Summary
Denne protokol beskriver en metode til isolering og identifikation af fedtvævsafledte mesenkymale stamceller (MSC'er) fra Sprague Dawley-rotter.
Abstract
Voksne mesenkymale celler har revolutioneret molekylær- og cellebiologi i de seneste årtier. De kan differentiere sig i forskellige specialiserede celletyper ud over deres store kapacitet til selvfornyelse, migration og spredning. Fedtvæv er en af de mindst invasive og mest tilgængelige kilder til mesenkymale celler. Det er også blevet rapporteret at have højere udbytter sammenlignet med andre kilder, samt overlegne immunmodulerende egenskaber. For nylig er forskellige procedurer til opnåelse af voksne mesenkymale celler fra forskellige vævskilder og dyrearter blevet offentliggjort. Efter at have evalueret kriterierne for nogle forfattere standardiserede vi en metode, der er anvendelig til forskellige formål og let reproducerbar. En pulje af stromal vaskulær fraktion (SVF) fra perirenal og epididymalt fedtvæv tillod os at udvikle primære kulturer med optimal morfologi og funktionalitet. Cellerne blev observeret klæbet til plastoverfladen i 24 timer og udviste en fibroblastlignende morfologi med forlængelser og en tendens til at danne kolonier. Flowcytometri (FC) og immunofluorescens (IF) teknikker blev anvendt til at vurdere ekspressionen af membranmarkørerne CD105, CD9, CD63, CD31 og CD34. Fedtafledte stamcellers (ASC'ers) evne til at differentiere sig til den adipogene afstamning blev også vurderet ved hjælp af en cocktail af faktorer (4 μM insulin, 0,5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthin og 1 μM dexamethason). Efter 48 timer blev der observeret et gradvist tab af fibroblastoid morfologi, og efter 12 dage blev tilstedeværelsen af lipiddråber, der var positive for olierød farvning, bekræftet. Sammenfattende foreslås en procedure for at opnå optimale og funktionelle ASC-kulturer til anvendelse i regenerativ medicin.
Introduction
Mesenkymale stamceller (MSC'er) har haft stor indflydelse på regenerativ medicin på grund af deres høje kapacitet til selvfornyelse, spredning, migration og differentiering i forskellige cellelinjer 1,2. I øjeblikket fokuserer en stor del af forskningen på deres potentiale til behandling og diagnose af forskellige sygdomme.
Der er forskellige kilder til mesenkymale celler: knoglemarv, skeletmuskulatur, fostervand, hårsække, placenta og fedtvæv, blandt andre. De fås fra forskellige arter, herunder mennesker, mus, rotter, hunde og heste3. Knoglemarvsafledte MSC'er (BMSC'er) har været anvendt i mange år som en vigtig kilde til stamceller i regenerativ medicin og som et alternativ til brugen af embryonale stamceller4. Imidlertid er fedtafledte MSC'er eller fedtafledte stamceller (ASC'er) et vigtigt alternativ med store fordele på grund af deres lette indsamling og isolering samt udbyttet af celler opnået pr. gram fedtvæv 5,6. Det er blevet rapporteret, at høstraten for ASC'er generelt er højere end for BMSC'er7. Det blev oprindeligt foreslået, at ASC'ernes reparative/regenerative kapacitet skyldtes deres evne til at differentiere sig til andre cellelinjer8. Forskning i de senere år har imidlertid forstærket den primære rolle af parakrinefaktorer frigivet af ASC'er i deres reparative potentiale 9,10.
Fedtvæv (AT) interagerer ud over at være en energireserve med de endokrine, nervøse og kardiovaskulære systemer. Det er også involveret i postnatal vækst og udvikling, vedligeholdelse af vævshomeostase, vævsreparation og regenerering. AT består af adipocytter, vaskulære glatte muskelceller, endotelceller, fibroblaster, monocytter, makrofager, lymfocytter, preadipocytter og ASC'er. Sidstnævnte har en vigtig rolle i regenerativ medicin på grund af deres lave immunogenicitet11,12. ASC'er kan opnås ved enzymatisk fordøjelse og mekanisk behandling eller ved fedtvævseksplanter. Primære kulturer af ASC'er er nemme at vedligeholde, dyrke og udvide. Fænotypisk karakterisering af ASC'er er afgørende for at verificere cellernes identitet ved at vurdere ekspressionen af specifikke membranmarkører ved hjælp af metoder som immunofluorescens og flowcytometri13. International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) og International Society for Cellular Therapy (ISCT) har defineret, at ASC'er udtrykker CD73, CD90 og CD105, mens de mangler udtrykket CD11b, CD14, CD19, CD45 og HLA-DR14. Disse markører, både positive og negative, betragtes derfor som pålidelige til karakterisering af ASC'er.
