Pinces magnétiques à grande vitesse pour les mesures nanomécaniques sur des éléments sensibles à la force

Summary

Ici, nous décrivons une pince magnétique à haute vitesse qui effectue des mesures nanomécaniques sur des biomolécules sensibles à la force à la vitesse maximale de 1,2 kHz. Nous introduisons son application aux épingles à cheveux à ADN et aux complexes SNARE en tant que systèmes modèles, mais elle sera également applicable à d’autres molécules impliquées dans des événements mécanobiologiques.

Abstract

Les pincettes magnétiques à molécule unique (MT) ont servi d’outils puissants pour interroger avec force les biomolécules, telles que les acides nucléiques et les protéines, et sont donc sur le point d’être utiles dans le domaine de la mécanobiologie. Étant donné que la méthode repose généralement sur le suivi des billes magnétiques basé sur l’image, la limite de vitesse dans l’enregistrement et l’analyse des images, ainsi que les fluctuations thermiques des billes, ont longtemps entravé son application dans l’observation de changements structurels petits et rapides dans les molécules cibles. Cet article décrit en détail les méthodes de construction et d’exploitation d’une installation de traduction automatique à haute résolution capable de résoudre la dynamique nanométrique en millisecondes des biomolécules et de leurs complexes. À titre d’exemples d’application, des expériences avec des épingles à cheveux à ADN et des complexes SNARE (machinerie de fusion membranaire) sont démontrées, en se concentrant sur la façon dont leurs états transitoires et transitions peuvent être détectés en présence de forces à l’échelle du piconewton. Nous nous attendons à ce que les MT à grande vitesse continuent de permettre des mesures nanomécaniques de haute précision sur des molécules qui détectent, transmettent et génèrent des forces dans les cellules, approfondissant ainsi notre compréhension moléculaire de la mécanobiologie.

Introduction

Les cellules détectent activement les stimuli mécaniques et y répondent. Ce faisant, de nombreuses biomolécules présentent des propriétés dépendantes de la force qui permettent des changements structurels dynamiques. Des exemples très appréciés incluent les canaux ioniques mécanosensibles et les éléments cytosquelettiques qui fournissent aux cellules des informations mécaniques clés de leur environnement.

En outre, les molécules qui présentent une nature unique de force porteuse peuvent également être considérées comme mécanosensibles dans un sens plus large. Par exemple, la formation locale et la fusion des duplex d’acides nucléiques, ainsi que des structures d’ordre supérieur telles que les quadriplex G, jouent un rôle crucial dans la réplication, la transcription, la recombinaison et, plus récemment, l’édition du génome. De plus, certaines protéines neuronales impliquées dans les communications synaptiques remplissent leurs fonctions en générant des forces physiques qui dépassent les niveaux des interactions intermoléculaires typiques. Quel que soit l’exemple étudié, l’étude de la nanomécanique des biomolécules impliquées avec une grande précision spatio-temporelle s’avérera très utile pour révéler les mécanismes moléculaires des processus mécanobiologiques associés ^1,2,3.

Les méthodes de spectroscopie de force à molécule unique ont servi d’outils puissants pour examiner les propriétés mécaniques des biomolécules 2,4,5,6. Ils peuvent surveiller les changements structurels dans les acides nucléiques et les protéines en même temps que l’application de la force, examinant ainsi les propriétés dépendantes de la force. Deux configurations bien connues sont les pinces optiques et les pinces magnétiques (MT), qui utilisent des billes de la taille d’un micron pour manipuler les molécules 5,6,7,8. Dans ces plateformes, le polystyrène (pour les pinces optiques) ou les billes magnétiques (pour les MT) sont attachés à des molécules cibles (p. ex. acides nucléiques et protéines) via des « poignées » moléculaires, généralement constituées de courts fragments d’ADN double brin (ADNds). Les billes sont ensuite déplacées pour exercer une force et imagées pour suivre leurs emplacements qui signalent les changements structurels dans les molécules cibles. Les pinces optiques et magnétiques sont largement interchangeables dans leurs applications, mais il existe des différences importantes dans leurs approches du contrôle de la force. Les pincettes optiques sont intrinsèquement des instruments de serrage de position qui emprisonnent les billes en position, à cause desquelles la force appliquée fluctue lorsqu’une construction cible subit des changements de forme; L’augmentation de l’extension, par exemple en se dépliant, desserre l’attache et réduit la tension, et vice versa. Bien que la rétroaction active puisse être mise en œuvre pour contrôler la force dans les pincettes optiques, les MT en revanche fonctionnent naturellement comme un dispositif de serrage de force, tirant parti des forces magnétiques stables et éloignées des aimants permanents, qui peuvent également résister à la perturbation de l’environnement.

Malgré leur longue histoire et leur conception simple, les MT ont pris du retard par rapport aux pincettes optiques dans leurs applications pour les mesures de haute précision, en grande partie en raison des défis techniques liés au suivi rapide des talons. Récemment, cependant, plusieurs groupes ont mené conjointement une amélioration multidimensionnelle du matériel et des logiciels pour les instruments de traduction automatique 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Dans ce travail, nous présentons un exemple d’une telle configuration fonctionnant à 1,2 kHz et décrivons comment l’utiliser pour effectuer des mesures nanomécaniques sur des biomolécules sensibles à la force. En tant que systèmes modèles, nous utilisons des épingles à cheveux à ADN et des complexes SNARE neuronaux et examinons leurs changements structurels rapides dans le régime piconewton. Les épingles à cheveux ADN présentent des transitions simples à deux états dans une plage de force bien définie^20,21, et servent donc de modèles de jouets pour vérifier les performances d’une pince à épiler. Comme les protéines SNARE s’assemblent en un complexe sensible aux forces qui entraîne la fusion membranaire²², elles ont également été étudiées de manière approfondie par spectroscopie de force à molécule unique 14,23,24,25. Les approches standard pour analyser les données et extraire des informations utiles sur la thermodynamique et la cinétique sont présentées. Nous espérons que cet article facilitera l’adoption de MT de haute précision dans les études mécanobiologiques et motivera les lecteurs à explorer leurs propres systèmes d’intérêt sensibles à la force.

Protocol

Tous les matériaux et équipements décrits dans ce protocole sont énumérés dans le tableau des matériaux. Le logiciel LabVIEW permettant de faire fonctionner la configuration de traduction automatique à grande vitesse décrite ci-dessous, ainsi que les scripts MATLAB permettant d’analyser des exemples de données, sont déposés sur GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) et accessibles au public.

1. Construction de l’appareil

REMARQUE : Le principe général de la construction MT à grande vitesse est similaire à celui des systèmes de traduction automatique conventionnels standard, à l’exception de l’utilisation d’une caméra CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) à grande vitesse et d’une source lumineuse cohérente et de grande puissance (Figure 1). Reportez-vous à d’autres sources pour plus de descriptions des instruments de traduction automatique standard 5,26,27.

1. Installez un microscope inversé sur une table optique antivibratoire. Installez une caméra CMOS haute vitesse et une carte d’acquisition.
2. Construisez une étape de traduction pour manipuler des aimants en 3D. Montez une platine linéaire motorisée (>20 mm de débattement) verticalement sur une platine XY manuelle.
   REMARQUE: Le mouvement vertical contrôle la force, tandis que l’étage XY est pour l’alignement manuel des aimants sur l’axe optique pour la construction initiale de la configuration.
3. Installez un moteur pas à pas rotatif et un système de courroie et de poulie pour les aimants rotatifs.
   REMARQUE: La courroie transmet le mouvement rotatif entre l’arbre du moteur et les aimants distants de quelques centimètres. La rotation des aimants est interne à la manipulation translationnelle.
4. Montez les aimants. Utilisez un support en acrylique (commandé auprès d’une entreprise de fabrication; voir la figure supplémentaire S1) qui peut loger étroitement deux aimants identiques en parallèle, avec un espace bien défini de 1 mm entre les aimants (Figure 1B). Pour utiliser la force maximale pouvant être obtenue avec une paire d’aimants donnée, ajustez la position verticale de l’étage de translation de sorte que la surface inférieure des aimants s’aligne sur le plan de l’échantillon lorsqu’il est déplacé vers la position la plus basse.
   NOTE: Se référer à Lipfert et al. pour plus d’informations sur la conception et la configuration du support magnétique²⁸. La hauteur et l’orientation des aimants sont contrôlées par le logiciel LabVIEW en conjonction avec l’acquisition de données.
5. En regardant avec un objectif à faible grossissement, alignez les aimants au centre du champ de vision. Vérifiez que la rotation des aimants ne provoque pas un déplacement important du centre de la paire d’aimants.
   REMARQUE: Si le point médian entre les aimants tourne autour de l’axe de rotation, il est probable que les aimants soient décentrés en raison d’un support imparfait. Un faible niveau de désalignement par rapport à la taille de l’espace est tolérable, car la rotation de l’aimant sert uniquement à vérifier les attaches et à appliquer des couples dans des applications spécifiques.
6. Installez une diode superluminescente (SLD) pour l’éclairage des billes. Passez le faisceau à travers l’espace de 1 mm entre les deux aimants. Assurez-vous que le faisceau est correctement collimaté pour tenir dans l’espace et que l’éclairage n’est pas ombragé par les aimants.
7. Installez un scanner de lentille piézoélectrique sur le nez et montez un objectif d’objectif à immersion dans l’huile 100x (ouverture numérique [NA]: 1,45) pour le suivi du cordon. Pour éviter les artefacts potentiels dans le suivi des résultats, assurez-vous que l’éclairage est maintenu uniformément lorsque les aimants sont déplacés. Enfin, réglez le niveau de lumière à la luminosité maximale sans saturer les pixels.
   NOTA : Pour la comparaison de différentes sources lumineuses pour le suivi à grande vitesse des billes, se reporter à Dulin et ^coll.29.

