Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عزل وتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية لفئران Sprague Dawley

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/65172
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 3, 4, 2
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Medical Research Unit in Biochemistry, Specialties Hospital, National Medical Center SXXI, Instituto Mexicano de Seguro Social, 3Department of Agricultural and Animal Production, Division of Biological and Health Science, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, 4Molecular Biology Research Laboratory, Center for Congenital Malformations, Children Hospital of Mexico Federico Gomez (HIMFG)

Summary

يصف هذا البروتوكول منهجية لعزل وتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية (MSCs) من فئران Sprague Dawley.

Abstract

أحدثت خلايا اللحمة المتوسطة البالغة ثورة في البيولوجيا الجزيئية والخلوية في العقود الأخيرة. يمكن أن تتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا المتخصصة ، بالإضافة إلى قدرتها الكبيرة على التجديد الذاتي والهجرة والانتشار. الأنسجة الدهنية هي واحدة من أقل المصادر الغازية والأكثر سهولة للخلايا الوسيطة. كما تم الإبلاغ عن أن لها غلات أعلى مقارنة بالمصادر الأخرى ، فضلا عن خصائص مناعية فائقة. في الآونة الأخيرة ، تم نشر إجراءات مختلفة للحصول على خلايا اللحمة المتوسطة البالغة من مصادر الأنسجة المختلفة والأنواع الحيوانية. بعد تقييم معايير بعض المؤلفين ، قمنا بتوحيد منهجية قابلة للتطبيق لأغراض مختلفة ويمكن استنساخها بسهولة. سمحت لنا مجموعة من الأجزاء الوعائية اللحمية (SVF) من الأنسجة الدهنية حول الكلى والبربخ بتطوير ثقافات أولية مع مورفولوجيا ووظائف مثالية. لوحظت الخلايا ملتصقة بالسطح البلاستيكي لمدة 24 ساعة ، وأظهرت مورفولوجيا تشبه الخلايا الليفية ، مع إطالة وميل لتشكيل مستعمرات. تم استخدام تقنيات قياس التدفق الخلوي (FC) والتألق المناعي (IF) لتقييم التعبير عن علامات الغشاء CD105 و CD9 و CD63 و CD31 و CD34. كما تم تقييم قدرة الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) على التمايز في السلالة الشحمية باستخدام مزيج من العوامل (4 ميكرومتر أنسولين ، 0.5 مللي متر 3-ميثيل أيزو بوتيل زانثين ، و 1 ميكرومتر ديكساميثازون). بعد 48 ساعة ، لوحظ فقدان تدريجي لمورفولوجيا الخلايا الليفية ، وفي 12 يوما ، تم تأكيد وجود قطرات دهنية إيجابية لتلطيخ الزيت الأحمر. باختصار ، يقترح إجراء للحصول على ثقافات ASC المثلى والوظيفية للتطبيق في الطب التجديدي.

Introduction

أثرت الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) بشدة على الطب التجديدي بسبب قدرتها العالية على التجديد الذاتي والانتشار والهجرة والتمايز إلى سلالات خلايا مختلفة 1,2. حاليا ، يركز قدر كبير من الأبحاث على إمكاناتها لعلاج وتشخيص الأمراض المختلفة.

هناك مصادر مختلفة لخلايا اللحمة المتوسطة: نخاع العظام ، والعضلات الهيكلية ، والسائل الأمنيوسي ، وبصيلات الشعر ، والمشيمة ، والأنسجة الدهنية ، من بين أمور أخرى. يتم الحصول عليها من أنواع مختلفة ، بما في ذلك البشر والفئران والجرذان والكلاب والخيول3. تم استخدام MSCs المشتقة من نخاع العظام (BMSCs) لسنوات عديدة كمصدر رئيسي للخلايا الجذعية في الطب التجديدي وكبديل لاستخدام الخلايا الجذعية الجنينية4. ومع ذلك ، فإن MSCs المشتقة من الدهون ، أو الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) ، هي بديل مهم يتمتع بمزايا كبيرة نظرا لسهولة جمعها وعزلها ، فضلا عن إنتاجية الخلايا التي تم الحصول عليها لكل جرام من الأنسجة الدهنية 5,6. وقد أفيد بأن معدل حصاد ASCs أعلى بشكل عام من معدل حصادBMSCs 7. اقترح في البداية أن القدرة التعويضية / التجديدية ل ASCs كانت بسبب قدرتها على التمايز إلى سلالات الخلاياالأخرى 8. ومع ذلك ، فقد عززت الأبحاث في السنوات الأخيرة الدور الأساسي لعوامل paracrine التي أطلقتها ASCs في إمكاناتها التعويضية 9,10.

