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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Pinzette magnetiche ad alta velocità per misure nanomeccaniche su elementi sensibili alla forza

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65137
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 2,3, 1,4
1Department of Physics, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2School of Biological Sciences, Seoul National University, 3Institute for Molecular Biology and Genetics, Seoul National University, 4School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH)
* These authors contributed equally

Summary

Qui, descriviamo una configurazione di pinzette magnetiche ad alta velocità che esegue misurazioni nanomeccaniche su biomolecole sensibili alla forza alla velocità massima di 1,2 kHz. Presentiamo la sua applicazione a forcine di DNA e complessi SNARE come sistemi modello, ma sarà applicabile anche ad altre molecole coinvolte in eventi meccanobiologici.

Abstract

Le pinzette magnetiche a singola molecola (MT) sono servite come potenti strumenti per interrogare con forza le biomolecole, come gli acidi nucleici e le proteine, e sono quindi pronte per essere utili nel campo della meccanobiologia. Poiché il metodo si basa comunemente sul tracciamento basato su immagini delle sfere magnetiche, il limite di velocità nella registrazione e nell'analisi delle immagini, così come le fluttuazioni termiche delle perle, ha a lungo ostacolato la sua applicazione nell'osservazione di piccoli e veloci cambiamenti strutturali nelle molecole bersaglio. Questo articolo descrive metodi dettagliati per la costruzione e il funzionamento di una configurazione MT ad alta risoluzione in grado di risolvere dinamiche su scala nanometrica e millisecondi delle biomolecole e dei loro complessi. Come esempi applicativi, vengono dimostrati esperimenti con forcine di DNA e complessi SNARE (meccanismo di fusione a membrana), concentrandosi su come i loro stati transitori e transizioni possono essere rilevati in presenza di forze su scala piconewton. Ci aspettiamo che le MT ad alta velocità continueranno a consentire misurazioni nanomeccaniche ad alta precisione su molecole che rilevano, trasmettono e generano forze nelle cellule, e quindi approfondiscono la nostra comprensione a livello molecolare della meccanobiologia.

Introduction

Le cellule percepiscono attivamente e rispondono agli stimoli meccanici. In tal modo, molte biomolecole mostrano proprietà dipendenti dalla forza che consentono cambiamenti strutturali dinamici. Esempi ben apprezzati includono canali ionici meccanosensibili ed elementi citoscheletrici che forniscono alle cellule informazioni meccaniche chiave dall'ambiente circostante.

Inoltre, le molecole che mostrano una natura portante unica possono anche essere considerate meccanosensibili in un senso più ampio. Ad esempio, la formazione locale e la fusione di duplex di acidi nucleici, così come strutture di ordine superiore come i G-quadruplex, svolgono ruoli cruciali nella replicazione, nella trascrizione, nella ricombinazione e, più recentemente, nell'editing del genoma. Inoltre, alcune proteine neuronali coinvolte nelle comunicazioni sinaptiche svolgono le loro funzioni generando forze fisiche che superano i livelli delle tipiche interazioni intermolecolari. Indipendentemente dall'esempio studiato, lo studio della nanomeccanica delle biomolecole coinvolte con elevata precisione spaziotemporale si rivelerà molto utile per rivelare i meccanismi molecolari dei processi meccanobiologici associati 1,2,3.

I metodi di spettroscopia di forza a singola molecola sono serviti come potenti strumenti per esaminare le proprietà meccaniche delle biomolecole 2,4,5,6. Possono monitorare i cambiamenti strutturali negli acidi nucleici e nelle proteine in concomitanza con l'applicazione della forza, esaminando così le proprietà dipendenti dalla forza. Due configurazioni ben note sono le pinzette ottiche e le pinzette magnetiche (MT), che impiegano perline di dimensioni micron per manipolare le molecole 5,6,7,8. In queste piattaforme, il polistirene (per le pinzette ottiche) o le perle magnetiche (per le MT) sono legati alle molecole bersaglio (ad esempio, acidi nucleici e proteine) tramite "maniglie" molecolari, tipicamente costituite da brevi frammenti di DNA a doppio filamento (dsDNA). Le perle vengono quindi spostate per esercitare forza e visualizzate per tracciare le loro posizioni che riportano i cambiamenti strutturali nelle molecole bersaglio. Le pinzette ottiche e magnetiche sono in gran parte intercambiabili nelle loro applicazioni, ma esistono importanti differenze nei loro approcci al controllo della forza. Le pinzette ottiche sono strumenti intrinsecamente posizionati che intrappolano le perline in posizione, a causa delle quali la forza applicata fluttua quando un costrutto bersaglio subisce cambiamenti di forma; L'aumento dell'estensione, ad esempio dall'apertura, allenta il cavo e riduce la tensione e viceversa. Sebbene il feedback attivo possa essere implementato per controllare la forza nelle pinzette ottiche, gli MT al contrario funzionano naturalmente come un dispositivo di morsetto, sfruttando le forze magnetiche stabili e a campo lontano da magneti permanenti, che possono anche resistere alle perturbazioni ambientali.

Nonostante la loro lunga storia e il design semplice, le MT sono rimaste indietro rispetto alle pinzette ottiche nelle loro applicazioni a misurazioni ad alta precisione, in gran parte a causa delle sfide tecniche nel tracciamento rapido delle perline. Recentemente, tuttavia, diversi gruppi hanno condotto congiuntamente un miglioramento multiforme sia dell'hardware che del software per gli strumenti MT 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . In questo lavoro, presentiamo un esempio di tale configurazione in esecuzione a 1,2 kHz e descriviamo come usarla per eseguire misurazioni nanomeccaniche su biomolecole sensibili alla forza. Come sistemi modello, utilizziamo forcine di DNA e complessi SNARE neuronali ed esaminiamo i loro rapidi cambiamenti strutturali nel regime di Piconewton. Le forcine per capelli in DNA mostrano semplici transizioni a due stati in un intervallo di forza ben definito20,21, e quindi servono come modelli giocattolo per verificare le prestazioni di una configurazione pinzetta. Poiché le proteine SNARE si assemblano in un complesso sensibile alla forza che guida la fusione di membrana22, sono state anche ampiamente studiate mediante spettroscopia di forza a singola molecola 14,23,24,25. Vengono presentati approcci standard per l'analisi dei dati e l'estrazione di informazioni utili sulla termodinamica e sulla cinetica. Speriamo che questo articolo possa facilitare l'adozione di MT ad alta precisione negli studi meccanobiologici e motivare i lettori a esplorare i propri sistemi di interesse sensibili alla forza.

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Protocol

Tutti i materiali e le attrezzature descritti in questo protocollo sono elencati nella tabella dei materiali. Il software LabVIEW per gestire la configurazione MT ad alta velocità descritta di seguito, così come gli script MATLAB per analizzare i dati di esempio, sono depositati su GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) e disponibili pubblicamente.

1. Costruzione di apparecchi

NOTA: Il principio generale della costruzione MT ad alta velocità è simile ai sistemi MT standard e convenzionali, ad eccezione dell'uso di una telecamera CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) ad alta velocità e di una sorgente luminosa coerente ad alta potenza (Figura 1). Fare riferimento ad altre fonti per ulteriori descrizioni degli strumenti MT standard 5,26,27.

  1. Installare un microscopio invertito su un tavolo ottico antivibrante. Installa una fotocamera CMOS ad alta velocità e un frame grabber.
  2. Costruisci una fase di traduzione per manipolare i magneti in 3D. Montare un palco lineare motorizzato (>escursione di 20 mm) verticalmente sopra un palco XY manuale.
    NOTA: Il movimento verticale controlla la forza, mentre lo stadio XY è per l'allineamento manuale dei magneti all'asse ottico per la costruzione iniziale del setup.
  3. Installare un motore passo-passo rotativo e un sistema di cinghie e pulegge per magneti rotanti.
    NOTA: La cinghia trasmette il moto rotatorio tra l'albero motore e i magneti che distano pochi centimetri l'uno dall'altro. La rotazione dei magneti è interna alla manipolazione traslazionale.
  4. Montare i magneti. Utilizzare un supporto acrilico (ordinato da un'azienda produttrice; vedere la figura supplementare S1) che possa ospitare saldamente due magneti identici in parallelo, con uno spazio ben definito di 1 mm tra i magneti (Figura 1B). Per utilizzare la forza massima ottenibile con una data coppia di magneti, regolare la posizione verticale dello stadio di traslazione in modo che la superficie inferiore dei magneti si allinei con il piano del campione quando viene spostato nella posizione più bassa.
    NOTA: Fare riferimento a Lipfert et al. per ulteriori informazioni sul design del supporto e sulla configurazione dei magneti28. L'altezza e l'orientamento dei magneti sono controllati dal software LabVIEW in combinazione con l'acquisizione dei dati.
  5. Visualizzazione con un obiettivo a basso ingrandimento, allineare i magneti al centro del campo visivo. Verificare che la rotazione dei magneti non causi un grande spostamento del centro della coppia di magneti.
    NOTA: Se il punto medio tra i magneti ruota attorno all'asse di rotazione, è probabile che i magneti siano decentrati a causa di un supporto imperfetto. Un piccolo livello di disallineamento rispetto alla dimensione dello spazio è tollerabile, poiché la rotazione del magnete serve solo per controllare i cavi e applicare coppie in applicazioni specifiche.
  6. Installare un diodo superluminescente (SLD) per l'illuminazione delle perline. Far passare il fascio attraverso lo spazio di 1 mm tra i due magneti. Assicurarsi che il raggio sia correttamente collimato per adattarsi allo spazio e che l'illuminazione non sia ombreggiata dai magneti.
  7. Installare uno scanner per lenti piezoelettriche sul nasello e montare un obiettivo a immersione in olio 100x (apertura numerica [NA]: 1,45) per il tracciamento delle perline. Per evitare potenziali artefatti nel tracciamento dei risultati, assicurarsi che l'illuminazione sia mantenuta uniformemente quando i magneti vengono spostati. Infine, regola il livello di luce alla massima luminosità senza saturare i pixel.
    NOTA: Per il confronto di diverse sorgenti luminose per il tracciamento ad alta velocità delle perline, fare riferimento a Dulin et al.29.