Dette projekt fokuserede på at beskrive en procedure til isolering og identifikation af voksne mesenkymale celler udvundet af rotters AT, da denne cellekilde ikke giver etiske udfordringer, i modsætning til embryonale stamceller. Dette styrker proceduren som en levedygtig mulighed på grund af den lette adgang og minimalt invasive metode sammenlignet med knoglemarvsafledte stamceller.
Mesenkymale celler fra denne vævskilde har en vigtig rolle i regenerativ medicin på grund af deres immunmodulerende evner og lave immunafstødning. Derfor er denne undersøgelse en grundlæggende del af fremtidig forskning i deres sekretom og deres anvendelse som regenerativ terapi i forskellige sygdomme, herunder metaboliske sygdomme som diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev udført efter mexicanske retningslinjer for dyrepleje, baseret på anbefalinger fra Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexico). Protokollen blev gennemgået, godkendt og registreret af den etiske komité for sundhedsforskning ved Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).
1. Fjernelse af fedtvæv fra rotter ved kirurgisk resektion
- Forbered to koniske rør med 20 ml steril 1x phosphatbufret saltvand-antibiotisk antimykotisk (PBS-AA) opløsning (1x PBS, gentamicin [20 μg / ml] og amphotericin [0,5 μg / ml]) og vedligehold på is.
- Vælg to voksne hanrotter (R. norvegicus) i god sundhedstilstand. Sørg for, at rotterne er mellem 3-4 måneder gamle og har en koporalvægt på 350-450 g.
- Fortsæt til sedation med 20 mg / kg xylazinhydrochlorid, og 5 minutter senere administreres et bedøvelsesmiddel med en dosis på 120 mg / kg ketaminhydrochlorid intraperitonealt. Smør begge øjne med en oftalmisk salve for at forhindre tørring. Bekræft derefter anæstesidybden via manglende pedalrefleks.
- Barber og desinficer mave- og inguinalområdet med en jodopløsning. Påfør kirurgiske gardiner for at opretholde sterilitet. Lav derefter et median langsgående snit fra brystbenet til testikelområdet.
- Fjern fedtvævet omkring både epididymis og nyrerne med sterile tang og læg i 1x PBS-AA-opløsningen. Opbevar prøverne på is.
- Sutur snittet lukket, hvis det kræves i henhold til de institutionelle retningslinjer, og aflive dyrene med en intrakardial dosis på 40 mg / kg natriumpentobarbital. Når døden er bekræftet, bortskaffes slagtekroppen efter institutionelle/institutionelle procedurer.
BEMÆRK: Døden fremkalder signalmekanismer, der påvirker immunofænotype, differentieringskapacitet og parakrin effekt af mesenkymale celler. Derfor udføres vævsindsamling før eutanasi.
2. Isolering af mesenkymale celler fra fedtvæv
- Fjern fedtvævet med sterile pincet i et biosikkerhedsskab og læg det på sterilt filterpapir i en petriskål med en diameter på 100 mm for at absorbere overskydende PBS.
- Overfør fedtvævet til en anden petriskål, og udfør tre vaske i 5 minutter hver med 10 ml 1x PBS-AA-opløsning ved hjælp af en 10 ml pipette.
- Mekanisk opdele vævet i fragmenter på ca. 1 cm2 ved hjælp af en saks og en skalpel.
- Forbered kollagenase type IV (0,075%) i 20 ml ikke-suppleret Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM). Der filtreres gennem et 0,22 μm sprøjtefilter og opbevares ved 37 °C.