الأنسجة الدهنية (AT) ، بالإضافة إلى كونها احتياطي للطاقة ، تتفاعل مع الغدد الصماء والجهاز العصبي والقلب والأوعية الدموية. كما أنها تشارك في النمو والتطور بعد الولادة ، والحفاظ على توازن الأنسجة ، وإصلاح الأنسجة ، وتجديدها. يتكون AT من الخلايا الشحمية ، وخلايا العضلات الملساء الوعائية ، والخلايا البطانية ، والخلايا الليفية ، والوحيدات ، والبلاعم ، والخلايا الليمفاوية ، والخلايا preadipocytes ، و ASCs. هذا الأخير يمتلك دورا مهما في الطب التجديدي بسبب انخفاض مناعته11,12. يمكن الحصول على ASCs عن طريق الهضم الأنزيمي والمعالجة الميكانيكية أو عن طريق زراعة الأنسجة الدهنية. من السهل الحفاظ على الثقافات الأساسية ل ASCs وتنميتها وتوسيعها. يعد توصيف النمط الظاهري ل ASCs ضروريا للتحقق من هوية الخلايا من خلال تقييم التعبير عن علامات غشائية محددة باستخدام طرق مثل التألق المناعي وقياس التدفق الخلوي13. حدد الاتحاد الدولي للعلاجات والعلوم الدهنية (IFATS) والجمعية الدولية للعلاج الخلوي (ISCT) أن ASCs تعبر عن CD73 و CD90 و CD105 ، بينما تفتقر إلى التعبير عن CD11b و CD14 و CD19 و CD45 و HLA-DR14. لذلك تعتبر هذه العلامات ، الإيجابية والسلبية على حد سواء ، موثوقة لتوصيف ASCs.

ركز هذا المشروع على وصف إجراء لعزل وتحديد خلايا اللحمة المتوسطة البالغة المستخرجة من ATللفئران ، لأن مصدر الخلايا هذا لا يمثل تحديات أخلاقية ، على عكس الخلايا الجذعية الجنينية. هذا يعزز الإجراء كخيار قابل للتطبيق بسبب سهولة الوصول وطريقة الحد الأدنى من التدخل الجراحي مقارنة بالخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظام.

تلعب خلايا اللحمة المتوسطة من مصدر الأنسجة هذا دورا مهما في الطب التجديدي بسبب قدراتها المناعية وانخفاض الرفض المناعي. لذلك ، تعد الدراسة الحالية جزءا أساسيا من الأبحاث المستقبلية في إفرازها وتطبيقها كعلاج تجديدي في أمراض مختلفة ، بما في ذلك أمراض التمثيل الغذائي مثل مرض السكري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية المكسيكية لرعاية الحيوان ، بناء على توصيات جمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر الدولية (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999 ، المكسيك). تمت مراجعة البروتوكول والموافقة عليه وتسجيله من قبل لجنة أخلاقيات البحوث الصحية التابعة للمعهد المكسيكي للبحوث الاجتماعية (R-2021-785-092).

1. إزالة الأنسجة الدهنية من الفئران عن طريق الاستئصال الجراحي

  1. تحضير أنبوبين مخروطيين مع 20 مل من محلول مضاد حيوي ملحي معقم 1x فوسفات (PBS-AA) (1x PBS ، جنتاميسين [20 ميكروغرام / مل] ، وأمفوتريسين [0.5 ميكروغرام / مل]) والحفاظ على الجليد.
  2. حدد اثنين من ذكور الفئران Sprague Dawley (R. norvegicus) في حالة صحية جيدة. تأكد من أن عمر الفئران يتراوح بين 3-4 أشهر ولها وزن مشترك يتراوح بين 350-450 جم.
  3. يجب إجراء التخدير بجرعة 20 ملغ/ كغ من زيلازين هيدروكلوريد، وبعد 5 دقائق يتم تطبيق مخدر بجرعة 120 ملغ/كغ من الكيتامين هيدروكلوريد داخل الصفاق. تليين كلتا العينين مع مرهم العيون لمنع الجفاف. ثم تأكد من عمق التخدير عن طريق عدم وجود منعكس الدواسة.
  4. حلق وتطهير منطقة البطن والأربية بمحلول اليود. ضع الستائر الجراحية للحفاظ على العقم. ثم قم بعمل شق طولي متوسط من القص إلى منطقة الخصية.
  5. قم بإزالة الأنسجة الدهنية المحيطة بكل من البربخ والكلى بالملقط المعقم وضعها في محلول 1x PBS-AA. احتفظ بالعينات على الجليد.
  6. خياطة الشق المغلق إذا لزم الأمر وفقا للإرشادات المؤسسية والقتل الرحيم للحيوانات بجرعة داخل القلب تبلغ 40 مجم / كجم بنتوباربيتال الصوديوم. بمجرد تأكيد الوفاة ، تخلص من الذبيحة باتباع الإجراء (الإجراءات) المؤسسية.
    ملاحظة: يثير الموت آليات الإشارات التي تؤثر على النمط المناعي ، وقدرة التمايز ، وتأثير paracrine لخلايا اللحمة المتوسطة. وبالتالي ، يتم إجراء جمع الأنسجة قبل القتل الرحيم. 

