Summary
Ce protocole décrit une méthodologie pour isoler et identifier les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (CSM) de rats Sprague Dawley.
Abstract
Les cellules mésenchymateuses adultes ont révolutionné la biologie moléculaire et cellulaire au cours des dernières décennies. Ils peuvent se différencier en différents types de cellules spécialisées, en plus de leur grande capacité d’auto-renouvellement, de migration et de prolifération. Le tissu adipeux est l’une des sources les moins invasives et les plus accessibles de cellules mésenchymateuses. Il a également été rapporté pour avoir des rendements plus élevés par rapport à d’autres sources, ainsi que des propriétés immunomodulatrices supérieures. Récemment, différentes procédures pour obtenir des cellules mésenchymateuses adultes à partir de différentes sources de tissus et d’espèces animales ont été publiées. Après avoir évalué les critères de certains auteurs, nous avons normalisé une méthodologie applicable à différents usages et facilement reproductible. Un pool de fraction vasculaire stromale (SVF) provenant de tissus adipeux périrénaux et épididymaires nous a permis de développer des cultures primaires avec une morphologie et une fonctionnalité optimales. Les cellules ont été observées collées à la surface plastique pendant 24 h et présentaient une morphologie semblable à celle d’un fibroblaste, avec des prolongements et une tendance à former des colonies. Des techniques de cytométrie en flux (FC) et d’immunofluorescence (IF) ont été utilisées pour évaluer l’expression des marqueurs membranaires CD105, CD9, CD63, CD31 et CD34. La capacité des cellules souches dérivées du tissu adipeux (CSA) à se différencier dans la lignée adipogène a également été évaluée à l’aide d’un cocktail de facteurs (4 μM d’insuline, 0,5 mM de 3-méthyl-iso-butyl-xanthine et 1 μM de dexaméthasone). Après 48 h, une perte progressive de la morphologie fibroblastoïde a été observée, et à 12 jours, la présence de gouttelettes lipidiques positives à la coloration rouge d’huile a été confirmée. En résumé, une procédure est proposée pour obtenir des cultures d’ASC optimales et fonctionnelles pour une application en médecine régénérative.
Introduction
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont fortement impacté la médecine régénérative en raison de leur grande capacité d’auto-renouvellement, de prolifération, de migration et de différenciation en différentes lignées cellulaires 1,2. Actuellement, de nombreuses recherches se concentrent sur leur potentiel pour le traitement et le diagnostic de diverses maladies.
Il existe différentes sources de cellules mésenchymateuses: moelle osseuse, muscle squelettique, liquide amniotique, follicules pileux, placenta et tissu adipeux, entre autres. Ils sont obtenus à partir de différentes espèces, y compris les humains, les souris, les rats, les chiens et les chevaux3. Les CSM dérivées de la moelle osseuse (CSMB) sont utilisées depuis de nombreuses années comme source majeure de cellules souches en médecine régénérative et comme alternative à l’utilisation de cellules souches embryonnaires4. Cependant, les CSM dérivées du tissu adipeux, ou cellules souches dérivées du tissu adipeux (CSA), sont une alternative importante avec de grands avantages en raison de leur facilité de collecte et d’isolement, ainsi que du rendement en cellules obtenues par gramme de tissu adipeux 5,6. Il a été signalé que le taux de récolte des ASC est généralement plus élevé que celui des CSB7. Il a été initialement proposé que la capacité réparatrice / régénérative des ASC était due à leur capacité à se différencier en d’autres lignées cellulaires8. Cependant, les recherches menées ces dernières années ont renforcé le rôle primordial des facteurs paracrines libérés par les ASC dans leur potentiel réparateur 9,10.