2. Calibrage de la force magnétique

1. À l’aide de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR; voir le tableau 1), préparer des fragments d’ADNds de 5 kbp (en utilisant l’amorce B, l’amorce Z_5k et l’ADNλ) marqués avec de la biotine à une extrémité (pour la fixation de surface) et de l’azoture à l’autre extrémité (pour la fixation des billes).
2. Après la section 6, préparez une cellule d’écoulement avec les molécules de 5 kbp.
3. À la suite de la section 7, identifier une bonne construction d’attache de perles en vérifiant son extension et sa rotation. En particulier, assurez-vous de choisir un cordon avec une trajectoire de rotation minimale (c.-à-d. avec un rayon <200 nm) pour minimiser le décalage de hauteur du cordon en raison de la fixation décentrée^30,31. Une fois qu’une bonne attache est identifiée, commencez à suivre les perles, en vous référant à la section 9.
4. Si la configuration est nouvelle, caractérisez son bruit et sa stabilité pour des mesures haute résolution fiables. Placez l’aimant à ~3 mm de la surface de la cellule d’écoulement (pour appliquer >10 pN et supprimer le mouvement brownien d’une bille), suivre la position z de la bille à 1,2 kHz et calculer la déviation d’Allan (AD) par rapport à la série chronologique de coordonnées z ^32,33 (Figure 2C). Vérifier que des valeurs AD de quelques nanomètres sont réalisables dans le régime à grande vitesse (<0,1 s) et que le suivi différentiel (position du cordon magnétique par rapport à une bille de référence) réduit AD sur une échelle de temps plus longue.
   REMARQUE: Nous obtenons généralement un AD de <3 nm à la vitesse maximale (résolution de 1,2 kHz ou 0,83 ms), et l’AD continue de diminuer au moins jusqu’à 10 s, ce qui implique une dérive minimale. D’autres ont signalé des valeurs similaires sur des configurations similaires 9,10,11,12,34.
5. Avec les aimants en position de repos (F ~ 0 pN), enregistrez les coordonnées x et y du cordon captif à 1,2 kHz. Enregistrer la position pendant une période suffisamment longue (c’est-à-dire suffisamment longue que le temps de relaxation caractéristique de la fluctuation³⁵) pour que le mouvement brownien soit suffisamment échantillonné.
   REMARQUE: Ici, la direction x est le long de la direction du champ magnétique, alors que le mouvement dans y représente le mouvement transversal perpendiculaire au champ.
6. Rapprochez les aimants de la cellule d’écoulement et répétez les mesures de position des billes jusqu’à ce que les aimants touchent doucement le haut de la cellule d’écoulement. Déplacez-vous par grands pas (p. ex., 1 à 2 mm) lorsque les aimants sont à plus de 7 mm du plan d’échantillonnage (puisque la force appliquée augmente lentement dans le champ éloigné des aimants), mais réduisez progressivement la taille des pas (p. ex., 0,1-0,5 mm) à mesure qu’ils se rapprochent pour un étalonnage plus fin à des niveaux de force plus élevés (figure 2B).
7. Calculez la force à chaque position magnétique, d, en utilisant l’une des deux méthodes alternatives (un script MATLAB « force calibration.m » incluant les deux méthodes est fourni; voir Fichier supplémentaire 1).
   1. Mesurer la variance des coordonnées y du cordon (figure 2D) et la position z moyenne du cordon par rapport à la position la plus basse (figure 2B, en bas). Ensuite, utilisez l’équation (1)^7,27,36 pour estimer la force (avec un rayon de bille fixe R = 1 400 nm et une énergie thermique k_RT = ^4,11 pN∙nm):
      (1)
   2. Vous pouvez également calculer la densité spectrale de puissance (PSD) des coordonnées y, S_y (Figure 2E). Déterminer la force appliquée F en ajustant un modèle de Lorentzien double³⁷ au S_y mesuré à l’aide de l’équation (2).
      (2)
      Ici, , R est le rayon de bille, γ _yet γ_φ sont les coefficients de traînée translationnel et rotationnel, respectivement (estimés à partir de l’équation de Stokes-Einstein), k_RT est l’énergie thermique, f₊ et f_- sont deux fréquences caractéristiques obtenues à l’aide de l’équation (3).
      (3)
      REMARQUE: Étant donné que l’extension d’attache L est une fonction de force qui suit le modèle bien établi de chaîne ressemblant à un ver (WLC), les expressions ci-dessus laissent F comme seul paramètre d’ajustement (nous fixons R à 1 400 nm pour plus de simplicité car il est partagé entre tous les niveaux de force et la valeur exacte n’influence pas sensiblement les résultats). Si nécessaire, le flou de mouvement et l’aliasing provenant de l’acquisition d’images par caméra doivent être pris en compte^38,39, mais cet effet est négligeable dans nos mesures à grande vitesse au-dessus de 1 kHz avec des attaches de 5 kbp.
8. Répétez les étapes 2.4 à 2.7 pour quelques constructions supplémentaires. Sondez trois à cinq billes différentes pour faire la moyenne de la variabilité de la force entre les billes magnétiques.
   REMARQUE : La variation de force entre les billes magnétiques utilisées doit être prise en compte pour déterminer le nombre approprié de constructions pour la moyenne. Cette variabilité est faible mais peut entraîner une erreur de plus de 1 pN dans la force mesurée, même pour les produits commerciaux³¹. Pour la plupart des applications, où la détermination absolue des forces en jeu n’est pas cruciale, la moyenne des résultats d’étalonnage de trois à cinq billes est généralement suffisante. Une autre approche pour tenir compte de cette variation consiste à mesurer la force avec des attaches individuelles au début de l’expérience, ce qui peut prendre beaucoup de temps. Une autre option consiste à intégrer des structures en épingle à cheveux qui se décompressent à des niveaux de force connus dans chaque construction³¹.
9. Tracer la force mesurée en fonction de la distance de l’aimant et ajuster une fonction exponentielle double aux données (Figure 2F) à l’aide de l’équation (4).
   (4)
   Ici, F₀ (ligne de base), A 1 et A 2 (amplitudes) et d ₁ et d ₂ (constantes de désintégration) sont des paramètres d’ajustement. Assurez-vous que les valeurs de force des deux méthodes, ainsi que les ajustements à double exponentielle qui en résultent, concordent largement (Figure 2F,G).
   REMARQUE : Pour confirmer que l’étalonnage de la force est effectué correctement, vérifiez la relation force-extension des constructions sondées en traçant l’extension par rapport à la force mesurée.
10. Pour corriger le décalage de hauteur du cordon z off résultant de l’inclinaison dépendante de la force des billes magnétiques^30,31, estimer z_off à partir du décalage latéral x_off^, en tenant compte de la géométrie d’une attache décentrée avec un rayon de cordon en utilisant l’équation (5), et appliquer les valeurs aux valeurs d’extension mesurées. Cette étape est implémentée dans le script MATLAB « force calibration.m » (lignes 252-254).
    (5)
    NOTE: Bien que cette correction apporte de petits changements à l’extension, en particulier pour les billes avec un petit rayon de rotation (<200 nm), ce décalage affecte souvent de manière critique la réponse élastique, comme on le voit dans le passage de la figure 2H à la figure 2I ^30,31.
11. Vérifiez la longueur de persistance L_p en ajustant un modèle WLC extensible aux données à l’aide de l’équation (6).
    (6)
    Ici, L 0 est la longueur du contour (1,7 μm pour 5 kbp) et K₀ est le module pour l’étirement enthalpique.
    REMARQUE: Bien que la L p de l’ADNds soit bien acceptée pour être de 40-50 nm dans un tampon typique tel que la solution saline tamponnée au phosphate (PBS), la formule WLC appliquée aux molécules courtes (<5 kbp) sous-estime systématiquement L _p car L₀ diminue de^31,40. En effet, le modèle WLC classique suppose un polymère dont la longueur de chaîne est suffisamment plus longue que sa longueur de persistance. Ici, nous avons obtenu L p = 40 ± 3 nm pour la construction de 5 kbp (Figure 2H), et la correction d’extension a en outre donné un K₀ homogène de 1 100 ± 200 _pN (Figure 2I). L’application d’un modèle WLC fini 31,40, ainsi qu’une correction pour non-Gaussianité dans la distribution d’extension ^41, augmentera légèrement L _p.
12. Une fois l’étalonnage de la force vérifié, appliquez les paramètres d’ajustement obtenus du modèle à double exponentielle au logiciel LabVIEW fourni (fichier supplémentaire 2) et attendez que le logiciel calcule la force de courant en temps réel à partir des lectures du moteur (c’est-à-dire la position de l’aimant). Comme une expression analytique pour la fonction inverse d(F) n’est pas disponible, préparer une table de correspondance de d par rapport à F par pas de 0,1 pN par estimation numérique des niveaux de force cibles d. Stockez également cette table dans le logiciel pour commander le contrôle de force.

3. Synthèse d’épingles à cheveux ADN

NOTE: Les constructions en épingle à cheveux de l’ADN pour les expériences de TA sont préparées par amplification par PCR d’une région de 510 pb dans l’ADNλ avec deux amorces personnalisées, dont l’une contient une structure en épingle à cheveux à son extrémité 5' (Figure 3A). De cette façon, un motif en épingle à cheveux est placé à une extrémité du produit PCR.

1. Préparez les amorces.
   1. Amorce avant : L’apprêt B_hp marqué à la 5′-biotine pour la fixation de la surface du verre et se lie à l’ADNλ. Cet apprêt contient un motif en épingle à cheveux avec une tige de 8 pb et une boucle de 6 nt, 5' à la région de liaison λ.
   2. Amorce inversée : L’amorce Z_hp marquée au 5′-azoture pour la fixation des billes magnétiques et se lie à l’ADNλ à 1 kbp de l’amorce avant.
2. Configurez et exécutez la PCR avec λ-ADN (modèle), nTaq polymérase et des conditions PCR standard (voir Tableau 1). Nettoyez le produit avec un kit de purification commercial.
3. Mesurer la concentration d’ADN par absorption UV à 260 nm (A260) et effectuer une électrophorèse sur gel d’agarose (gel à 2 %) (voir Tableau 2) pour vérifier la taille du produit. Un rendement typique est de ~35 μL de solution de ~600 nM.

4. Préparation des protéines SNARE

REMARQUE : Les complexes SNARE neuronaux sont assemblés en combinant trois protéines de rat purifiées exprimées à partir d’E. coli : VAMP2/synaptobrévine-2, syntaxine-1A et SNAP-25 (Figure 3B). Pour faciliter leur assemblage, la syntaxine et SNAP-25 sont co-exprimées avec un fragment VAMP2 (dépourvu de la région N-terminale; appelé « ΔN-VAMP2 ») dans une structure appelée « complexe ΔN », puis mélangées avec VAMP2 pleine longueur après fixation de la poignée d’ADN pour former des complexes complets.

1. Préparer les plasmides contenant de l’ADNc pour l’expression des protéines SNARE (les séquences d’ADN pour tous les plasmides sont données dans le tableau des matériaux).
   1. Préparer le VAMP2 marqué 6×His dépourvu du domaine transmembranaire (2-97; L32C/I97C pour les liaisons disulfure) cloné dans un vecteur pET28a.
   2. Préparer la syntaxine-1A dépourvue de Habc et du domaine transmembranaire (191-267, I202C/I266C substitutions pour les liaisons disulfure) clonée avec 6×His marqué ΔN-VAMP2 (49-96) dans un vecteur pETDuet-1.
   3. Préparer l’isoforme b pleine longueur de SNAP-25 (2-206, toutes C à A) clonée en vecteur pET28a. Celui-ci sera utilisé pour la préparation des complexes ΔN.
   4. Préparer l’isoforme b pleine longueur SNAP-25 marquée 6×His (1-206, toutes C à A) clonée en un vecteur pET28a pour l’ajout direct au tampon de dosage MT afin de réassembler les complexes SNARE après le dépliage.
2. Préparez deux tubes de cellules d’E. coli de Rosetta (DE3). Transformez un groupe avec des plasmides VAMP2 (à partir de l’étape 4.1.1), un avec des plasmides syntaxine-1A/ΔN-VAMP2 et SNAP-25 non marqués (à partir des étapes 4.1.2 et 4.1.3) pour exprimer le complexe ΔN, et l’autre avec des plasmides SNAP-25 marqués par His (à partir de l’étape 4.1.4).
3. Transférer les cellules transformées dans un bouillon Luria-Bertani (LB) avec les antibiotiques appropriés (ici, la kanamycine et le chloramphénicol pour VAMP2 et le SNAP-25 marqué His; kanamycine, chloramphénicol et ampicilline pour le complexe ΔN). Cultivez-les à 37 °C dans un incubateur à agitation (220 tr/min) jusqu’à ce que la densité optique (OD) du bouillon atteigne 0,7-0,9.
4. Ajouter 1 mM d’isopropyle β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) pour induire l’expression des protéines et incuber les cellules pendant 3-4 h à 37 °C dans un incubateur à agitation (220 rpm).
5. Enduire les cellules en centrifugeant la culture à 4 500 × g pendant 15 min à 4 °C.
6. Préparer des tampons pour la purification des protéines (voir tableau 2).
7. Suspendre les pastilles cellulaires exprimant SNARE dans 40 mL de tampon de lyse glacé et lyser les cellules par sonication sur glace (amplitude de 15%, 5 s allumé et 5 s éteint, 30 min au total).
8. Centrifuger le lysat à 15 000 × g pendant 30 min à 4 °C pour éliminer les matières insolubles.
9. Passez le surnageant à travers une colonne de gravité remplie de 1 mL de résine Ni-NTA. Laver la résine avec le tampon de lavage A, puis avec le tampon de lavage B, et éluer les protéines avec 10 mL de tampon d’élution.
10. Retirer la tris(2-carboxyéthyl)phosphine (PTCE) et l’imidazole de l’éluant à l’aide d’une colonne de dessalage (suivre les instructions du fabricant). Éluer l’échantillon avec PBS.
11. Concentrer les protéines avec des filtres centrifuges (coupure de 10 kDa) à ~70 μM tout en maintenant les protéines dans du PBS (produisant généralement 2 mL). Mesurer la concentration de protéines soit par absorption ultraviolette (UV) à 280 nm (A280), soit par le test de Bradford.
12. Préparer de petites aliquotes, les congeler dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C jusqu’à utilisation.
    REMARQUE: Les complexes SNARE complets seront assemblés après la conjugaison du complexe ΔN sur une poignée d’ADN (voir ci-dessous).

