Summary
פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה לבידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים (MSC) שמקורם ברקמת שומן מחולדות Sprague Dawley.
Abstract
תאים מזנכימליים בוגרים חוללו מהפכה בביולוגיה המולקולרית ובביולוגיה התאית בעשורים האחרונים. הם יכולים להתמיין לסוגי תאים מיוחדים שונים, בנוסף ליכולתם הגדולה להתחדשות עצמית, הגירה והתפשטות. רקמת השומן היא אחד המקורות הפחות פולשניים והנגישים ביותר של תאים מזנכימליים. כמו כן, דווח כי יש לו תשואות גבוהות יותר בהשוואה למקורות אחרים, כמו גם תכונות אימונומודולטוריות מעולות. לאחרונה פורסמו נהלים שונים להשגת תאים מזנכימליים בוגרים ממקורות רקמה שונים וממיני בעלי חיים. לאחר הערכת הקריטריונים של מחברים מסוימים, תיקננו מתודולוגיה ישימה למטרות שונות וניתנת לשחזור בקלות. מאגר של מקטע כלי דם סטרומה (SVF) מרקמת שומן פרירנלית ואפידידימלית איפשר לנו לפתח תרביות ראשוניות עם מורפולוגיה ופונקציונליות אופטימליות. התאים נצפו דבוקים למשטח הפלסטיק במשך 24 שעות, והציגו מורפולוגיה דמוית פיברובלסט, עם הארכות ונטייה ליצור מושבות. טכניקות ציטומטריית זרימה (FC) ואימונופלואורסנציה (IF) שימשו להערכת הביטוי של סמני הממברנה CD105, CD9, CD63, CD31 ו- CD34. יכולתם של תאי גזע שמקורם בשומן (ASC) להתמיין לשושלת האדיפוגנית הוערכה גם באמצעות קוקטייל של גורמים (4 מיקרומטר אינסולין, 0.5 מילימטר 3-מתיל-איזו-בוטיל-קסנטין ו-1 מיקרומטר דקסמתזון). לאחר 48 שעות, אובדן הדרגתי של מורפולוגיה פיברובלסטואיד נצפתה, ובגיל 12 ימים, נוכחות של טיפות שומנים חיובי שמן כתמים אדום אושר. לסיכום, מוצע הליך להשגת תרביות ASC אופטימליות ותפקודיות ליישום ברפואה רגנרטיבית.
Introduction
תאי גזע מזנכימליים (MSCs) השפיעו מאוד על הרפואה הרגנרטיבית בשל יכולתם הגבוהה להתחדשות עצמית, התפשטות, הגירה והתמיינות לשושלות תאים שונות 1,2. כיום, מחקרים רבים מתמקדים בפוטנציאל שלהם לטיפול ואבחון של מחלות שונות.
ישנם מקורות שונים של תאים מזנכימליים: מח עצם, שרירי שלד, מי שפיר, זקיקי שיער, שליה ורקמת שומן, בין היתר. הם מתקבלים ממינים שונים, כולל בני אדם, עכברים, חולדות, כלבים וסוסים3. MSCs שמקורם במח עצם (BMSCs) שימשו במשך שנים רבות כמקור עיקרי לתאי גזע ברפואה רגנרטיבית וכחלופה לשימוש בתאי גזע עובריים4. עם זאת, MSCs נגזר שומן, או תאי גזע נגזר שומן (ASC), הם חלופה חשובה עם יתרונות גדולים בשל קלות האיסוף והבידוד שלהם, כמו גם את התשואה של תאים המתקבלים לכל גרם של רקמת שומן 5,6. דווח כי קצב הקציר של ASCs הוא בדרך כלל גבוה יותר מזה של BMSCs7. בתחילה הוצע כי יכולת התיקון/התחדשות של ASCs נובעת מיכולתם להתמיין לשושלות תאים אחרות8. עם זאת, מחקרים בשנים האחרונות חיזקו את התפקיד העיקרי של גורמים פרקריניים ששוחררו על ידי ASCs בפוטנציאל התיקון שלהם 9,10.