Le tissu adipeux (AT), en plus d’être une réserve d’énergie, interagit avec les systèmes endocrinien, nerveux et cardiovasculaire. Il est également impliqué dans la croissance et le développement postnatals, le maintien de l’homéostasie tissulaire, la réparation des tissus et la régénération. L’AT est composé d’adipocytes, de cellules musculaires lisses vasculaires, de cellules endothéliales, de fibroblastes, de monocytes, de macrophages, de lymphocytes, de préadipocytes et d’ASC. Ces derniers possèdent un rôle important en médecine régénérative en raison de leur faible immunogénicité11,12. Les ASC peuvent être obtenus par digestion enzymatique et traitement mécanique ou par explants de tissu adipeux. Les cultures primaires des ASC sont faciles à maintenir, à développer et à développer. La caractérisation phénotypique des ASC est essentielle pour vérifier l’identité des cellules en évaluant l’expression de marqueurs membranaires spécifiques à l’aide de méthodes telles que l’immunofluorescence et la cytométrie en flux13. L’International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) et l’International Society for Cellular Therapy (ISCT) ont défini que les ASC expriment CD73, CD90 et CD105, tout en manquant de l’expression de CD11b, CD14, CD19, CD45 et HLA-DR14. Ces marqueurs, tant positifs que négatifs, sont donc considérés comme fiables pour la caractérisation des ASC.
Ce projet était axé sur la description d’une procédure d’isolement et d’identification de cellules mésenchymateuses adultes extraites de l’AT de rats, car cette source de cellules ne présente pas de défis éthiques, contrairement aux cellules souches embryonnaires. Cela solidifie la procédure en tant qu’option viable en raison de la facilité d’accès et de la méthode peu invasive par rapport aux cellules souches dérivées de la moelle osseuse.
Les cellules mésenchymateuses de cette source tissulaire jouent un rôle important dans la médecine régénérative en raison de leurs capacités immunomodulatrices et de leur faible rejet immunitaire. Par conséquent, la présente étude est un élément fondamental de la recherche future sur leur sécrétome et leur application en tant que thérapie régénérative dans différentes maladies, y compris les maladies métaboliques telles que le diabète.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux lignes directrices mexicaines sur les soins aux animaux, basées sur les recommandations de l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexique). Le protocole a été examiné, approuvé et enregistré par le Comité d’éthique pour la recherche en santé de l’Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).
1. Ablation du tissu adipeux de rats par résection chirurgicale
- Préparer deux tubes coniques avec 20 mL de solution antimycotique saline-antibiotique tamponnée au phosphate 1x (PBS-AA) stérile (1x PBS, gentamicine [20 μg/mL] et amphotéricine [0,5 μg/mL]) et conserver sur la glace.
- Choisissez deux rats Sprague Dawley mâles adultes (R. norvegicus) en bonne santé. Assurez-vous que les rats ont entre 3-4 mois et ont un poids cooral de 350-450 g.
- Procéder à la sédation avec 20 mg / kg de chlorhydrate de xylazine et, 5 minutes plus tard, administrer un anesthésique à une dose de 120 mg / kg de chlorhydrate de kétamine par voie intrapéritonéale. Lubrifiez les deux yeux avec une pommade ophtalmique pour éviter le dessèchement. Ensuite, confirmez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de pédale.
- Rasez et désinfectez la région abdominale et inguinelle avec une solution d’iode. Appliquez des champs chirurgicaux pour maintenir la stérilité. Ensuite, faites une incision longitudinale médiane du sternum à la région testiculaire.
- Retirer le tissu adipeux entourant l’épididyme et les reins avec une pince stérile et placer dans la solution 1x PBS-AA. Conservez les échantillons sur la glace.
- Suturer l’incision fermée si nécessaire selon les directives institutionnelles et euthanasier les animaux avec une dose intracardiaque de 40 mg / kg de pentobarbital sodique. Une fois le décès confirmé, éliminer la carcasse en suivant la ou les procédures institutionnelles.
REMARQUE: La mort provoque des mécanismes de signalisation qui affectent l’immunophénotype, la capacité de différenciation et l’effet paracrine des cellules mésenchymateuses. Par conséquent, la collecte de tissus est effectuée avant l’euthanasie.
2. Isolement des cellules mésenchymateuses du tissu adipeux
- Retirez le tissu adipeux à l’aide d’une pince stérile dans une enceinte de biosécurité et placez-le sur du papier filtre stérile dans une boîte de Petri de 100 mm de diamètre pour absorber l’excès de PBS.
- Transférer le tissu adipeux dans une autre boîte de Petri et effectuer trois lavages de 5 minutes chacun avec 10 ml de 1x solution PBS-AA à l’aide d’une pipette de 10 ml.
- Désagréger mécaniquement le tissu en fragments d’environ 1 cm2 à l’aide de ciseaux et d’un scalpel.
- Préparer la collagénase de type IV (0,075 %) dans 20 mL de milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) non supplémenté. Filtrer à travers un filtre à seringue de 0,22 μm et maintenir à 37 °C.