2. Calibrazione della forza magnetica

  1. Usando la reazione a catena della polimerasi (PCR; vedi Tabella 1), preparare frammenti di dsDNA a 5 kbp (usando Primer B, Primer Z_5k e λ-DNA) che sono etichettati con biotina su un'estremità (per l'attacco superficiale) e azide sull'altra estremità (per l'attacco del tallone).
  2. Seguendo la sezione 6, preparare una cella a flusso con le molecole da 5 kbp.
  3. Seguendo la sezione 7, identificare un buon costrutto bead-tether verificandone l'estensione e la rotazione. In particolare, assicurati di scegliere un tallone con una traiettoria di rotazione minima (cioè con un raggio <200 nm) per ridurre al minimo l'offset dell'altezza del tallone a causa dell'attacco decentrato30,31. Una volta identificato un buon legame, iniziare il tracciamento delle perline, facendo riferimento alla sezione 9.
  4. Se la configurazione è nuova, caratterizzarne il rumore e la stabilità per misurazioni affidabili ad alta risoluzione. Posizionare il magnete a ~3 mm dalla superficie della cella di flusso (per applicare >10 pN e sopprimere il moto browniano di una perla), tracciare la posizione z della perla a 1,2 kHz e calcolare la deviazione di Allan (AD) dalla serie di tempi delle coordinate z 32,33 (Figura 2C). Verificare che valori di AD di pochi nanometri siano ottenibili nel regime ad alta velocità (<0,1 s) e che il tracciamento differenziale (posizione del tallone magnetico rispetto a un tallone di riferimento) riduca l'AD nella scala temporale più lunga.
    NOTA: in genere otteniamo un AD di <3 nm alla velocità massima (risoluzione di 1,2 kHz o 0,83 ms) e l'AD continua a diminuire almeno fino a 10 s, il che implica una deriva minima. Altri hanno riportato valori simili su configurazioni simili 9,10,11,12,34.
  5. Con i magneti in posizione di riposo (F ~ 0 pN), registrare le coordinate x e y del tallone legato a 1,2 kHz. Registrare la posizione per un periodo sufficientemente lungo (cioè sufficientemente più lungo del tempo di rilassamento caratteristico della fluttuazione35) in modo che il moto browniano sia sufficientemente campionato.
    NOTA: Qui, la direzione x è lungo la direzione del campo magnetico, mentre il movimento in y rappresenta il moto trasversale perpendicolare al campo.
  6. Avvicinare i magneti alla cella di flusso e ripetere le misurazioni della posizione del tallone fino a quando i magneti toccano delicatamente la parte superiore della cella di flusso. Muoversi a grandi passi (ad esempio, 1-2 mm) quando i magneti si trovano a più di 7 mm di distanza dal piano del campione (poiché la forza applicata aumenta lentamente nel campo lontano dei magneti), ma ridurre gradualmente la dimensione del passo (ad esempio, 0,1-0,5 mm) man mano che si avvicinano per una calibrazione più fine a livelli di forza più elevati (Figura 2B).
  7. Calcola la forza in ciascuna posizione del magnete, d, utilizzando uno dei due metodi alternativi (viene fornito uno script MATLAB "force calibration.m" che include entrambi i metodi; vedi File supplementare 1).
    1. Misurare la varianza delle coordinate Equation 1 y del tallone (Figura 2D) e la posizione z media del tallone rispetto alla posizione Equation 2 più bassa (Figura 2B, in basso). Quindi, utilizzare l'equazione (1)7,27,36 per stimare la forza (con un raggio fisso del tallone R = 1.400 nm ed energia termica kRT = 4,11 pN∙nm):
      Equation 3(1)
    2. In alternativa, calcolare la densità spettrale di potenza (PSD) delle coordinate y, Sy (Figura 2E). Determinare la forza applicata F adattando un modello lorentziano doppio37 alla misura Sy usando l'equazione (2).
      Equation 4(2)
      Qui, , R è il raggio del tallone, γ ye γφ sono rispettivamente i coefficienti di resistenza traslazionale e rotazionale (stimati dall'equazione di Stokes-Einstein), kRT è l'energia termica, Equation 5f+ e f- sono due frequenze caratteristiche ottenute usando l'equazione (3).
      Equation 6 (3)
      NOTA: Poiché l'estensione del cavo L è una funzione della forza che segue il modello WLC (Worm-Like Chain) ben consolidato, le espressioni precedenti lasciano F come unico parametro di adattamento (fissiamo R a 1.400 nm per semplicità perché è condiviso tra tutti i livelli di forza e il valore esatto non influenza sensibilmente i risultati). Quando necessario, il motion blur e l'aliasing dall'acquisizione di immagini basate su telecamera devono essere considerati38,39, ma questo effetto è trascurabile nelle nostre misurazioni ad alta velocità superiori a 1 kHz con cavi a 5 kbp.
  8. Ripetere i passaggi 2.4-2.7 per alcuni altri costrutti. Sonda da tre a cinque diverse perle per calcolare la media della variabilità della forza tra le sfere magnetiche.
    NOTA: La variazione di forza tra le sfere magnetiche in uso deve essere considerata per determinare il numero corretto di costrutti per la media. Questa variabilità è piccola ma può portare a più di 1 pN di errore nella forza misurata, anche per i prodotti commerciali31. Per la maggior parte delle applicazioni, in cui la determinazione assoluta delle forze coinvolte non è cruciale, la media dei risultati di calibrazione da tre a cinque sfere è generalmente sufficiente. Un approccio alternativo per tenere conto di questa variazione è misurare la forza con singoli legami all'inizio dell'esperimento, che può richiedere molto tempo. Un'altra opzione è quella di incorporare strutture a forcina che si decomprimono a livelli di forza noti in ogni costrutto31.
  9. Tracciare la forza misurata in funzione della distanza del magnete e adattare una doppia funzione esponenziale ai dati (Figura 2F) utilizzando l'equazione (4).
    Equation 7(4)
    Qui, F0 (linea di base), A 1 e A 2 (ampiezze) e d 1 e d 2 (costanti di decadimento) sono parametri di adattamento. Assicuratevi che i valori di forza dei due metodi, così come i doppi adattamenti esponenziali risultanti, concordino ampiamente (Figura 2F,G).
    NOTA: per verificare che la calibrazione della forza sia stata eseguita correttamente, verificare la relazione forza-estensione dei costrutti sondati tracciando l'estensione rispetto alla forza misurata.
  10. Per correggere l'offset z off dell'altezza del tallone risultante dall'inclinazione dipendente dalla forza delle sfere magnetiche30,31, stimare z off dall'offset laterale x off, considerando la geometria di un cavo decentrato con un raggio del tallone usando l'equazione (5) e applicare i valori ai valori di estensione misurati. Questo passaggio è implementato nello script MATLAB "force calibration.m" (righe 252-254).
    Equation 8(5)
    NOTA: Sebbene questa correzione apporti piccole modifiche all'estensione, specialmente per le perle con un piccolo raggio di rotazione (<200 nm), questo offset spesso influisce in modo critico sulla risposta elastica, come si vede nel passaggio dalla Figura 2H alla Figura 2I30,31.
  11. Controllare la lunghezza di persistenza Lp adattando un modello WLC estensibile ai dati utilizzando l'equazione (6).
    Equation 9(6)
    Qui, L 0 è la lunghezza del contorno (1,7 μm per 5 kbp) e K0 è il modulo per lo stretching entalpico.
    NOTA: Sebbene l'L p del dsDNA sia ben accettato per essere 40-50 nm in un tipico tampone come la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), la formula WLC applicata alle molecole corte (<5 kbp) sottostima sistematicamente L p mentre L 0 diminuisce31,40. Questo perché il modello WLC classico presuppone un polimero la cui lunghezza della catena è sufficientemente più lunga della sua lunghezza di persistenza. Qui, abbiamo ottenuto L p = 40 ± 3 nm per il costrutto 5 kbp (Figura 2H), e la correzione dell'estensione ha ulteriormente prodotto un K0 omogeneo di 1.100 ± 200 pN (Figura 2I). L'applicazione di un modello WLC finito 31,40, così come una correzione per la non-gaussianità nella distribuzione di estensione 41, aumenterà leggermente Lp.
  12. Una volta verificata la calibrazione della forza, applicare i parametri di adattamento ottenuti del modello a doppia esponenziale al software LabVIEW fornito (Supplemental File 2) e attendere che il software calcoli la forza corrente in tempo reale dalle letture del motore (ad esempio, posizione del magnete). Poiché non è disponibile un'espressione analitica per la funzione inversa d(F), preparare una tabella di ricerca di d rispetto a F in incrementi di 0,1 pN mediante stima numerica dei livelli di forza target d. Memorizza questa tabella anche nel software per comandare il controllo della forza.

3. Sintesi di forcine per capelli a DNA

NOTA: I costrutti a forcina di DNA per esperimenti di MT sono preparati mediante amplificazione PCR di una regione di 510 bp in λ-DNA con due primer personalizzati, uno dei quali contiene una struttura a forcina sulla sua estremità 5' (Figura 3A). In questo modo, un motivo a forcina viene posizionato a un'estremità del prodotto PCR.

  1. Preparare i primer.
    1. Primer in avanti: B_hp di primer marcato con 5′-biotina per l'attacco della superficie del vetro e si lega all'λ-DNA. Questo primer contiene un motivo a forcina con uno stelo da 8 bp e un anello da 6 nt, 5' alla regione di legame λ.
    2. Primer inverso: Primer Z_hp marcato con 5′-azide per l'attacco magnetico del tallone e si lega al λ-DNA a 1 kbp di distanza dal primer anteriore.
  2. Impostare ed eseguire la PCR con λ-DNA (modello), nTaq polimerasi e condizioni standard di PCR (vedere Tabella 1). Pulire il prodotto con un kit di purificazione commerciale.
  3. Misurare la concentrazione di DNA mediante assorbimento UV a 260 nm (A260) ed eseguire l'elettroforesi su gel di agarosio (gel al 2%) (vedere Tabella 2) per verificare le dimensioni del prodotto. Una resa tipica è ~ 35 μL di ~ 600 nM soluzione.