רקמת השומן (AT), בנוסף להיותה עתודת אנרגיה, מקיימת אינטראקציה עם המערכת האנדוקרינית, העצבים והלב וכלי הדם. הוא מעורב גם בצמיחה והתפתחות לאחר הלידה, תחזוקה של הומאוסטזיס רקמות, תיקון רקמות, והתחדשות. ה- AT מורכב מאדיפוציטים, תאי שריר חלק של כלי הדם, תאי אנדותל, פיברובלסטים, מונוציטים, מקרופאגים, לימפוציטים, פרדיפויטים ו- ASC. אלה האחרונים בעלי תפקיד חשוב ברפואה רגנרטיבית בשל האימונוגניות הנמוכה שלהם11,12. ASCs ניתן להשיג על ידי עיכול אנזימטי ועיבוד מכני או על ידי חצילים רקמת שומן. תרבויות ראשוניות של ASCs קלות לתחזוקה, צמיחה והרחבה. אפיון פנוטיפי של ASCs חיוני כדי לאמת את זהות התאים על ידי הערכת הביטוי של סמנים ספציפיים בממברנה באמצעות שיטות כגון immunofluorescence ו cytometry זרימה13. הפדרציה הבינלאומית לטיפולי שומן ומדע (IFATS) והאגודה הבינלאומית לטיפול תאי (ISCT) הגדירו כי ASCs מבטאים CD73, CD90 ו- CD105, בעוד שחסרים את הביטוי של CD11b, CD14, CD19, CD45 ו- HLA-DR14. סמנים אלה, הן חיוביים והן שליליים, נחשבים לפיכך אמינים לאפיון ASC.
פרויקט זה התמקד בתיאור הליך לבידוד וזיהוי של תאים מזנכימליים בוגרים שהופקו מתאי AT, שכן מקור תאים זה אינו מציב אתגרים אתיים, בניגוד לתאי גזע עובריים. זה ממצק את ההליך כאפשרות מעשית בגלל קלות הגישה והשיטה הזעיר פולשנית בהשוואה לתאי גזע שמקורם במח עצם.
לתאים מזנכימליים ממקור רקמה זה יש תפקיד חשוב ברפואה רגנרטיבית בגלל יכולותיהם האימונומודולטוריות ודחייה חיסונית נמוכה. לכן, המחקר הנוכחי הוא חלק מהותי במחקר עתידי על הפרשתם ויישומם כטיפול רגנרטיבי במחלות שונות, כולל מחלות מטבוליות כגון סוכרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם להנחיות המקסיקניות לטיפול בבעלי חיים, בהתבסס על המלצות האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה בינלאומיות (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, מקסיקו). הפרוטוקול נבדק, אושר ונרשם על ידי ועדת האתיקה לחקר הבריאות של המכון המקסיקני דל סגורו חברתי (R-2021-785-092).
1. הסרת רקמת שומן מחולדות על ידי כריתה כירורגית
- הכינו שני צינורות חרוטיים עם 20 מ"ל של תמיסת מלח אנטי-מיקרוטית סטרילית 1x פוספט חוצץ (PBS-AA) (1x PBS, גנטמיצין [20 מיקרוגרם/מ"ל], ואמפוטריצין [0.5 מיקרוגרם/מ"ל]) ושמרו על קרח.
- בחר שני זכרים בוגרים של חולדות Sprague Dawley (R. norvegicus) במצב בריאותי טוב. ודאו שהחולדות בנות 3-4 חודשים ומשקלן הקופורלי הוא 350-450 גרם.
- המשך להרגעה עם 20 מ"ג / ק"ג קסילזין הידרוכלוריד, וכעבור 5 דקות, מתן הרדמה עם מינון של 120 מ"ג / ק"ג קטמין הידרוכלוריד תוך צפקי. יש לשמן את שתי העיניים במשחה אופתלמית למניעת התייבשות. לאחר מכן, יש לוודא את עומק ההרדמה באמצעות חוסר רפלקס דוושה.
- לגלח ולחטא את אזור הבטן והמפשעה עם תמיסת יוד. החל וילונות כירורגיים כדי לשמור על סטריליות. לאחר מכן, בצע חתך אורכי חציוני מעצם החזה לאזור האשכים.
- הסר את רקמת השומן המקיפה הן את האפידידימיס והן את הכליות באמצעות מלקחיים סטריליים ומקם בתמיסת PBS-AA 1x. שמור את הדגימות על קרח.