- Ajouter la solution de collagénase (20 mL) préparée à l’étape 2.4 dans un bécher en cristal avec le tissu fragmenté et une barre magnétique. Sceller le récipient et incuber sous agitation lente et continue à 37 °C.
REMARQUE: La digestion enzymatique dure environ 90 minutes (maintenir une agitation lente pour préserver l’intégrité des membranes cellulaires). - Filtrer l’homogénat à travers un filtre à 40 mailles en acier inoxydable à ouverture de 0,38 mm sur une boîte de Petri de 100 mm et recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique stérile de 50 mL.
- Ajouter 20 mL de DMEM réchauffé et supplémenté (sérum bovin fœtal à 10 %, glutamine 2 mM, pyruvate de sodium 2 mM, solution d’acides aminés non essentiels 100x et solution antimycotique antibiotique [AA] 100x). Suspendre délicatement la fraction vasculaire stromale (SVE).
- Centrifuger la suspension cellulaire à 290 x g pendant 10 min, jeter le surnageant avec une pipette de 25 ml et laver délicatement les cellules avec 40 mL d’un milieu DMEM non supplémenté.
- Répétez cette étape. Utilisez un nouveau tube conique stérile entre les étapes pour faire glisser le moins de détritus cellulaires et de graisse.
- Suspendre la pastille dans 5 mL de DMEM supplémenté avec une pipette de 5 mL et transférer dans une bouteille T-25 cm2 . Incuber pendant 24 h à 37 °C et 5% CO2.
- Le lendemain, effectuez trois lavages avec 5 mL de 1x PBS-AA chauffé et deux lavages avec du DMEM non supplémenté pour éliminer les débris cellulaires et les cellules non adhérentes. Ajouter 5 ml de DMEM frais, réchauffé et supplémenté à l’aide d’une pipette de 5 ml et changer le milieu tous les 3-4 jours.
3. Maintien et expansion des cultures primaires de l’ASC
- Une fois que les cellules atteignent 90% - 100% de confluence (8 ± 2 jours), laver deux fois avec 5 ml de DMEM non supplémenté. Ajouter 1 mL d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) réchauffé à 0,025 % de trypsine-2 mM et incuber pendant 5 à 7 minutes à 37 °C.
- Lorsque la monocouche cellulaire est détachée, ajouter 4 mL de DMEM supplémenté et désagréger doucement la suspension cellulaire.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL, ajouter 5 mL de DMEM réchauffé et supplémenté et suspendre doucement pour homogénéiser.
- Centrifuger à 290 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant et mélanger délicatement la pastille dans 1 mL de DMEM supplémenté. Compter les cellules dans une chambre de Neubauer après coloration au bleu de trypan.
- Enfin, semer 2,5 x 103 cellules/cm2 à un rapport fractionné de 1:4 dans des fioles T-75. Cette étape assure la formation de colonies et un taux de prolifération élevé.
4. Caractérisation morphologique des cultures primaires ASC
- Observer la morphologie des ASC sous microscopie inversée.
REMARQUE: Avant le montage pour l’histologie et l’identification ASC, traiter les lamelles de couverture avec une solution de gélatine à 1%. Irradier aux UV pendant 15 min.- Retirer les lamelles de couverture de la solution d’éthanol à 70% et les laisser sécher pendant 5 min.
- Immerger les lames de couverture dans une solution stérile de gélatine à 1 %, égoutter et sécher à température ambiante (RT).
- Placez chaque lamelle de couverture dans chaque puits d’une plaque de 6 puits et irradiez les plaques avec de la lumière UV pendant 15 min.
- Ensemencer une goutte contenant 25 x 103 cellules au centre du puits, attendre 1 min et ajouter 1 mL de milieu DMEM supplémenté. Incuber pendant 96 h à 37 °C et 5% CO2.
- Retirez le milieu et effectuez trois lavages avec 1x PBS-AA à l’aide d’une pipette de transfert.
- Ajouter 1 mL de formol neutre à 3,5 % dans chaque puits et incuber pendant 1 h à TA. Retirer délicatement le formol et ajouter 1 mL d’éthanol froid à 70 % dans chaque puits.
- Sceller la plaque avec du parafilm jusqu’à utilisation, pour éviter le dessèchement.