- Kollagenaseopløsningen (20 ml) fremstillet i trin 2.4 tilsættes i et krystalbægerglas med det fragmenterede væv og en magnetisk stang. Beholderen forsegles og inkuberes under langsom og kontinuerlig omrøring ved 37 °C.
BEMÆRK: Den enzymatiske fordøjelse tager ca. 90 minutter (oprethold langsom omrøring for at bevare cellemembranernes integritet). - Homogenatet filtreres gennem et 40 masket, 0,38 mm blændefilter i rustfrit stål på en 100 mm petriskål, og cellesuspensionen opsamles i et sterilt 50 ml konisk rør.
- Tilsæt 20 ml opvarmet, suppleret DMEM (10% føtalt bovint serum [FBS], 2 mM glutamin, 2 mM natriumpyruvat, 100x ikke-essentiel aminosyreopløsning og 100x antibiotisk antimykotisk opløsning [AA]). Suspender forsigtigt den stromale vaskulære fraktion (SVE).
- Cellesuspensionen centrifugeres ved 290 x g i 10 min., supernatanten kasseres med en 25 ml pipette, og cellerne vaskes forsigtigt med 40 ml af et DMEM-medium, der ikke er tilskudsbaseret.
- Gentag dette trin. Brug et nyt sterilt konisk rør mellem trin for at trække den mindste mængde cellulær detritus og fedt.
- Suspender pelleten i 5 ml suppleret DMEM med en 5 ml pipette og overfør til en T-25 cm2 flaske. Der inkuberes i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
- Den følgende dag udføres tre vaske med 5 ml opvarmet 1x PBS-AA og to vaske med ikke-suppleret DMEM for at fjerne cellerester og ikke-klæbende celler. Tilsæt 5 ml frisk, opvarmet, suppleret DMEM med en 5 ml pipette og skift mediet hver 3-4 dage.
3. Vedligeholdelse og udvidelse af ASC-primærkulturerne
- Når cellerne når 90% -100% sammenløb (8 ± 2 dage), vaskes to gange med 5 ml ikke-suppleret DMEM. Tilsæt 1 ml opvarmet 0,025% trypsin-2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og inkuber i 5-7 minutter ved 37 °C.
- Når cellemonolaget løsnes, tilsættes 4 ml suppleret DMEM og opdeles, cellesuspensionen opdeles.
- Overfør cellesuspensionen til et 15 ml konisk rør, tilsæt 5 ml opvarmet, suppleret DMEM og suspender forsigtigt for at homogenisere.
- Centrifuger ved 290 x g i 5 min. Supernatanten kasseres og pellets blandes forsigtigt i 1 ml DMEM med tilskud. Tæl cellerne i et Neubauer-kammer efter farvning med Trypan-blå.
- Endelig frø 2,5 x 103 celler / cm2 i et splitforhold på 1: 4 i T-75 kolber. Dette trin sikrer kolonidannelse og en høj spredningshastighed.
4. Morfologisk karakterisering af ASC primære kulturer
- Overhold ASC'ernes morfologi under omvendt mikroskopi.
BEMÆRK: Før montering til histologi og ASC-identifikation behandles dækslerne med en 1% gelatineopløsning. Bestråle med UV i 15 min.- Fjern dæksedlerne fra 70% ethanolopløsningen og lad dem tørre i 5 min.
- Dyp dæksedlerne i en steril 1% gelatineopløsning, dræn og tør ved stuetemperatur (RT).
- Placer hvert dæksel i hver brønd på en 6-brønds plade, og bestråle pladerne med UV-lys i 15 minutter.
- Frø en dråbe indeholdende 25 x 103 celler i midten af brønden, vent 1 min, og tilsæt 1 ml suppleret DMEM-medium. Der inkuberes i 96 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
- Fjern mediet og udfør tre vaske med 1x PBS-AA ved hjælp af en overførselspipette.
- Tilsæt 1 ml 3,5% neutral formalin til hvert hul og inkuber i 1 time ved RT. Fjern forsigtigt formalinen og tilsæt 1 ml kold 70% ethanol til hvert hul.
- Pladen forsegles med parafilm indtil brug for at forhindre udtørring.
