示しており、ヘアピンダイナミクスによる変動の緩やかな増減を示しています。略称:MT =磁気ピンセット。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ニューロンのSNARE複合体の立体構造変化。 (A)SNARE複合体のMT実験の概略図。(B)SNARE構造の代表的な力-伸張曲線。黒と青の痕跡(100 Hz)は、それぞれフォースランプ実験の伸張期間とリラックス期間から得られました。破線は拡張モデルを示し、(C)に示すSNARE複合体の様々な立体配座を説明する。(C)SNARE複素配座の分子モデルと、対応する計算された拡張。値は、ポリペプチド領域14についてのらせん束およびWLCモデルの幾何学的パラメータから推定した。(D)SNARE複素配座を調べるためのフォースジャンプ実験の模式図。(E-H)示されたレベルの力で実行されたフォースジャンプ実験からの代表的な伸展トレース。(E)では、解凍は観察されなかった。(F)および(G)では、解凍とそれに続く10pNでの再圧縮が観察された。(H)では、解凍後にさらに展開イベントが続きました。(I)2pNでのSNARE複合体のリフォールディング。UF状態からFZ状態への伸長の明らかな減少は5pNで観察された。略称:MT =磁気ピンセット。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| PCR設定 | 条件 | ||
| 料 | 1.25 μg/mL λ-DNA (テンプレート)、1 μM フォワードプライマーおよびリバースプライマー、0.2 mM dNTP、0.05 U/μL nTaq、1x nTaq バッファー | ||
| 変性 | 95 °C で 30 秒 | ||
| アニーリング | 校正構成:55°Cで30秒 | ||
| DNAヘアピン:57°Cで30秒 | |||
| DNAハンドル:50°Cで30秒 | |||
| 延長 | DNAヘアピンとハンドル:72°Cで1分 | ||
| キャリブレーションコンストラクト:72°Cで5分間 | |||
| サイクル | 30–34 | ||
| アガロースゲル電気泳動 | |||
| ゲル | 1x SYBR セーフを含む0.5x トリス-ホウ酸-EDTA (TBE、pH 8.3) 中の2%アガロース | ||
| ランニング | Mupid-2plus(アドバンス)のフルパワー(108 V平均)、40〜50分 | ||
表1:PCR反応及びアガロースゲル電気泳動の条件。 フォースキャリブレーション用の5 kbp dsDNA、DNAヘアピンコンストラクト、SNAREを結合するためのDNAハンドルなど、DNAコンストラクトのPCRの反応パラメーター。プライマー配列は 材料表に記載されています。
| タンパク質精製バッファー | 組成 | ||
| 洗浄バッファーA | 50 mM トリス塩酸塩 (pH 8.0), 500 mM NaCl, 7 mM β-メルカプトエタノール (BME), 10% グリセロール, および 20 mM イミダゾール | ||
| 洗浄バッファーB | 50 mM HEPES (pH 7.2), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10% グリセロール, および 20 mM イミダゾール | ||
| 溶解バッファー | 1%Triton X-100、1 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、および1xプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した洗浄バッファーA | ||
| 溶出バッファー | 400 mMイミダゾールを添加した洗浄バッファーB | ||
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | 81 mM リン酸二ナトリウム (Na 2 HPO 4), 19 mM リン酸一ナトリウム (NaH 2 PO4) (pH7.2), 150 mM NaCl | ||
| リン酸緩衝液 | 81 mM Na 2 HPO 4, 19 mM NaH2PO 4,pH7.4 | ||
表2:バッファーとその組成。タンパク質精製に使用されるバッファーの組成。
補足図S1:マグネットホルダーの図面。 1 mmのギャップを持つ2つの10 mm x 10 mm x 12 mm磁石用のアクリルホルダーの寸法を示します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:MATLABコードを含むzipファイル。 フォースキャリブレーション、ヘアピン、SNARE複素解析など、高速磁気ピンセット実験によって生成されたデータを分析するためのMATLABスクリプト。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:LabVIEWソフトウェアパッケージの圧縮ファイル 高速磁気ピンセットのセットアップを操作し、それを使用してデータを集録するためのLabVIEWコードの完全なパッケージ。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、生体分子の構造変化を高い時空間精度で観察できる1分子力分光装置を導入しました。高速CMOSカメラは、1,280 x 1,024の解像度で1,200フレーム- 1を取得し、1.2kHzのビーズトラッキングを可能にします。ただし、現在、測定速度はビーズトラッキングソフトウェアによって制限されているため、高速測定ではROIは通常、より小さな領域に低下します。SLDの高出力は、最大数kHzの帯域幅までの高速ビーズイメージングに不可欠な明るい照明を提供します。さらに、ビームの空間コヒーレンスは、ビーズの周りに高コントラストの同心円状の回折リングを生成し(図1A、挿入図)、対称性に基づいてビードの位置を正確に決定することができます。
ビーズ−テザー構築物に及ぼされる磁力は、テザービーズ35、37、38のブラウン揺らぎを測定することによって決定することができる。リアルタイムの力解析は計算負荷が高いため、加えられた力は通常、参照構造を使用して事前に測定されます。例えば、使用する磁気ビーズは長い(>5kbp)dsDNA断片によってつながれており、ビーズ位置の対応する熱変動は磁石の距離の関数として測定されます(図2A)。力のキャリブレーションは通常、セットアップの構築後に一度実行されますが、磁石を交換するなどしてセットアップを変更しない限り、定期的に繰り返す必要はありません。ビード変動の特徴的な周波数は力を加えると増加するため、高速セットアップは、高力領域での高速ダイナミクスをキャプチャし、力を正確に測定するために特に役立ちます。分散からの力推定は、その実装において周波数領域でのスペクトル解析よりもはるかに簡単であるが、ドリフト、カメラベースの取得、および中心から外れたビードアタッチメントによる伸長変化によるアーチファクトの影響を受けやすい31、37、38。しかし、2つの方法の結果は、適切に得られた場合、0〜2pNしか異なりません(図2G)。したがって、分散法は、力の絶対的な決定が重要でない場合に十分に信頼できます。