NOTE: La morphologie cellulaire des ASC est également évaluée par coloration de l’hématoxyline-éosine au cours de différents passages. - Retirez l’éthanol à 70% de chaque puits et hydratez les cellules pendant 5 min avec de l’eau distillée. Pendant ce temps, filtrer les solutions de coloration.
- Retirer l’eau et colorer les cellules sous agitation lente pendant 15 min avec la solution d’hématoxyline de Harris.
- Retirez la solution de coloration et effectuez deux lavages avec 1x PBS.
- Colorer les cellules avec une solution d’éosine sous agitation lente pendant 1 min. Ensuite, retirez la solution et effectuez deux lavages avec 1x PBS.
- Retirez délicatement les lames de couvercle de chaque puits et montez les lames sur une goutte de solution de montage PBS-glycérol (1:1 v/v).
- Placez une ligne de vernis à ongles autour de la lamelle de couverture et observez les lames histologiques au microscope optique.
5. Marqueurs d’expression des ASC par immunofluorescence
- Préparez le tampon de lavage contenant 1x PBS-0,05% Tween 20. Effectuer les lavages à RT et avec des secousses lentes. Lavez les assiettes trois fois avec 2 ml de tampon/puits (incuber pendant 3 min pour chaque lavage).
- Placer 1 mL de réactif bloquant (1:10) et incuber en agitant lentement pendant 20 min.
- Ajouter 200 μL (dilution 1:50) des anticorps primaires suivants dans chaque puits : CD9 (souris monoclonale), CD34 (lapin polyclonal) et anti-CD63 (chèvre polyclonale). Incuber pendant une nuit à 4 °C.
- Laver les plaques trois fois de nouveau et incuber avec 200 μL (dilution 1:50) des anticorps secondaires suivants: chèvre conjuguée anti-souris IgG FITC, âne anti-chèvre IgG DyeLight 550 et chèvre anti-lapin IgG Cy3.
- Laver trois fois avec 1x PBS-0,05% Tween 20 et contre-colorer les noyaux cellulaires avec 100 μL de DRAQ-7 (dilution: 17 μL dans 1 mL d’eau distillée double) pendant 20 min.
- Lavez trois fois de plus et montez les lames conformément aux étapes 4.1.12-4.1.13. Conservez les échantillons à l’abri de la lumière et congelés jusqu’à utilisation.
- Visualisez les échantillons sous microscopie confocale à épifluorescence à l’aide des paramètres appropriés et du logiciel recommandé pour cet équipement.
6. Marqueurs d’expression des ASC par cytométrie de flux
- Ajuster une suspension unicellulaire à partir de cellules trypsinisées ou décongelées (sous-passages 3 ou 4) à une concentration de 1 x 106 cellules/mL de 1x PBS-5% FBS. Aliquote 100 μL avec 100 000 cellules dans des tubes centrifugeuses de 1,5 mL. Utilisez une partie aliquote sans marquage pour le contrôle de l’autofluorescence.
- Ajouter au repos toutes les quantités appropriées d’Anti-CD105 AF-594 et d’Anti-CD31 AF-680, selon les instructions du fabricant. Incuber dans l’obscurité pendant 20 min à 4 °C.
- Laver l’excès de tache avec 1 mL de 1x PBS-5% FBS par centrifugation à 250 x g pendant 5 min et suspendre dans 300 μL de formol à 1%.
- Effectuer l’acquisition d’échantillons sur un cytomètre en flux. La stratégie de contrôle des cellules est basée sur le contrôle FSC-A par rapport à SSC-A, les cellules individuelles sont fermées en utilisant SSC-H par rapport à SSC-A suivies de FSC-A par rapport à FSC-H.
- Utilisez le détecteur Y610-mCherry-A pour le détecteur CD105 AF-594 et le détecteur R660-APC-A pour CD31 AF-680.
7. Différenciation des ASC par rapport à la lignée adipogène
- Dans une plaque à 6 puits, ensemencer 1 x 10 4 cellules (P-4) par cm2 et incuber à 37 °C, 5% CO2, jusqu’à confluence à 60-80% (~72-96 h). Induire la différenciation, en appliquant directement sur le milieu de culture : 4 μM d’insuline, 1 μM de dexaméthasone 21-acétate (Dxa), et 0,5 mM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (MIX). Changez le milieu de différenciation tous les 2-3 jours.