4. Preparazione delle proteine SNARE

NOTA: I complessi SNARE neuronali sono assemblati combinando tre proteine purificate di ratto espresse da E. coli: VAMP2/sinaptobrevina-2, sintassina-1A e SNAP-25 (Figura 3B). Per facilitare il loro assemblaggio, la sintassi e SNAP-25 sono co-espressi con un frammento VAMP2 (privo della regione N-terminale; definito "ΔN-VAMP2") in una struttura chiamata "ΔN-complesso", e poi mescolato con VAMP2 a lunghezza intera dopo l'attaccamento del DNA per formare complessi completi.

  1. Preparare plasmidi contenenti cDNA per l'espressione delle proteine SNARE (le sequenze di DNA per tutti i plasmidi sono riportate nella Tabella dei Materiali).
    1. Preparare VAMP2 marcato 6×His-His, privo del dominio transmembrana (2-97; L32C/I97C per i legami disolfuro) clonato in un vettore pET28a.
    2. Preparare la sintassina-1A priva di Habc e del dominio transmembrana (sostituzioni 191-267, I202C/I266C per legami disolfuro) clonato insieme a ΔN-VAMP2 marcato 6×His-(49-96) in un vettore pETDuet-1.
    3. Preparare l'isoforma b (2-206, tutta C ad A) clonata in un vettore pET28a. Questo sarà utilizzato per la preparazione di complessi ΔN.
    4. Preparare l'isoforma b (1-206, tutta C ad A) clonata in un vettore pET28a per l'aggiunta diretta al buffer di analisi MT con tag 6×His.
  2. Preparare due provette di cellule di E . coli di Rosetta (DE3). Trasformare un gruppo con plasmidi VAMP2 (dal punto 4.1.1), uno con entrambi i plasmidi sintassina-1A/ΔN-VAMP2 e SNAP-25 non marcati (dai punti 4.1.2 e 4.1.3) per esprimere il complesso ΔN, e l'altro con plasmidi SNAP-25 marcati con His-(dal punto 4.1.4).
  3. Trasferire le cellule trasformate in brodo di Luria-Bertani (LB) con antibiotici appropriati (qui, kanamicina e cloramfenicolo per VAMP2 e SNAP-25 con tag His; kanamicina, cloramfenicolo e ampicillina per il complesso ΔN). Coltivarli a 37 °C in un'incubatrice agitatrice (220 rpm) fino a quando la densità ottica (OD) del brodo raggiunge 0,7-0,9.
  4. Aggiungere 1 mM di isopropile β-d-1-tiogalattopiranoside (IPTG) per indurre l'espressione proteica e incubare le cellule per 3-4 ore a 37 °C in un incubatore agitatore (220 rpm).
  5. Pellet le cellule centrifugando la coltura a 4.500 × g per 15 minuti a 4 °C.
  6. Preparare tamponi per la purificazione delle proteine (vedere Tabella 2).
  7. Sospendere i pellet cellulari che esprimono SNARE in 40 ml di tampone di lisi ghiacciato e lisare le cellule mediante sonicazione su ghiaccio (ampiezza 15%, 5 s on e 5 s off, 30 min totali).
  8. Centrifugare il lisato a 15.000 × g per 30 minuti a 4 °C per rimuovere i materiali insolubili.
  9. Far passare il surnatante attraverso una colonna gravitazionale riempita con 1 mL di resina Ni-NTA. Lavare la resina con tampone di lavaggio A, quindi con tampone di lavaggio B ed eluire le proteine con 10 ml di tampone di eluizione.
  10. Rimuovere tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) e imidazolo dall'eluente utilizzando una colonna di desalinizzazione (seguire le istruzioni del produttore). Eluire il campione con PBS.
  11. Concentrare le proteine con filtri centrifughi (cutoff di 10 kDa) a ~70 μM mantenendo le proteine in PBS (producendo tipicamente 2 ml). Misurare la concentrazione proteica mediante assorbimento ultravioletto (UV) a 280 nm (A280) o mediante il saggio di Bradford.
  12. Preparare piccole aliquote, congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C fino all'uso.
    NOTA: I complessi SNARE completi saranno assemblati dopo aver coniugato il complesso ΔN su un manico di DNA (vedi sotto).

5. Attacco delle maniglie del DNA

NOTA: Due maniglie di dsDNA da 510 bp contenenti gruppi amminici primari su un'estremità vengono prima preparati mediante PCR e i gruppi amminici vengono quindi convertiti in gruppi maleimmide utilizzando un reticolante bifunzionale, SM (PEG) 2. I due manici sono quindi legati covalentemente ai complessi SNARE attraverso i loro gruppi di cisteina per la coniugazione sito-specifica (Figura 3B).

  1. Preparare i primer.
    1. Preparare primer in avanti: Primer B (per amplificare il manico B) che è marcato con 5′-biotina per l'attacco della superficie del vetro e si lega al λ-DNA; Primer Z (per amplificare Handle Z) che è etichettato con 5′-azide per l'attacco del tallone magnetico e ha la stessa sequenza del Primer B.
    2. Preparare un primer inverso: Primer N (condiviso per Handle B e Handle Z) che è marcato con 5′-ammina per la coniugazione proteica e si lega al λ-DNA a 510 bp di distanza dal primer anteriore.
  2. Impostare ed eseguire due serie di reazioni PCR (18 provette di reazione da 200 μL per ciascuna maniglia) con λ-DNA (modello), nTaq polimerasi e condizioni PCR standard (vedere Tabella 1). Pulire il prodotto con un kit di pulizia PCR ed eluire ogni maniglia con 45 μL di acqua ultrapura. Utilizzare un volume minimo di acqua per ottenere alte concentrazioni di maniglie per una reazione efficace nelle fasi successive.
  3. Misurare la concentrazione di DNA mediante A260. La resa tipica è ~650 μL di ~2 μM di soluzione per ogni maniglia. Tenere piccoli campioni separati per una successiva verifica nell'elettroforesi su gel di agarosio.
  4. Reagisci ogni impugnatura (1 μM in PBS) con 5 mM SM(PEG)2. Incubare a temperatura ambiente con una leggera rotazione. Dopo 1 ora, utilizzare un kit di purificazione del DNA per rimuovere SM(PEG)2 non reagito. Eluire ogni maniglia con 250 μL di PBS per ottenere ~2 μM di soluzioni.
  5. Mescolare le soluzioni di Handle B e ΔN-complex ad un rapporto molare di 1:16 (ad esempio, 1 μM Handle B e 16 μM ΔN-complex) in PBS e incubare per 2 ore a temperatura ambiente con agitazione. Tenere da parte un piccolo campione per l'elettroforesi su gel di agarosio.
  6. Aggiungere una soluzione di VAMP2 in un eccesso molare di 2,5 volte sul complesso ΔN utilizzato nel passaggio precedente. Incubare la miscela per un'altra 1 ora a temperatura ambiente con agitazione. I complessi SNARE completi sono assemblati in questa fase.
  7. Rimuovere le proteine libere mediante scambio tampone con PBS fresco e un filtro centrifugo (cutoff 100 kDa): centrifugare a 14.000 × g per 5 minuti a 4 °C, ripetere almeno 6 volte e far funzionare per 15 minuti per l'ultimo giro. Misurare l'aumento del rapporto A260/A280 per monitorare la rimozione delle proteine libere. Tenere da parte un piccolo campione per l'elettroforesi su gel di agarosio.
  8. Aggiungere il manico Z alla soluzione in un eccesso molare di 15 volte rispetto al manico B. Mantenere la concentrazione del manico Z almeno al di sopra di 1 μM per facilitare la reazione. Incubare la miscela per una notte a 4 °C agitando.
  9. Verificare gli intermedi (Handle B e i suoi coniugati proteici) e il prodotto finale (complesso SNARE con due maniglie) mediante elettroforesi su gel di agarosio (Figura 3B, riquadro) (vedere Tabella 2).
    NOTA: se le proteine sono attaccate correttamente al manico B, verrà rilevato uno spostamento della mobilità. In particolare, la formazione di complessi SNARE completi sulle maniglie del DNA può essere confermata dalla loro resistenza al dodecilsolfato di sodio (SDS), a differenza dei complessi ΔN, che sono disassemblati in SDS e lasciano solo la sintassi legata al DNA (confronta b e c in Figura 3B).
  10. Preparare piccole aliquote, congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C fino all'uso.
    NOTA: sebbene la soluzione finale contenga maniglie non reagite, durante l'assemblaggio del campione in una cella a flusso verrà selezionato solo il costrutto desiderato doppiamente etichettato con biotina e azide.

6. Fabbricazione di celle a flusso

NOTA: Le celle di flusso per le misure MT sono costituite da due vetrini di vetro incollati insieme da nastro biadesivo (Figura 3C). Un coprislip è rivestito con una miscela di PEG e glicole polietilenico biotinilato (PEG) per evitare legami non specifici e per consentire il legame specifico delle molecole bersaglio tramite il legame biotina-NeutrAvidin (Figura 3D). Quindi, le soluzioni dei materiali per gli esperimenti MT vengono infuse sequenzialmente in una cella di flusso utilizzando una pompa a siringa (Figura 3C, D).