2. عزل خلايا اللحمة المتوسطة من الأنسجة الدهنية

  1. قم بإزالة الأنسجة الدهنية بالملقط المعقم داخل خزانة السلامة البيولوجية وضعها على ورق ترشيح معقم في طبق بتري قطره 100 مم لامتصاص PBS الزائد.
  2. انقل الأنسجة الدهنية إلى طبق بتري آخر وقم بإجراء ثلاث غسلات لمدة 5 دقائق لكل منها 10 مل من محلول 1x PBS-AA باستخدام ماصة سعة 10 مل.
  3. قم بتقسيم الأنسجة ميكانيكيا إلى شظايا يبلغ طولها حوالي 1 سم2 باستخدام مقص ومشرط.
  4. تحضير كولاجيناز من النوع الرابع (0.075٪) في 20 مل من وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) غير المكمل غذائيا. قم بالتصفية من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر واحفظه عند 37 درجة مئوية.
  5. أضف محلول كولاجيناز (20 مل) المحضر في الخطوة 2.4 إلى دورق بلوري مع منديل مجزأ وقضيب مغناطيسي. أغلق الحاوية واحتضانها تحت التحريك البطيء والمستمر عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يستغرق الهضم الأنزيمي حوالي 90 دقيقة (الحفاظ على التحريك البطيء للحفاظ على سلامة أغشية الخلايا).
  6. قم بتصفية التجانس من خلال مرشح من الفولاذ المقاوم للصدأ ، 40 شبكة ، فتحة 0.38 مم على طبق بتري 100 مم وجمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل.
  7. أضف 20 مل من DMEM الدافئ والمكمل (10٪ مصل بقري جنيني [FBS] ، 2 مللي مول جلوتامين ، 2 مللي مول بيروفات الصوديوم ، 100x محلول حمض أميني غير أساسي ، و 100x محلول مضاد حيوي [AA]). تعليق بعناية جزء الأوعية الدموية اللحمية (SVE).
  8. قم بطرد مركزي تعليق الخلية عند 290 × جم لمدة 10 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية بماصة 25 مل ، واغسل الخلايا برفق باستخدام 40 مل من وسط DMEM غير المكمل.
  9. كرر هذه الخطوة. استخدم أنبوبا مخروطيا معقم جديدا بين الخطوات لسحب أقل كمية من المخلفات الخلوية والدهون.
  10. الحبيبات في 5 مل من DMEM المكمل بماصة 5 مل وانقلها إلى زجاجة T-25 سم2 . احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  11. في اليوم التالي ، قم بإجراء ثلاث غسلات مع 5 مل من 1x PBS-AA الدافئ وغسلتين مع DMEM غير المكمل لإزالة حطام الخلايا والخلايا غير الملتصقة. أضف 5 مل من DMEM الطازج والدافئ والمكمل مع ماصة 5 مل وقم بتغيير الوسط كل 3-4 أيام.

3. الحفاظ على الثقافات الأولية ASC وتوسيعها

  1. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 90٪ -100٪ (8 ± 2 أيام) ، اغسل مرتين باستخدام 5 مل من DMEM غير المكمل. أضف 1 مل من التربسين -2 mM الدافئ 0.025٪ حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) واحتضانه لمدة 5-7 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  2. عندما يتم فصل الطبقة الأحادية للخلية ، أضف 4 مل من DMEM المكمل وقم بتقسيم تعليق الخلية برفق.
  3. انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وأضف 5 مل من DMEM الدافئ والمكمل ، ثم برفق للتجانس.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 290 × ز لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية واخلط الحبيبات برفق في 1 مل من DMEM المكمل. عد الخلايا في غرفة نيوباور بعد تلطيخها بتريبان الأزرق.
  5. أخيرا ، البذور 2.5 × 103 خلايا / سم2 بنسبة انقسام 1: 4 في قوارير T-75. تضمن هذه الخطوة تكوين مستعمرة ومعدل انتشار مرتفع.