- יש לתפור את החתך סגור במידת הצורך בהתאם להנחיות המוסדיות ולהרדים את בעלי החיים במינון תוך לבבי של 40 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל. לאחר אישור המוות, יש להשליך את הפגר בהתאם להליכים מוסדיים.
הערה: המוות מעורר מנגנוני איתות המשפיעים על אימונופנוטיפ, יכולת התמיינות והשפעה פרקרינית של תאים מזנכימליים. לפיכך, איסוף רקמות מבוצע לפני המתת חסד.
2. בידוד תאים מזנכימליים מרקמת השומן
- הסר את רקמת השומן עם מלקחיים סטריליים בתוך ארון בטיחות ביולוגית והנח אותה על נייר סינון סטרילי בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ כדי לספוג PBS עודף.
- מעבירים את רקמת השומן לצלחת פטרי אחרת ומבצעים שלוש שטיפות במשך 5 דקות כל אחת עם 10 מ"ל של תמיסת PBS-AA אחת באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.
- מכנית לפרק את הרקמה לשברים של כ 1 ס"מ2 באמצעות מספריים ואזמל.
- הכינו collagenase סוג IV (0.075%) ב 20 מ"ל של מדיום הנשר של Dulbecco ללא תוספת (DMEM). יש לסנן דרך מסנן מזרקים בגודל 0.22 מיקרומטר ולשמור על טמפרטורה של 37°C.
- הוסף את תמיסת הקולגנאז (20 מ"ל) שהוכנה בשלב 2.4 לתוך קריסטל עם הרקמה המקוטעת ופס מגנטי. יש לאטום את המיכל ולדגור תחת תסיסה איטית ומתמשכת בטמפרטורה של 37°C.
הערה: העיכול האנזימטי אורך כ-90 דקות (יש לשמור על ערבוב איטי כדי לשמור על שלמות קרומי התא). - סנן את ההומוגנט דרך נירוסטה, 40 רשת, מסנן צמצם 0.38 מ"מ על צלחת פטרי 100 מ"מ ולאסוף את מתלה התא בצינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל.
- הוסף 20 מ"ל של DMEM מחומם בתוספת (10% סרום בקר עוברי [FBS], 2 מ"מ גלוטמין, 2 מ"מ נתרן פירובט, 100x תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות, ותמיסה אנטי-מיקוטית אנטיביוטית 100x [AA]). בזהירות להשעות את מקטע כלי הדם סטרומה (SVE).
- צנטריפוגה את תרחיף התא ב 290 x גרם במשך 10 דקות, להשליך את supernatant עם פיפטה 25 מ"ל, ולשטוף בעדינות את התאים עם 40 מ"ל של מדיום DMEM ללא תוספת.
- חזור על שלב זה. השתמש בצינור חרוטי סטרילי חדש בין השלבים כדי לגרור את הכמות הקטנה ביותר של פסולת תאית ושומן.
- להשעות את הגלולה ב 5 מ"ל של DMEM בתוספת עם פיפטה 5 מ"ל ולהעביר T-25 ס"מ2 בקבוק. יש לדגור במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- למחרת, בצע שלוש שטיפות עם 5 מ"ל של PBS-AA מחומם 1x ושתי שטיפות עם DMEM ללא תוספת כדי להסיר פסולת תאים ותאים שאינם דבקים. הוסף 5 מ"ל של DMEM טרי, מחומם, בתוספת פיפטה 5 מ"ל ולשנות את המדיום כל 3-4 ימים.
3. שימור והרחבה של התרבויות הראשוניות של ASC
- ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 90%-100% (8 ± יומיים), יש לשטוף פעמיים עם 5 מ"ל DMEM ללא תוסף. הוסף 1 מ"ל של 0.025% מחומם טריפסין-2 mM חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) ודגור במשך 5-7 דקות ב 37 ° C.
- כאשר monolayer התא מנותק, להוסיף 4 מ"ל של DMEM בתוספת בעדינות לפרק את השעיית התא.
- מעבירים את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל, מוסיפים 5 מ"ל של DMEM מחומם, בתוספת ומשהה בעדינות להומוגניזה.