  1. Preparare due vetrini di vetro, uno ciascuno per la superficie superiore (24 mm × 50 mm, spessore n. 1,5) e uno inferiore (24 mm × 60 mm, spessore n. 1,5). Pulire i coperchi sonicando in 1 M KOH per 30 minuti. Dopo la sonicazione, sciacquare i coperchi con acqua distillata e tenerli in acqua fino al passaggio successivo.
  2. PEGylate il coprislip inferiore seguendo i protocolli pubblicati42,43. Utilizzare N-[3-(trimetossisilil)propil]etilendiammina per la silanizzazione e una miscela 1:100 (ww) di biotina-PEG-SVA e mPEG-SVA in tampone bicarbonato da 100 mM. Mantenere i coprivetrini PEGilati asciutti a -20 °C e conservarli per alcune settimane.
  3. Il giorno degli esperimenti, estrarre i foglietti di copertura PEGilati e asciugarli con una pistola ad azoto. Ispezionali visivamente per lo sporco per assicurarti che siano puliti.
  4. Per realizzare i canali del campione, preparare strisce di nastro biadesivo larghe ~ 2 mm e stendere quattro strisce su un coprivetro inferiore (superficie PEGilata verso l'alto), parallele e separate l'una dall'altra da ~ 5 mm (Figura 3C).
    NOTA: In questo modo, è possibile creare tre canali di campionamento larghi 5 mm in una singola cella di flusso.
  5. Posizionare un coprislip superiore al centro del coperchio inferiore, lasciando ~ 5 mm di spazio sui bordi corti per le entrate e le uscite del canale. Premere delicatamente il retro del coperchio superiore con una pinzetta per sigillare saldamente i canali.
  6. Per creare un serbatoio di ingresso, tagliare il bordo di una punta di pipetta da 200 μL. Tagliare ~10 mm dall'apertura più ampia per consentire di contenere ~200 μL di soluzione. Fatene tre per i tre canali di flusso. Per configurare le prese, preparare tre aghi per siringa che si adattano al tubo per la pompa della siringa.
  7. Utilizzando resina epossidica di 5 minuti, incollare i serbatoi e i mozzi dell'ago alla cella di flusso. Assicurarsi che si formi una guarnizione completa per evitare perdite e che i canali non siano bloccati con colla in eccesso. Lasciate asciugare per almeno 30 min.

7. Assemblaggio di costrutti bead-tether

NOTA: Le soluzioni dei materiali per gli esperimenti di MT, comprese quelle per i costrutti bead-tether, vengono introdotte sequenzialmente nelle celle a flusso utilizzando una pompa a siringa (Figura 3C,D).

  1. Preparare perline magnetiche. Prelevare 5 mg di sfere di resina epossidica M270 da una soluzione madre (~3,3 × 108 sfere in 167,5 μL di dimetilformammide) e sostituire il solvente con tampone fosfato (vedere Tabella 2) mediante separazione magnetica delle sfere.
  2. Preparare le sfere a ~1,1 × 109 sfere mL−1 in un tampone fosfato con 1 M solfato di ammonio e reagire con 2 mM di dibenzocicloottino (DBCO)-NH2. Incubare la miscela per 3 ore su un miscelatore rotante a temperatura ambiente. Dopo la reazione, lavare le perle 3 volte con tampone fosfato fresco per rimuovere le molecole non reagite.
    NOTA: Le perle lavate possono essere conservate senza ulteriore rotazione a 4 °C per diverse settimane prima dell'uso.
  3. Collegare un ago all'uscita del canale della cella di flusso alla pompa a siringa con tubi in polietilene. Equilibra i canali con PBS.
  4. Introdurre le seguenti soluzioni sequenzialmente nel canale mediante aspirazione con la pompa: NeutrAvidin, costrutti target (forcine per capelli di DNA o complessi SNARE con maniglie di DNA), perle di polistirene di riferimento e perle magnetiche rivestite DBCO. Prima dell'uso, vortice accuratamente le soluzioni di perline per disperdere potenziali aggregati di perline.
  5. Lavare via le perline non legate applicando 0,1 pN di forza.
    NOTA: L'applicazione di una piccola forza verso l'alto facilita la rimozione delle perline non legate e aiuta ad evitare la rottura dei costrutti di perline specificamente legati.
  6. Per gli esperimenti con complessi SNARE, includere 1,5 μM SNAP-25 nel buffer finale.
    NOTA: Le molecole libere di SNAP-25 possono rilegare i complessi SNARE dopo lo sviluppo e consentire misurazioni ripetute su un singolo complesso.

8. Identificazione dei costrutti target

  1. Sulla superficie di un canale di cella a flusso, cercare le sfere magnetiche che sono legate da singole molecole del costrutto bersaglio. Assicurati che un tallone di riferimento si trovi nelle vicinanze.
  2. Ruota un tallone candidato e controlla che ruoti liberamente. Se la perla è legata da più molecole, mostra un movimento vincolato.
  3. Ruota il tallone per alcuni giri completi e scopri il raggio di rotazione (questa funzione è implementata nel software fornito). Preferibilmente, scegli una perlina con un piccolo raggio di rotazione.
    NOTA: Questo raggio indica quanto il tallone è decentrato rispetto all'asse del legatura, che viene determinato casualmente durante l'assemblaggio perlina-cavo30,31. In tutti gli esperimenti, il minimo decentrare un tallone allevia molti artefatti associati all'elevato rapporto di estensione del raggio del tallone e del cavo che utilizziamo.
  4. Aumentare la forza da 0 a 5 pN per identificare buone perline single-lethered. Cerca un grande cambiamento nel modello di diffrazione di una perlina risultante dall'allungamento di un cavo da 1 kbp (o delle due maniglie equivalenti da 510 bp). Se il modello di diffrazione non cambia in modo significativo, ridurre la forza a zero ed eseguire la scansione per un altro tallone candidato.
    NOTA: Il sollevamento di ~ 300 nm di una perlina può essere facilmente notato dalle immagini raw senza effettivamente avviare il processo di tracciamento.

9. Inseguimento delle perline per le misure di estensione

NOTA: Il tracciamento delle perline viene eseguito analizzando le immagini delle perline in tempo reale nel software LabVIEW fornito con questo articolo. Il metodo di tracciamento e le sue varianti sono stati utilizzati nella maggior parte dei sistemi MT convenzionali e sono spiegati nella letteratura precedente 2,5,7,26. Misurando la posizione di una scura magnetica rispetto a una perla di riferimento fissa (cioè il tracciamento differenziale), le misurazioni della posizione diventano estremamente robuste per una perturbazione esterna.

  1. Una volta individuata una perla magnetica corretta insieme a una perlina di riferimento, fare clic sul pulsante Calibra per iniziare a prepararsi per il tracciamento delle perline.
  2. Fare clic sulle perline nell'immagine per definire le posizioni delle perline. Le immagini verranno quindi ritagliate in regioni di interesse (ROI) (ad esempio, 150 x 150 pixel per una perla da 3 μm) attorno alle perline e quindi ulteriormente analizzate per estrarre le coordinate precise delle perline.
  3. Attendere il completamento della rotazione del magnete. Questo processo registra le coordinate x e y del tallone (calcolando la correlazione incrociata 2D44 o utilizzando la simmetria radiale45 delle immagini delle perline, con prestazioni comparabili) mentre ruota i magneti per documentare l'attacco decentrato del tallone31.
  4. Per il tracciamento nella direzione z, attendere che il software generi una tabella di ricerca di immagini di diffrazione delle perline a diverse distanze dal piano focale. Ciò viene effettuato facendo calpestare l'obiettivo con uno scanner piezoelettrico a passi equidistanti e registrando le immagini delle perline mediate dalle fluttuazioni in ogni posizione. Quindi, le coordinate z delle perle negli esperimenti reali vengono determinate confrontando le immagini delle perline in tempo reale con la tabella di ricerca con l'interpolazione7.
  5. Al termine della generazione della tabella di ricerca, abilitare il tracciamento e la messa a fuoco automatica (premere Track ? e AF? Pulsanti) e fare clic sul pulsante Acquisisci per avviare la registrazione delle posizioni delle perline.
    NOTA: la messa a fuoco automatica è facoltativa, ma si consiglia di correggere la deriva dello stadio in z durante l'acquisizione.

10. Schemi di applicazione forzata

  1. Esperimenti di forza-rampa: Per verificare la relazione forza-estensione del costrutto, applicare una rampa di forza su e giù a una velocità di carico costante (± 1,0 pN s−1) (Figura 4A). Ad esempio, applicate tre arrotondamenti di un ciclo 0-20-0 pN per verificare la lunghezza complessiva del costrutto e la curva forza-estensione delle maniglie.
  2. Specificando i parametri di tether nel software, sovrapporre una curva di estensione della forza WLC sopra i dati misurati e determinare se il tallone target è legato da un costrutto campione autentico con maniglie di DNA appropriate. Utilizzare la lunghezza nota del contorno (ad esempio, ~340 nm per 1 kbp dsDNA) e la lunghezza di persistenza WLC (30-45 nm per il dsDNA breve31) del costrutto come punto di partenza. Se necessario, applicare il metodo di correzione dell'estensione descritto al punto 2.11.
  3. Se il costrutto è verificato, esaminare la risposta forza-estensione in dettaglio per cercare un'estensione aggiuntiva risultante dalle molecole bersaglio-forcine o complessi SNARE.
  4. Esperimenti a forza costante: Variare gradualmente la forza applicata in passi discreti per sondare la sensibilità alla forza delle molecole bersaglio (Figura 4B).
    NOTA: Gli MT consentono esperimenti di forza costante semplici ed efficaci perché la forza applicata viene mantenuta costante quando i magneti sono tenuti fermi.
    1. Per le forcine del DNA, applicare 4-8 pN di forza con passi di 0,2-0,5 pN e misurare la posizione del tallone per ~ 10 s a ciascun livello di forza.
    2. Per i complessi SNARE, applicare 14-16 pN di forza con passi di 0,1-0,2 pN e misurare la posizione del tallone per ~ 10 s a ciascun livello di forza.
  5. Esperimenti di salto di forza: Osservare gli eventi di transizione dei complessi SNARE.
    NOTA: Gli esperimenti di salto di forza, come gli esperimenti di forza costante, comportano cambiamenti nei livelli di forza. Tuttavia, i salti di forza impiegano cambiamenti più bruschi nella forza applicata, consentendo il monitoraggio di eventi innescati dalla forza nelle molecole sondate, come un'improvvisa rottura dei complessi proteici. Ad esempio, poiché i complessi SNARE mostrano isteresi strutturale nel ciclo di forza23, è informativo eseguire esperimenti di salto di forza e misurare la latenza alla transizione (Figura 4C).
    1. Decompressione: Staccamento di una molecola VAMP2 da un complesso SNARE ternario intatto, lasciando un complesso binario di sintassi-1A e SNAP-25.
    2. Rezipping: Zipping della molecola VAMP2 decompressa per rigenerare un complesso SNARE intatto.
      1. Svolgimento: Smontaggio completo di un complesso SNARE accompagnato dalla completa dissociazione di SNAP-25. Solo le molecole di VAMP2 e sintassi rimangono nel costrutto dopo lo spiegamento.
      2. Ripiegatura: Rigenerazione di un complesso SNARE dopo il legame di una molecola libera di SNAP-25 dal tampone.
  6. A 2 pN, indurre l'assemblaggio di un complesso SNARE intatto aspettando (~30 s) l'associazione di una molecola libera di SNAP25. Un'improvvisa diminuzione dell'estensione si osserva alla formazione di un complesso SNARE.
  7. Per osservare gli eventi di decompressione, attendere alcuni secondi a 10-12 pN, quindi passare bruscamente a 14-15 pN con la massima velocità del motore possibile. A seconda della forza target, il complesso SNARE mostrerà una transizione reversibile tra intermedi parzialmente decompressi (come negli esperimenti a forza costante) o un salto di ~ 25 nm a uno stato più alto e decompresso dopo un tempo di attesa casuale (o latenza).
  8. Per osservare gli eventi di ricompressione, abbassare la forza a 10-12 pN immediatamente dopo aver osservato la decompressione. Ancora una volta, il complesso SNARE mostra una transizione stocastica allo stato inferiore, zippato dopo una certa latenza casuale. Se lo sviluppo si è verificato dopo la decompressione, il complesso non riuscirà a ricomprimersi, poiché mancherà una molecola SNAP-25.
  9. Per osservare gli eventi in corso, attendere un periodo più lungo dopo la decompressione per rilevare un ulteriore aumento dell'estensione (~ 2 nm).