4. التوصيف المورفولوجي للثقافات الأولية ASC

  1. مراقبة مورفولوجيا ASCs تحت المجهر المقلوب.
    ملاحظة: قبل التركيب لتحديد الأنسجة و ASC ، عالج أغطية الغطاء بمحلول جيلاتيني 1٪. يشع بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
    1. قم بإزالة أغطية الغطاء من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ واتركها تجف لمدة 5 دقائق.
    2. اغمر أغطية الغطاء في محلول جيلاتيني معقم بنسبة 1٪ ، وصفيها وجففها في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. ضع كل غطاء في كل بئر من صفيحة ذات 6 آبار وقم بإشعاع الألواح بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
    4. بذر قطرة تحتوي على 25 × 103 خلايا في وسط البئر ، وانتظر 1 دقيقة ، وأضف 1 مل من وسط DMEM المضاف. احتضان لمدة 96 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    5. قم بإزالة الوسط وقم بإجراء ثلاث غسلات باستخدام 1x PBS-AA باستخدام ماصة نقل.
    6. أضف 1 مل من الفورمالين المحايد بنسبة 3.5٪ إلى كل بئر واحتضانه لمدة 1 ساعة في RT. قم بإزالة الفورمالين بعناية وأضف 1 مل من الإيثانول البارد بنسبة 70٪ إلى كل بئر.
    7. ختم اللوحة مع parafilm حتى الاستخدام ، لمنع الجفاف.
      ملاحظة: يتم أيضا تقييم التشكل الخلوي ل ASCs عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين خلال الممرات المختلفة.
    8. قم بإزالة 70٪ من الإيثانول من كل بئر ورطب الخلايا لمدة 5 دقائق بالماء المقطر. وفي الوقت نفسه ، قم بتصفية حلول تلطيخ.
    9. قم بإزالة الماء وبقع الخلايا تحت التحريك البطيء لمدة 15 دقيقة بمحلول الهيماتوكسيلين هاريس.
    10. قم بإزالة محلول التلوين وقم بإجراء غسلتين باستخدام 1x PBS.
    11. تلطيخ الخلايا بمحلول eosin تحت التحريض البطيء لمدة 1 دقيقة. ثم ، قم بإزالة المحلول وإجراء غسلتين باستخدام 1x PBS.
    12. قم بإزالة أغطية الغطاء بعناية من كل بئر وقم بتركيب الشرائح على قطرة من محلول تركيب PBS-glycerol (1: 1 فولت / حجم).
    13. ضع خطا من طلاء الأظافر حول غطاء الغطاء ولاحظ الشرائح النسيجية تحت المجهر الضوئي.

5. علامات التعبير عن ASCs عن طريق التألق المناعي

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت للغسيل الذي يحتوي على 1x PBS-0.05٪ Tween 20. أداء يغسل في RT ومع اهتزاز بطيء. اغسل الأطباق ثلاث مرات ب 2 مل من المخزن المؤقت / البئر (احتضانها لمدة 3 دقائق لكل غسلة).
  2. ضع 1 مل من الكاشف المانع (1:10) واحتضنه مع التقليب البطيء لمدة 20 دقيقة.
  3. أضف 200 ميكرولتر (تخفيف 1:50) من الأجسام المضادة الأولية التالية إلى كل بئر: CD9 (فأر وحيد النسيلة) ، CD34 (أرنب متعدد النسيلة) ، ومضاد CD63 (ماعز متعدد النسيلة). احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  4. اغسل الألواح ثلاث مرات مرة أخرى واحتضانها ب 200 ميكرولتر (1:50 تخفيف) من الأجسام المضادة الثانوية التالية: الماعز المترافق IgG FITC المضاد للفأر ، والحمير المضاد للماعز IgG DyeLight 550 ، والماعز المضاد للأرانب IgG Cy3.
  5. اغسل ثلاث مرات باستخدام 1x PBS-0.05٪ Tween 20 وقم بتلطيخ نوى الخلية ب 100 ميكرولتر من DRAQ-7 (التخفيف: 17 ميكرولتر في 1 مل من الماء المقطر المزدوج) لمدة 20 دقيقة.
  6. اغسل ثلاث مرات أخرى وقم بتركيب الشرائح وفقا للخطوات 4.1.12-4.1.13. قم بتخزين العينات المحمية من الضوء والمجمدة حتى الاستخدام.
  7. تصور العينات تحت المجهر متحد البؤر epifluorescence باستخدام الإعدادات المناسبة والبرامج الموصى بها لهذا الجهاز.

6. علامات التعبير عن ASCs عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. اضبط معلق خلية واحدة من الخلايا المذابة أو المذابة (الممرات الفرعية 3 أو 4) بتركيز 1 × 106 خلايا / مل من 1x PBS-5٪ FBS. القسمة 100 ميكرولتر مع 100000 خلية في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل. استخدم قسمة واحدة بدون وضع علامات للتحكم التلقائي في التألق.
  2. أضف إلى الراحة جميع الكميات المناسبة من Anti-CD105 AF-594 و Anti-CD31 AF-680 ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. احتضان في الظلام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  3. اغسل البقعة الزائدة ب 1 مل من 1x PBS-5٪ FBS عن طريق الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق وعلقها في 300 ميكرولتر من 1٪ فورمالين.
  4. إجراء الحصول على عينة على مقياس التدفق الخلوي. تعتمد استراتيجية البوابات للخلايا على بوابات FSC-A مقابل SSC-A ، والخلايا المفردة ذات البوابات باستخدام SSC-H مقابل SSC-A متبوعة ب FSC-A مقابل FSC-H.
  5. استخدم كاشف Y610-mCherry-A لكاشف CD105 AF-594 و R660-APC-A ل CD31 AF-680.