5. Fixation des poignées d’ADN

REMARQUE: Deux poignées d’ADNds de 510 bp contenant des groupes amines primaires à une extrémité sont d’abord préparées par PCR, puis les groupes amines sont ensuite convertis en groupes maléimide à l’aide d’un agent de réticulation bifonctionnel, SM (PEG) ₂. Les deux poignées sont ensuite liées par covalence aux complexes SNARE via leurs groupes cystéine pour une conjugaison spécifique au site (Figure 3B).

1. Préparez les amorces.
   1. Préparer les amorces avant : l’amorce B (pour amplifier la poignée B) qui est marquée à la 5′-biotine pour la fixation de la surface du verre et qui se lie à l’ADNλ; Primer Z (pour amplifier la poignée Z) qui est marqué au 5′-azoture pour la fixation du cordon magnétique et a la même séquence que l’apprêt B.
   2. Préparez une amorce inversée : l’amorce N (partagée pour la poignée B et la poignée Z) qui est marquée à la 5′-amine pour la conjugaison des protéines et se lie à l’ADNλ à 510 pb de l’amorce avant.
2. Configurez et exécutez deux séries de réactions PCR (18 tubes de réaction de 200 μL pour chaque poignée) avec de l’ADN λ (modèle), de la nTaq polymérase et des conditions PCR standard (voir le tableau 1). Nettoyez le produit avec un kit de nettoyage PCR et éluez chaque poignée avec 45 μL d’eau ultrapure. Utilisez un volume minimal d’eau pour obtenir des concentrations élevées de poignées pour une réaction efficace dans les étapes ultérieures.
3. Mesurer la concentration d’ADN par A260. Le rendement typique est de ~650 μL de solution de ~2 μM pour chaque poignée. Conserver les petits échantillons à part pour une vérification ultérieure dans l’électrophorèse sur gel d’agarose.
4. Réagissez chaque poignée (1 μM dans PBS) avec 5 mM SM(PEG₎₂. Incuber à température ambiante avec une rotation douce. Après 1 h, utilisez un kit de purification de l’ADN pour éliminer le SM(PEG)₂ qui n’a pas réagi. Éluer chaque manche avec 250 μL de PBS pour obtenir des solutions de ~2 μM.
5. Mélanger les solutions de poignée B et de complexe ΔN à un rapport molaire de 1:16 (par exemple, 1 μM de poignée B et 16 μM de complexe ΔN) dans du PBS et incuber pendant 2 h à température ambiante en agitant. Conserver un petit échantillon pour l’électrophorèse sur gel d’agarose.
6. Ajouter une solution de VAMP2 dans un excès molaire de 2,5 fois sur le complexe ΔN utilisé à l’étape précédente. Incuber le mélange pendant encore 1 h à température ambiante en agitant. Des complexes SNARE complets sont assemblés dans cette étape.
7. Éliminer les protéines libres par échange tampon avec du PBS frais et un filtre centrifuge (coupure de 100 kDa) : centrifuger à 14 000 × g pendant 5 min à 4 °C, répéter au moins 6x et faire fonctionner pendant 15 min pour le dernier essorage. Mesurer l’augmentation du rapport A260/A280 pour surveiller l’élimination des protéines libres. Conserver un petit échantillon pour l’électrophorèse sur gel d’agarose.
8. Ajouter la poignée Z à la solution dans un excès molaire de 15 fois sur la poignée B. Maintenir la concentration de la poignée Z au moins au-dessus de 1 μM pour faciliter la réaction. Incuber le mélange pendant une nuit à 4 °C en agitant.
9. Vérifier les intermédiaires (poignée B et ses conjugués protéiques) et le produit final (complexe SNARE à deux poignées) par électrophorèse sur gel d’agarose (figure 3B, encadré) (voir tableau 2).
   REMARQUE: Si les protéines sont fixées avec succès à la poignée B, un changement de mobilité sera détecté. En particulier, la formation de complexes SNARE complets sur les poignées d’ADN peut être confirmée par leur résistance au dodécylsulfate de sodium (SDS), contrairement aux complexes ΔN, qui sont désassemblés en SDS et ne laissent que la syntaxine liée à l’ADN (comparer b et c dans la figure 3B).
10. Préparer de petites aliquotes, les congeler dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C jusqu’à utilisation.
    REMARQUE: Bien que la solution finale contienne des poignées n’ayant pas réagi, seule la construction recherchée qui est doublement marquée avec de la biotine et de l’azoture sera sélectionnée lors de l’assemblage de l’échantillon dans une cellule d’écoulement.

6. Fabrication de cellules d’écoulement

REMARQUE : Les cellules d’écoulement pour les mesures de TA sont construites à partir de deux lamelles de verre collées ensemble par du ruban adhésif double face (Figure 3C). Une lamelle de couverture est recouverte d’un mélange de PEG et de polyéthylène glycol biotinylé (PEG) pour éviter la liaison non spécifique et permettre l’attache spécifique des molécules cibles via la liaison biotine-NeutrAvidine (Figure 3D). Ensuite, les solutions de matériaux pour les expériences de MT sont infusées séquentiellement dans une cellule d’écoulement à l’aide d’une pompe à seringue (Figure 3C,D).

1. Préparez deux lamelles de couvercle en verre, une pour la surface supérieure (24 mm × 50 mm, épaisseur no 1,5) et une pour la surface inférieure (24 mm × 60 mm, épaisseur no 1,5). Nettoyer les lamelles de couverture par sonication dans 1 M KOH pendant 30 min. Après la sonication, rincer les lamelles de couverture avec de l’eau distillée et conserver dans l’eau jusqu’à l’étape suivante.
2. PEGylate le capot inférieur suivant les protocoles publiés^42,43. Utiliser de la N-[3-(triméthoxysilyl)propyl]éthylènediamine pour la silanisation et un mélange 1:100 (pw) de biotine-PEG-SVA et de mPEG-SVA dans un tampon de bicarbonate de 100 mM. Gardez les lamelles de couverture PEGylated sèches à -20 °C et conservez-les pendant quelques semaines.
3. Le jour des expériences, sortez les lamelles de couverture PEGylated et séchez-les avec un pistolet à azote. Inspectez-les visuellement pour détecter la saleté pour vous assurer qu’ils sont propres.
4. Pour fabriquer les canaux d’échantillonnage, préparer des bandes de ruban adhésif double face de ~2 mm de large et déposer quatre bandes sur une lame de couverture inférieure (surface PEGylée vers le haut), parallèles et séparées les unes des autres par ~5 mm (Figure 3C).
   REMARQUE: De cette façon, trois canaux d’échantillonnage de 5 mm de large peuvent être créés dans une seule cellule d’écoulement.
5. Placez un couvercle supérieur au centre du couvercle inférieur, en laissant ~5 mm d’espace sur les bords courts pour les entrées et les sorties de canal. Appuyez doucement sur le dos de la housse supérieure avec une pince à épiler pour bien sceller les canaux.
6. Pour créer un réservoir d’entrée, coupez le bord d’une pointe de pipette de 200 μL. Découpez ~10 mm de l’ouverture plus large pour permettre de retenir ~200 μL de solution. Faites-en trois pour les trois canaux d’écoulement. Pour configurer les sorties, préparez trois aiguilles de seringue qui s’adaptent au tube de la pompe à seringue.
7. À l’aide d’époxy de 5 min, collez les réservoirs et les moyeux à aiguilles à la cellule d’écoulement. Assurez-vous qu’un joint complet est formé pour éviter les fuites et que les canaux ne sont pas bloqués par un excès de colle. Laissez sécher pendant au moins 30 min.

7. Assemblage de constructions d’attache de perles

NOTE: Les solutions de matériaux pour les expériences de TA, y compris celles pour les constructions d’attache de perles, sont introduites séquentiellement dans les cellules d’écoulement à l’aide d’une pompe à seringue (Figure 3C, D).

1. Préparez des billes magnétiques. Prélever 5 mg de billes époxy M270 dans une solution mère (~3,3 × 10⁸ billes dans 167,5 μL de diméthylformamide) et remplacer le solvant par un tampon phosphate (voir tableau 2) par séparation magnétique des billes.
2. Préparer les billes à ~1,1 × 10⁹ billes mL⁻¹ dans un tampon phosphate avec 1 M sulfate d’ammonium et les faire réagir avec 2 mM de dibenzocyclooctyne (DBCO)-_NH2. Incuber le mélange pendant 3 h sur un batteur rotatif à température ambiante. Après la réaction, laver les billes 3x avec un tampon phosphate frais pour éliminer les molécules qui n’ont pas réagi.
   REMARQUE: Les billes lavées peuvent être conservées sans rotation supplémentaire à 4 °C pendant plusieurs semaines avant utilisation.
3. Connectez une aiguille sur la sortie du canal de la cellule d’écoulement à la pompe à seringue avec un tube en polyéthylène. Équilibrez les canaux avec PBS.
4. Introduisez les solutions suivantes séquentiellement dans le canal en aspirant avec la pompe : NeutrAvidin, constructions cibles (épingles à cheveux ADN ou complexes SNARE avec poignées d’ADN), billes de polystyrène de référence et billes magnétiques revêtues de DBCO. Avant utilisation, vortex les solutions de billes à fond pour disperser les agrégats de billes potentiels.
5. Laver les billes non liées tout en appliquant une force de 0,1 pN.
   NOTE: L’application d’une petite force ascendante facilite l’élimination des perles non liées et aide à éviter la rupture des constructions d’attache de perles spécifiquement liées.
6. Pour les expériences avec des complexes SNARE, inclure 1,5 μM SNAP-25 dans le tampon final.
   REMARQUE: Les molécules libres de SNAP-25 peuvent se relier aux complexes SNARE après le déploiement et permettre des mesures répétées sur un seul complexe.

8. Identification des constructions cibles

1. À la surface d’un canal de cellule d’écoulement, recherchez les billes magnétiques qui sont attachées par des molécules uniques de la construction cible. Assurez-vous qu’une perle de référence est située à proximité.
2. Faites pivoter une perle candidate et vérifiez qu’elle pivote librement. Si le cordon est attaché par plusieurs molécules, il présente un mouvement contraint.
3. Faites pivoter le cordon pendant quelques tours complets et découvrez le rayon de rotation (cette fonction est implémentée dans le logiciel fourni). De préférence, choisissez un cordon avec un petit rayon de rotation.
   REMARQUE: Ce rayon indique dans quelle mesure le cordon est décentré de l’axe de l’attache, ce qui est déterminé aléatoirement lors de l’assemblage^{perle-attache 30,31}. Dans toutes les expériences, le décentrage minimal d’une perle atténue de nombreux artefacts associés au rapport rayon de perle / extension de l’attache élevé que nous utilisons.
4. Augmentez la force de 0 à 5 pN pour identifier les bonnes billes attachées à une seule épingle. Recherchez un changement important dans le diagramme de diffraction d’une perle résultant de l’étirement d’une attache de 1 kbp (ou des deux poignées équivalentes de 510 pb). Si le diagramme de diffraction ne change pas de manière significative, abaissez la force à zéro et recherchez un autre cordon candidat.
   REMARQUE: Le levage ~300 nm d’une perle peut être facilement remarqué à partir des images brutes sans réellement démarrer le processus de suivi.

9. Suivi des billes pour les mesures d’extension

REMARQUE : Le suivi des perles est effectué en analysant les images des perles en temps réel dans le logiciel LabVIEW fourni avec cet article. La méthode de suivi et ses variantes ont été utilisées dans la plupart des systèmes de TA conventionnels et sont expliquées dans la littérature précédente 2,5,7,26. En mesurant la position d’un cordon magnétique par rapport à un cordon de référence fixe (c.-à-d. suivi différentiel), les mesures de position deviennent extrêmement robustes à une perturbation externe.