- Préparer une solution mère d’insuline 800 μM dans 2 mL d’eau ultrapure stérile (ajouter 20 μL de HCl 1 N pour assurer une dissolution complète) et conserver à -20 °C. Ajouter 10 μL de stock d’insuline, préalablement dilué 1:100, et appliquer 10 μL à un volume final de 2 mL par puits.
- Préparer une solution mère de 1 mM Dxa dans 5 mL d’eau ultrapure stérile (notez qu’il n’y a pas dissolution complète). Conserver à 4 °C. Ajouter 40 μL/puits d’une dilution 1:4 du stock de Dxa.
- Préparer un bouillon de 100 mM de MIX dans 2,5 mL de NaOH 0,1 N, vortex, et ajouter 40 μL de NaOH 1 N pour une dissolution complète. Conserver à -70 °C. Ajouter 10 μL/puits de bouillon MIX.
- Filtrer les solutions mères à travers un filtre à seringue stérile de 0,22 μm avant de les stocker.
- Le jour 12, laver les cellules trois fois avec 1x PBS et incuber avec 500 μL de formol à 4 % pendant 1 h à TA. Laver chaque puits deux fois avec de l’eau distillée suivie de 60% d’isopropanol pendant 5 min et laisser sécher.
- Ajouter 0,5 % de rouge d’huile O dilué dans de l’isopropanol à 60 % (500 μL/puits) et incuber pendant 20 min à TA. Laver trois fois avec 1 mL d’eau distillée et observer au microscope inversé.
REMARQUE : Pour connaître les réactifs, l’équipement et les matériaux requis, reportez-vous au Tableau des matériaux.
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Representative Results
Le tissu adipeux a été obtenu à partir de rats Sprague Dawley adultes âgés de 3 à 4 mois et pesant 401 ± 41 g (moyenne géométrique ± écart-type). Une valeur moyenne de 3,8 g de tissu adipeux pérididymaire et périrénal correspondait à l’analyse de 15 extractions expérimentales. Après 24 h de culture, les populations cellulaires sont restées collées à la surface plastique et présentaient une morphologie hétérogène. Le premier passage a été réalisé à 8 ± 2 jours, avec un rendement de 1,4 ± 0,6 x 106 cellules dans un total de huit expériences. L’observation directe en champ clair (Figure 1) et la coloration à l’hématoxyline-éosine (Figure 2) ont facilité la caractérisation morphologique par microscopie optique. Un cytoplasme étendu était visible avec des prolongations allongées et des microfilaments intracellulaires abondants, une caractéristique des cellules stromales mésenchymateuses.
Les ASC ont exprimé des marqueurs de surface spécifiquement visualisés par immunofluorescence indirecte dans différents sous-passages (1, 3, 7 et 9) (Figure 3). Les ASC étaient positifs à 100 % pour les marqueurs de surface CD9 dans tous les sous-passages testés. Le pourcentage est le nombre de cellules positives par rapport au nombre total de cellules comptées dans cinq micrographies prises au hasard. Les cellules (100%) exprimaient les marqueurs CD63 dans les sous-passages 1, 3 et 9 (P-1, P-3, P-9), tandis que 49,3% l’ont fait dans P-7. Le marqueur CD34 était négatif dans les passages 1, 7 et 9, mais des résultats d’étiquetage positifs ont été observés dans le passage 3. De plus, l’immunophénotypage par FCM a montré que 98,7 % de la population cellulaire était positive pour CD105, alors que seulement 5,88 % exprimaient le marqueur CD31 (Figure 4).
Enfin, les ASC exposés à un cocktail de facteurs de différenciation pendant 12 jours ont montré leur capacité à se différencier vers la lignée adipogène (Figure 5). Après 48 h, nous avons observé les premiers changements dans la morphologie; Les cellules ont diminué en taille et présentaient une forme arrondie. Après 7 jours, les vésicules lipidiques étaient visibles, qui étaient positives pour la coloration rouge huileuse 12 jours après la différenciation.