7. تمايز ASCs إلى النسب الدهني

  1. في صفيحة ذات 6 آبار ، البذور 1 × 10 4 خلايا (P-4) لكل سم 2 وتحضن عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، حتى التقاء 60-80٪ (~ 72-96 ساعة). تحفيز التمايز ، وتطبيقه مباشرة على وسط الثقافة: 4 ميكرومتر أنسولين ، 1 ميكرومتر ديكساميثازون 21-أسيتات (Dxa) ، و 0.5 مللي متر من 3-إيزوبوتيل-1-ميثيل زانثين (MIX). تغيير وسيط التمايز كل 2-3 أيام.
  2. قم بإعداد محلول مخزون من الأنسولين 800 ميكرومتر في 2 مل من الماء المعقم عالي النقاء (أضف 20 ميكرولتر من 1 N HCl لضمان الذوبان الكامل) وتخزينه في -20 درجة مئوية. أضف 10 ميكرولتر من مخزون الأنسولين ، المخفف مسبقا 1: 100 ، وقم بتطبيق 10 ميكرولتر بحجم نهائي قدره 2 مل لكل بئر.
  3. قم بإعداد محلول مخزون يبلغ 1 mM Dxa في 5 مل من الماء المعقم عالي النقاء (لاحظ أن الذوبان الكامل لا يحدث). يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية. أضف 40 ميكرولتر / بئر من تخفيف 1: 4 من مخزون Dxa.
  4. قم بإعداد مخزون 100 mM من MIX في 2.5 مل من 0.1 N NaOH ، دوامة ، وأضف 40 ميكرولتر من 1 N NaOH للذوبان الكامل. يحفظ في درجة حرارة -70 درجة مئوية. أضف 10 ميكرولتر / بئر من مخزون MIX.
  5. قم بتصفية محاليل المخزون من خلال مرشح حقنة معقم 0.22 ميكرومتر قبل التخزين.
  6. في اليوم 12 ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1x PBS واحتضانها ب 500 ميكرولتر من 4٪ فورمالين لمدة 1 ساعة في RT. اغسل كل بئر مرتين بالماء المقطر متبوعا بنسبة 60٪ من الأيزوبروبانول لمدة 5 دقائق واتركه حتى يجف.
  7. أضف 0.5٪ زيت أحمر O مخفف في 60٪ إيزوبروبانول (500 ميكرولتر / بئر) واحتضانه لمدة 20 دقيقة في RT. يغسل ب 1 مل من الماء المقطر ثلاث مرات ويلاحظ تحت المجهر المقلوب.
    ملاحظة: بالنسبة للكواشف والمعدات والمواد المطلوبة، راجع جدول المواد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم الحصول على الأنسجة الدهنية من فئران Sprague Dawley البالغة من العمر 3-4 أشهر ويبلغ وزن جسمها 401 ± 41 جم (المتوسط الهندسي ± SD). تتوافق القيمة المتوسطة البالغة 3.8 جم من الأنسجة الدهنية البربخية وحول الكلى مع تحليل 15 عملية استخراج تجريبية. بعد 24 ساعة من الثقافة ، ظلت مجموعات الخلايا ملتصقة بالسطح البلاستيكي وأظهرت مورفولوجيا غير متجانسة. تم تحقيق المقطع الأول في 8 ± 2 أيام ، مع عائد 1.4 ± 0.6 × 106 خلايا في ما مجموعه ثماني تجارب. سهلت الملاحظة الميدانية الساطعة المباشرة (الشكل 1) وتلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين (الشكل 2) التوصيف المورفولوجي باستخدام المجهر الضوئي. كان السيتوبلازم واسع النطاق مرئيا مع استطالة ممدودة وخيوط دقيقة وفيرة داخل الخلايا ، وهي السمة المميزة لخلايا اللحمة المتوسطة.

عبرت ASCs عن علامات سطحية تم تصورها على وجه التحديد من خلال التألق المناعي غير المباشر في ممرات فرعية مختلفة (1 و 3 و 7 و 9) (الشكل 3). كانت ASCs إيجابية بنسبة 100٪ لعلامات سطح CD9 في جميع الممرات الفرعية التي تم اختبارها. النسبة المئوية هي عدد الخلايا الموجبة فيما يتعلق بعدد الخلايا الكلية التي تم عدها في خمس صور مجهرية تم التقاطها عشوائيا. عبرت الخلايا (100٪) عن علامات CD63 في الممرات الفرعية 1 و 3 و 9 (P-1 و P-3 و P-9) ، بينما فعلت 49.3٪ في P-7. كانت علامة CD34 سلبية في المقاطع 1 و 7 و 9 ، ولكن لوحظت نتائج إيجابية لوضع العلامات في المقطع 3. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر التنميط المناعي بواسطة FCM أن 98.7٪ من سكان الخلايا كانوا إيجابيين ل CD105 ، بينما عبر 5.88٪ فقط عن علامة CD31 (الشكل 4).

أخيرا ، أظهرت ASCs التي تعرضت لمزيج من عوامل التمايز لمدة 12 يوما قدرتها على التمايز نحو النسب الشحمي (الشكل 5). بعد 48 ساعة ، لاحظنا التغييرات الأولى في المورفولوجيا. تم تقليل حجم الخلايا وأظهرت شكلا مستديرا. بعد 7 أيام ، كانت حويصلات الدهون مرئية ، والتي كانت إيجابية لتلطيخ الزيت الأحمر بعد 12 يوما من التمايز.