- צנטריפוגה ב 290 x גרם במשך 5 דקות. יש להשליך את הסופרנאטנט ולערבב בעדינות את הגלולה ב-1 מ"ל של תוסף DMEM. ספרו את התאים בתא נויבאואר לאחר צביעה בכחול טריפאן.
- לבסוף, זרע 2.5 x 103 תאים/ס"מ2 ביחס פיצול של 1:4 בצלוחיות T-75. צעד זה מבטיח היווצרות מושבות וקצב ריבוי גבוה.
4. אפיון מורפולוגיה של תרבויות ראשוניות ASC
- שימו לב למורפולוגיה של ASCs תחת מיקרוסקופ הפוך.
הערה: לפני ההרכבה לצורך זיהוי היסטולוגיה ואוטיזם, יש לטפל בכיסויים בתמיסת ג'לטין 1%. הקרינו עם UV במשך 15 דקות.- הסירו את הכיסויים מתמיסת אתנול 70% והניחו להם להתייבש במשך 5 דקות.
- יש לטבול את החלקות בתמיסת ג'לטין סטרילית 1%, לנקז ולייבש בטמפרטורת החדר (RT).
- הכניסו כל מכסה לכל באר של צלחת בעלת 6 בארות והקרינו את הצלחות באור UV למשך 15 דקות.
- זרעו טיפה המכילה 25X103 תאים במרכז הבאר, המתינו דקה והוסיפו 1 מ"ל של מדיום DMEM מוסף. יש לדגור במשך 96 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- מוציאים את המדיום ומבצעים שלוש שטיפות עם 1x PBS-AA באמצעות פיפטת העברה.
- הוסף 1 מ"ל של פורמלין נייטרלי 3.5% לכל באר ודגר במשך שעה אחת ב- RT. בזהירות להסיר את הפורמלין ולהוסיף 1 מ"ל של אתנול קר 70% לכל באר.
- אטמו את הצלחת בפרפילם עד לשימוש, כדי למנוע התייבשות.
הערה: המורפולוגיה התאית של ASCs מוערכת גם על ידי צביעת hematoxylin-eosin במהלך מעברים שונים. - הסר את 70% אתנול מכל באר ולחות את התאים במשך 5 דקות עם מים מזוקקים. בינתיים, סננו את פתרונות הצביעה.
- מוציאים את המים ומכתימים את התאים בתסיסה איטית למשך 15 דקות עם תמיסת המטוקסילין של האריס.
- הסירו את תמיסת הכתמים ובצעו שתי שטיפות עם PBS אחד.
- מכתימים את התאים בתמיסת אאוזין תחת תסיסה איטית למשך דקה אחת. לאחר מכן, הסר את התמיסה ובצע שתי שטיפות עם PBS 1x.
- הסר בזהירות את הכיסויים מכל באר והרכיב את המגלשות על טיפה של תמיסת הרכבה PBS-גליצרול (1:1 v/v).
- הניחו קו של לכה סביב הכיסוי והתבוננו בשקופיות ההיסטולוגיות מתחת למיקרוסקופ האור.
5. סמני ביטוי של ASCs על ידי immunofluorescence
- הכינו את מאגר הכביסה המכיל 1x PBS-0.05% Tween 20. בצעו את השטיפות ב-RT ובטלטול איטי. לשטוף את הצלחות שלוש פעמים עם 2 מ"ל של חיץ / באר (לדגור במשך 3 דקות עבור כל כביסה).
- מניחים 1 מ"ל של מגיב חוסם (1:10) ודגורים עם תסיסה איטית במשך 20 דקות.
- הוסף 200 μL (דילול 1:50) של הנוגדנים העיקריים הבאים לכל באר: CD9 (עכבר חד שבטי), CD34 (ארנב רב-שבטי) ואנטי-CD63 (עז רב-שבטית). לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).
- שטפו את הצלחות שלוש פעמים שוב ודגרו עם 200 μL (דילול 1:50) של הנוגדנים המשניים הבאים: עז מצומדת נגד עכבר IgG FITC, חמור נגד עז IgG DyeLight 550, ועז נגד ארנב IgG Cy3.
- יש לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS-0.05% Tween 20 ולהכתים את גרעיני התא ב-100 μL של DRAQ-7 (דילול: 17 μL ב-1 מ"ל מים מזוקקים כפול) למשך 20 דקות.
- שטפו שלוש פעמים נוספות והרכיבו את המגלשות לפי שלבים 4.1.12-4.1.13. יש לאחסן את הדגימות מוגנות מפני אור ומוקפאות עד לשימוש.
- דמיינו את הדגימות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי אפיפלואורסצנטי באמצעות ההגדרות והתוכנה המתאימות המומלצות לציוד זה.
6. סמני ביטוי של ASCs לפי ציטומטריית זרימה
- התאם תרחיף תא בודד מתאים שעברו טריפסינזציה או הפשרה (תת-מעברים 3 או 4) בריכוז של 1 x 106 תאים/מ"ל של 1x PBS-5% FBS. Aliquot 100 μL עם 100,000 תאים בצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל. השתמש ב- aliquot אחד ללא תיוג עבור בקרת הפלואורסצנטיות האוטומטית.
- הוסף למנוחה את כל הכמויות המתאימות של Anti-CD105 AF-594 ו- Anti-CD31 AF-680, בהתאם להוראות היצרן. לדגור בחושך במשך 20 דקות ב 4 ° C.
- יש לשטוף את הכתם העודף עם 1 מ"ל של 1x PBS-5% FBS על ידי צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ולהשהות ב 300 μL של 1% פורמלין.
- בצע רכישת דגימה על ציטומטר זרימה. אסטרטגיית ה-gating של התאים מבוססת על גידור FSC-A לעומת SSC-A, תאים בודדים מגודרים באמצעות SSC-H לעומת SSC-A ואחריו FSC-A לעומת FSC-H.
- השתמש בגלאי Y610-mCherry-A עבור CD105 AF-594 וגלאי R660-APC-A עבור CD31 AF-680.
7. בידול ASCs לשושלת האדיפוגנית
- בצלחת 6 בארות, זרע 1 x 10 4 תאים (P-4) לכל ס"מ 2 ודגור ב 37 ° C, 5% CO2, עד 60-80% מפגש (~ 72-96 שעות). השראת התמיינות ישירות על מדיום התרבית: 4 מיקרומטר אינסולין, 1 מיקרומטר דקסמתזון 21-אצטט (Dxa), ו-0.5 מילימטר של 3-איזובוטיל-1-מתיל-קסנטין (MIX). שנה את מדיום הבידול כל 2-3 ימים.
- הכינו תמיסת מלאי של 800 מיקרומטר אינסולין ב-2 מ"ל מים סטריליים אולטרה-טהורים (הוסיפו 20 מיקרוליטר של 1 N HCl כדי להבטיח פירוק מלא) ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. הוסף 10 μL של מלאי אינסולין, בעבר מדולל 1:100, ולהחיל 10 μL בנפח הסופי של 2 מ"ל לכל באר.
- הכינו תמיסת מלאי של 1 mM Dxa ב 5 מ"ל של מים סטריליים טהורים במיוחד (שים לב כי המסה מלאה אינה מתרחשת). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. הוסף 40 μL/well של דילול 1:4 של מלאי Dxa.
- הכינו מלאי של 100 מילימטר של MIX ב-2.5 מ"ל של 0.1 N NaOH, מערבולת, והוסיפו 40 מיקרוליטר של 1 N NaOH לפירוק מלא. יש לאחסן בטמפרטורה של -70°C. הוסף 10 μL / באר של מלאי MIX.
- סנן את תמיסות המלאי דרך מסנן מזרק סטרילי בגודל 0.22 מיקרומטר לפני האחסון.
- ביום ה-12, יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS 1x ולדגור עם 500 μL של 4% פורמלין במשך שעה אחת ב-RT. לשטוף כל באר פעמיים עם מים מזוקקים ולאחר מכן, על ידי 60% איזופרופנול במשך 5 דקות ולתת להתייבש.
- הוסיפו 0.5% שמן אדום O מדולל ב-60% איזופרופנול (500 מיקרוליטר/באר) ודגרו במשך 20 דקות ב-RT. שטפו עם 1 מ"ל מים מזוקקים שלוש פעמים והתבוננו תחת מיקרוסקופ הפוך.
הערה: לקבלת ריאגנטים, ציוד וחומרים נדרשים, עיין בטבלת החומרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
רקמת השומן התקבלה מחולדות בוגרות של Sprague Dawley בגילאי 3-4 חודשים ומשקל גוף של 401 ± 41 גרם (ממוצע גיאומטרי ± SD). ערך ממוצע של 3.8 גרם של רקמת שומן אפידידימלית ופרירנלית התאים לניתוח של 15 מיצויים ניסיוניים. לאחר 24 שעות של תרבית, אוכלוסיות התאים נותרו דבוקות למשטח הפלסטיק והציגו מורפולוגיה הטרוגנית. המעבר הראשון מומש לאחר 8 ± יומיים, עם תפוקה של 1.4 ± 0.6 x 106 תאים בסך הכל שמונה ניסויים. תצפית ישירה בשדה בהיר (איור 1) וצביעת המטוקסילין-אאוסין (איור 2) אפשרו אפיון מורפולוגי באמצעות מיקרוסקופ אור. ציטופלסמה נרחבת נראתה עם הארכות מוארכות ומיקרופילמנטים תוך-תאיים בשפע, סימן היכר של תאי סטרומה מזנכימליים.
ASCs ביטאו סמני שטח שהודגמו באופן ספציפי על-ידי אימונופלואורסנציה עקיפה בתת-מעברים שונים (1, 3, 7 ו-9) (איור 3). ASCs היו חיוביים ב-100% לסמני משטח CD9 בכל תת-המעברים שנבדקו. האחוז הוא מספר התאים החיוביים ביחס למספר התאים הכולל שנספרו בחמישה מיקרוגרפים שנלקחו באופן אקראי. התאים (100%) ביטאו סמני CD63 במעברים 1, 3 ו-9 (P-1, P-3, P-9), בעוד 49.3% ביטאו ב-P-7. סמן CD34 היה שלילי במעברים 1, 7 ו-9, אך תוצאות תיוג חיוביות נצפו בקטע 3. בנוסף, אימונופנוטיפ של FCM הראה כי 98.7% מאוכלוסיית התאים הייתה חיובית ל- CD105, בעוד שרק 5.88% ביטאו את סמן CD31 (איור 4).
לבסוף, ASCs שנחשפו לקוקטייל של גורמי התמיינות במשך 12 יום הראו את יכולתם להתמיין לקראת השושלת האדיפוגנית (איור 5). לאחר 48 שעות, ראינו את השינויים הראשונים במורפולוגיה; התאים הצטמצמו והציגו צורה מעוגלת. לאחר 7 ימים, שלפוחיות שומנים נראו, אשר היו חיוביות עבור כתמים אדומים שמן 12 ימים לאחר ההבחנה.
איור 1: מקטע כלי דם סטרומלי (SVF) שמופק מרקמת שומן של חולדה ומתעכל עם 0.075% קולגנאז (תוך 24 שעות). (A) SVF (פי 20). (B) SVF ביצע חמש שטיפות (פי 10). התאים הדבוקים למשטח הפלסטיק מציגים מורפולוגיה הטרוגנית: מעוגלים, בצורת כוכב ופיברובלסטואידים במראה (מיקרוסקופ הפוך). סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אפיון מורפולוגי עם צביעת המטוקסילין-אאוסין. (A) ASCs, P-1 (10x). (B) ASCs, P-1, (C) P-3 ו-(D) P-9 (100x). סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הערכה של סמני ביטוי שונים עבור ASCs ואקסוזומים על-ידי IF. ציר X: מעברים 1, 3, 7 ו-9. ציר Y: CD9: עז מצומדת נגד עכבר IgG FITC; CD63: עז נגד ארנב IgG Cy3; ו-CD34: חמור נגד עזים IgG DyeLight 550. גרעינים מוכתמים בכחול עם DraQ7 (הגדלה פי 40, זום אחד). סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר בכל לוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: זיהוי ASC לפי ציטומטריית זרימה. (A-C) דגימות שנבחרו בהתבסס על חיתוך FSC-A לעומת SSC-A, תאים בודדים מגודרים באמצעות SSC-H לעומת SSC-A ואחריו FSC-A לעומת FSC-H. (ד,ה) בקרת Autofluorescence (תאים ללא תווית). (ו,ז) ASCs המסומנים עם anti-CD105 AF-594 (Y610 mCherry; סמן חיובי) ו- anti-CD31 AF-680 (גלאי R660-APC-A; סמן שלילי), בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הערכה תפקודית של תאי סטרומה מזנכימליים ברקמת השומן של חולדה. (A) בקרה (פי 10). (B) התמיינות אדיפוגנית 10x, (C) 20x ו-(D) 40x. טיפות שומנים תוך ציטופלזמיות חיוביות לצבע אדום שמן לאחר 12 יום של אינדוקציה (מיקרוסקופ ניגודיות פאזה). סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בארבעת העשורים האחרונים מאז גילוי MSCs, כמה קבוצות של חוקרים תיארו הליכים להשגת MSCs מרקמות ומינים שונים. אחד היתרונות של שימוש בחולדות כמודל של בעלי חיים הוא התחזוקה הקלה וההתפתחות המהירה שלהן, כמו גם הקלות של קבלת MSCs מרקמת השומן. מקורות רקמה שונים תוארו לקבלת ASCs, כגון ויסצרלי, פריrenal, epididymal, ושומן תת עורי 12,13,14,15,16.