BEMÆRK: ASC'ernes cellulære morfologi evalueres også ved hæmatoxylin-eosinfarvning under forskellige passager. - Fjern 70% ethanol fra hver brønd og hydrat cellerne i 5 minutter med destilleret vand. I mellemtiden filtreres farvningsopløsningerne.
- Fjern vandet og pletter cellerne under langsom omrøring i 15 minutter med Harris 'hæmatoxylinopløsning.
- Fjern farvningsopløsningen, og udfør to vaske med 1x PBS.
- Plet cellerne med eosinopløsning under langsom omrøring i 1 min. Fjern derefter opløsningen og udfør to vaske med 1x PBS.
- Fjern forsigtigt dækslerne fra hvert hul, og monter gliderne på en dråbe PBS-glycerolmonteringsopløsning (1: 1 v / v).
- Placer en linje neglelak omkring dæksedlen og observer de histologiske dias under lysmikroskopet.
5. Ekspressionsmarkører for ASC'er ved immunofluorescens
- Klargør vaskebufferen indeholdende 1x PBS-0,05% Tween 20. Udfør vasken ved RT og med langsom omrystning. Pladerne vaskes tre gange med 2 ml buffer/brønd (inkuberes i 3 min for hver vask).
- Der anbringes 1 ml blokerende reagens (1:10) og inkuberes under langsom omrøring i 20 minutter.
- Der tilsættes 200 μL (1:50 fortynding) af følgende primære antistoffer til hvert hul: CD9 (monoklonal mus), CD34 (polyklonal kanin) og anti-CD63 (polyklonal ged). Der inkuberes natten over ved 4 °C.
- Pladerne vaskes tre gange igen og inkuberes med 200 μL (1:50 fortynding) af følgende sekundære antistoffer: antimus IgG FITC konjugeret ged, æselantiged IgG DyeLight 550 og ged antikanin IgG Cy3.
- Vask tre gange med 1x PBS-0,05% Tween 20 og bedrag cellekernerne med 100 μL DRAQ-7 (fortynding: 17 μL i 1 ml dobbeltdestilleret vand) i 20 min.
- Vask tre gange mere, og monter lysbillederne i henhold til trin 4.1.12-4.1.13. Opbevar prøverne beskyttet mod lys og frysning indtil brug.
- Visualiser prøverne under epifluorescenskonfokalmikroskopi ved hjælp af de korrekte indstillinger og software, der anbefales til dette udstyr.
6. Ekspressionsmarkører for ASC'er ved flowcytometri
- Juster en enkelt cellesuspension fra trypsiniserede eller optøede celler (underafsnit 3 eller 4) i en koncentration på 1 x 106 celler / ml 1x PBS-5% FBS. Alikvote 100 μL med 100.000 celler i 1,5 ml centrifugeglas. Brug en alikvote uden mærkning til autofluorescenskontrollen.
- Tilføj alle passende mængder Anti-CD105 AF-594 og Anti-CD31 AF-680 i henhold til producentens anvisninger. Der inkuberes i mørke i 20 minutter ved 4 °C.
- Vask den overskydende plet med 1 ml 1x PBS-5% FBS ved centrifugering ved 250 x g i 5 minutter og opslæm i 300 μL 1% formalin.
- Udfør prøveoptagelse på et flowcytometer. Cellernes gating-strategi er baseret på FSC-A vs. SSC-A gating, enkeltceller gated ved hjælp af SSC-H vs. SSC-A efterfulgt af FSC-A vs. FSC-H.
- Brug Y610-mCherry-A detektor til CD105 AF-594 og R660-APC-A detektor til CD31 AF-680.
7. Differentiering af ASC'er til den adipogene afstamning
- I en 6-brønds plade sås 1 x 10 4 celler (P-4) pr. cm2 og inkuberes ved 37 °C, 5% CO2, indtil 60-80% sammenløb (~72-96 timer). Inducer differentiering, der påføres direkte på dyrkningsmediet: 4 μM insulin, 1 μM dexamethason 21-acetat (Dxa) og 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthin (MIX). Skift differentieringsmediet hver 2-3 dage.