Figure 1
الشكل 1: الكسر الوعائي اللحمي (SVF) المستخرج من الأنسجة الدهنية للفئران وهضمه بنسبة 0.075٪ كولاجيناز (عند 24 ساعة). (أ) SVF (20x). (ب) يتبع SVF خمس غسلات (10x). تظهر الخلايا الملتصقة بالسطح البلاستيكي مورفولوجيا غير متجانسة: مدورة ، على شكل نجمة ، وليفية في المظهر (مجهر مقلوب). يمثل شريط المقياس 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: التوصيف المورفولوجي مع تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين. (أ) ASCs، ف-1 (10x). (ب) ASCs ، ف-1 ، (ج) ف-3 ، (د) ف-9 (100x). يمثل شريط المقياس 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تقييم علامات التعبير المختلفة ل ASCs و exosomes بواسطة IF. المحور X: الممرات 1 و 3 و 7 و 9. المحور Y: CD9: الماعز المترافق IgG FITC المضاد للفأر ؛ CD63: الماعز مكافحة الأرانب IgG Cy3 ؛ و CD34: حمار مضاد للماعز IgG DyeLight 550. نوى ملطخة باللون الأزرق مع DraQ7 (تكبير 40x ، تكبير 1x). يمثل شريط المقياس 100 ميكرومتر في كل لوحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحديد ASC عن طريق قياس التدفق الخلوي. (A-C) العينات المختارة بناء على بوابات FSC-A مقابل SSC-A ، والخلايا المفردة ذات البوابات باستخدام SSC-H مقابل SSC-A متبوعة ب FSC-A مقابل FSC-H. (د، ه) التحكم في التألق الذاتي (الخلايا غير المصنفة). (و ، ز) ASCs المسمى بمضاد CD105 AF-594 (Y610 mCherry ؛ علامة موجبة) ومضاد CD31 AF-680 (كاشف R660-APC-A ؛ علامة سلبية) ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: التقييم الوظيفي لخلايا اللحمة المتوسطة للأنسجة الدهنية للفئران. (أ) التحكم (10x). ب: التمايز الديبيجيني 10x، (ج) 20x، (د) 40x. قطرات الدهون داخل الهيولى إيجابية لصبغة الزيت الأحمر في 12 يوما من الحث (مجهر تباين الطور). يمثل شريط المقياس 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في العقود الأربعة الماضية منذ اكتشاف MSCs ، وصفت عدة مجموعات من الباحثين إجراءات الحصول على MSCs من الأنسجة والأنواع المختلفة. واحدة من مزايا استخدام الفئران كنموذج حيواني هي سهولة صيانتها وتطورها السريع ، فضلا عن سهولة الحصول على MSCs من الأنسجة الدهنية. تم وصف مصادر الأنسجة المختلفة للحصول على ASCs ، مثل الدهون الحشوية وحول الكلى والبربخ وتحت الجلد12،13،14،15،16.

فيما يتعلق بإجراء الاستخراج المستخدم هنا ، يوصي المؤلفون بأن الفئران يجب أن تزن ما بين 350-450 جم ، ويمكن تحقيقها في أول 4 أشهر من الحياة. عندما كان وزن الحيوانات بين 450-600 غرام وكان عمرها يصل إلى 8 أشهر ، كانت كمية الأنسجة الدهنية لكل فأر (5.5 ± 2.1 ؛ متوسط ± SD) أعلى. ومع ذلك ، لم يزد عدد ASCs بشكل متناسب (البيانات غير معروضة). تتوافق هذه الملاحظات مع تلك التي أدلى بها غونزاليس3، الذي أحال أيضا السكان ذوي الجدوى والالتصاق العالي إلى سطح الثقافة الذي تم الحصول عليه من الأنسجة تحت الجلد، مقارنة بالمصادر الأخرى. من ناحية أخرى ، تظهر ASCs من استئصال الخزعة قدرة أكبر على الجدوى والتكرار والقدرة على النسخ مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها عن طريق شفط الدهون7. في هذه الدراسة ، كانت الأنسجة تحت الجلد للفئران في الأعمار التي تمت دراستها نادرة للغاية. لذلك قررنا إزالة الأنسجة الدهنية المجاورة للبربخ والمنطقة المحيطة بالكلى ، والتي تشارك في تخليق وإفراز الأديبوكينات ذات الصلة بتنظيم الجلوكوز والدهون ، وكذلك الالتهاب16 ، عن طريق الاستئصال الجراحي.