באשר להליך המיצוי הנהוג כאן, המחברים ממליצים כי חולדות ישקלו בין 350-450 גרם, בר השגה בארבעת החודשים הראשונים לחיים. כאשר החיות שקלו בין 450-600 גרם והיו עד גיל 8 חודשים, כמות רקמת השומן לחולדה (5.5 ± 2.1; ממוצע ± SD) הייתה גבוהה יותר; עם זאת, מספר ASCs לא גדל באופן יחסי (הנתונים לא מוצגים). תצפיות אלה תואמות את אלה שנעשו על ידי גונזלס3, שגם התייחס לאוכלוסיות עם כדאיות גבוהה יותר והיצמדות למשטח התרבית המתקבל מהרקמה התת-עורית, בהשוואה למקורות אחרים. מצד שני, ASCs מכריתת ביופסיה מפגינים כדאיות, תדירות ויכולת שכפול גבוהה יותר בהשוואה לאלה המתקבלים בשאיבת שומן7. במחקר הנוכחי, הרקמה התת-עורית של החולדות בגילאים שנחקרו הייתה נדירה מאוד. לכן החלטנו להסיר את רקמת השומן הצמודה לאפידידימיס ולאזור הפרירנלי, המעורבים בסינתזה ובהפרשה של אדיפוקינים הרלוונטיים לוויסות גלוקוז ושומנים, כמו גם דלקת16, על ידי כריתה כירורגית.
הפרוטוקולים הנוכחיים לבידוד MSCs שמקורם ברקמת שומן מסתמכים על הליכי עיבוד נטולי אנזימים, כגון תרבית צמחים17, כמו גם על שימוש בטיפולים אנזימטיים להשגת פירוק רקמות כמעט מוחלט18. ההליך המוצע פשוט יחסית וכולל דיסאגרגציה מכנית, דיסאגרגציה אנזימטית ושטיפות עוקבות לתרחיף התא. האחרון מבוצע כדי להסיר תאים רבים ככל האפשר שאינם קשורים מתאי האב, ובכך להשיג ביטוי מינימלי (<5%) של סמני פני השטח שלהם. באופן מעניין, כמויות SVF שיש להשיג עשויות להיות תלויות בסוג של collagenase המשמש פירוק אנזימטי של רקמת שומן. סוג I collagenase מומלץ מאוד לבידוד אדיפוציטים, אם כי השימוש בסוג II19 וסוג VIII מדווח גם20,21. בעבודה הנוכחית השתמשנו בקולגנאז מסוג IV, בעל פעילות אנזימטית נמוכה, המשמש בדרך כלל לעיבוד רקמת הלבלב. לפיכך, מתקבלת תשואה נמוכה יותר של ASCs, אך יש גם פחות נזק לממברנה. זה יכול לשנות את הביטוי של כמה סמני פני השטח, ובכך, את הפונקציונליות שלהם. מאידך גיסא, יחס הפיצול הנמוך ששימש להרחבת התרבות איפשר היווצרות מושבות ויכולת שגשוג גדולה יותר.