- Forbered en stamopløsning af 800 μM insulin i 2 ml sterilt ultrarent vand (tilsæt 20 μL 1 N HCl for at sikre fuldstændig opløsning) og opbevar ved -20 °C. Der tilsættes 10 μL insulinfond, der forinden er fortyndet 1:100, og der påføres 10 μL ved et slutvolumen på 2 ml pr. hul.
- Forbered en stamopløsning på 1 mM Dxa i 5 ml sterilt ultrarent vand (bemærk, at fuld opløsning ikke forekommer). Opbevares ved 4 °C. Der tilsættes 40 μL/hul af en 1:4 fortynding af Dxa-lager.
- Forbered en bestand på 100 mM MIX i 2,5 ml 0,1 N NaOH, hvirvelstrøm, og tilsæt 40 μL 1 N NaOH til fuldstændig opløsning. Opbevares ved -70 °C. Tilsæt 10 μL/hul MIX-lager.
- Stamopløsningerne filtreres gennem et 0,22 μm sterilt sprøjtefilter før opbevaring.
- På dag 12 vaskes cellerne tre gange med 1x PBS og inkuberes med 500 μL 4 % formalin i 1 time ved RT. Hvert hul vaskes to gange med destilleret vand efterfulgt af 60% isopropanol i 5 minutter og lader tørre.
- Tilsæt 0,5% olie rød O fortyndet i 60% isopropanol (500 μL / hul) og inkuber i 20 minutter ved RT. Vask med 1 ml destilleret vand tre gange og observer under et omvendt mikroskop.
BEMÆRK: For nødvendige reagenser, udstyr og materialer henvises til materialetabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fedtvæv blev opnået fra voksne Sprague Dawley-rotter i alderen 3-4 måneder gamle og med en kropsvægt på 401 ± 41 g (geometrisk gennemsnit ± SD). En middelværdi på 3,8 g epididymalt og perirenal fedtvæv svarede til analysen af 15 eksperimentelle ekstraktioner. Efter 24 timers kultur forblev cellepopulationer klæbet til plastoverfladen og udviste en heterogen morfologi. Den første passage blev realiseret på 8 ± 2 dage med et udbytte på 1,4 ± 0,6 x 106 celler i i alt otte eksperimenter. Direkte lysfeltobservation (figur 1) og hæmatoxylin-eosinfarvning (figur 2) lettede morfologisk karakterisering med lysmikroskopi. En omfattende cytoplasma var synlig med aflange forlængelser og rigelige intracellulære mikrofilamenter, et kendetegn ved mesenkymale stromale celler.
ASC'er udtrykte overflademarkører specifikt visualiseret ved indirekte immunfluorescens i forskellige underpassager (1, 3, 7 og 9) (figur 3). ASC'er var 100% positive for CD9-overflademarkører i alle testede underpassager. Procentdelen er antallet af positive celler i forhold til antallet af samlede celler talt i fem tilfældigt udtagne mikrografier. Cellerne (100%) udtrykte CD63-markører i underpassager 1, 3 og 9 (P-1, P-3, P-9), mens 49,3% gjorde i P-7. CD34-markøren var negativ i passager 1, 7 og 9, men positive mærkningsresultater blev observeret i passage 3. Derudover viste immunofænotypning ved FCM, at 98,7% af cellepopulationen var positiv for CD105, mens kun 5,88% udtrykte CD31-markøren (figur 4).
Endelig viste ASC'er udsat for en cocktail af differentieringsfaktorer i 12 dage deres evne til at differentiere sig mod den adipogene afstamning (figur 5). Efter 48 timer observerede vi de første ændringer i morfologien; Cellerne reduceret i størrelse og udviste en afrundet form. Efter 7 dage var lipidvesikler synlige, som var positive for olierød farvning 12 dage efter differentiering.