30 pNを超え、約65 pN(dsDNAの過伸張がベンチマークとして機能する)のより高い力の場合、市販の高級(N50-N52)磁石を取り付けるか、磁石間のギャップを減らすか、磁場をさらに設計する必要があります28,49。このセットアップでは、垂直モーターの最速速度は30 mm/sで、~0.6秒で0 pNから20 pNに力がジャンプします。モーターの動きが力の負荷率を制限する場合、いくつかの速い力に依存する構造変化を見逃す可能性があります。用途によっては、磁石の移動方法の変更やさらなる最適化が必要になる場合があります。一例は、磁気テープヘッド15の創造的な使用を含む。
MTによる高分解能測定では、さまざまなソースからのノイズのレベルを評価することが重要です。光学部品(高倍率レンズ、明るい光源、高速カメラを備えた顕微鏡)を適切に構成すると、ビードトラッキングのサブナノメートル精度を実現できます。次に、ノイズの主な発生源はビーズのブラウン運動になり、これを使用して加えられた力を測定します。テザービードの熱変動は、その半径、テザーの長さ、および加えられた力に依存します。 z方向の本質的な変動(すなわち、伸展変化)は熱エネルギーとテザー剛性にのみ依存しますが、ビーズ-テザーダイナミクスとカメラベースの取得速度はビーズの動きをフィルタリングし、したがって標的生体分子のモニタリングを順番にフィルタリングします。したがって、良好な時空間分解能を達成するために、ビーズサイズとサンプリングレートを戦略的に選択する必要があります。当社が採用した2.8 μmビーズの代替品として、より小さな1 μmビーズも人気があり、応答が速いため、高速測定に有利です。ただし、重大な弱点は磁気成分が小さいため、発生できる最大力が制限されます(
)。小さいビーズでも少なくとも最大10pNの力を発揮できるため、DNAスーパーコイルなどの弱い力の現象の研究に適している可能性があります。対照的に、分子モーター、タンパク質フォールディング(例えば、SNARE、ここに示されている)、または細胞力学50 の調査は、より高い力の適用を必要とし、その場合、適用可能な力の範囲を拡張するために磁石構成を変更する(例えば、ギャップまたは距離を減少させる)ことを検討することができる28、51。
この手法は、生体物理学的に関連するスケールで力を加えながら、標的分子のナノメカニカル応答を調べるため、メカノバイオロジカルプロセスで極めて重要な役割を果たす力に敏感な要素の研究に最適です。高精度MTアッセイの幅広い適用性を説明するために、ピコンウトンスケールの力を加えると動的かつ迅速な立体構造変化を示す核酸モデルとタンパク質モデルの両方を採用しました。この技術の1つの制限は、精製された核酸およびタンパク質の要件であり、これは特に広範囲のタンパク質への広範な拡張を推奨していない。 in vitro タンパク質発現および結合技術の進歩は、あまり研究されていないタンパク質へのアクセスを提供し続けるでしょう。関連する問題は、ターゲット構造に関する 先験的な 知識が設計実験(ハンドルの取り付けなど)にとって重要であることが多いことです。シングルパーティクルクライオEM52 とAlphaFold253 の出現は、単一タンパク質分子の機械的測定の設計と分析を強力にサポートし、高分解能MTのより強力なアプリケーションを解き放つと期待しています。
DNAヘアピンの解凍力は、配列、構造、バッファー組成など多くの要因に依存しますが、最も重要なのはステムの長さとグアニン-シトシン(GC)含有量です20。高速トラッキングの威力を実証するために、高速ダイナミクスで低力で展開することが期待される8 bpステム(3つのGC塩基対を持つ)を意図的に設計しました。実際、 図5 の結果は、このような高速ダイナミクスを10ms以下の分解能を特徴とする標準的な手法では解決が困難であることを示しています。この側面は、HMM分析から測定された遷移速度によってさらに確認され、その高い速度は100〜200 s−1 の範囲であった(図5J)。
ニューロンのSNAREは、シナプス小胞のエキソサイトーシスを引き起こすと考えられています。特に、SNAREタンパク質は、小胞と原形質膜の間の静電反発などの関連するエネルギー障壁を低下させることにより、膜融合を触媒します。したがって、SNARE複合体のコンフォメーション変動は、予想される反発力のレベルに対応する12〜15pNの狭い力範囲で発生することが見出される14、23。ここで説明した高速MTを用いて、ニューロンSNARE複合体の力依存的な挙動に関する主要な知見を要約しました。解凍と再圧縮の力ヒステリシス(図6B)は、再圧縮が解凍よりも低い力で発生するため、このサイクル中に作業が行われることを示しています。このような非平衡遷移は、荷重下での遷移待ち時間(結合破壊イベントに類似)または解凍前のコンフォメーション変動を測定できるフォースジャンプ実験によってよりよくアプローチされます。どちらの場合も、生体分子とその複合体の過渡状態に関する最近の研究によって示されているように、高速セットアップの恩恵を受けています15,17,54,55,56。
まとめると、これらの結果は、従来の単一分子力分光法で報告されたDNAヘアピンおよびニューロンSNARE複合体の特徴的な力依存性変化と一致します。同時に、生体分子とその集合体の力感度を明らかにするための高精度の機械的測定の有用性を強調しています。この記事がメカノバイオロジーの分野からより多くの人々を引き付け、研究者が独自の関心のあるシステムを調査するために高速MTを採用する動機付けになることを願っています。
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Disclosures
著者には、宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、韓国政府(MSIT)が資金提供する韓国国立研究財団(NRF)の助成金(NRF-2022R1C1C1012176、NRF-2021R1A4A1031754、およびNRF-2021R1A6A1A10042944)の支援を受けました。S.-H.R.はNRF助成金(2021R1C1C2009717)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for construct synthesis | |||
| Agarose gel electrophoresis system | Advance | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Bioneer | D-1037 | |
| nTaq polymerase | Enzynomics | P050A | |
| PCR purification kit | LaboPass | CMR0112 | |
| PEGylated SMCC crosslinker / SM(PEG)2 | ThermoFisher Scientific | 22102 | For SNARE–DNA coupling |