1. Une fois qu’une perle magnétique appropriée est localisée avec une perle de référence, cliquez sur le bouton Calibrer pour commencer à préparer le suivi des perles.
2. Cliquez sur les perles dans l’image pour définir les emplacements des perles. Les images seront ensuite recadrées en régions d’intérêt (ROI) (par exemple, 150 x 150 pixels pour une perle de 3 μm) autour des perles, puis analysées pour extraire les coordonnées précises des perles.
3. Attendez la fin de la rotation de l’aimant. Ce processus enregistre les coordonnées x et y du cordon (en calculant la corrélation croisée 2D⁴⁴ ou en utilisant la symétrie radiale⁴⁵ des images de la perle, avec des performances comparables) tout en faisant tourner les aimants pour documenter la fixation décentrée de la perle³¹.
4. Pour le suivi dans la direction z, attendez que le logiciel génère une table de correspondance d’images de diffraction des billes à différentes distances du plan focal. Ceci est réalisé en déplaçant l’objectif avec un scanner piézoélectrique par pas équidistants et en enregistrant des images de perles moyennes de fluctuation à chaque position. Ensuite, les coordonnées z des perles dans les expériences réelles sont déterminées en comparant les images de perles en temps réel à la table de correspondance avec interpolation⁷.
5. Lorsque la génération de la table de correspondance est terminée, activez le suivi et la mise au point automatique (appuyez sur la touche Track ? et AF? Boutons) et cliquez sur le bouton Acquérir pour commencer à enregistrer les positions des perles.
   REMARQUE: La mise au point automatique est facultative mais recommandée pour corriger la dérive de l’étage en z lors de l’acquisition.

10. Régimes d’application forcée

1. Expériences de rampe de force: Pour vérifier la relation force-extension de la construction, appliquer une montée et une descente de la force à une vitesse de charge constante (± 1,0 pN s⁻¹) (figure 4A). Par exemple, appliquez trois cycles d’un cycle 0-20-0 pN pour vérifier la longueur totale de la construction et la courbe d’extension de force des poignées.
2. En spécifiant les paramètres d’attache dans le logiciel, superposez une courbe d’extension de force WLC sur les données mesurées et déterminez si la perle cible est attachée par une véritable construction d’échantillon avec des poignées d’ADN appropriées. Utilisez la longueur de contour connue (par exemple, ~340 nm pour 1 kbp dsDNA) et la longueur de persistance WLC (30-45 nm pour l’ADNds³¹ abrégé) de la construction comme point de départ. Appliquez la méthode de correction d’extension décrite à l’étape 2.11 si nécessaire.
3. Si la construction est vérifiée, examinez en détail la réponse d’extension de force pour rechercher une extension supplémentaire résultant des molécules-épingles à cheveux cibles ou des complexes SNARE.
4. Expériences à force constante : Faire varier progressivement la force appliquée par étapes discrètes pour sonder la sensibilité à la force des molécules cibles (Figure 4B).
   REMARQUE: Les MT permettent des expériences simples et efficaces à force constante, car la force appliquée est maintenue constante lorsque les aimants sont maintenus immobiles.
   1. Pour les épingles à cheveux à ADN, appliquez une force de 4 à 8 pN avec des pas de 0,2 à 0,5 pN et mesurez la position du cordon pendant ~10 s à chaque niveau de force.
   2. Pour les complexes SNARE, appliquez une force de 14 à 16 pN avec des pas de 0,1 à 0,2 pN et mesurez la position du cordon pendant ~10 s à chaque niveau de force.
5. Expériences de saut de force: Observez les événements de transition des complexes SNARE.
   REMARQUE: Les expériences de saut de force, comme les expériences de force constante, impliquent des changements dans les niveaux de force. Cependant, les sauts de force utilisent des changements plus brusques dans la force appliquée, ce qui permet de surveiller les événements déclenchés par la force dans les molécules sondées, tels qu’une rupture soudaine de complexes protéiques. Par exemple, étant donné que les complexes SNARE présentent une hystérésis structurelle dans le cycle de force²³, il est instructif d’effectuer des expériences de saut de force et de mesurer la latence de transition (Figure 4C).
   1. Décompression: Décollement d’une molécule VAMP2 d’un complexe SNARE ternaire intact, laissant un complexe binaire de syntaxine-1A et SNAP-25.
   2. Rezippation: Fermeture éclair de la molécule VAMP2 décompressée pour régénérer un complexe SNARE intact.
      1. Déroulement: Démontage complet d’un complexe SNARE accompagné d’une dissociation complète de SNAP-25. Seules les molécules VAMP2 et syntaxine restent dans la construction après le déploiement.
      2. Repliage : Régénération d’un complexe SNARE lors de la liaison d’une molécule SNAP-25 libre du tampon.
6. A 2 pN, induire l’assemblage d’un complexe SNARE intact en attendant (~30 s) l’association d’une molécule libre de SNAP25. Une diminution soudaine de l’extension est observée lors de la formation d’un complexe SNARE.
7. Pour observer les événements de décompression, attendez quelques secondes à 10-12 pN, puis passez brusquement à 14-15 pN avec la vitesse maximale possible. Selon la force cible, le complexe SNARE présentera soit une transition réversible entre des intermédiaires partiellement décompressés (comme dans les expériences à force constante), soit un saut de ~25 nm vers un état plus élevé, non compressé, après un temps d’attente aléatoire (ou latence).
8. Pour observer les événements de rezipping, abaissez la force à 10-12 pN immédiatement après l’observation du dézippage. Encore une fois, le complexe SNARE présente une transition stochastique vers l’état inférieur, zippé après une certaine latence aléatoire. Si le dépliage s’est produit après le dézippage, le complexe ne pourra pas se rezipper, car une molécule SNAP-25 sera manquante.
9. Pour observer les événements qui se déroulent, attendez une période plus longue après l’observation de la décompression pour détecter une nouvelle augmentation de l’extension (~ 2 nm).

11. Analyse des données

REMARQUE: Les types d’analyse que l’on peut effectuer avec des données de TA dépendent du système cible. Cependant, il existe des approches communes pour extraire des informations utiles des expériences respectives décrites à la figure 4. Toutes les analyses sont effectuées avec MATLAB (R2021a) à l’aide des codes personnalisés fournis avec cet article. Ces codes génèrent des graphiques en utilisant les mêmes données présentées dans cet article. Il est à noter que même si les données brutes du suivi de 100 Hz ont été directement prises pour analyse, les données du suivi de 1,2 kHz ont généralement été filtrées par médiane (avec une fenêtre coulissante à cinq points) avant l’analyse pour réduire le bruit (sauf pour l’analyse du bruit).

1. Expériences de rampe de force: Analyser la relation force-extension (p. ex., élasticité des polymères) et transférer la force pour extraire de l’information sur les propriétés nanomécaniques.
2. Expériences à force constante : Analyser les populations d’état et le temps de séjour (ou taux de transition) en fonction de la force pour extraire les paramètres structurels (p. ex., régions impliquées dans la transition), thermodynamiques (p. ex., différence d’énergie libre) et cinétiques (p. ex., barrière énergétique) des changements conformationnels.
3. Expériences de saut de force: Analyser la cinétique de rupture (p. ex., interactions protéine-protéine et liaison récepteur-ligand) ou la durée de vie des intermédiaires transitoires (p. ex., déploiement de biomolécules) pour extraire la stabilité des molécules cibles et leurs états.
4. En tant qu’applications représentatives, analysez les données d’échantillon pour les épingles à cheveux ADN et les complexes SNARE :
   1. Transitions à deux états d’une épingle à cheveux d’ADN: force de décompression, distance d’ouverture, dépendance à la force du déplacement de population et mesures d’assignation d’état et de taux de transition avec un modèle de Markov caché (HMM) (codes MATLAB fournis).
   2. Changements conformationnels des complexes SNARE: force de décompression, dépendance de la force des états intermédiaires et latence de décompression, hystérésis dans la refermeture et comportement de déploiement / repliement.
      NOTE: Les modèles d’extension de force pour les poignées d’ADN, les épingles à cheveux ADN et les conformations complexes SNARE sont donnés dans les références précédentes^14,31.

Representative Results

Calibrage de la force
Les résultats des deux méthodes de mesure de la force (variance de déplacement latéral des billes et analyse du spectre de puissance) différaient de 0 à 2 pN (figure 2G). Selon les résultats de la figure 2F, nous pouvons atteindre de manière fiable jusqu’à 30 pN avec des aimants en néodyme réguliers.

Transitions à deux états d’une épingle à cheveux ADN de 8 pb
Nous avons d’abord étudié la nanomécanique d’une épingle à cheveux à ADN courte (Figure 5). Les épingles à cheveux à ADN ont été largement caractérisées par spectroscopie de force conventionnelle à molécule unique, et donc une vaste source de références à comparer est disponible. Le dézippage d’une épingle à cheveux courte est généralement réversible, de sorte que ses événements de refermeture sont également observés dans la même plage de force que celle dans laquelle le dézippage se produit (Figure 5A). En appliquant une rampe de force comprise entre 0 pN et 20 pN (figure 5B), l’extension induite par la force de la construction en épingle à cheveux a été vérifiée pour suivre un modèle WLC, qui peut être attribué uniquement à l’élasticité des poignées d’ADN (figure 5C, « fermé »). À environ 6 pN, la construction présentait des fluctuations supplémentaires d’extension, associées à un dézippage réversible de la structure en épingle à cheveux (figure 5C, encadré). Finalement, à ~8 pN, la transition a finalement disparu et l’extension s’est installée sur l’état supérieur qui a été encore étendu de ~7 nm. Par conséquent, le profil d’extension de force mesuré au-dessus de 8 pN s’est accroché à une nouvelle courbe du modèle (figure 5C, « ouverte ») qui comprend la longueur de la région simple brin de l’épingle à cheveux non zippée.

Nous avons ensuite effectué des expériences à force constante pour examiner systématiquement la transition en épingle à cheveux. La position du cordon a été mesurée dans la plage de force de 4-8 pN avec des pas de 0,5 pN pendant ~10 s à chaque niveau; Ensuite, les valeurs d’extension ont été collectées et analysées pour mesurer leur distribution d’équilibre en fonction de la force. Les résultats du suivi à 100 Hz suggèrent un changement graduel vers un état plus étendu dans ce régime de force (Figure 5D), mais les histogrammes obtenus de l’extension n’étaient pas assez clairs pour résoudre des populations distinctes (Figure 5E). En revanche, lorsque les mêmes expériences ont été menées à 1,2 kHz (Figure 5F), les trajectoires à grande vitesse des changements d’extension après filtrage doux (filtre médian à cinq points) ont révélé deux populations distinctes qui sont bien décrites par un mélange de deux distributions gaussiennes (Figure 5G). La séparation entre les deux populations, indiquant la distance d’ouverture de l’épingle à cheveux, est restée inchangée à ~7 nm dans le régime de force de décompression (Figure 5H). La déviation des extrémités (4 pN et 8 pN) était due à la localisation inexacte d’un État en raison de sa rareté.

Les données ont révélé que la force moyenne de décompression de la transition (la force à laquelle les populations fermées et ouvertes deviennent égales) F_1/2 était de ~6 pN, et l’état supérieur ouvert est devenu progressivement dominant à mesure que nous augmentions la force sur 4-8 pN (Figure 5I). Lorsqu’on a ajusté une relation de Boltzmann pour la probabilité ouverte, les valeurs exactes de F 1_/2 = 5,9 pN et Δz = 7,1 nm ont été obtenues, cohérentes avec les observations ci-dessus. Il convient toutefois de noter que la force d’ouverture obtenue à partir d’une seule construction peut ne pas être exacte en raison de la variabilité de la génération de force d’une perle à l’autre, qui a été mesurée à ~4 % pour les perles commerciales^{M270 31}. De plus, comme la longueur de la tige (8 pb) est courte, la force d’ouverture de la vérité au sol d’autres épingles à cheveux de 8 pb avec une composition nucléotidique différente peut varier beaucoup²⁰. Enfin, nous avons appliqué le HMM aux traces d’extension pour cartographier la transition d’état et ainsi mesurer les taux de transition (Figure 5F, trace rouge). Les taux de décompression et de refermeture variaient exponentiellement avec la force appliquée (figure 5J), de telle sorte que la force favorise le dézippage et inhibe la réfermeture. Si nécessaire, on peut utiliser l’expression classique de Bell pour extraire les paramètres du paysage énergétique (par exemple, la hauteur et la distance de la barrière)⁴⁶.