Figur 1: Stromal vaskulær fraktion (SVF) ekstraheret fra rottefedtvæv og fordøjet med 0,075% kollagenase (ved 24 timer). (A) SVF (20x). (B) SVF fulgte fem vaske (10x). Cellerne, der klæber til plastoverfladen, udviser en heterogen morfologi: afrundet, stjerneformet og fibroblastoid i udseende (omvendt mikroskop). Skalabjælken repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Morfologisk karakterisering med hæmatoxylin-eosinfarvning. A) ASC'er, P-1 (10x). (B) ASC'er, P-1, (C) P-3 og (D) P-9 (100x). Skalabjælken repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Evaluering af forskellige ekspressionsmarkører for ASC'er og exosomer efter IF. Akse X: passager 1, 3, 7 og 9. Akse Y: CD9: anti mus IgG FITC konjugeret ged; CD63: ged anti kanin IgG Cy3; og CD34: æsel anti-ged IgG DyeLight 550. Kerner farvet i blåt med DraQ7 (40x forstørrelse, 1x zoom). Skalabjælken repræsenterer 100 μm i hvert panel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: ASC-identifikation ved flowcytometri. (A-C) Prøver udvalgt baseret på FSC-A vs. SSC-A gating, enkeltceller gated ved hjælp af SSC-H vs. SSC-A efterfulgt af FSC-A vs. FSC-H. (D,E) Autofluorescenskontrol (umærkede celler). (F,G) ASC'er mærket med henholdsvis anti-CD105 AF-594 (Y610 mCherry; positiv markør) og anti-CD31 AF-680 (R660-APC-A detektor; negativ markør). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Funktionel vurdering af mesenkymale stromale celler i rottefedtvæv. (A) Kontrol (10x). (B) Adipogen differentiering 10x, (C) 20x og (D) 40x. Intracytoplasmatiske lipiddråber positive over for olierødt farvestof ved 12 dages induktion (fasekontrastmikroskopi). Skalabjælken repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de sidste fire årtier siden opdagelsen af MSC'er har flere grupper af forskere beskrevet procedurer for opnåelse af MSC'er fra forskellige væv og arter. En af fordelene ved at bruge rotter som dyremodel er deres nemme vedligeholdelse og hurtige udvikling samt den lette opnåelse af MSC'er fra fedtvæv. Forskellige vævskilder er blevet beskrevet til opnåelse af ASC'er, såsom visceralt, perirenalt, epididymalt og subkutant fedt 12,13,14,15,16.
Med hensyn til ekstraktionsproceduren, der anvendes her, anbefaler forfatterne, at rotter skal veje mellem 350-450 g, hvilket kan opnås i de første 4 måneder af livet. Når dyrene vejede mellem 450-600 g og var op til 8 måneder gamle, var mængden af fedtvæv pr. rotte (5,5 ± 2,1; gennemsnitlig ± SD) højere; Antallet af ASC'er steg dog ikke proportionalt (data ikke vist). Disse observationer er i overensstemmelse med dem foretaget af González3, som også henviste populationer med højere levedygtighed og klæbeevne til kulturoverfladen opnået fra det subkutane væv sammenlignet med andre kilder. På den anden side udviser ASC'er fra biopsi resektion større levedygtighed, frekvens og replikativ kapacitet sammenlignet med dem, der opnås ved fedtsugning7. I nærværende undersøgelse var det subkutane væv hos rotterne i de undersøgte aldre meget sparsomt. Vi besluttede derfor at fjerne fedtvævet ved siden af epididymis og perirenalområdet, som er involveret i syntese og sekretion af adipokiner, der er relevante for glukose- og lipidregulering samt inflammation16, ved kirurgisk resektion.
Nuværende protokoller til isolering af fedtvævsafledte MSC'er er afhængige af enzymfrie behandlingsprocedurer, såsom eksplantatkultur17, samt anvendelse af enzymatiske behandlinger for at opnå næsten total vævsdisaggregering18. Den foreslåede procedure er relativt enkel og omfatter mekanisk disaggregering, enzymatisk disaggregering og successive vaske til cellesuspensionen. Sidstnævnte udføres for at fjerne så mange ikke-relaterede celler som muligt fra stamcellerne og dermed opnå minimal ekspression (<5%) af deres overflademarkører. Interessant nok kan mængderne af SVF, der skal opnås, afhænge af den type kollagenase, der anvendes til enzymatisk disaggregering af fedtvæv. Type I collagenase anbefales stærkt til adipocytisolering, selvom brugen af type II19 og type VIII også rapporteres20,21. I dette arbejde brugte vi collagenase type IV med en lav enzymatisk aktivitet, der normalt bruges til at behandle bugspytkirtelvæv. Således opnås et lavere udbytte af ASC'er, men der er også mindre membranskader. Dette kan ændre udtrykket af nogle overflademarkører og dermed deres funktionalitet. På den anden side tillod det lave splitforhold, der blev anvendt i udvidelsen af kulturen, dannelsen af kolonier og en større proliferativ kapacitet.