Figure 1 : Fraction vasculaire stromale (SVF) extraite du tissu adipeux du rat et digérée avec 0,075% de collagénase (à 24 h). (A) SVF (20x). (B) SVF a suivi cinq lavages (10x). Les cellules adhérant à la surface plastique présentent une morphologie hétérogène : arrondie, en forme d’étoile et d’apparence fibroblastoïde (microscope inversé). La barre d’échelle représente 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Caractérisation morphologique avec coloration à l’hématoxyline-éosine. a) ASC, P-1 (10x). b) ASC, P-1, C) P-3 et D) P-9 (100x). La barre d’échelle représente 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Évaluation de différents marqueurs d’expression pour les ASC et les exosomes par FI. Axe X : passages 1, 3, 7 et 9. Axe Y: CD9: chèvre conjuguée anti-souris IgG FITC; CD63: chèvre anti lapin IgG Cy3; et CD34 : âne anti-chèvre IgG DyeLight 550. Noyaux colorés en bleu avec DraQ7 (grossissement 40x, zoom 1x). La barre d’échelle représente 100 μm dans chaque panneau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Identification de l’ASC par cytométrie en flux. (A-C) Échantillons sélectionnés en fonction du critère FSC-A par rapport au SSC-A, cellules individuelles fermées à l’aide de SSC-H par rapport à SSC-A suivies de FSC-A par rapport à FSC-H. (D, E) Contrôle de l’autofluorescence (cellules non marquées). (F,G) ASC marqués avec anti-CD105 AF-594 (Y610 mCherry; marqueur positif) et anti-CD31 AF-680 (détecteur R660-APC-A; marqueur négatif), respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Évaluation fonctionnelle des cellules stromales mésenchymateuses du tissu adipeux du rat. (A) Contrôle (10x). (B) Différenciation adipogène 10x, (C) 20x et (D) 40x. Gouttelettes lipidiques intracytoplasmiques positives au colorant rouge huileux à 12 jours d’induction (microscopie à contraste de phase). La barre d’échelle représente 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Au cours des quatre dernières décennies, depuis la découverte des CSM, plusieurs groupes de chercheurs ont décrit des procédures pour obtenir des CSM à partir de différents tissus et espèces. L’un des avantages de l’utilisation de rats comme modèle animal est leur facilité d’entretien et leur développement rapide, ainsi que la facilité d’obtenir des CSM à partir de tissu adipeux. Différentes sources tissulaires ont été décrites pour obtenir des ASC, telles que la graisse viscérale, périrénale, épididymaire et sous-cutanée 12,13,14,15,16.
En ce qui concerne la procédure d’extraction utilisée ici, les auteurs recommandent que les rats pèsent entre 350 et 450 g, réalisable au cours des 4 premiers mois de la vie. Lorsque les animaux pesaient entre 450 et 600 g et étaient âgés de moins de 8 mois, la quantité de tissu adipeux par rat (5,5 ± 2,1; moyenne ± écart-type) était plus élevée; toutefois, le nombre d’ASC n’a pas augmenté proportionnellement (données non présentées). Ces observations sont en correspondance avec celles faites par González3, qui a également référé des populations ayant une viabilité et une adhérence plus élevées à la surface de culture obtenue à partir du tissu sous-cutané, par rapport à d’autres sources. D’autre part, les ASC issus de la résection par biopsie présentent une viabilité, une fréquence et une capacité de réplication supérieures à celles obtenues par liposuccion7. Dans la présente étude, le tissu sous-cutané des rats aux âges étudiés était très rare. Nous avons donc décidé de retirer le tissu adipeux adjacent à l’épididyme et à la région périrénale, qui sont impliqués dans la synthèse et la sécrétion d’adipokines pertinentes pour la régulation du glucose et des lipides, ainsi que l’inflammation16, par résection chirurgicale.
Les protocoles actuels d’isolement des CSM dérivées du tissu adipeux reposent sur des procédures de traitement sans enzymes, telles que la culture explant17, ainsi que sur l’utilisation de traitements enzymatiques pour obtenir une désagrégation tissulaire quasi totale18. La procédure proposée est relativement simple et comprend la désagrégation mécanique, la désagrégation enzymatique et les lavages successifs à la suspension cellulaire. Ce dernier est réalisé pour retirer autant de cellules non apparentées que possible des cellules progénitrices, et ainsi obtenir une expression minimale (<5%) de leurs marqueurs de surface. Fait intéressant, les quantités de SVF à obtenir peuvent dépendre du type de collagénase utilisé dans la désagrégation enzymatique du tissu adipeux. La collagénase de type I est fortement recommandée pour l’isolement des adipocytes, bien que l’utilisation des types II19 et VIII soit également signalée20,21. Dans le présent travail, nous avons utilisé la collagénase de type IV, avec une faible activité enzymatique, généralement utilisée pour traiter le tissu pancréatique. Ainsi, un rendement plus faible en ASC est obtenu, mais il y a aussi moins de dommages à la membrane. Cela peut modifier l’expression de certains marqueurs de surface, et donc leur fonctionnalité. D’autre part, le faible taux de division utilisé dans l’expansion de la culture a permis la formation de colonies et une plus grande capacité de prolifération.