| Primer B | Bioneer | 5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3' | For 5-kbp force calibration construct and DNA handles |
| Primer B_hp | IDT | 5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3' |
For hairpin construct |
| Primer N | Bioneer | 5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3' | For DNA handles |
| Primer Z | Bioneer | 5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3' | For DNA handles |
| Primer Z_5k | Bioneer | 5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA TCG-3' |
For 5-kbp force calibration construct |
| Primer Z_hp | Bioneer | 5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3' | For hairpin construct |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| λ-DNA | Bioneer | D-2510 | Template strand for PCR |
| DNA sequences for SNARE proteins | |||
| 6×His-tagged SNAP-25b (2-206; capitalized) in pET28a | homemade | tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa 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|
| 6×His-tagged VAMP2 (2-97, L32C/I97C; capitalized) in pET28a | homemade | tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg 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|
| 6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49–96; capitalized) and Syntaxin-1A (191–267, I202C/I266C; capitalized) in pETDuet-1 | homemade | ggggaattgtgagcggataacaattcccctc tagaaataattttgtttaactttaagaagga gatataccATGGGCAGCAGCCATCA TCATCATCATCACAGCAGCGG CCTGGAAGTTCTGTTCCAGGG GCCCGGTAATGTGGACAAGGT CCTGGAGCGAGACCAGAAGCT ATCGGAACTGGATGATCGCGC AGATGCCCTCCAGGCAGGGGC CTCCCAGTTTGAAACAAGTGC AGCCAAGCTCAAGCGCAAATAC TGGTGGAAAAACCTCAAGATGAT GTAAgcggccgcataatgcttaagtcgaaca gaaagtaatcgtattgtacacggccgcataa tcgaaattaatacgactcactataggggaat tgtgagcggataacaattccccatcttagta tattagttaagtataagaaggagatatacat ATGGCCCTCAGTGAGATCGAGA CCAGGCACAGTGAGTGCATC AAGTTGGAGAACAGCATCCG GGAGCTACACGATATGTTCAT GGACATGGCCATGCTGGTGG AGAGCCAGGGGGAGATGATT GACAGGATCGAGTACAATGTG GAACACGCTGTGGACTACGTG GAGAGGGCCGTGTCTGACACC AAGAAGGCCGTCAAGTACCAG AGCAAGGCACGCAGGAAGAA GTGCATGATCTAActcgagtc tggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaa cgccagcacatggactcgtctactagcgcag cttaattaacctaggctgctgccaccgctga gcaataactagcataaccccttggggcctct aaacgggtcttgaggggttttttgctgaaag 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|
| SNAP-25b (1–206, all C to A; capitalized) in pET28a | homemade | tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa 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|
| Materials for protein purificaiton | |||
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-25ML | |
| Agar | LPS Solution | AGA500 | |
| Ampicillin, Sodium salt | PLS | AC1043-005-00 | |
| Chloramphenicol | PLS | CR1023-050-00 | |
| Competent cells (E. coli) | Novagen | 70956 | Rosetta(DE3)pLysS |
| Glycerol | SIGMA | G5516-500ML | |
| HEPES | SIGMA | H4034-100G | |
| Hydrochloric acid / HCl | SIGMA | 320331-500ML | |
| Imidazole | SIGMA | I2399-100G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside / IPTG | SIGMA | 10724815001 | |
| Kanamycin Sulfate | PLS | KC1001-005-02 | |
| Luria-Bertani (LB) Broth | LPS Solution | LB-05 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 30210 | |
| PD MiniTrap G-25 (desalting column) | Cytiva | GE28-9180-07 | For instructions, see: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174 |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride / PMSF | ThermoFisher Scientific | 36978 | |
| Plasmids for SNARE proteins | cloned in house | N/A | Available upon request |
| Protease inhibitor cocktail | genDEPOT | P3100 | |
| Sodium chloride | SIGMA | S5886-500G | |
| Sodium phosphate dibasic / Na2HPO4 | SIGMA | S7907-100G | |
| Sodium phosphate monobasic / NaH2PO4 | SIGMA | S3139-250G | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine / TCEP | SIGMA | C4706-2G | |
| Trizma base | SIGMA | T1503-250G | |
| Materials for sample assembly | |||
| Biotin-PEG-SVA | LAYSAN BIO | BIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1g | For PEGylation |
| Dibenzocyclooctyne-amine / DBCO-NH2 | SIGMA | 761540-10MG | For bead coating |
| Double-sided tape | 3M | 136 | For flow cell assembly |
| Epoxy glue | DEVCON | S-208 | For flow cell assembly |
| Glass coverslip for bottom surface | VWR | 48393-251 | Rectangular, 60×24 mm, #1.5 |
| Glass coverslip for top surface | VWR | 48393-241 | Rectangular, 50×24 mm, #1.5 |
| Magnetic bead | ThermoFisher Scientific | 14301 | Dynabeads M-270 Epoxy, 2.8 μm |
| mPEG-SVA | LAYSAN BIO | mPEG-SVA 1g | For PEGylation |
| N,N-Dimethylformamide / DMF | SIGMA | D4551-250ML | For bead coating |
| N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine | SIGMA | 104884-100ML | For PEGylation |
| Neutravidin | ThermoFisher Scientific | 31000 | For sample tethering |
| Phosphate buffered saline / PBS, pH 7.2 | PLS | PR2007-100-00 | |
| Plastic syringe | Norm-ject | A5 | 5 ml, luer tip |
| Polyethylene Tubing | SCI | BB31695-PE/4 | PE-60 |
| Reference bead | SPHEROTECH | SVP-30-5 | Streptavidin-coated Polystyrene Particles; 3.0-3.4 µm |
| Syringe needle | Kovax | 21G-1 1/4'' | 21 G |
| Syringe pump | KD SCIENTIFIC | 788210 | |
| Equipment for magnetic tweezer instrument | |||
| 1-axis motorized microtranslation stage | PI | M-126.PD1 | For vertical positioning of magnets |
| 2-axis manual translation stage | ST1 | LEE400 | For alignment of magnets to the optical axis |
| Acrylic holder for magnets | DaiKwang Precision | custum order | Drawing available upon request |
| Frame grabber | Active Silicon | AS-FBD-4XCXP6-2PE8 | |
| High-speed CMOS camera | Mikrotron | EoSens 3CXP | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73P2F-1-2 | |
| Neodymium magnets | LG magnet | ND 10x10x12t | Dimension: 10 mm × 10 mm × 12 mm; two needed |
| Objective lens | Olympus | UPLXAPO100XO | Oil-immersion, NA 1.45 |
| Objective lens nanopositioner | Mad City Labs | Nano-F100S | |
| Rotation stepper motor | AUTONICS | A3K-S545W | For rotating magnets |
| Superluminescent diode | QPHOTONICS | QSDM-680-2 | 680 nm |
| Software | |||
| LabVIEW | National Instruments | v20.0f1 | |
| MATLAB | MathWorks | v2021a |
References
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