Ifølge morfologi er der tre hovedtyper af mesenkymale celler: små celler, aflange celler og store, fladede celler med store kerner, der er langsomme til at formere sig. Disse former er sandsynligvis relateret til iboende kvaliteter, såsom deres differentieringspotentiale22. Morfologien observeret i primære kulturer af ASC'er er i overensstemmelse med resultaterne rapporteret af disse forfattere. Et rigeligt antal mikrofilamenter i cytoplasmaet var også synlige i alle evaluerede faser, hvilket bekræfter den fibroblastoide morfologi af ASC'erne opnået i undersøgelsen23,24,25. Derudover kræves immunofænotypning for at bekræfte de isolerede cellers mesenkymale natur. ISCT og IFATS anbefaler brugen af nogle markører, selv om andre alternativer også er mulige. Det er kendt, at MSC'er kan producere store mængder exosomer26, som er små vesikler, der udskilles i det ekstracellulære medium med et bestemt proteinindhold. På grund af deres endosomale oprindelse indeholder de fusions- og membrantransportproteiner (GTPaser, annexiner og flotillin), tetraspaniner (CD9, CD63, CD81 og CD82), blandt andre, også udtrykt på overfladen af cellerne, hvorfra de stammer17,18. En begrænsning ved denne undersøgelse er, at et bredt panel af markører ikke evalueres. Det accepteres dog, at der anvendes mindst to positive og negative markører i samme test.
I dette arbejde afslørede indirekte immunfluorescens med exosomale markører et positivt signal fra ASC'er til CD9- og CD63-markører i underpassager 1, 3, 7 og 9. Da signalet observeret i passage 7 var svagt, ville det være vigtigt at bruge de markører, der anbefales af ISCT og IFATS for at opnå bedre resultater. CD34 er et overfladeantigen anerkendt som en endotel- og hæmatopoietisk cellemarkør og en positiv markør for fedtvæv SVF-afledte celler. Imidlertid korrelerer dets udtryk på native ASC'er negativt med celleekspansion in vitro27. CD34+ celleprocent afhænger af metoden til fedtvævshøst, graden af vaskulær blødning og de efterfølgende fordøjelses- og isolationsteknikker. Selvom ASC'er konsekvent udtrykker forskellige markører, har deres dynamik vist sig at ændre sig under in vitro-ekspansion 28,29, som det fremgår af resultaterne opnået med den foreslåede metode.
På nuværende tidspunkt er der ingen standardiseret protokol til opnåelse af ASC'er. Resultaterne er variable, da forskellige faktorer ændrer dens morfologi og funktionalitet. Donorens alder og sundhedsstatus, kilden og dyrkningsbetingelserne for ASC'erne er nogle af disse faktorer. Den foreslåede metode fokuserer på standardisering af en reproducerbar metode, der dækker formålet med forskellige undersøgelser. Det videnskabelige samfund stræber efter at finde nye terapeutiske muligheder for diagnose, kontrol og behandling af forskellige metaboliske sygdomme, herunder diabetes. Derfor er offentliggørelse af metodologiske procedurer også relevant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige over for det mexicanske institut for social sikring (IMSS) og Children's Hospital of Mexico, Federico Gomez (HIMFG) og Bioterio-personalet i IMSS Research Coordination for den støtte, der er givet til at gennemføre dette projekt. Vi takker National Council of Science and Technology for AOC (815290) stipendiet og Antonio Duarte Reyes for den tekniske support i det audiovisuelle materiale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
- González, M. Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , Universidad de León. PhD thesis, http://hdl.handle.net/10612/3600 (2014).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221 (2013).
- Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
- Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
- Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
- Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
- Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765 (2019).
- Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126 (2021).
- Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
- Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
- Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
- Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
- Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
- Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
- He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).