על פי המורפולוגיה, ישנם שלושה סוגים עיקריים של תאים מזנכימליים: תאים קטנים, תאים מוארכים, ותאים גדולים ושטוחים עם גרעינים גדולים שהתרבות איטית. צורות אלה קשורות כנראה לאיכויות פנימיות, כגון פוטנציאל ההתמיינות שלהן22. המורפולוגיה שנצפתה בתרבויות ראשוניות של ASCs עולה בקנה אחד עם התוצאות שדווחו על ידי מחברים אלה. מספר רב של מיקרופילמנטים בציטופלסמה נראה גם בכל השלבים שהוערכו, מה שמאשש את המורפולוגיה הפיברובלסטואידית של ASCs שהתקבלו במחקר23,24,25. בנוסף, אימונופנוטיפ נדרש כדי לאשר את האופי המזנכימלי של התאים המבודדים. ה- ISCT וה- IFATS ממליצים על שימוש בסמנים מסוימים, אם כי חלופות אחרות אפשריות גם כן. ידוע כי MSCs יכולים לייצר כמויות גדולות של אקסוזומים26 שהם שלפוחיות קטנות המופרשות לתוך התווך החוץ תאי עם תכולת חלבון מסוימת. בשל מקורם האנדוזומי, הם מכילים חלבוני איחוי והובלת ממברנות (GTPases, annexins, ו flotillin), tetraspanins (CD9, CD63, CD81, ו CD82), בין היתר, לידי ביטוי גם על פני השטח של התאים שמהם הם נובעים17,18. מגבלה של מחקר זה היא כי פאנל רחב של סמנים אינו מוערך. עם זאת, השימוש בשני סמנים חיוביים ושליליים לפחות באותה בדיקה מקובל.
בעבודה זו, אימונופלואורסנציה עקיפה עם סמנים אקסוזומליים חשפה אות חיובי מ- ASCs לסמנים CD9 ו- CD63 במעברים 1, 3, 7 ו- 9. מכיוון שהאות שנצפה בקטע 7 היה חלש, יהיה חשוב להשתמש בסמנים המומלצים על ידי ISCT ו- IFATS כדי להשיג תוצאות טובות יותר. CD34 הוא אנטיגן פני השטח המוכר כסמן תאי אנדותל והמטופויטי וסמן חיובי של תאים שמקורם ברקמת השומן SVF. עם זאת, הביטוי שלה על ASCs המקורי נמצא בקורלציה שלילית עם התרחבות התא במבחנה27. CD34+ אחוז התאים תלוי בשיטת קצירת רקמת השומן, מידת הדימום הווסקולרי וטכניקות העיכול והבידוד שלאחר מכן. למרות ASCs לבטא באופן עקבי סמנים שונים, הדינמיקה שלהם הוכחה להשתנות במהלך הרחבת חוץ גופית 28,29, כפי שמעידים התוצאות שהתקבלו עם המתודולוגיה המוצעת.
נכון לעכשיו, אין פרוטוקול סטנדרטי להשגת ASC. התוצאות משתנות, שכן גורמים שונים משנים את המורפולוגיה והפונקציונליות שלה. הגיל והמצב הבריאותי של התורם, המקור ותנאי התרבית של ASCs הם חלק מגורמים אלה. המתודולוגיה המוצעת מתמקדת בסטנדרטיזציה של מתודולוגיה הניתנת לשחזור המכסה את המטרות של חקירות מגוונות. הקהילה המדעית שואפת למצוא אפשרויות טיפוליות חדשות לאבחון, בקרה וטיפול במחלות מטבוליות שונות, כולל סוכרת. לכן, גילוי של נהלים מתודולוגיים רלוונטי גם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.
Acknowledgments
המחברים אסירי תודה למכון המקסיקני לביטוח לאומי (IMSS) ולבית החולים לילדים של מקסיקו, פדריקו גומז (HIMFG) ולצוות Bioterio של תיאום המחקר של IMSS, על התמיכה שניתנה לביצוע פרויקט זה. אנו מודים למועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה על מלגת AOC (815290) ולאנטוניו דוארטה רייס על התמיכה הטכנית בחומר האודיו-ויזואלי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
- González, M. Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , Universidad de León. PhD thesis, http://hdl.handle.net/10612/3600 (2014).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221 (2013).
- Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
- Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
- Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
- Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
- Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765 (2019).
- Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126 (2021).
- Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
- Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
- Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
- Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
- Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
- Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
- He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).