11. Analisi dei dati

NOTA: I tipi di analisi che è possibile condurre con i dati MT dipendono dal sistema di destinazione. Tuttavia, esistono approcci comuni per estrarre informazioni utili dai rispettivi esperimenti descritti nella Figura 4. Tutte le analisi vengono eseguite con MATLAB (R2021a) utilizzando i codici personalizzati forniti con questo articolo. Questi codici generano grafici utilizzando gli stessi dati presentati in questo articolo. Si noti che mentre i dati grezzi dal tracciamento a 100 Hz sono stati presi direttamente per l'analisi, i dati dal tracciamento a 1,2 kHz sono stati tipicamente filtrati mediana (con una finestra scorrevole a cinque punti) prima dell'analisi per ridurre il rumore (ad eccezione dell'analisi del rumore).

  1. Esperimenti di forza-rampa: Analizzare la relazione forza-estensione (ad esempio, elasticità dei polimeri) e transizione della forza per estrarre informazioni sulle proprietà nanomeccaniche.
  2. Esperimenti a forza costante: Analizzare le popolazioni statali e il tempo di permanenza (o tasso di transizione) in funzione della forza per estrarre i parametri strutturali (ad esempio, le regioni coinvolte nella transizione), termodinamici (ad esempio, la differenza di energia libera) e cinetici (ad esempio, barriera energetica) dei cambiamenti conformazionali.
  3. Esperimenti di salto di forza: Analizzare la cinetica di rottura (ad esempio, le interazioni proteina-proteina e il legame recettore-ligando) o la durata di vita di intermedi transitori (ad esempio, lo sviluppo di biomolecole) per estrarre la stabilità delle molecole bersaglio e i loro stati.
  4. Come applicazioni rappresentative, analizzare i dati campione per forcine di DNA e complessi SNARE:
    1. Transizioni a due stati di una forcina di DNA: forza di decompressione, distanza di apertura, dipendenza dalla forza dello spostamento della popolazione e assegnazione dello stato e misurazione della velocità di transizione con un modello di Markov nascosto (HMM) (codici MATLAB forniti).
    2. Cambiamenti conformazionali dei complessi SNARE: forza di decompressione, dipendenza dalla forza degli stati intermedi e latenza di decompressione, isteresi nel rezipping e comportamento di spiegamento/ripiegamento.
      NOTA: I modelli di estensione della forza per maniglie del DNA, forcine per capelli del DNA e conformazioni complesse SNARE sono riportati nei riferimenti precedenti14,31.

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Representative Results

Calibrazione della forza
I risultati dei due metodi di misurazione della forza (varianza dello spostamento laterale delle perle e analisi dello spettro di potenza) differivano di 0-2 pN (Figura 2G). Secondo i risultati della Figura 2F, possiamo raggiungere in modo affidabile fino a 30 pN con magneti al neodimio regolari.

Transizioni a due stati di una forcina di DNA da 8 bp
Per prima cosa abbiamo studiato la nanomeccanica di una corta forcina di DNA (Figura 5). Le forcine per capelli di DNA sono state ampiamente caratterizzate dalla spettroscopia convenzionale di forza a singola molecola, e quindi è disponibile una vasta fonte di riferimenti con cui confrontarsi. La decompressione di una forcina corta è solitamente reversibile, quindi i suoi eventi di ricompressione sono osservati anche nello stesso intervallo di forza in cui si verifica la decompressione (Figura 5A). Applicando una rampa di forza tra 0 pN e 20 pN (Figura 5B), l'estensione indotta dalla forza del costrutto hairpin è stata verificata per seguire un modello WLC, che può essere attribuito esclusivamente all'elasticità delle maniglie del DNA (Figura 5C, "chiuso"). A circa 6 pN, il costrutto mostrava ulteriori fluttuazioni di estensione, associate alla decompressione reversibile della struttura della forcina (Figura 5C, riquadro). Infine, a ~8 pN, la transizione alla fine scomparve e l'estensione si stabilì sullo stato superiore che fu ulteriormente esteso di ~7 nm. Di conseguenza, il profilo di estensione della forza misurato sopra 8 pN si è agganciato a una nuova curva del modello (Figura 5C, "aperta") che include la lunghezza della regione a filamento singolo della forcina senza zip.

Abbiamo quindi eseguito esperimenti a forza costante per esaminare sistematicamente la transizione della forcina. La posizione del tallone è stata misurata nell'intervallo di forza di 4-8 pN con passi di 0,5 pN per ~ 10 s ad ogni livello; Quindi, i valori di estensione sono stati raccolti e analizzati per misurare la loro distribuzione di equilibrio in funzione della forza. I risultati del tracciamento a 100 Hz hanno suggerito uno spostamento graduale verso uno stato più esteso in questo regime di forza (Figura 5D), ma gli istogrammi ottenuti dell'estensione non erano abbastanza chiari da risolvere popolazioni distinte (Figura 5E). In netto contrasto, quando gli stessi esperimenti sono stati condotti a 1,2 kHz (Figura 5F), le traiettorie ad alta velocità dei cambiamenti di estensione dopo un filtraggio delicato (filtro mediano a cinque punti) hanno rivelato due popolazioni distinte che sono ben descritte da una miscela di due distribuzioni gaussiane (Figura 5G). La separazione tra le due popolazioni, che indica la distanza di apertura della forcina, è rimasta invariata a ~ 7 nm nel regime di forza di decompressione (Figura 5H). La deviazione nelle estremità (4 pN e 8 pN) era dovuta alla localizzazione imprecisa di uno stato a causa della sua scarsità.

I dati hanno rivelato che la forza media per la transizione di decompressione (la forza alla quale le popolazioni chiuse e aperte diventano uguali) F1/2 era ~ 6 pN, e lo stato superiore e aperto è diventato gradualmente dominante man mano che aumentavamo la forza su 4-8 pN (Figura 5I). Quando dotato di una relazione di Boltzmann per la probabilità aperta, sono stati ottenuti i valori esatti di F 1/2 = 5,9 pN e Δz = 7,1 nm, Equation 10coerenti con le osservazioni di cui sopra. Va notato, tuttavia, che la forza di apertura ottenuta da un singolo costrutto potrebbe non essere accurata a causa della variabilità da tallone a tallone nella generazione della forza, che è stata misurata essere ~ 4% per le perle commerciali M27031. Inoltre, poiché la lunghezza dello stelo (8 bp) è breve, la forza di apertura della verità di base di altre forcine da 8 bp con diversa composizione nucleotidica può variare molto20. Infine, abbiamo applicato l'HMM alle tracce di estensione per mappare la transizione di stato e quindi misurato i tassi di transizione (Figura 5F, traccia rossa). Sia la velocità di decompressione che quella di ricompressione variavano esponenzialmente con la forza applicata (Figura 5J), in modo tale che la forza promuova la decompressione e inibisca la ricompressione. Se necessario, si può ulteriormente utilizzare la classica espressione di Bell per estrarre i parametri del paesaggio energetico (ad esempio, altezza e distanza della barriera)46.

Caratterizzazione della fluttuazione termica nelle misure di estensione
Utilizzando il costrutto hairpin, abbiamo profilato il rumore dipendente dalla forza nelle misurazioni di estensione. In primo luogo, le fluttuazioni termiche di una perla vincolata sono state calcolate da equazioni utilizzando i parametri (ad esempio, raggio del tallone, lunghezza del cavo) appropriati per questi esperimenti2,5 (Figura 5K, curve solide). Abbiamo anche tracciato la deviazione standard dell'estensione Equation 11 misurata dalla traccia temporale di un costrutto a forcina a livelli di forza distinti. Poiché questa molecola aveva un motivo a forcina, la sua risposta sotto 4 pN (stato chiuso) è stata utilizzata per la misurazione del rumore intrinseco, mentre la dinamica della forcina è stata rilevata ~ 6 pN, come previsto, ed è servita come controllo. La soppressione della fluttuazione dipendente dalla forza è stata osservata anche dopo che la forcina è diventata per lo più aperta (confronta 8 pN vs. 4 pN). Il confronto con il limite termico indica che c'è un margine di miglioramento, ma questo rumore residuo è spesso associato alla fluttuazione rotazionale di una perla magnetica30, che è casuale e difficile da risolvere. Per un'analisi più sistematica del rumore browniano attraverso il tempo di osservazione, il calcolo della deviazione di Allan è spesso impiegato32,33. Abbiamo calcolato la varianza Allan per i dati hairpin presentati nella Figura 5F, in modo simile alle misurazioni a 5 kbp nella Figura 2C. I risultati nella Figura 5L mostrano che, nell'intervallo di forza intermedio di 4-8 pN, abbiamo ottenuto 2-3 nm di deviazione di Allan alla massima velocità (1,2 kHz), e questo valore è sceso al di sotto di 1 nm per il tempo di osservazione (τ) superiore a 0,1 s. È interessante notare che la dinamica della forcina è emersa intorno a 5-7 pN per ~ 0,01 s (Figura 5L, riquadro), coerente con la forza di transizione misurata e le velocità nella Figura 5I,J.

Cambiamenti conformazionali dei complessi SNARE neuronali
Abbiamo quindi impiegato complessi SNARE neuronali come modello proteico e abbiamo esaminato le loro proprietà meccaniche dipendenti dalla forza. A differenza del costrutto hairpin, singoli complessi SNARE erano tenuti tra due maniglie di dsDNA da 510 bp (Figura 6A). Va notato che i termini della sintassina-1A e VAMP2, distali dalle maniglie, erano reticolati da un legame disolfuro tra residui artificiali di cisteina per evitare la rottura e consentire cicli multipli di tweezing di un dato costrutto.

Per prima cosa abbiamo applicato una rampa di forza, sia con livelli di forza crescenti che decrescenti (± 1 pN s-1) per allungare e rilassare il costrutto target, rispettivamente. Nel regime di forza medio-bassa (0-10 pN), le due maniglie si sono comportate indipendentemente come polimeri WLC, modellando complessivamente la curva forza-estensione indistinguibile da quella del dsDNA a 1 kbp (Figura 6B, nero). Tuttavia, quando la forza è stata aumentata al di sopra di 10 pN, i valori di estensione si sono discostati sensibilmente dal modello WLC, indicando che il complesso SNARE incorporato mostrava un ulteriore aumento dell'estensione. Più specificamente, l'aumento dell'estensione può essere riassunto in tre fasi distinte: (a) un leggero e graduale aumento di 11-13 pN, (b) fluttuazioni rapide e più grandi (~ 10 nm) in 14-16 pN e (c) la decompressione finale irreversibile di circa ~ 20 nm. Inoltre, quando la forza è stata abbassata per rilassare il costrutto, l'estensione è tornata alla curva di estensione della forza originale a una forza inferiore (<15 pN) o ha seguito una nuova curva del modello con un'estensione più grande (Figura 6B, blu). L'estensione totale è stata infine ripristinata ai valori più bassi (dal blu al nero nella figura 6B) al di sotto di 5 pN e si sono potuti applicare gli stessi cicli di forza-rampa, che hanno mostrato una tendenza simile.

Dal modello molecolare della conformazione complessa SNARE, possiamo calcolare con precisione i possibili valori di estensione dei potenziali intermedi (Figura 6C). Inoltre, assumendo il comportamento WLC per i polipeptidi non arrotolati, le estensioni possono essere stimate in funzione della forza, generando così i modelli completi di forza-estensione per le varie conformazioni (Figura 6B, linee tratteggiate). Prendendo questi valori come riferimento, abbiamo interpretato le transizioni di cui sopra come segue 14,23: (a) un passaggio graduale dallo stato completamente zippato (FZ) allo stato linker-open (LO) in 11-13 pN, implicando l'apertura delle regioni linker di sintassi-1A e VAMP2; b) rapida transizione tra LO e lo stato semicernierato (HZ), che implica l'apertura di un complesso SNARE fino allo strato ionico zero; e (c) la transizione finale allo stato unzipped (UZ) o unfolded (UF), che implica un completo disfacimento di VAMP2 dal resto del complesso. Lo stato UZ è diverso da UF in quanto la molecola associata di SNAP-25 è ancora legata alla sintassina-1A, mantenendo un complesso binario. Nel caso di UF (senza SNAP-25), l'intero complesso SNARE può essere rigenerato solo dopo che una molecola libera di SNAP-25 dalla soluzione si ricombina, in cui è fondamentale abbassare la forza applicata per consentire tale rilegame.

Per verificare i cambiamenti conformazionali dei complessi SNARE in modo più sistematico, abbiamo quindi eseguito esperimenti di salto di forza nel regime di forza, dove fluttuazioni conformazionali sono state frequentemente osservate a 14-15 pN (Figura 6D). In genere, abbiamo iniziato misurando la posizione del tallone a 10 pN e controllato l'estensione stabile, indicando l'assenza di cambiamenti correlati a SNARE. Quindi, il livello di forza è stato bruscamente aumentato a 14-15 pN, in cui l'estensione è stata monitorata fino a quando non si è verificata la decompressione, se presente. Infine, la forza è stata ridotta a 10 pN per verificare eventuali aumenti persistenti dell'estensione associati allo sviluppo. A 14 pN, le tracce di estensione sono rimaste per lo più nello stato LO, con picchi occasionali allo stato HZ. Va notato che queste brevi escursioni allo stato HZ rischiano di essere perse nel tracciamento a 100 Hz, che media e sottocampiona le immagini delle perline di un fattore 12. Nonostante le chiare e frequenti visite allo stato HZ, il complesso non è riuscito a effettuare una transizione completa allo stato UZ (Figura 6E), suggerendo che la forza esterna non era abbastanza forte da superare la barriera energetica alla decompressione. Al contrario, anche un piccolo aumento della forza (a 14,3 pN) ha reso la transizione molto efficiente in modo che lo stato UZ fosse raggiunto per lo più in pochi secondi (Figura 6F). Coerentemente, la decompressione è stata completata per lo più entro 1 s quando abbiamo applicato 14,5 pN al complesso (Figura 6G, H). In particolare, la decompressione a forze più elevate ha spesso portato al completo dispiegamento dell'intero complesso (accompagnato dalla rimozione di SNAP-25), come evidenziato dal piccolo aumento aggiuntivo dell'estensione sopra UZ (Figura 6H) e dalla firma di ripiegamento osservata a 2 pN (Figura 6I). Nel complesso, questi dati mostrano il classico comportamento slip-bond47 per lo sviluppo di complessi SNARE, coerente con i precedenti rapporti 14,23,48.

Figure 1
Figura 1: Configurazione dello strumento. Schema (A) e fotografia (B) di una configurazione MT ad alta velocità. I magneti controllati da un motore lineare e da un motore rotativo si trovano sopra lo stadio di campionamento di un microscopio invertito dotato di una lente ad immersione d'olio 100x e di una fotocamera CMOS ad alta velocità. Il fascio di luce di un diodo superluminescente passa attraverso i magneti e illumina il campo. Riquadro: immagini rappresentative di diffrazione di perline situate a diverse distanze dal piano focale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Taratura forzata . (A) Schema di un campione di taratura della forza. Le grandezze della forza esercitata da una coppia di magneti antiparalleli con separazione di 1 mm sono misurate in funzione della distanza del magnete d dagli spostamenti di una perla magnetica (M270) legata da un frammento di dsDNA di 5 kbp. (B) Dati rappresentativi della procedura di taratura della forza. Le frecce colorate indicano le aree espanse in (D) (colori corrispondenti). (C) Deviazione di Allan per la posizione z di un tallone legato di 5 kbp misurato con 15-20 pN. Vengono visualizzate le curve per le coordinate z del tallone magnetico prima (blu) e dopo (rosso) sottraendo la posizione del tallone di riferimento. (D) Serie temporale rappresentativa della posizione y misurata alla distanza del magnete indicata d. L'istogramma corrispondente della distribuzione delle coordinate y è mostrato a destra con un adattamento gaussiano (rosso). (E) PSD rappresentativa dai dati di cui alla lettera D). I valori di forza ottenuti montando un modello (rosso) sulle rispettive PSD sono riportati in alto. (F) Taratura della forza magnetica in funzione della distanza del magnete. Le forze sono state misurate dalla varianza (a sinistra) o dal metodo PSD (a destra). Il fit (rosso) indica un modello a doppia esponenziale con l'equazione annotata. (G) Differenza nella forza misurata ottenuta dalla varianza e dalla PSD. Viene calcolata una curva rossa per gli adattamenti mostrati in (F). (H,I) Verifica della relazione forza-estensione del costrutto di calibrazione 5 kbp. I valori medi di estensione a livelli di forza distinti (misurati dalla varianza) sono stati utilizzati direttamente (H) o dopo aver corretto l'offset dell'altezza del tallone (I) a causa dell'inclinazione di un tallone decentrato31. I dati di estensione della forza per n = 5 molecole sono stati adattati da un modello WLC estensibile e i parametri adattati (lunghezza di persistenza Lp e modulo di allungamento Ko) sono annotati in alto (media ± s.d.). Abbreviazione: PSD = densità spettrale di potenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Preparazione del campione . (A) Preparazione di costrutti a forcina di DNA da 8 bp mediante amplificazione PCR di una regione di 1 kbp di λ-DNA. (B) Preparazione di costrutti complessi SNARE con due maniglie di DNA da 510 bp. Riquadro: Verifica delle maniglie del DNA e del loro attaccamento alle proteine mediante elettroforesi su gel di agarosio (gel al 2%). Le frecce indicano lo spostamento della mobilità (codificato a colori) delle specie di prodotto: maniglie libere da 510 bp (magenta); Maniglia B attaccata alla sintassi (rosso), al complesso ΔN (verde) e al complesso SNARE (blu); e l'ultimo complesso SNARE a due manici (verde). L'aggiunta di SDS sconvolge i complessi ΔN (presenti in b) ma non i complessi SNARE completi formati dal VAMP2 a lunghezza intera (presente in c). (C) Progettazione e fotografia di una cella a flusso per esperimenti di MT. (D) Schema dell'introduzione sequenziale di soluzioni campione in un canale di cella di flusso. Abbreviazione: MT = pinzetta magnetica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Tipi di esperimenti rappresentativi. (A-C) Schemi degli esperimenti force-ramp, force-clamp, e force-jump (in alto) con tracce temporali rappresentative di estensione dalle misurazioni corrispondenti (al centro). I tipi di analisi che possono essere condotti sono mostrati in basso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Transizione a due stati di una forcina di DNA a 8 bp. (A) Schema degli esperimenti di MT su una forcina di DNA con la transizione prevista per la decompressione e la ricompressione. (B) Traccia rappresentativa dell'estensione del costrutto da esperimenti di rampa di forza con livelli di forza crescenti (~0,25 pN s−1). (C) Curva rappresentativa forza-estensione ricostruita a partire dai dati di cui alla lettera B). Le curve gialle indicano i modelli WLC per il costrutto a forcina con la forcina nella conformazione chiusa (solida) e aperta (tratteggiata). (D) Traccia di estensione rappresentativa da esperimenti a forza costante con livelli di forza crescenti, misurati a 100 Hz. (E) Istogrammi dei dati di estensione in (D). (F,G) Risultati per gli stessi esperimenti in (D) ed (E) ma con tracking a 1,2 kHz. La serie temporale grezza a 1,2 kHz è stata attenuata applicando un filtro mediano a cinque punti. Tracce rosse nella vista espansa di (F) sono state ottenute da un HMM. Le linee rosse in (G) indicano la posizione delle popolazioni gaussiane. (H) Distanza tra le due popolazioni di cui alla lettera G). (I) Probabilità allo stato aperto in funzione della forza applicata. La curva rossa è un modello Boltzmann montato (Equation 10 ) con la forza media F1/2 = 5,9 pN. (J) Velocità di transizione di decompressione e ricompressione misurate in base ai risultati HMM. Le linee continue indicano una dipendenza esponenziale dalla forza. (K) Fluttuazione termica nelle misure di estensione. Le deviazioni standard dei dati di estensione della forcina (senza filtro) sono mostrate in funzione della forza. Il limite di risoluzione termica che rappresenta l'entità teorica delle fluttuazioni termiche è stato stimato dall'Eq. 9 nel lavoro di Choi et al.2 per una perla da 2,8 μm con un cavo di 1 kbp. (L) Deviazioni di Allan calcolate dai dati della forcina a 1,2 kHz in (F) (senza filtraggio). L'inserto mostra la deviazione di Allan a 0,01 s in funzione della forza, che dimostra un graduale aumento e diminuzione della fluttuazione dovuta alla dinamica del tornante. Abbreviazione: MT = pinzetta magnetica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Cambiamenti conformazionali dei complessi SNARE neuronali. (A) Schema degli esperimenti di MT sui complessi SNARE. (B) Curve rappresentative di forza-estensione per il costrutto SNARE. Tracce nere e blu (100 Hz) sono state ottenute rispettivamente da periodi di allungamento e rilassamento in esperimenti di rampa di forza. Le linee tratteggiate indicano modelli di estensione, che tengono conto delle varie conformazioni dei complessi SNARE mostrati in (C). (C) Modelli molecolari di conformazioni complesse SNARE con le corrispondenti estensioni calcolate. I valori sono stati stimati dai parametri geometrici dei fasci elicoidali e da un modello WLC per la regione polipeptidica14. (D) Schema di esperimenti di salto di forza per studiare le conformazioni complesse di SNARE. (E-H) Tracce di estensione rappresentative da esperimenti di salto di forza eseguiti ai livelli di forza indicati. In (E), non è stata osservata la decompressione. Nei punti (F) e (G), è stata osservata la decompressione seguita da una ricompressione a 10 pN. In (H), la decompressione è stata seguita da un ulteriore evento in corso. (I) Ripiegamento di un complesso SNARE a 2 pN. Una chiara riduzione dell'estensione dallo stato UF allo stato FZ è stata osservata a 5 pN. Abbreviazione: MT = pinzetta magnetica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Impostazione PCR Condizione
Materiali 1,25 μg/mL λ-DNA (modello), 1 μM primer avanti e indietro, 0,2 mM dNTP, 0,05 U/μL nTaq, 1x tampone nTaq
Denaturazione 95 °C per 30 s
Ricottura Costrutto di calibrazione: 55 °C per 30 s
Forcina DNA: 57 °C per 30 s
Maniglie DNA: 50 °C per 30 s
Estensione Forcina e maniglie DNA: 72 °C per 1 min
Costrutto di calibrazione: 72 °C per 5 min
Ciclo 30–34
Elettroforesi su gel di agarosio
Gel 2% agarosio in tris-borato-EDTA 0,5x (TBE, pH 8,3) contenente 1x SYBR Safe
Corsa Piena potenza (108 V avg) su Mupid-2plus (Advance), 40-50 min

Tabella 1: Condizioni per le reazioni PCR e l'elettroforesi su gel di agarosio. Parametri di reazione per la PCR di costrutti di DNA, tra cui dsDNA a 5 kbp per la calibrazione della forza, costrutto a forcina di DNA e maniglie di DNA per attaccare SNARE. Le sequenze di primer sono riportate nella tabella dei materiali.

Tampone di purificazione delle proteine Composizione
Tampone di lavaggio A 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCl, 7 mM β-mercaptoetanolo (BME), 10% glicerolo e 20 mM imidazolo
Tampone di lavaggio B 50 mM HEPES (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10% glicerolo e 20 mM imidazolo
Tampone di lisi Wash Buffer A integrato con Triton X-100 all'1%, 1 mM di fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) e 1x cocktail inibitore della proteasi
Buffer di eluizione Wash Buffer B integrato con 400 mM di imidazolo
Soluzione salina tamponata fosfato (PBS) 81 mM fosfato di sodio bibasico (Na 2 HPO 4), 19 mM fosfato di sodio monobasico (NaH 2 PO4) (pH7,2), 150 mM NaCl
tampone fosfato 81 mM Na 2 HPO4, 19 mM NaH2PO 4, pH7,4

Tabella 2: Buffer e loro composizione. Composizione dei tamponi utilizzati per la purificazione delle proteine.

Figura supplementare S1: Disegno di un portamagneti. Vengono mostrate le dimensioni di un supporto acrilico per due magneti da 10 mm x 10 mm x 12 mm con uno spazio di 1 mm. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: un file compresso contenente codici MATLAB. Script MATLAB per l'analisi dei dati prodotti dagli esperimenti di pinzette magnetiche ad alta velocità, tra cui calibrazione della forza, forcina e analisi complessa SNARE. Clicca qui per scaricare questo file.

Supplemental File 2: file compresso del pacchetto software LabVIEW. Un pacchetto completo di codici LabVIEW per il funzionamento di una configurazione di pinzette magnetiche ad alta velocità e l'acquisizione di dati con esso. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

In questo lavoro, abbiamo introdotto una configurazione di spettroscopia di forza a singola molecola in grado di osservare i cambiamenti strutturali delle biomolecole ad alta precisione spaziotemporale. La telecamera CMOS ad alta velocità utilizzata acquisisce 1.200 fotogrammi s-1 con risoluzione 1.280 x 1.024, consentendo il tracciamento delle perline a 1,2 kHz. Tuttavia, la velocità delle misurazioni è attualmente limitata dal software di tracciamento delle perline, quindi il ROI è in genere ridotto ad aree più piccole nelle misurazioni ad alta velocità. L'elevata potenza dell'SLD fornisce un'illuminazione brillante che è fondamentale per l'imaging rapido delle perline fino a pochi kHz di larghezza di banda. Inoltre, la coerenza spaziale del fascio genera anelli di diffrazione concentrica ad alto contrasto attorno alle perline (Figura 1A, inserto), che consentono una determinazione precisa della posizione del tallone in base alla simmetria.

La forza magnetica esercitata su un costrutto bead-tether può essere determinata misurando le fluttuazioni browniane della perla legata35,37,38. Poiché l'analisi della forza in tempo reale è pesante per il calcolo, la forza applicata viene in genere misurata in anticipo utilizzando un costrutto di riferimento. Ad esempio, le sfere magnetiche da utilizzare sono legate da frammenti di dsDNA lunghi (>5 kbp) e le corrispondenti fluttuazioni termiche nella posizione delle perle sono misurate in funzione della distanza del magnete (Figura 2A). La calibrazione della forza viene in genere eseguita una volta dopo la costruzione della configurazione, ma non è necessario ripeterla regolarmente a meno che la configurazione non venga modificata, ad esempio sostituendo i magneti. Poiché la frequenza caratteristica della fluttuazione del tallone aumenta con la forza applicata2, una configurazione ad alta velocità è particolarmente utile per catturare la dinamica veloce in un regime di forza elevata e misurare la forza con precisione. La stima della forza dalla varianza è molto più semplice nella sua implementazione rispetto all'analisi spettrale nel dominio della frequenza, ma è suscettibile agli artefatti derivanti dalla deriva, dall'acquisizione basata sulla telecamera e dalle modifiche di estensione dovute all'attacco del tallone decentrato31,37,38. Tuttavia, i risultati dei due metodi differiscono solo di 0-2 pN se ottenuti correttamente (Figura 2G); Quindi, il metodo della varianza è abbastanza affidabile quando la determinazione assoluta della forza non è critica.

Per forze superiori a 30 pN e intorno a 65 pN (in cui l'overstretching del dsDNA funge da punto di riferimento), devono essere installati magneti di alta qualità (N50-N52) disponibili in commercio, lo spazio tra i magneti deve essere ridotto o il campo magnetico deve essere ulteriormente ingegnerizzato 28,49. In questa configurazione, la velocità massima del motore verticale è di 30 mm / s, che consente un salto di forza da 0 pN a 20 pN in ~ 0,6 s. Alcune modifiche strutturali dipendenti dalla forza possono essere perse se il movimento del motore limita la velocità di carico della forza. A seconda dell'applicazione, potrebbero essere necessarie modifiche e ulteriori ottimizzazioni del modo in cui i magneti vengono spostati. Un esempio riguarda l'uso creativo di una testina a nastro magnetico15.

Per misurazioni ad alta risoluzione con MT, è importante valutare il livello di rumore proveniente da varie fonti. Una volta che i componenti ottici (un microscopio con una lente ad alto ingrandimento, una sorgente luminosa e una fotocamera veloce) sono configurati correttamente, è possibile ottenere una precisione sub-nanometrica nel tracciamento delle perline. Quindi, la principale fonte di rumore diventa il moto browniano di una perla, che viene utilizzato per misurare la forza applicata. La fluttuazione termica di un cordone legato dipende dal raggio, dalla lunghezza del cavo e dalla forza applicata. Sebbene la fluttuazione intrinseca nella direzione z (cioè i cambiamenti di estensione) dipenda esclusivamente dall'energia termica e dalla rigidità del legame, la dinamica bead-tether e la velocità di acquisizione basata sulla telecamera filtrano il movimento del tallone e quindi il monitoraggio delle biomolecole bersaglio a sua volta. Pertanto, la dimensione del tallone e la frequenza di campionamento devono essere scelte strategicamente per ottenere una buona risoluzione spaziotemporale. In alternativa al tallone da 2,8 μm che abbiamo impiegato, anche le perle più piccole da 1 μm sono popolari e possono essere vantaggiose per misurazioni rapide a causa della loro risposta rapida. Tuttavia, una debolezza critica è il piccolo contenuto magnetico, che limita la forza massima che può essere generata (Equation 12 ). Poiché le perle più piccole possono ancora esercitare una forza almeno fino a 10 pN, possono essere adatte per studiare fenomeni di forza debole, come nel superavvolgimento del DNA. Al contrario, le indagini sui motori molecolari, sul ripiegamento delle proteine (ad esempio, SNARE, mostrati qui) o sulla meccanica cellulare50 richiedono l'applicazione di forze più elevate, nel qual caso si può considerare di modificare la configurazione del magnete (ad esempio, ridurre il divario o la distanza) per estendere l'intervallo della forza applicabile 28,51.