Caractérisation de la fluctuation thermique dans les mesures d’extension
À l’aide de la construction en épingle à cheveux, nous avons profilé le bruit dépendant de la force dans les mesures d’extension. Tout d’abord, les fluctuations thermiques d’une bille attachée ont été calculées à partir d’équations utilisant les paramètres (par exemple, rayon du cordon, longueur de l’attache) appropriés pour ces expériences^2,5 (Figure 5K^, courbes solides). Nous avons également tracé l’écart type d’extension mesuré à partir de la trace temporelle d’une construction en épingle à cheveux à des niveaux de force distincts. Comme cette molécule avait un motif d’épingle à cheveux, sa réponse sous 4 pN (état fermé) a été utilisée pour la mesure du bruit intrinsèque, tandis que la dynamique de l’épingle à cheveux a été détectée ~ 6 pN, comme prévu, et a servi de vérification. La suppression de la fluctuation dépendante de la force a également été observée après que l’épingle à cheveux soit devenue presque ouverte (comparer 8 pN vs 4 pN). La comparaison avec la limite thermique indique qu’il y a place à amélioration, mais ce bruit restant est souvent associé à la fluctuation de rotation d’une bille magnétique³⁰, qui est aléatoire et difficile à résoudre. Pour une analyse plus systématique du bruit brownien à travers le temps d’observation, le calcul de la déviation d’Allan est fréquemment utilisé^32,33. Nous avons calculé la variance d’Allan pour les données en épingle à cheveux présentées à la figure 5F, de la même manière que les mesures de 5 kbp de la figure 2C. Les résultats de la figure 5L montrent que, dans la gamme de force intermédiaire de 4-8 pN, nous avons obtenu 2-3 nm de déviation d’Allan à la vitesse maximale (1,2 kHz), et cette valeur est tombée à moins de 1 nm pour le temps d’observation (τ) supérieur à 0,1 s. Il est intéressant de noter que la dynamique en épingle à cheveux a émergé autour de 5-7 pN pendant ~ 0,01 s (Figure 5L, encadré), ce qui correspond à la force de transition mesurée et aux taux mesurés dans la Figure 5I,J.

Changements conformationnels des complexes SNARE neuronaux
Nous avons ensuite utilisé les complexes SNARE neuronaux comme modèle protéique et examiné leurs propriétés mécaniques dépendantes de la force. Contrairement à la construction en épingle à cheveux, des complexes SNARE uniques ont été maintenus entre deux poignées d’ADNds de 510 pb (Figure 6A). Il convient de noter que les terminus de la syntaxine-1A et de VAMP2, distaux des poignées, étaient réticulés par une liaison disulfure entre des résidus artificiels de cystéine pour éviter la rupture et permettre plusieurs tours de pince à épiler d’une construction donnée.

Nous avons d’abord appliqué une rampe de force, à la fois avec des niveaux de force croissants et décroissants (± 1 pN ^s-1) pour étirer et détendre la construction cible, respectivement. Dans le régime de force faible à moyenne (0-10 pN), les deux poignées se sont comportées indépendamment comme des polymères WLC, façonnant globalement la courbe d’extension de force indiscernable de celle de l’ADNds de 1 kbp (Figure 6B, noir). Cependant, lorsque la force a été augmentée au-dessus de 10 pN, les valeurs d’extension se sont sensiblement écartées du modèle WLC, indiquant que le complexe SNARE intégré présentait une augmentation supplémentaire de l’extension. Plus précisément, l’augmentation de l’extension peut être résumée en trois étapes distinctes: (a) une légère augmentation progressive de 11-13 pN, (b) des fluctuations rapides et plus importantes (~10 nm) de 14-16 pN, et (c) le dézippage final irréversible d’environ ~20 nm. De plus, lorsque la force a été abaissée pour détendre la construction, l’extension est revenue à la courbe d’extension de force d’origine à une force inférieure (<15 pN) ou a suivi une nouvelle courbe de modèle avec une extension plus grande (Figure 6B, bleu). L’extension totale a finalement été rétablie aux valeurs inférieures (du bleu au noir dans la figure 6B) inférieures à 5 pN et les mêmes cycles de rampe de force ont pu être appliqués, ce qui a montré une tendance similaire.

A partir du modèle moléculaire de conformation du complexe SNARE, on peut calculer avec précision les valeurs d’extension possibles des intermédiaires potentiels (Figure 6C). De plus, en supposant le comportement WLC pour les polypeptides non enroulés, les extensions peuvent être estimées en fonction de la force, générant ainsi les modèles d’extension de force complète pour les différentes conformations (Figure 6B, lignes pointillées). En prenant ces valeurs comme référence, nous avons interprété les transitions ci-dessus comme suit 14,23: (a) un passage progressif de l’état complètement zippé (FZ) à l’état d’ouverture de l’éditeur de liens (LO) en 11-13 pN^, impliquant l’ouverture des régions de liaison de syntaxine-1A et VAMP2; b) transition rapide entre LO et l’état semi-zippé (HZ), impliquant l’ouverture d’un complexe SNARE jusqu’à la couche ionique zéro; et (c) la transition finale vers l’état décompressé (UZ) ou l’état déplié (UF), ce qui implique un démêlage complet de VAMP2 du reste du complexe. L’état UZ est différent de UF en ce que la molécule associée de SNAP-25 est toujours liée à la syntaxine-1A, maintenant un complexe binaire. Dans le cas de l’UF (sans SNAP-25), le complexe SNARE complet ne peut être régénéré qu’après qu’une molécule SNAP-25 libre de la solution se recombine, ce qui réduit la force appliquée pour permettre une telle reliaison.

Pour vérifier les changements conformationnels des complexes SNARE de manière plus systématique, nous avons ensuite effectué des expériences de saut de force dans le régime de force, où des fluctuations conformationnelles ont été fréquemment observées à 14-15 pN (Figure 6D). En règle générale, nous avons d’abord commencé par mesurer la position du cordon à 10 pN et vérifié l’extension stable, indiquant l’absence de changements liés à SNARE. Ensuite, le niveau de force a été brusquement augmenté à 14-15 pN, à laquelle l’extension a été surveillée jusqu’à ce que le dézippage se produise, le cas échéant. Enfin, la force a été réduite à 10 pN pour vérifier toute augmentation persistante de l’extension associée au déploiement. À 14 pN, les traces d’extension sont principalement restées dans l’état LO, avec des pics occasionnels à l’état HZ. Il convient de noter que ces brèves excursions à l’état HZ sont susceptibles d’être manquées dans le suivi 100 Hz, qui fait la moyenne et sous-échantillonne les images de perles d’un facteur 12. Malgré les visites claires et fréquentes à l’état HZ, le complexe n’a pas réussi à faire une transition complète vers l’état UZ (Figure 6E), ce qui suggère que la force externe n’était pas assez forte pour surmonter la barrière énergétique du décompression. En revanche, même une légère augmentation de la force (à 14,3 pN) a rendu la transition très efficace, de sorte que l’état UZ a été atteint principalement en quelques secondes (Figure 6F). De manière constante, le décompression était terminé principalement en 1 s lorsque nous avons appliqué 14,5 pN au complexe (Figure 6G,H). Notamment, le décompression à des forces plus élevées a souvent conduit au déploiement complet de l’ensemble du complexe (accompagné de la suppression de SNAP-25), comme en témoigne la légère augmentation supplémentaire de l’extension au-dessus de UZ (Figure 6H) et par la signature de repliement observée à 2 pN (Figure 6I). Dans l’ensemble, ces données montrent le comportement classique de glissement⁴⁷ pour le déploiement des complexes SNARE, ce qui correspond aux rapports précédents 14,23,48.

Figure 1 : Configuration de l’instrument. Schéma (A) et photographie (B) d’une installation de traduction automatique à grande vitesse. Les aimants contrôlés par un moteur linéaire et un moteur rotatif sont situés au-dessus de l’étage d’échantillonnage d’un microscope inversé équipé d’une lentille à immersion dans l’huile 100x et d’une caméra CMOS haute vitesse. Le faisceau lumineux d’une diode superluminescente traverse les aimants et illumine le champ. Encart : images représentatives de diffraction de perles situées à différentes distances du plan focal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Calibrage de la force. (A) Schéma d’un échantillon d’étalonnage de force. Les amplitudes de la force exercée par une paire antiparallèle d’aimants à 1 mm de séparation sont mesurées en fonction de la distance magnétique d par rapport aux déplacements d’une bille magnétique (M270) attachée par un fragment d’ADNds de 5 kbp. B) Données représentatives de la procédure d’étalonnage des forces. Les flèches colorées indiquent les régions développées en (D) (couleurs correspondantes). (C) Déviation d’Allan pour la position z d’une bille captive de 5 kbp mesurée avec 15-20 pN. Les courbes des coordonnées z du cordon magnétique avant (bleu) et après (rouge) soustrayant la position du cordon de référence sont représentées. (D) Série chronologique représentative de la position y mesurée à la distance d’aimant indiquée d. L’histogramme correspondant de la distribution des coordonnées y est représenté à droite avec un ajustement gaussien (rouge). E) Représentatif de la Division du secteur privé d’après les données indiquées à l’alinéa D). Les valeurs de force obtenues en ajustant un modèle (rouge) aux DSP respectifs sont indiquées en haut. (F) Étalonnage de la force magnétique en fonction de la distance magnétique. Les forces ont été mesurées soit à partir de la variance (à gauche), soit à partir de la méthode PSD (à droite). L’ajustement (rouge) indique un modèle à double exponentielle avec l’équation annotée. G) Différence entre la force mesurée obtenue à partir de la variance et du PSD. Une courbe rouge est calculée pour les ajustements indiqués en (F). (H,I) Vérification de la relation force-extension de la construction d’étalonnage de 5 kbp. Les valeurs moyennes d’extension à des niveaux de force distincts (mesurées à partir de la variance) ont été utilisées soit directement (H), soit après correction du décalage de hauteur du cordon (I) dû à l’inclinaison d’une bille décentrée³¹. Les données d’extension de force pour n = 5 molécules ont été ajustées par un modèle WLC extensible et les paramètres ajustés (longueur de persistance L_p et module d’étirement K _o) sont annotés sur le dessus (moyenne ± s.d.). Abréviation : PSD = densité spectrale de puissance. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Préparation de l’échantillon. (A) Préparation de constructions en épingle à cheveux d’ADN de 8 pb par amplification par PCR d’une région de 1 kbp d’ADN λ. (B) Préparation de constructions complexes SNARE avec deux poignées d’ADN de 510 pb. Encart : Vérification des poignées d’ADN et de leur fixation aux protéines par électrophorèse sur gel d’agarose (gel à 2 %). Les flèches indiquent le déplacement de la mobilité (code couleur) des espèces de produits: poignées libres de 510 pb (magenta); Poignée B attachée à la syntaxine (rouge), au complexe ΔN (vert) et au complexe SNARE (bleu); et le dernier complexe SNARE à deux poignées (vert). L’ajout de SDS perturbe les complexes ΔN (présents en b) mais pas les complexes SNARE complets formés par le VAMP2 pleine longueur (présent en c). (C) Conception et photographie d’une cellule d’écoulement pour les expériences de magnétoscopie. D) Schéma de l’introduction séquentielle de solutions d’échantillon dans un canal de cellule d’écoulement. Abréviation : MT = pince magnétique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Types d’expériences représentatives. (A-C) Schémas des expériences de rampe de force, de pince de force et de saut de force (en haut) avec des traces temporelles représentatives d’extension à partir des mesures correspondantes (au milieu). Les types d’analyse qui peuvent être effectués sont indiqués en bas. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Transition à deux états d’une épingle à cheveux à ADN de 8 pb. (A) Schéma des expériences de TA sur une épingle à cheveux ADN avec la transition attendue de décompression et de refermeture. (B) Trace représentative de l’extension de la construction à partir d’expériences de rampe de force avec des niveaux de force croissants (~0,25 pN s⁻¹). (C) Courbe représentative d’extension de force reconstruite à partir des données de (B). Les courbes jaunes indiquent les modèles WLC pour la construction en épingle à cheveux avec l’épingle à cheveux dans la conformation fermée (pleine) et ouverte (pointillée). (D) Trace d’extension représentative à partir d’expériences à force constante avec des niveaux de force croissants, mesurée à 100 Hz. (E) Histogrammes des données d’extension en (D). (F,G) Résultats pour les mêmes expériences en (D) et (E) mais avec un suivi de 1,2 kHz. La série chronologique brute de 1,2 kHz a été lissée en appliquant un filtre médian à cinq points. Des traces rouges dans la vue élargie de (F) ont été obtenues à partir d’un HMM. Les lignes rouges en (G) indiquent les emplacements des populations gaussiennes. (H) Distance entre les deux populations en (G). (I) Probabilité à l’état ouvert en fonction de la force appliquée. La courbe rouge est un modèle de Boltzmann ( ) avec la force moyenne F_1/2 = 5,9 pN. (J) Taux de transition de décompression et de refermeture à la fermeture mesurés à partir des résultats du HMM. Les lignes pleines indiquent une dépendance exponentielle à la force. K) Fluctuation thermique des mesures d’extension. Les écarts-types des données d’extension en épingle à cheveux (sans filtrage) sont indiqués en fonction de la force. La limite de résolution thermique qui représente l’amplitude théorique des fluctuations thermiques a été estimée à partir de l’équation 9 dans les travaux de Choi et al.2 pour une bille de ^2,8 μm avec une attache de 1 kbp. (L) Écarts Allan calculés à partir des données en épingle à cheveux de 1,2 kHz en (F) (sans filtrage). L’encart montre la déviation d’Allan à 0,01 s en fonction de la force, ce qui démontre une augmentation et une diminution progressives de la fluctuation due à la dynamique de l’épingle à cheveux. Abréviation : MT = pince magnétique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Modifications conformationnelles des complexes SNARE neuronaux. (A) Schéma des expériences de MT sur les complexes SNARE. (B) Courbes représentatives d’extension de force pour la construction SNARE. Des traces noires et bleues (100 Hz) ont été obtenues à partir de périodes d’étirement et de relaxation dans des expériences de rampe de force, respectivement. Les lignes pointillées indiquent des modèles d’extension, tenant compte des différentes conformations des complexes SNARE montrées en (C). (C) Modèles moléculaires des conformations complexes SNARE avec les extensions calculées correspondantes. Les valeurs ont été estimées à partir des paramètres géométriques des faisceaux hélicoïdaux et d’un modèle WLC pour la région polypeptidique¹⁴. (D) Schéma des expériences de saut de force pour étudier les conformations complexes SNARE. (E-H) Des traces d’extension représentatives provenant d’expériences de saut de force effectuées aux niveaux de force indiqués. En (E), le dézippage n’a pas été observé. En (F) et (G), un dézippage a été observé suivi d’un rezippage à 10 pN. En (H), le dézippage a été suivi d’un autre événement. (I) Repliement d’un complexe SNARE à 2 pN. Une nette réduction de l’extension de l’état UF à l’état FZ a été observée à 5 pN. Abréviation : MT = pince magnétique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Réglage PCR	Condition
Matériaux	1,25 μg/mL d’ADN λ (matrice), amorces directes et inverses de 1 μM, 0,2 mM de dNTP, 0,05 U/μL de nTaq, 1x tampon nTaq
Dénaturation	95 °C pendant 30 s
Recuit	Construction d’étalonnage: 55 °C pendant 30 s
	Épingle à cheveux ADN : 57 °C pendant 30 s
	Poignées ADN : 50 °C pendant 30 s
Extension	Épingle à cheveux ADN et poignées : 72 °C pendant 1 min
	Construction d’étalonnage : 72 °C pendant 5 min
Cycle	30–34
Électrophorèse sur gel d’agarose
Gel	2% d’agarose dans 0,5x tris-borate-EDTA (TBE, pH 8,3) contenant 1x SYBR Safe
Course	Pleine puissance (108 V en moyenne) sur Mupid-2plus (Advance), 40-50 min

Tableau 1 : Conditions pour les réactions de PCR et l’électrophorèse sur gel d’agarose. Paramètres de réaction pour la PCR des constructions d’ADN, y compris l’ADNds de 5 kbp pour l’étalonnage de la force, la construction en épingle à cheveux de l’ADN et les poignées d’ADN pour la fixation des SNARE. Les séquences d’amorces sont données dans le tableau des matériaux.

Tampon de purification des protéines	Composition
Tampon de lavage A	50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM de NaCl, 7 mM de β-mercaptoéthanol (BME), 10 % de glycérol et 20 mM d’imidazole
Tampon de lavage B	50 mM HEPES (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10% glycérol et 20 mM imidazole
Tampon de lyse	Tampon de lavage A complété par 1 % de Triton X-100, 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et 1x cocktail d’inhibiteurs de protéase
Tampon d’élution	Wash Buffer B complété par 400 mM d’imidazole
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	81 mM phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4), phosphate de sodium monobasique 19 mM (NaH2PO4) (pH 7,2), NaCl 150 mM
Tampon phosphate	81 mM Na 2 HPO 4, 19 mM NaH2PO 4, pH7,4

Tableau 2 : Tampons et leur composition. Composition des tampons utilisés pour la purification des protéines.

Figure supplémentaire S1 : Dessin d’un support magnétique. Les dimensions d’un support en acrylique pour deux aimants de 10 mm x 10 mm x 12 mm avec un espace de 1 mm sont indiquées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : fichier compressé contenant des codes MATLAB. Scripts MATLAB pour l’analyse des données produites par les expériences de pince magnétique à grande vitesse, y compris l’étalonnage de force, l’épingle à cheveux et l’analyse complexe SNARE. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : fichier compressé du progiciel LabVIEW. Un ensemble complet de codes LabVIEW pour faire fonctionner une pince magnétique haute vitesse et acquérir des données avec elle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Dans ce travail, nous avons introduit une configuration de spectroscopie de force à molécule unique qui peut observer les changements structurels des biomolécules avec une grande précision spatio-temporelle. La caméra CMOS haute vitesse utilisée acquiert 1 200 images s⁻¹ à une résolution de 1 280 x 1 024, permettant un suivi des billes de 1,2 kHz. Cependant, la vitesse des mesures est actuellement limitée par le logiciel de suivi des perles, de sorte que le retour sur investissement est généralement réduit à des zones plus petites dans les mesures à grande vitesse. La puissance élevée du SLD fournit un éclairage lumineux qui est essentiel pour l’imagerie rapide des billes jusqu’à une bande passante de quelques kHz. De plus, la cohérence spatiale du faisceau génère des anneaux de diffraction concentrique à contraste élevé autour des billes (Figure 1A, encadré), qui permettent une détermination précise de la position du cordon basée sur la symétrie.

La force magnétique exercée sur une construction de corde-attache peut être déterminée en mesurant les fluctuations browniennes de la perle attachée^35,37,38. Étant donné que l’analyse de la force en temps réel nécessite beaucoup de calcul, la force appliquée est généralement mesurée au préalable à l’aide d’une construction de référence. Par exemple, les billes magnétiques à utiliser sont attachées par de longs fragments d’ADNds (>5 kbp), et les fluctuations thermiques correspondantes de la position des billes sont mesurées en fonction de la distance de l’aimant (Figure 2A). L’étalonnage de la force est généralement effectué une fois après la construction de l’installation, mais il n’est pas nécessaire de le répéter régulièrement, sauf si la configuration est modifiée, par exemple, en remplaçant les aimants. Étant donné que la fréquence caractéristique de fluctuation du cordon augmente avec la force appliquée², une configuration à grande vitesse est particulièrement utile pour capturer la dynamique rapide dans un régime de force élevée et mesurer la force avec précision. L’estimation de la force à partir de la variance est beaucoup plus simple dans sa mise en œuvre que l’analyse spectrale dans le domaine fréquentiel, mais elle est sensible aux artefacts de la dérive, de l’acquisition par caméra et des changements d’extension dus à la fixation décentrée du cordon^31,37,38. Pourtant, les résultats des deux méthodes ne diffèrent que de 0 à 2 pN s’ils sont correctement obtenus (Figure 2G); Ainsi, la méthode de variance est suffisamment fiable lorsque la détermination absolue de la force n’est pas critique.

Pour des forces plus élevées supérieures à 30 pN et à environ 65 pN (auxquelles l’étirement excessif de l’ADNds sert de référence), soit des aimants de haute qualité disponibles dans le commerce (N50-N52) doivent être installés, soit l’écart entre les aimants doit être réduit, soit le champ magnétique doit être davantage conçu^28,49. Dans cette configuration, la vitesse la plus rapide du moteur vertical est de 30 mm/s, ce qui permet un saut de force de 0 pN à 20 pN en ~0,6 s. Certains changements structurels rapides en fonction de la force peuvent être manqués si le mouvement du moteur limite le taux de charge de force. Selon l’application, des modifications et une optimisation supplémentaire de la façon dont les aimants sont déplacés peuvent être nécessaires. Un exemple concerne l’utilisation créative d’une tête de bande magnétique¹⁵.

Pour les mesures à haute résolution avec des MT, il est important d’évaluer le niveau de bruit provenant de diverses sources. Une fois que les composants optiques (un microscope avec une lentille à fort grossissement, une source de lumière vive et une caméra rapide) sont correctement configurés, une précision subnanométrique dans le suivi des billes peut être atteinte. Ensuite, la principale source de bruit devient le mouvement brownien d’une perle, qui est utilisé pour mesurer la force appliquée. La fluctuation thermique d’une perle attachée dépend de son rayon, de la longueur de l’attache et de la force appliquée. Bien que la fluctuation intrinsèque de la direction z (c’est-à-dire les changements d’extension) dépende uniquement de l’énergie thermique et de la rigidité de l’attache, la dynamique de l’attache de perles et le taux d’acquisition par caméra filtrent le mouvement de la bille et donc la surveillance des biomolécules cibles à son tour. Par conséquent, la taille du cordon et le taux d’échantillonnage doivent être choisis stratégiquement pour obtenir une bonne résolution spatio-temporelle. Comme alternative aux billes de 2,8 μm que nous avons utilisées, les billes plus petites de 1 μm sont également populaires et peuvent être avantageuses pour des mesures rapides en raison de leur réponse rapide. Cependant, une faiblesse critique est le faible contenu magnétique, qui limite la force maximale qui peut être générée ( ). Étant donné que les billes plus petites peuvent encore exercer une force au moins jusqu’à 10 pN, elles peuvent convenir à l’étude des phénomènes de force faible, tels que le surenroulement de l’ADN. En revanche, les études sur les moteurs moléculaires, le repliement des protéines (par exemple, SNAREs, illustré ici) ou la mécanique cellulaire⁵⁰ nécessitent l’application de forces plus élevées, auquel cas on peut envisager de modifier la configuration de l’aimant (par exemple, réduire l’écart ou la distance) pour étendre la plage de force applicable ^28,51.

Parce que la technique sonde les réponses nanomécaniques des molécules cibles tout en appliquant une force à l’échelle biophysiquement pertinente, elle est idéale pour étudier les éléments sensibles à la force qui jouent un rôle central dans les processus mécanobiologiques. Pour illustrer la large applicabilité du test MT de haute précision, nous avons utilisé à la fois un acide nucléique et un modèle protéique qui présentent des changements conformationnels dynamiques et rapides lors de l’application d’une force à l’échelle du piconewton. L’une des limites de la technique est l’exigence d’acides nucléiques et de protéines purifiés, ce qui a particulièrement découragé sa large extension à une large gamme de protéines. Les progrès des technologies in vitro d’expression et de conjugaison des protéines continueront de donner accès à des protéines moins étudiées. Un problème connexe est que la connaissance a priori de la structure cible est souvent essentielle à la conception d’expériences (par exemple, la fixation de poignées). Nous nous attendons à ce que l’avènement de la cryo-EM 52 et de l’AlphaFold2⁵³ à particule unique soutienne fortement la conception et l’analyse de mesures mécaniques sur des molécules de protéines uniques et libère des applications plus puissantes de la traduction automatique à haute résolution.

La force de décompression des épingles à cheveux à ADN dépend de nombreux facteurs, y compris la séquence, la structure et la composition tampon, mais surtout de la longueur de la tige et de la teneur en guanine-cytosine (GC)²⁰. Pour démontrer la puissance du suivi à grande vitesse, nous avons intentionnellement conçu une tige de 8 pb (avec trois paires de bases GC) qui devait se déployer à une faible force avec une dynamique rapide. En effet, les résultats de la figure 5 montrent qu’une dynamique aussi rapide aurait été difficile à résoudre avec des techniques standard avec une résolution de 10 ms ou moins. Cet aspect est encore confirmé par les taux de transition mesurés à partir de l’analyse HMM, dont les taux élevés variaient entre 100 et 200 s⁻¹ (figure 5J).

On pense que les SNARE neuronales entraînent l’exocytose des vésicules synaptiques. En particulier, les protéines SNARE catalysent la fusion membranaire en abaissant la barrière énergétique associée, telle que la répulsion électrostatique entre les vésicules et les membranes plasmiques. En conséquence, les fluctuations conformationnelles des complexes SNARE se produisent dans une plage de force étroite de 12-15 pN, ce qui correspond au niveau attendu des forces répulsives ^14,23. En utilisant les MT à grande vitesse décrites ici, nous avons récapitulé les principales conclusions sur le comportement dépendant de la force des complexes SNARE neuronaux. L’hystérésis de force lors du dézippage et de la refermeture (Figure 6B) indique que la refermeture à glissière se produit à une force inférieure à celle du dézippage et que, par conséquent, le travail est effectué au cours de ce cycle. De telles transitions hors équilibre sont mieux abordées par des expériences de saut de force, dans lesquelles la latence de transition sous charge (similaire à un événement de rupture de liaison) ou les fluctuations conformationnelles avant le décompression peut être mesurée. Les deux cas bénéficient de configurations à grande vitesse, comme l’illustrent des études récentes sur les états transitoires des biomolécules et de leurs complexes 15,17,54,55,56.

Collectivement, ces résultats concordent avec les changements caractéristiques dépendants de la force des épingles à cheveux de l’ADN et des complexes SNARE neuronaux rapportés par spectroscopie de force conventionnelle à molécule unique. Simultanément, ils soulignent l’utilité des mesures mécaniques de haute précision pour révéler la sensibilité à la force des biomolécules et de leurs assemblages. Nous espérons que cet article pourra attirer plus de personnes du domaine de la mécanobiologie, motivant les chercheurs à utiliser des MT à grande vitesse pour étudier leurs systèmes d’intérêt uniques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials for construct synthesis
Agarose gel electrophoresis system	Advance	Mupid-2plus
DNA ladder	Bioneer	D-1037
nTaq polymerase	Enzynomics	P050A
PCR purification kit	LaboPass	CMR0112
PEGylated SMCC crosslinker / SM(PEG)2	ThermoFisher Scientific	22102	For SNARE–DNA coupling
Primer B	Bioneer	5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3'	For 5-kbp force calibration construct and DNA handles
Primer B_hp	IDT	5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'	For hairpin construct
Primer N	Bioneer	5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3'	For DNA handles
Primer Z	Bioneer	5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3'	For DNA handles
Primer Z_5k	Bioneer	5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA TCG-3'	For 5-kbp force calibration construct
Primer Z_hp	Bioneer	5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3'	For hairpin construct
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher Scientific	S33102
λ-DNA	Bioneer	D-2510	Template strand for PCR
DNA sequences for SNARE proteins
6×His-tagged SNAP-25b (2-206; capitalized) in pET28a	homemade	tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt cacctgaatcaggatattcttctaatacctg gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct gtaacatcattggcaacgctacctttgccat gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc catataaatcagcatccatgttggaatttaa tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga atatggctcataacaccccttgtattactgt ttatgtaagcagacagttttattgttcatga ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa gagctaccaactctttttccgaaggtaactg gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg ttggactcaagacgatagttaccggataagg cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg cacacagcccagcttggagcgaacgacctac accgaactgagatacctacagcgtgagctat gagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt acggttcctggccttttgctggccttttgct cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcgg aagagcgcctgatgcggtattttctccttac gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc cgcatagttaagccagtatacactccgctat cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg acacccgccaacacccgctgacgcgccctga cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa agcgggccatgttaagggcggttttttcctg tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga tttctgttcatgggggtaatgataccgatga aacgagagaggatgctcacgatacgggttac tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt gttccacagggtagccagcagcatcctgcga tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc gtattgggcgccagggtggtttttcttttca ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt caccgcctggccctgagagagttgcagcaag cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga atttgattgcgagtgagatatttatgccagc cagccagacgcagacgcgccgagacagaa cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat actgttgatgggtgtctggtcagagacatca agaaataacgccggaacattagtgcaggcag cttccacagcaatggcatcctggtcatccag cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga caccaccacgctggcacccagttgatcggcg cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca gctccgccatcgccgcttccactttttcccg cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc accacgcgggaaacggtctgataagagacac cggcatactctgcgacatcgtataacgttac tggtttcacattcaccaccctgaattgactc tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga ctcactataggggaattgtgagcggataaca attcccctctagaaataattttgtttaactt taagaaggagatataccATGGGCAGC AGCCATCATCATCATCATCACA GCAGCGGCCTGGTGCCGCGC GGCAGCCATACTAGCGGAGAT ATCGCCGAGGACGCAGACAT GCGCAATGAGCTGGAGGAGA TGCAGAGGAGGGCTGACCAG CTGGCTGATGAGTCCCTGGA AAGCACCCGTCGCATGCTGC AGCTGGTTGAAGAGAGTAAA GATGCTGGCATCAGGACTTT GGTTATGTTGGATGAGCAAG GCGAACAACTGGAACGCATT GAGGAAGGGATGGACCAAAT CAATAAGGACATGAAAGAAG CAGAAAAGAATTTGACGGAC CTAGGAAAATTCGCCGGCCT TGCCGTGGCCCCCGCCAAC AAGCTTAAATCCAGTGATGC TTACAAAAAAGCCTGGGGC AATAATCAGGATGGAGTAGT GGCCAGCCAGCCTGCCCG TGTGGTGGATGAACGGGAG CAGATGGCCATCAGTGGTG GCTTCATCCGCAGGGTAAC AAATGATGCCCGGGAAAAT GAGATGGATGAGAACCTG GAGCAGGTGAGCGGCATC ATCGGAAACCTCCGCCAC ATGGCTCTAGACATGGGCA ATGAGATTGACACCCAGA ATCGCCAGATCGACAGGA TCATGGAGAAGGCTGATT CCAACAAAACCAGAATTG ATGAAGCCAACCAACGTG CAACAAAGATGCTGGGAA GTGGTTAAggatccgaattcgag ctccgtcgacaagcttgcggccgcactc gagcaccaccaccaccaccactgagat ccggctgctaacaaagcccgaaagga agctgagttggctgctgccaccgctgag caataactagcataaccccttggggcct ctaaacgggtcttgaggggttttttgctga aaggaggaactatatccggat
6×His-tagged VAMP2 (2-97, L32C/I97C; capitalized) in pET28a	homemade	tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt cacctgaatcaggatattcttctaatacctg gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct gtaacatcattggcaacgctacctttgccat gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc catataaatcagcatccatgttggaatttaa tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga atatggctcataacaccccttgtattactgt ttatgtaagcagacagttttattgttcatga ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa gagctaccaactctttttccgaaggtaactg gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg ttggactcaagacgatagttaccggataagg cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg cacacagcccagcttggagcgaacgacctac accgaactgagatacctacagcgtgagctatg agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt acggttcctggccttttgctggccttttgct cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc ggaagagcgcctgatgcggtattttctccttac gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc cgcatagttaagccagtatacactccgctat cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg acacccgccaacacccgctgacgcgccctga cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa agcgggccatgttaagggcggttttttcctg tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga tttctgttcatgggggtaatgataccgatga aacgagagaggatgctcacgatacgggttac tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt gttccacagggtagccagcagcatcctgcga tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc gtattgggcgccagggtggtttttcttttca ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt caccgcctggccctgagagagttgcagcaag cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga atttgattgcgagtgagatatttatgccagc cagccagacgcagacgcgccgagacagaa cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat actgttgatgggtgtctggtcagagacatca agaaataacgccggaacattagtgcaggcag cttccacagcaatggcatcctggtcatccag cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga caccaccacgctggcacccagttgatcggcg cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca gctccgccatcgccgcttccactttttcccg cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc accacgcgggaaacggtctgataagagacac cggcatactctgcgacatcgtataacgttac tggtttcacattcaccaccctgaattgactc tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga ctcactataggggaattgtgagcggataaca attcccctctagaaataattttgtttaactt taagaaggagatataccATGGGCAGC AGCCATCATCATCATCATCAC AGCAGCGGCCTGGTGCCGC GCGGCAGCCATATGGCAGAT CTCTCGGCTACCGCTGCCAC CGTCCCGCCTGCCGCCCCG GCCGGCGAGGGTGGCCCCC CTGCACCTCCTCCAAATCTTA CCAGTAACAGGAGATGCCAG CAGACCCAGGCCCAGGTGG ATGAGGTGGTGGACATCATG AGGGTGAATGTGGACAAGGT CCTGGAGCGAGACCAGAAG CTATCGGAACTGGATGATCG CGCAGATGCCCTCCAGGCA GGGGCCTCCCAGTTTGAAA CAAGTGCAGCCAAGCTCAA GCGCAAATACTGGTGGAAA AACCTCAAGATGATGTGCTA Aggatccgaattcgagctccgtcg acaagcttgcggccgcactcgagcaccacca ccaccaccactgagatccggctgctaacaaa gcccgaaaggaagctgagttggctgctgcca ccgctgagcaataactagcataaccccttgg ggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg ctgaaaggaggaactatatccggat
6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49–96; capitalized) and Syntaxin-1A (191–267, I202C/I266C; capitalized) in pETDuet-1	homemade	ggggaattgtgagcggataacaattcccctc tagaaataattttgtttaactttaagaagga gatataccATGGGCAGCAGCCATCA TCATCATCATCACAGCAGCGG CCTGGAAGTTCTGTTCCAGGG GCCCGGTAATGTGGACAAGGT CCTGGAGCGAGACCAGAAGCT ATCGGAACTGGATGATCGCGC AGATGCCCTCCAGGCAGGGGC CTCCCAGTTTGAAACAAGTGC AGCCAAGCTCAAGCGCAAATAC TGGTGGAAAAACCTCAAGATGAT GTAAgcggccgcataatgcttaagtcgaaca gaaagtaatcgtattgtacacggccgcataa tcgaaattaatacgactcactataggggaat tgtgagcggataacaattccccatcttagta tattagttaagtataagaaggagatatacat ATGGCCCTCAGTGAGATCGAGA CCAGGCACAGTGAGTGCATC AAGTTGGAGAACAGCATCCG GGAGCTACACGATATGTTCAT GGACATGGCCATGCTGGTGG AGAGCCAGGGGGAGATGATT GACAGGATCGAGTACAATGTG GAACACGCTGTGGACTACGTG GAGAGGGCCGTGTCTGACACC AAGAAGGCCGTCAAGTACCAG AGCAAGGCACGCAGGAAGAA GTGCATGATCTAActcgagtc tggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaa cgccagcacatggactcgtctactagcgcag cttaattaacctaggctgctgccaccgctga gcaataactagcataaccccttggggcctct aaacgggtcttgaggggttttttgctgaaag gaggaactatatccggattggcgaatgggac gcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgg gtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac acttgccagcgccctagcgcccgctcctttc gctttcttcccttcctttctcgccacgttcg ccggctttccccgtcaagctctaaatcgggg gctccctttagggttccgatttagtgcttta cggcacctcgaccccaaaaaacttgattagg gtgatggttcacgtagtgggccatcgccctg atagacggtttttcgccctttgacgttggag tccacgttctttaatagtggactcttgttcc aaactggaacaacactcaaccctatctcggt ctattcttttgatttataagggattttgccg atttcggcctattggttaaaaaatgagctga tttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaa aatattaacgtttacaatttctggcggcacg atggcatgagattatcaaaaaggatcttcac ctagatccttttaaattaaaaatgaagtttt aaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtga ggcacctatctcagcgatctgtctatttcgt tcatccatagttgcctgactccccgtcgtgt agataactacgatacgggagggcttaccatc tggccccagtgctgcaatgataccgcgagac ccacgctcaccggctccagatttatcagcaa taaaccagccagccggaagggccgagcgca gaagtggtcctgcaactttatccgcctccatc cagtctattaattgttgccgggaagctagag taagtagttcgccagttaatagtttgcgcaa cgttgttgccattgctacaggcatcgtggtg tcacgctcgtcgtttggtatggcttcattca gctccggttcccaacgatcaaggcgagttac atgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggtt agctccttcggtcctccgatcgttgtcagaa gtaagttggccgcagtgttatcactcatggt tatggcagcactgcataattctcttactgtc atgccatccgtaagatgcttttctgtgactg gtgagtactcaaccaagtcattctgagaata gtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccg gcgtcaatacgggataataccgcgccacata gcagaactttaaaagtgctcatcattggaaa acgttcttcggggcgaaaactctcaaggatc ttaccgctgttgagatccagttcgatgtaac ccactcgtgcacccaactgatcttcagcatc ttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaa aacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagg gaataagggcgacacggaaatgttgaatact catactcttcctttttcaatcatgattgaag catttatcagggttattgtctcatgagcgga tacatatttgaatgtatttagaaaaataaac aaataggtcatgaccaaaatcccttaacgtg agttttcgttccactgagcgtcagaccccgt agaaaagatcaaaggatcttcttgagatcct ttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaa caaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttg tttgccggatcaagagctaccaactcttttt ccgaaggtaactggcttcagcagagcgcaga taccaaatactgtccttctagtgtagccgta gttaggccaccacttcaagaactctgtagca ccgcctacatacctcgctctgctaatcctgt taccagtggctgctgccagtggcgataagtc gtgtcttaccgggttggactcaagacgatag ttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaa cggggggttcgtgcacacagcccagcttgga gcgaacgacctacaccgaactgagataccta cagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttccc gaagggagaaaggcggacaggtatccggta agcggcagggtcggaacaggagagcgcac gagggagcttccagggggaaacgcctggtatc tttatagtcctgtcgggtttcgccacctctg acttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtca ggggggcggagcctatggaaaaacgccagc aacgcggcctttttacggttcctggccttttg ctggccttttgctcacatgttctttcctgcg ttatcccctgattctgtggataaccgtatta ccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgc agccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtg agcgaggaagcggaagagcgcctgatgcgg tattttctccttacgcatctgtgcggtatttc acaccgcatatatggtgcactctcagtacaa tctgctctgatgccgcatagttaagccagta tacactccgctatcgctacgtgactgggtca tggctgcgccccgacacccgccaacacccgc tgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccg gcatccgcttacagacaagctgtgaccgtct ccgggagctgcatgtgtcagaggttttcacc gtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcgg taaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgatt cacagatgtctgcctgttcatccgcgtccag ctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtc tggcttctgataaagcgggccatgttaaggg cggttttttcctgtttggtcactgatgcctc cgtgtaagggggatttctgttcatgggggta atgataccgatgaaacgagagaggatgctca cgatacgggttactgatgatgaacatgcccg gttactggaacgttgtgagggtaaacaactg gcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaa tcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaa tacagatgtaggtgttccacagggtagccag cagcatcctgcgatgcagatccggaacataa tggtgcagggcgctgacttccgcgtttccag actttacgaaacacggaaaccgaagaccatt catgttgttgctcaggtcgcagacgttttgc agcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtat cggtgattcattctgctaaccagtaaggcaa ccccgccagcctagccgggtcctcaacgaca ggagcacgatcatgctagtcatgccccgcgc ccaccggaaggagctgactgggttgaaggct ctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcct aatgagtgagctaacttacattaattgcgtt gcgctcactgcccgctttccagtcgggaaac ctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggcc aacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgg gcgccagggtggtttttcttttcaccagtga gacgggcaacagctgattgcccttcaccgcc tggccctgagagagttgcagcaagcggtcca cgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctg tttgatggtggttaacggcgggatataacat gagctgtcttcggtatcgtcgtatcccacta ccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccgga ctcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgcc atctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgg gaacgatgccctcattcagcatttgcatggt ttgttgaaaaccggacatggcactccagtcg ccttcccgttccgctatcggctgaatttgat tgcgagtgagatatttatgccagccagccag acgcagacgcgccgagacagaacttaatggg cccgctaacagcgcgatttgctggtgaccca atgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgt accgtcttcatgggagaaaataatactgttg atgggtgtctggtcagagacatcaagaaata acgccggaacattagtgcaggcagcttccac agcaatggcatcctggtcatccagcggatag ttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcga gaagattgtgcaccgccgctttacaggcttc gacgccgcttcgttctaccatcgacaccacc acgctggcacccagttgatcggcgcgagatt taatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtg cagggccagactggaggtggcaacgccaatc agcaacgactgtttgcccgccagttgttgtg ccacgcggttgggaatgtaattcagctccgc catcgccgcttccactttttcccgcgttttc gcagaaacgtggctggcctggttcaccacgc gggaaacggtctgataagagacaccggcata ctctgcgacatcgtataacgttactggtttc acattcaccaccctgaattgactctcttccg ggcgctatcatgccataccgcgaaaggtttt gcgccattcgatggtgtccgggatctcgacg ctctcccttatgcgactcctgcattaggaag cagcccagtagtaggttgaggccgttgagca ccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaagga gatggcgcccaacagtcccccggccacgggg cctgccaccatacccacgccgaaacaagcgc tcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttc cccatcggtgatgtcggcgatataggcgcca gcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccgg ccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagat cgatctcgatcccgcgaaattaatacgactc actata
SNAP-25b (1–206, all C to A; capitalized) in pET28a	homemade	tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt cacctgaatcaggatattcttctaatacctg gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct gtaacatcattggcaacgctacctttgccat gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc catataaatcagcatccatgttggaatttaa tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga atatggctcataacaccccttgtattactgt ttatgtaagcagacagttttattgttcatga ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa gagctaccaactctttttccgaaggtaactg gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg ttggactcaagacgatagttaccggataagg cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg cacacagcccagcttggagcgaacgacctac accgaactgagatacctacagcgtgagctatg agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc ggaacaggagagcgcacgagggagcttcc agggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt acggttcctggccttttgctggccttttgct cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc ggaagagcgcctgatgcggtattttctccttac gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc cgcatagttaagccagtatacactccgctat cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg acacccgccaacacccgctgacgcgccctga cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa agcgggccatgttaagggcggttttttcctg tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga tttctgttcatgggggtaatgataccgatga aacgagagaggatgctcacgatacgggttac tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt gttccacagggtagccagcagcatcctgcga tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc gtattgggcgccagggtggtttttcttttca ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt caccgcctggccctgagagagttgcagcaag cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga atttgattgcgagtgagatatttatgccagc cagccagacgcagacgcgccgagacagaa cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat actgttgatgggtgtctggtcagagacatca agaaataacgccggaacattagtgcaggcag cttccacagcaatggcatcctggtcatccag cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga caccaccacgctggcacccagttgatcggcg cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca gctccgccatcgccgcttccactttttcccg cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc accacgcgggaaacggtctgataagagacac cggcatactctgcgacatcgtataacgttac tggtttcacattcaccaccctgaattgactc tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga ctcactataggggaattgtgagcggataaca attcccctctagaaataattttgtttaactt taagaaggagatataccATGGCCGA GGACGCAGACATGCGCAATG AGCTGGAGGAGATGCAGAGG AGGGCTGACCAGCTGGCTGA TGAGTCCCTGGAAAGCACCC GTCGCATGCTGCAGCTGGTT GAAGAGAGTAAAGATGCTGG CATCAGGACTTTGGTTATGTT GGATGAGCAAGGCGAACAAC TGGAACGCATTGAGGAAGGG ATGGACCAAATCAATAAGGAC ATGAAAGAAGCAGAAAAGAAT TTGACGGACCTAGGAAAATTC GCCGGCCTTGCCGTGGCCCC CGCCAACAAGCTTAAATCCAG TGATGCTTACAAAAAAGCCTG GGGCAATAATCAGGATGGAGT AGTGGCCAGCCAGCCTGCCC GTGTGGTGGATGAACGGGAG CAGATGGCCATCAGTGGTGGC TTCATCCGCAGGGTAACAAAT GATGCCCGGGAAAATGAGATG GATGAGAACCTGGAGCAGGT GAGCGGCATCATCGGAAACCT CCGCCACATGGCTCTAGACAT GGGCAATGAGATTGACACCCA GAATCGCCAGATCGACAGGAT CATGGAGAAGGCTGATTCCAA CAAAACCAGAATTGATGAAGC CAACCAACGTGCAACAAAGAT GCTGGGAAGTGGTTAA ctcgagcaccaccaccaccaccactgag atccggctgctaacaaagcccgaaagga agctgagttggctgctgccaccgctgagc aataactagcataaccccttggggcctc taaacgggtcttgaggggttttttgctgaa aggaggaactatatccggat
Materials for protein purificaiton
2-Mercaptoethanol	SIGMA	M3148-25ML
Agar	LPS Solution	AGA500
Ampicillin, Sodium salt	PLS	AC1043-005-00
Chloramphenicol	PLS	CR1023-050-00
Competent cells (E. coli)	Novagen	70956	Rosetta(DE3)pLysS
Glycerol	SIGMA	G5516-500ML
HEPES	SIGMA	H4034-100G
Hydrochloric acid / HCl	SIGMA	320331-500ML
Imidazole	SIGMA	I2399-100G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside / IPTG	SIGMA	10724815001
Kanamycin Sulfate	PLS	KC1001-005-02
Luria-Bertani (LB) Broth	LPS Solution	LB-05
Ni-NTA resin	Qiagen	30210
PD MiniTrap G-25 (desalting column)	Cytiva	GE28-9180-07	For instructions, see: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174
Phenylmethylsulfonyl fluoride / PMSF	ThermoFisher Scientific	36978
Plasmids for SNARE proteins	cloned in house	N/A	Available upon request
Protease inhibitor cocktail	genDEPOT	P3100
Sodium chloride	SIGMA	S5886-500G
Sodium phosphate dibasic / Na2HPO4	SIGMA	S7907-100G
Sodium phosphate monobasic / NaH2PO4	SIGMA	S3139-250G
Tris(2-carboxyethyl)phosphine / TCEP	SIGMA	C4706-2G
Trizma base	SIGMA	T1503-250G
Materials for sample assembly
Biotin-PEG-SVA	LAYSAN BIO	BIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1g	For PEGylation
Dibenzocyclooctyne-amine / DBCO-NH2	SIGMA	761540-10MG	For bead coating
Double-sided tape	3M	136	For flow cell assembly
Epoxy glue	DEVCON	S-208	For flow cell assembly
Glass coverslip for bottom surface	VWR	48393-251	Rectangular, 60×24 mm, #1.5
Glass coverslip for top surface	VWR	48393-241	Rectangular, 50×24 mm, #1.5
Magnetic bead	ThermoFisher Scientific	14301	Dynabeads M-270 Epoxy, 2.8 μm
mPEG-SVA	LAYSAN BIO	mPEG-SVA 1g	For PEGylation
N,N-Dimethylformamide / DMF	SIGMA	D4551-250ML	For bead coating
N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine	SIGMA	104884-100ML	For PEGylation
Neutravidin	ThermoFisher Scientific	31000	For sample tethering
Phosphate buffered saline / PBS, pH 7.2	PLS	PR2007-100-00
Plastic syringe	Norm-ject	A5	5 ml, luer tip
Polyethylene Tubing	SCI	BB31695-PE/4	PE-60
Reference bead	SPHEROTECH	SVP-30-5	Streptavidin-coated Polystyrene Particles; 3.0-3.4 µm
Syringe needle	Kovax	21G-1 1/4''	21 G
Syringe pump	KD SCIENTIFIC	788210
Equipment for magnetic tweezer instrument
1-axis motorized microtranslation stage	PI	M-126.PD1	For vertical positioning of magnets
2-axis manual translation stage	ST1	LEE400	For alignment of magnets to the optical axis
Acrylic holder for magnets	DaiKwang Precision	custum order	Drawing available upon request
Frame grabber	Active Silicon	AS-FBD-4XCXP6-2PE8
High-speed CMOS camera	Mikrotron	EoSens 3CXP
Inverted microscope	Olympus	IX73P2F-1-2
Neodymium magnets	LG magnet	ND 10x10x12t	Dimension: 10 mm × 10 mm × 12 mm; two needed
Objective lens	Olympus	UPLXAPO100XO	Oil-immersion, NA 1.45
Objective lens nanopositioner	Mad City Labs	Nano-F100S
Rotation stepper motor	AUTONICS	A3K-S545W	For rotating magnets
Superluminescent diode	QPHOTONICS	QSDM-680-2	680 nm
Software
LabVIEW	National Instruments	v20.0f1
MATLAB	MathWorks	v2021a