تعتمد البروتوكولات الحالية لعزل MSCs المشتقة من الأنسجة الدهنية على إجراءات المعالجة الخالية من الإنزيم ، مثل زراعةالنباتات 17 ، بالإضافة إلى استخدام العلاجات الأنزيمية لتحقيق تصنيف الأنسجة شبه الكلي18. الإجراء المقترح بسيط نسبيا ويتضمن التصنيف الميكانيكي والتصنيف الأنزيمي والغسلات المتتالية لتعليق الخلية. يتم تنفيذ هذا الأخير لإزالة أكبر عدد ممكن من الخلايا غير ذات الصلة من الخلايا السلفية ، وبالتالي الحصول على الحد الأدنى من التعبير (<5 ٪) من علامات سطحها. ومن المثير للاهتمام ، أن كميات SVF التي يجب الحصول عليها قد تعتمد على نوع الكولاجين المستخدم في التصنيف الأنزيمي للأنسجة الدهنية. يوصى بشدة باستخدام الكولاجين من النوع الأول لعزل الخلايا الشحمية ، على الرغم من الإبلاغ أيضا عن استخدام النوع الثاني19 والنوع الثامن20,21. في العمل الحالي ، استخدمنا كولاجيناز من النوع الرابع ، مع نشاط إنزيمي منخفض ، وعادة ما يستخدم لمعالجة أنسجة البنكرياس. وبالتالي ، يتم الحصول على عائد أقل من ASCs ، ولكن هناك أيضا ضرر أقل للغشاء. يمكن أن يؤدي ذلك إلى تعديل تعبير بعض علامات السطح ، وبالتالي وظائفها. من ناحية أخرى ، سمحت نسبة الانقسام المنخفضة المستخدمة في توسيع الثقافة بتكوين مستعمرات وقدرة تكاثرية أكبر.

وفقا للمورفولوجيا ، هناك ثلاثة أنواع رئيسية من خلايا اللحمة المتوسطة: الخلايا الصغيرة ، والخلايا الممدودة ، والخلايا الكبيرة المسطحة ذات النوى الكبيرة البطيئة في التكاثر. ربما ترتبط هذه الأشكال بالصفات الجوهرية ، مثل إمكانات تمايزها22. تتوافق التشكل الذي لوحظ في الثقافات الأولية ل ASCs مع النتائج التي أبلغ عنها هؤلاء المؤلفون. كان هناك عدد وفير من الشعيرات الدقيقة في السيتوبلازم مرئيا أيضا في جميع المراحل التي تم تقييمها ، مما يؤكد مورفولوجيا الخلايا الليفية ل ASCs التي تم الحصول عليها في الدراسة23،24،25. بالإضافة إلى ذلك ، يلزم التنميط المناعي لتأكيد طبيعة اللحمة المتوسطة للخلايا المعزولة. ويوصي فريق التنسيق بين القطاعات والمعهد الدولي لتقنيات النقل البحري باستخدام بعض العلامات، على الرغم من إمكانية وجود بدائل أخرى أيضا. من المعروف أن MSCs يمكن أن تنتج كميات كبيرة من exosomes26 وهي حويصلات صغيرة تفرز في وسط خارج الخلية مع محتوى بروتين معين. نظرا لأصلها الإندوسومي ، فإنها تحتوي على بروتينات الاندماج ونقل الغشاء (GTPases ، والمرفقات ، والأسطول) ، و tetraspanins (CD9 ، CD63 ، CD81 ، و CD82) ، من بين أمور أخرى ، يتم التعبير عنها أيضا على سطح الخلايا التي تنشأ منها17,18. أحد قيود هذه الدراسة هو أنه لا يتم تقييم لوحة واسعة من العلامات. ومع ذلك ، يتم قبول استخدام علامتين إيجابيتين وسالبتين على الأقل في نفس الاختبار.

في هذا العمل ، كشف التألق المناعي غير المباشر مع علامات خارجية عن إشارة إيجابية من ASCs إلى علامات CD9 و CD63 في الممرات الفرعية 1 و 3 و 7 و 9. وبما أن الإشارة التي لوحظت في المقطع 7 كانت ضعيفة، سيكون من المهم استخدام تلك العلامات التي أوصى بها فريق التنسيق بين القطاعات وIFATS للحصول على نتائج أفضل. CD34 هو مستضد سطحي معترف به كعلامة للخلايا البطانية والمكونة للدم وعلامة إيجابية للخلايا المشتقة من SVF للأنسجة الدهنية. ومع ذلك ، فإن تعبيره على ASCs الأصلي يرتبط سلبا بتوسع الخلايا في المختبر27. تعتمد نسبة خلايا CD34 + على طريقة حصاد الأنسجة الدهنية ، ودرجة نزيف الأوعية الدموية ، وتقنيات الهضم والعزل اللاحقة. على الرغم من أن ASCs تعبر باستمرار عن علامات مختلفة ، فقد ثبت أن ديناميكياتها تتغير أثناء التوسع في المختبر 28,29 ، كما يتضح من النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام المنهجية المقترحة.