Poiché la tecnica sonda le risposte nanomeccaniche delle molecole bersaglio mentre applica una forza alla scala biofisicamente rilevante, è ideale per studiare elementi sensibili alla forza che svolgono ruoli fondamentali nei processi meccanobiologici. Per illustrare l'ampia applicabilità del saggio MT ad alta precisione, abbiamo impiegato sia un acido nucleico che un modello proteico che mostrano cambiamenti conformazionali dinamici e veloci dopo l'applicazione di una forza della scala di Piconewton. Una limitazione della tecnica è la necessità di acidi nucleici e proteine purificati, che ha particolarmente scoraggiato la sua ampia estensione a una vasta gamma di proteine. Il progresso delle tecnologie di espressione e coniugazione delle proteine in vitro continuerà a fornire accesso a proteine meno studiate. Un problema correlato è che la conoscenza a priori della struttura target è spesso fondamentale per gli esperimenti di progettazione (ad esempio, il fissaggio delle maniglie). Ci aspettiamo che l'avvento della crio-EM 52 a singola particella e diAlphaFold2 53 supporterà fortemente la progettazione e l'analisi di misure meccaniche su singole molecole proteiche e libererà applicazioni più potenti di MT ad alta risoluzione.

La forza di decompressione delle forcine del DNA dipende da molti fattori, tra cui la sequenza, la struttura e la composizione del tampone, ma soprattutto dalla lunghezza dello stelo e dal contenuto di guanina-citosina (GC)20. Per dimostrare la potenza dell'inseguimento ad alta velocità, abbiamo intenzionalmente progettato uno stelo da 8 bp (con tre coppie di basi GC) che avrebbe dovuto dispiegarsi a una forza bassa con dinamiche veloci. In effetti, i risultati nella Figura 5 mostrano che una dinamica così veloce sarebbe stata difficile da risolvere con tecniche standard con una risoluzione di 10 ms o inferiore. Questo aspetto è ulteriormente confermato dai tassi di transizione misurati dall'analisi HMM, i cui tassi elevati variavano tra 100 e 200 s−1 (Figura 5J).

Si ritiene che gli SNARE neuronali guidino l'esocitosi delle vescicole sinaptiche. In particolare, le proteine SNARE catalizzano la fusione di membrana abbassando la barriera energetica associata, come la repulsione elettrostatica tra vescicole e membrane plasmatiche. Di conseguenza, le fluttuazioni conformazionali dei complessi SNARE si verificano in un intervallo di forza ristretto di 12-15 pN, che corrisponde al livello atteso di forze repulsive14,23. Utilizzando le MT ad alta velocità qui descritte, abbiamo ricapitolato i principali risultati sul comportamento dipendente dalla forza dei complessi SNARE neuronali. L'isteresi della forza nella decompressione e nella ricompressione (Figura 6B) indica che la ricompressione avviene con una forza inferiore rispetto alla decompressione e quindi il lavoro viene eseguito durante questo ciclo. Tali transizioni di non equilibrio sono meglio affrontate da esperimenti di salto di forza, in cui è possibile misurare la latenza alla transizione sotto carico (simile a un evento di rottura del legame) o le fluttuazioni conformazionali prima della decompressione. Entrambi i casi beneficiano di configurazioni ad alta velocità, come illustrato da recenti studi sugli stati transitori delle biomolecole e dei loro complessi 15,17,54,55,56.

Collettivamente, questi risultati concordano con i caratteristici cambiamenti dipendenti dalla forza delle forcine del DNA e dei complessi SNARE neuronali riportati con la spettroscopia convenzionale a singola molecola. Allo stesso tempo, sottolineano l'utilità di misurazioni meccaniche ad alta precisione per rivelare la sensibilità alla forza delle biomolecole e dei loro assiemi. Speriamo che questo articolo possa attirare più persone dal campo della meccanobiologia, motivando i ricercatori a impiegare MT ad alta velocità nello studio dei loro sistemi unici di interesse.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT) (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 e NRF- 2021R1A6A1A10042944). S.-H.R. è stato sostenuto dalla sovvenzione NRF (2021R1C1C2009717).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for construct synthesis
Agarose gel electrophoresis system Advance Mupid-2plus
DNA ladder Bioneer D-1037
nTaq polymerase Enzynomics P050A
PCR purification kit LaboPass CMR0112
PEGylated SMCC crosslinker / SM(PEG)2 ThermoFisher Scientific 22102 For SNARE–DNA coupling
Primer B Bioneer 5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For 5-kbp force calibration construct and DNA handles
Primer B_hp IDT 5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT
TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'		 For hairpin construct
Primer N Bioneer 5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3' For DNA handles
Primer Z Bioneer 5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For DNA handles
Primer Z_5k Bioneer 5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA
TCG-3'		 For 5-kbp force calibration construct
Primer Z_hp Bioneer 5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3' For hairpin construct
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher Scientific S33102
λ-DNA Bioneer D-2510 Template strand for PCR
DNA sequences for SNARE proteins
6×His-tagged SNAP-25b (2-206; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
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6×His-tagged VAMP2 (2-97, L32C/I97C; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
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6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49–96; capitalized) and Syntaxin-1A (191–267, I202C/I266C; capitalized) in pETDuet-1 homemade ggggaattgtgagcggataacaattcccctc
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Materials for protein purificaiton
2-Mercaptoethanol SIGMA M3148-25ML
Agar LPS Solution AGA500
Ampicillin, Sodium salt PLS AC1043-005-00
Chloramphenicol PLS CR1023-050-00
Competent cells (E. coli) Novagen 70956 Rosetta(DE3)pLysS
Glycerol SIGMA G5516-500ML
HEPES SIGMA H4034-100G
Hydrochloric acid / HCl SIGMA 320331-500ML
Imidazole SIGMA I2399-100G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside / IPTG SIGMA 10724815001
Kanamycin Sulfate PLS KC1001-005-02
Luria-Bertani (LB) Broth LPS Solution LB-05
Ni-NTA resin Qiagen 30210
PD MiniTrap G-25 (desalting column) Cytiva GE28-9180-07 For instructions, see: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174
Phenylmethylsulfonyl fluoride / PMSF ThermoFisher Scientific 36978
Plasmids for SNARE proteins cloned in house N/A Available upon request
Protease inhibitor cocktail genDEPOT P3100
Sodium chloride SIGMA S5886-500G
Sodium phosphate dibasic / Na2HPO4 SIGMA S7907-100G
Sodium phosphate monobasic / NaH2PO4 SIGMA S3139-250G
Tris(2-carboxyethyl)phosphine / TCEP SIGMA C4706-2G
Trizma base SIGMA T1503-250G
Materials for sample assembly
Biotin-PEG-SVA LAYSAN BIO BIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1g For PEGylation
Dibenzocyclooctyne-amine / DBCO-NH2 SIGMA 761540-10MG For bead coating
Double-sided tape 3M 136 For flow cell assembly
Epoxy glue DEVCON S-208 For flow cell assembly
Glass coverslip for bottom surface VWR 48393-251 Rectangular, 60×24 mm, #1.5
Glass coverslip for top surface VWR 48393-241 Rectangular, 50×24 mm, #1.5
Magnetic bead ThermoFisher Scientific 14301 Dynabeads M-270 Epoxy, 2.8 μm
mPEG-SVA LAYSAN BIO mPEG-SVA 1g For PEGylation
N,N-Dimethylformamide / DMF SIGMA D4551-250ML For bead coating
N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine SIGMA 104884-100ML For PEGylation
Neutravidin ThermoFisher Scientific 31000 For sample tethering
Phosphate buffered saline / PBS, pH 7.2 PLS PR2007-100-00
Plastic syringe Norm-ject A5 5 ml, luer tip
Polyethylene Tubing SCI BB31695-PE/4 PE-60
Reference bead SPHEROTECH SVP-30-5 Streptavidin-coated Polystyrene Particles; 3.0-3.4 µm
Syringe needle Kovax 21G-1 1/4'' 21 G
Syringe pump KD SCIENTIFIC 788210
Equipment for magnetic tweezer instrument
1-axis motorized microtranslation stage PI M-126.PD1 For vertical positioning of magnets
2-axis manual translation stage ST1 LEE400 For alignment of magnets to the optical axis
Acrylic holder for magnets DaiKwang Precision custum order Drawing available upon request
Frame grabber Active Silicon AS-FBD-4XCXP6-2PE8
High-speed CMOS camera Mikrotron EoSens 3CXP
Inverted microscope Olympus IX73P2F-1-2
Neodymium magnets LG magnet ND 10x10x12t Dimension: 10 mm × 10 mm × 12 mm; two needed
Objective lens Olympus UPLXAPO100XO Oil-immersion, NA 1.45
Objective lens nanopositioner Mad City Labs Nano-F100S
Rotation stepper motor AUTONICS A3K-S545W For rotating magnets
Superluminescent diode QPHOTONICS QSDM-680-2 680 nm
Software
LabVIEW National Instruments v20.0f1
MATLAB MathWorks v2021a

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References

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Park, C., Yang, T., Rah, S. H., Kim, … More

Park, C., Yang, T., Rah, S. H., Kim, H. G., Yoon, T. Y., Shon, M. J. High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements. J. Vis. Exp. (195), e65137, doi:10.3791/65137 (2023).

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