Selon la morphologie, il existe trois principaux types de cellules mésenchymateuses : les petites cellules, les cellules allongées et les grandes cellules aplaties avec de gros noyaux qui sont lentes à se multiplier. Ces formes sont probablement liées à des qualités intrinsèques, comme leur potentiel de différenciation22. La morphologie observée dans les cultures primaires d’ASC est cohérente avec les résultats rapportés par ces auteurs. Un nombre abondant de microfilaments dans le cytoplasme était également visible à tous les stades évalués, ce qui corrobore la morphologie fibroblastoïde des ASC obtenus dans l’étude23,24,25. De plus, l’immunophénotypage est nécessaire pour confirmer la nature mésenchymateuse des cellules isolées. L’ISCT et l’IFATS recommandent l’utilisation de certains marqueurs, bien que d’autres alternatives soient également possibles. On sait que les CSM peuvent produire de grandes quantités d’exosomes26 qui sont de petites vésicules sécrétées dans le milieu extracellulaire avec une teneur en protéines particulière. En raison de leur origine endosomique, ils contiennent des protéines de fusion et de transport membranaire (GTPases, annexines et flottilline), des tétraspanines (CD9, CD63, CD81 et CD82), entre autres, également exprimées à la surface des cellules dont ils proviennent17,18. Une limite de cette étude est qu’un large panel de marqueurs n’est pas évalué. Cependant, l’utilisation d’au moins deux marqueurs positifs et négatifs dans le même test est acceptée.
Dans ce travail, l’immunofluorescence indirecte avec des marqueurs exosomaux a révélé un signal positif des ASC aux marqueurs CD9 et CD63 dans les sous-passages 1, 3, 7 et 9. Le signal observé au passage 7 étant faible, il serait important d’utiliser les marqueurs recommandés par l’ISCT et l’IFATS pour obtenir de meilleurs résultats. CD34 est un antigène de surface reconnu comme marqueur de cellules endothéliales et hématopoïétiques et un marqueur positif des cellules dérivées de la SVF du tissu adipeux. Cependant, son expression sur les ASC natifs est en corrélation négative avec l’expansion cellulaire in vitro27. Le pourcentage de cellules CD34+ dépend de la méthode de prélèvement du tissu adipeux, du degré d’hémorragie vasculaire et des techniques subséquentes de digestion et d’isolement. Bien que les ASC expriment systématiquement des marqueurs différents, il a été démontré que leur dynamique change au cours de l’expansion in vitro 28,29, comme en témoignent les résultats obtenus avec la méthodologie proposée.
À l’heure actuelle, il n’existe pas de protocole normalisé pour l’obtention d’ASC. Les résultats sont variables, car différents facteurs modifient sa morphologie et sa fonctionnalité. L’âge et l’état de santé du donneur, la source et les conditions de culture des ASC sont quelques-uns de ces facteurs. La méthodologie proposée est axée sur la normalisation d’une méthodologie reproductible qui couvre les objectifs de diverses enquêtes. La communauté scientifique s’efforce de trouver de nouvelles options thérapeutiques pour le diagnostic, le contrôle et le traitement de diverses maladies métaboliques, y compris le diabète. Par conséquent, la divulgation des procédures méthodologiques est également pertinente.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs remercient l’Institut mexicain de sécurité sociale (IMSS) et l’Hôpital pour enfants du Mexique, Federico Gomez (HIMFG) et le personnel Bioterio de la coordination de recherche de l’IMSS, pour le soutien apporté à la réalisation de ce projet. Nous remercions le Conseil national de la science et de la technologie pour la bourse AOC (815290) et Antonio Duarte Reyes pour le soutien technique dans le matériel audiovisuel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
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