في الوقت الحاضر ، لا يوجد بروتوكول موحد للحصول على ASCs. النتائج متغيرة ، لأن العوامل المختلفة تعدل مورفولوجيتها ووظائفها. العمر والحالة الصحية للمانح ، والمصدر ، وظروف الثقافة من ASCs هي بعض هذه العوامل. وتركز المنهجية المقترحة على توحيد منهجية قابلة للتكرار تغطي أغراض التحقيقات المتنوعة. يسعى المجتمع العلمي جاهدا لإيجاد خيارات علاجية جديدة لتشخيص ومكافحة وعلاج الأمراض الأيضية المختلفة ، بما في ذلك مرض السكري. لذلك ، فإن الكشف عن الإجراءات المنهجية مهم أيضا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يعرب المؤلفون عن امتنانهم للمعهد المكسيكي للضمان الاجتماعي (IMSS) ومستشفى الأطفال في المكسيك ، فيديريكو غوميز (HIMFG) وموظفي Bioterio في تنسيق أبحاث IMSS ، للدعم المقدم لتنفيذ هذا المشروع. نشكر المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا على منحة AOC (815290) وأنطونيو دوارتي رييس على الدعم الفني في المواد السمعية والبصرية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B HyClone SV30078.01
Analytical balance Sartorius AX224
Antibody anti- CD9 (C-4) Santa Cruz Sc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18) Santa Cruz Sc-7045
Antibody anti-C63 Santa Cruz Sc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 Santa Cruz Sc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 Santa Cruz Sc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 Novus NB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 Invitrogen SA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) RD Systems. No. F103B
Bottle Top Filter Sterile CORNING 10718003
Cell and Tissue Culture Flasks BIOFIL 170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides SIGMA Aldrich Z359629
Cell wells: 6 well with Lid CORNING 25810
Centrifuge conical tubes HeTTICH ROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubes Fischer Scientific M0018242_44797
Collagen IV Worthington LS004186
Cryovial SPL Life Science 43112
Culture tubes Greiner Bio-One 191180
CytExpert 2.0 Beckman Coulter Free version
CytoFlex LX cytometer Beckman Coulter FLOW-2463VID03.17
DMEM GIBCO 31600-034
DMSO SIGMA Aldrich 67-68-5
DraQ7 Dye Thermo Sc. D15106
EDTA SIGMA Aldrich 60-00-4
Eosin yellowish Hycel 300
Ethanol 96% Baker 64-17-5
Falcon tubes 15 mL Greiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 mL Greiner Bio-One 227261
Fetal Bovine Serum CORNING 35-010-CV
Gelatin SIGMA Aldrich 128111163
Gentamicin GIBCO 15750045
Glycerin-High Purity Herschi Trading 56-81-5
Hematoxylin AMRESCO 0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator Thermo Sc. 50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) Aranda SV057430
L-Glutamine GIBCO/ Thermo Sc. 25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5 Free version
Biological Safety Cabinet Class II NuAire 12082100801
Epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 100M 21.0028.001
Inverted microscope Olympus CK40 CK40-G100
Non-essential amino acids 100X GIBCO 11140050
Micro tubes 2 mL Sarstedt 72695400
Micro tubes 1,5 mL Sarstedt 72706400
Micropipettes 0.2-2 μL Finnpipette E97743
Micropipettes 2-20 μL Finnpipette F54167
Micropipettes 20-200 μL Finnpipette G32419
Micropipettes 100-1000 μL Finnpipette FJ39895
Nitrogen tank liquid Taylor-Wharton 681-021-06
Paraformaldehyde SIGMA Aldrich SLBC3029V
Penicillin / Streptomycin GIBCO/ Thermo Sc. 15140122
Petri dish Cell culture CORNING Inc 480167
Pipet Tips Axygen Scientific 301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium) PISA Agropecuaria Q-7833-215
Potassium chloride J.T.Baker 7447-40-7
Potassium Phosphate Dibasic J.T Baker 2139900
S1 Pipette Fillers Thermo Sc 9531
Serological pipette 5 mL PYREX L010005
Serological pipette 10 mL PYREX L010010
Sodium bicarbonate J.T Baker 144-55-8
Sodium chloride J.T.Baker 15368426
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous J.T Baker 7558-79-4
Sodium pyruvate GIBCO BRL 11840-048
Syringe Filter Sterile CORNING 431222
Spectrophotometer PerkinElmer Lambda 25 L6020060
Titer plate shaker LAB-LINE 1250
Transfer pipets Samco/Thermo Sc 728NL
Trypan Blue stain GIBCO 1198566
Trypsin From Porcine Pancreas SIGMA Aldrich 102H0234
Tween 20 SIGMA Aldrich 9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10x BioGenex HK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) Pet's Pharma Q-7972-025

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
  2. Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
  3. González, M. Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , Universidad de León. PhD thesis, http://hdl.handle.net/10612/3600 (2014).
  4. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  5. Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
  6. Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
  7. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
  8. Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221 (2013).
  9. Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
  10. Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
  11. Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
  12. Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
  13. Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
  14. Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765 (2019).
  15. Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126 (2021).
  16. Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
  17. Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
  18. Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615 (2011).
  19. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  20. Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
  21. Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
  22. Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
  23. Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
  24. Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
  25. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
  26. Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
  27. Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
  28. Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
  29. He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).

Tags

علم الأحياء، العدد 194،
عزل وتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية لفئران Sprague Dawley
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oliva Cárdenas, A.,… More

Oliva Cárdenas, A., Zamora-Rodríguez, B. C., Batalla-García, K. A., Ávalos-Rodríguez, A., Contreras-Ramos, A., Ortega-Camarillo, C. Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats. J. Vis. Exp. (194), e65172, doi:10.3791/65172 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter