Summary
Dit protocol beschrijft een methodologie voor het isoleren en identificeren van van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) van Sprague Dawley-ratten.
Abstract
Volwassen mesenchymale cellen hebben de afgelopen decennia een revolutie teweeggebracht in de moleculaire en celbiologie. Ze kunnen differentiëren in verschillende gespecialiseerde celtypen, naast hun grote vermogen tot zelfvernieuwing, migratie en proliferatie. Vetweefsel is een van de minst invasieve en meest toegankelijke bronnen van mesenchymale cellen. Er is ook gemeld dat het hogere opbrengsten heeft in vergelijking met andere bronnen, evenals superieure immunomodulerende eigenschappen. Onlangs zijn verschillende procedures voor het verkrijgen van volwassen mesenchymale cellen uit verschillende weefselbronnen en diersoorten gepubliceerd. Na het evalueren van de criteria van sommige auteurs, hebben we een methodologie gestandaardiseerd die toepasbaar is voor verschillende doeleinden en gemakkelijk reproduceerbaar. Een pool van stromale vasculaire fractie (SVF) uit perirenaal en epididymaal vetweefsel stelde ons in staat om primaire culturen te ontwikkelen met optimale morfologie en functionaliteit. De cellen werden waargenomen die gedurende 24 uur aan het plastic oppervlak kleefden en vertoonden een fibroblastachtige morfologie, met verlengingen en een neiging om kolonies te vormen. Flowcytometrie (FC) en immunofluorescentie (IF) technieken werden gebruikt om de expressie van de membraanmarkers CD105, CD9, CD63, CD31 en CD34 te beoordelen. Het vermogen van van vetweefsel afgeleide stamcellen (ASC's) om te differentiëren in de adipogene afstamming werd ook beoordeeld met behulp van een cocktail van factoren (4 μM insuline, 0,5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine en 1 μM dexamethason). Na 48 uur werd een geleidelijk verlies van fibroblastoïde morfologie waargenomen en na 12 dagen werd de aanwezigheid van lipidedruppeltjes positief voor olierode kleuring bevestigd. Samenvattend wordt een procedure voorgesteld om optimale en functionele ASC-culturen te verkrijgen voor toepassing in de regeneratieve geneeskunde.
Introduction
Mesenchymale stamcellen (MSC's) hebben een sterke invloed gehad op de regeneratieve geneeskunde vanwege hun hoge capaciteit voor zelfvernieuwing, proliferatie, migratie en differentiatie in verschillende cellijnen 1,2. Momenteel richt veel onderzoek zich op hun potentieel voor de behandeling en diagnose van verschillende ziekten.
Er zijn verschillende bronnen van mesenchymale cellen: beenmerg, skeletspieren, vruchtwater, haarzakjes, placenta en vetweefsel, onder anderen. Ze worden verkregen van verschillende soorten, waaronder mensen, muizen, ratten, honden en paarden3. Van beenmerg afgeleide MSC's (BMSC's) worden al vele jaren gebruikt als een belangrijke bron van stamcellen in de regeneratieve geneeskunde en als alternatief voor het gebruik van embryonale stamcellen4. Van vetweefsel afgeleide MSC's, of van vetweefsel afgeleide stamcellen (ASC's), zijn echter een belangrijk alternatief met grote voordelen vanwege hun gemak van verzameling en isolatie, evenals de opbrengst van cellen verkregen per gram vetweefsel 5,6. Er is gemeld dat de oogstsnelheid van ASC's over het algemeen hoger is dan die van BMSCs7. Aanvankelijk werd voorgesteld dat het herstellende/regeneratieve vermogen van ASC's te wijten was aan hun vermogen om te differentiëren in andere cellijnen8. Onderzoek in de afgelopen jaren heeft echter de primaire rol van paracriene factoren die door ASC's worden vrijgegeven in hun herstelpotentieelversterkt 9,10.
Vetweefsel (AT), naast het feit dat het een energiereserve is, interageert met het endocriene, nerveuze en cardiovasculaire systeem. Het is ook betrokken bij postnatale groei en ontwikkeling, het onderhoud van weefselhomeostase, weefselherstel en regeneratie. De AT bestaat uit adipocyten, vasculaire gladde spiercellen, endotheelcellen, fibroblasten, monocyten, macrofagen, lymfocyten, preadipocyten en ASC's. Deze laatste spelen een belangrijke rol in de regeneratieve geneeskunde vanwege hun lage immunogeniciteit11,12. ASC's kunnen worden verkregen door enzymatische vertering en mechanische verwerking of door vetweefselexplantaten. Primaire culturen van ASC's zijn gemakkelijk te onderhouden, te kweken en uit te breiden. Fenotypische karakterisering van ASC's is essentieel om de identiteit van de cellen te verifiëren door de expressie van specifieke membraanmarkers te beoordelen met behulp van methoden zoals immunofluorescentie en flowcytometrie13. De International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) en de International Society for Cellular Therapy (ISCT) hebben gedefinieerd dat ASC's CD73, CD90 en CD105 uitdrukken, terwijl ze de expressie van CD11b, CD14, CD19, CD45 en HLA-DR14 missen. Deze markers, zowel positief als negatief, worden daarom als betrouwbaar beschouwd voor de karakterisering van ASC's.
Dit project was gericht op het beschrijven van een procedure voor de isolatie en identificatie van volwassen mesenchymale cellen geëxtraheerd uit het AT van ratten, omdat deze bron van cellen geen ethische uitdagingen met zich meebrengt, in tegenstelling tot embryonale stamcellen. Dit stolt de procedure als een haalbare optie vanwege de gemakkelijke toegang en de minimaal invasieve methode in vergelijking met van beenmerg afgeleide stamcellen.
Mesenchymale cellen uit deze weefselbron spelen een belangrijke rol in de regeneratieve geneeskunde vanwege hun immunomodulerende mogelijkheden en lage immuunafstoting. Daarom is de huidige studie een fundamenteel onderdeel van toekomstig onderzoek naar hun secretoom en hun toepassing als regeneratieve therapie bij verschillende ziekten, waaronder metabole ziekten zoals diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de Mexicaanse richtlijnen voor dierenverzorging, gebaseerd op aanbevelingen van de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexico). Het protocol werd beoordeeld, goedgekeurd en geregistreerd door de Ethische Commissie voor Gezondheidsonderzoek van het Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).
1. Verwijdering van vetweefsel van ratten door chirurgische resectie
- Bereid twee conische buisjes met 20 ml steriele 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing-antibioticum antimycotische (PBS-AA) oplossing (1x PBS, gentamicine [20 μg / ml] en amfotericine [0,5 μg / ml]) en onderhoud op ijs.
- Selecteer twee volwassen mannelijke Sprague Dawley-ratten (R. norvegicus) in goede gezondheidstoestand. Zorg ervoor dat de ratten tussen de 3-4 maanden oud zijn en een coporal gewicht van 350-450 g hebben.
- Ga over tot sedatie met 20 mg / kg xylazinehydrochloride en dien 5 minuten later een verdovingsmiddel toe met een dosis van 120 mg / kg ketaminehydrochloride intraperitoneaal. Smeer beide ogen in met een oogzalf om uitdroging te voorkomen. Bevestig vervolgens de anesthesiediepte via een gebrek aan pedaalreflex.
- Scheer en desinfecteer de buik- en liesstreek met een jodiumoplossing. Breng chirurgische gordijnen aan om de steriliteit te behouden. Maak vervolgens een mediane longitudinale incisie van het borstbeen naar het testiculaire gebied.
- Verwijder het vetweefsel rond zowel de bijbal als de nieren met een steriele tang en plaats het in de 1x PBS-AA-oplossing. Bewaar de monsters op ijs.
- Hecht de incisie gesloten indien nodig volgens de institutionele richtlijnen en euthanaseer de dieren met een intracardiale dosis van 40 mg / kg natriumpentobarbital. Zodra de dood is bevestigd, gooit u het karkas weg volgens de institutionele procedure(s).
OPMERKING: De dood lokt signaleringsmechanismen uit die het immunofenotype, de differentiatiecapaciteit en het paracriene effect van mesenchymale cellen beïnvloeden. Daarom wordt weefselverzameling uitgevoerd vóór euthanasie.
2. Isolatie van mesenchymale cellen uit vetweefsel
- Verwijder het vetweefsel met een steriele tang in een bioveiligheidskast en plaats het op steriel filterpapier in een petrischaal met een diameter van 100 mm om overtollig PBS te absorberen.
- Breng het vetweefsel over naar een andere petrischaal en voer drie wasbeurten uit gedurende 5 minuten elk met 10 ml 1x PBS-AA-oplossing met behulp van een pipet van 10 ml.
- Splits het weefsel mechanisch in fragmenten van ongeveer 1 cm2 met behulp van een schaar en een scalpel.
- Bereid collagenase type IV (0,075%) in 20 ml niet-aangevulde Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM). Filtreer door een spuitfilter van 0,22 μm en houd het op 37 °C.
- Voeg de collagenase-oplossing (20 ml) bereid in stap 2.4 toe aan een kristalbeker met het gefragmenteerde weefsel en een magnetische staaf. Sluit de container af en incubeer onder langzaam en continu roeren bij 37 °C.
OPMERKING: De enzymatische vertering duurt ongeveer 90 minuten (blijf langzaam roeren om de integriteit van de celmembranen te behouden). - Filtreer het homogenaat door een roestvrijstalen, 40 mazen, 0,38 mm diafragmafilter op een petrischaal van 100 mm en vang de celsuspensie op in een steriele conische buis van 50 ml.
- Voeg 20 ml verwarmde, aangevulde DMEM toe (10% foetaal runderserum [FBS], 2 mM glutamine, 2 mM natriumpyruvaat, 100x niet-essentiële aminozuuroplossing en 100x antibiotische antimycotische oplossing [AA]). Suspensie voorzichtig de stromale vasculaire fractie (SVE).
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 minuten op 290 x g , gooi het supernatant weg met een pipet van 25 ml en was de cellen voorzichtig met 40 ml van een niet-aangevuld DMEM-medium.
- Herhaal deze stap. Gebruik een nieuwe steriele conische buis tussen de stappen om de minste hoeveelheid cellulair afval en vet te slepen.
- Suspensie de pellet in 5 ml aangevuld DMEM met een pipet van 5 ml en breng over in een T-25 cm2 fles. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2.
- Voer de volgende dag drie wasbeurten uit met 5 ml verwarmde 1x PBS-AA en twee wasbeurten met niet-aangevulde DMEM om celresten en niet-hechtende cellen te verwijderen. Voeg 5 ml verse, verwarmde, aangevulde DMEM toe met een pipet van 5 ml en vervang het medium om de 3-4 dagen.
3. Behoud en uitbreiding van de ASC primaire culturen
- Zodra de cellen 90% -100% samenvloeiing bereiken (8 ± 2 dagen), was twee keer met 5 ml niet-aangevulde DMEM. Voeg 1 ml verwarmd 0,025% trypsine-2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toe en incubeer gedurende 5-7 minuten bij 37 °C.
- Wanneer de celmonolaag is losgemaakt, voegt u 4 ml aangevulde DMEM toe en splitst u de celsuspensie voorzichtig uit.
- Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml, voeg 5 ml verwarmde, aangevulde DMEM toe en suspensie voorzichtig om te homogeniseren.
- Centrifugeer op 290 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en meng de pellet voorzichtig in 1 ml aangevulde DMEM. Tel de cellen in een Neubauer-kamer na kleuring met Trypan-blauw.
- Tot slot, zaad 2,5 x 103 cellen/cm2 in een gesplitste verhouding van 1:4 in T-75 kolven. Deze stap zorgt voor kolonievorming en een hoge proliferatiesnelheid.
4. Morfologische karakterisering van ASC primaire culturen
- Observeer de morfologie van ASC's onder omgekeerde microscopie.
OPMERKING: Voordat u monteert voor histologie en ASC-identificatie, behandelt u de coverslips met een 1% gelatine-oplossing. Bestralen met UV gedurende 15 min.- Verwijder de coverslips uit de 70% ethanoloplossing en laat ze 5 minuten drogen.
- Dompel de coverslips onder in een steriele 1% gelatineoplossing, giet af en droog op kamertemperatuur (RT).
- Plaats elke coverslip in elke put van een 6-putplaat en bestraal de platen gedurende 15 minuten met UV-licht.
- Zaai een druppel met 25 x 103 cellen in het midden van de put, wacht 1 minuut en voeg 1 ml aangevuld DMEM-medium toe. Incubeer gedurende 96 uur bij 37 °C en 5% CO2.
- Verwijder het medium en voer drie wasbeurten uit met 1x PBS-AA met behulp van een transferpipet.
- Voeg 1 ml 3,5% neutrale formaline toe aan elke put en incubeer gedurende 1 uur bij RT. Verwijder voorzichtig de formaline en voeg 1 ml koude 70% ethanol toe aan elk putje.
- Sluit de plaat af met parafilm tot gebruik, om uitdroging te voorkomen.
OPMERKING: De cellulaire morfologie van ASC's worden ook geëvalueerd door hematoxyline-eosinekleuring tijdens verschillende passages. - Verwijder de 70% ethanol uit elke put en hydrateer de cellen gedurende 5 minuten met gedestilleerd water. Filter ondertussen de kleuringsoplossingen.
- Verwijder het water en kleurt de cellen onder langzaam roeren gedurende 15 minuten met Harris 'hematoxyline-oplossing.
- Verwijder de vlekoplossing en voer twee wasbeurten uit met 1x PBS.
- Kleur de cellen met eosine-oplossing onder langzaam roeren gedurende 1 min. Verwijder vervolgens de oplossing en voer twee wasbeurten uit met 1x PBS.
- Verwijder voorzichtig de afdekstroken uit elke put en monteer de dia's op een druppel PBS-glycerolmontage-oplossing (1:1 v/v).
- Plaats een lijn nagellak rond de deklaag en observeer de histologische glaasjes onder de lichtmicroscoop.
5. Expressiemarkers van ASC's door immunofluorescentie
- Bereid de wasbuffer met 1x PBS-0,05% Tween 20 voor. Voer de wasbeurten uit bij RT en met langzaam schudden. Was de borden drie keer met 2 ml buffer/put (incubeer gedurende 3 minuten voor elke wasbeurt).
- Plaats 1 ml blokkerend reagens (1:10) en incubeer met langzaam roeren gedurende 20 minuten.
- Voeg 200 μL (1:50 verdunning) van de volgende primaire antilichamen toe aan elk putje: CD9 (monoklonale muis), CD34 (polyklonaal konijn) en anti-CD63 (polyklonale geit). Incubeer een nacht bij 4 °C.
- Was de platen drie keer opnieuw en incubeer met 200 μL (1:50 verdunning) van de volgende secundaire antilichamen: antimuis IgG FITC geconjugeerde geit, ezel anti-geit IgG DyeLight 550 en geit antikonijn IgG Cy3.
- Was drie keer met 1x PBS-0,05% Tween 20 en contrakleur de celkernen met 100 μL DRAQ-7 (verdunning: 17 μL in 1 ml dubbel gedestilleerd water) gedurende 20 min.
- Was nog drie keer en monteer de dia's volgens de stappen 4.1.12-4.1.13. Bewaar de monsters beschermd tegen licht en bevroren tot gebruik.
- Visualiseer de monsters onder epifluorescentie confocale microscopie met behulp van de juiste instellingen en software die voor deze apparatuur worden aanbevolen.
6. Expressiemarkers van ASC's door flowcytometrie
- Pas een eencellige suspensie van trypsinized of ontdooide cellen (subpassages 3 of 4) aan bij een concentratie van 1 x 106 cellen / ml van 1x PBS-5% FBS. Aliquot 100 μL met 100.000 cellen in 1,5 ml centrifugebuizen. Gebruik één aliquot zonder labeling voor de autofluorescentieregeling.
- Voeg alle juiste hoeveelheden Anti-CD105 AF-594 en Anti-CD31 AF-680 toe volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer in het donker gedurende 20 minuten bij 4 °C.
- Was de overtollige vlek met 1 ml 1x PBS-5% FBS door centrifugeren op 250 x g gedurende 5 minuten en suspensie in 300 μL van 1% formaline.
- Voer monsterverwerving uit op een flowcytometer. De gatingstrategie van de cellen is gebaseerd op FSC-A vs. SSC-A gating, single cells gated using SSC-H vs. SSC-A gevolgd door FSC-A vs. FSC-H.
- Gebruik Y610-mCherry-A detector voor CD105 AF-594 en R660-APC-A detector voor CD31 AF-680.
7. Differentiatie van ASC's naar de adipogene afstamming
- Zaai in een 6-well plaat 1 x 104 cellen (P-4) per cm 2 en incubeer bij 37 °C, 5% CO2, tot 60-80% samenvloeiing (~72-96 h). Induceer differentiatie, rechtstreeks van toepassing op het kweekmedium: 4 μM insuline, 1 μM dexamethason 21-acetaat (Dxa) en 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (MIX). Verander het differentiatiemedium elke 2-3 dagen.
- Bereid een stockoplossing van 800 μM insuline in 2 ml steriel ultrapuur water (voeg 20 μL 1 N HCl toe om volledige oplossing te garanderen) en bewaar bij -20 °C. Voeg 10 μL insulinebouillon toe, eerder verdund 1:100, en breng 10 μL aan met een eindvolume van 2 ml per put.
- Bereid een stamoplossing van 1 mM Dxa in 5 ml steriel ultrapuur water (merk op dat volledige oplossing niet optreedt). Bewaren bij 4 °C. Voeg 40 μL/well van een 1:4 verdunning van Dxa bouillon toe.
- Bereid een voorraad van 100 mM MIX in 2,5 ml 0,1 N NaOH, vortex, en voeg 40 μL 1 N NaOH toe voor volledige oplossing. Bewaren bij -70 °C. Voeg 10 μL/put MIX-bouillon toe.
- Filtreer de stamoplossingen door een steriele spuitfilter van 0,22 μm voordat u ze opbergt.
- Was op dag 12 de cellen drie keer met 1x PBS en incubeer met 500 μL 4% formaline gedurende 1 uur bij RT. Was elke put twee keer met gedestilleerd water gevolgd door 60% isopropanol gedurende 5 minuten en laat drogen.
- Voeg 0,5% olierood O verdund in 60% isopropanol (500 μL/put) toe en incubeer gedurende 20 minuten bij RT. Was drie keer met 1 ml gedestilleerd water en observeer onder een omgekeerde microscoop.
OPMERKING: Voor de benodigde reagentia, apparatuur en materialen raadpleegt u de materiaaltabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vetweefsel werd verkregen van volwassen Sprague Dawley-ratten van 3-4 maanden oud en met een lichaamsgewicht van 401 ± 41 g (geometrisch gemiddelde ± SD). Een gemiddelde waarde van 3,8 g epididymaal en perirenaal vetweefsel kwam overeen met de analyse van 15 experimentele extracties. Na 24 uur kweek bleven celpopulaties aan het plastische oppervlak kleven en vertoonden ze een heterogene morfologie. De eerste passage werd gerealiseerd na 8 ± 2 dagen, met een opbrengst van 1,4 ± 0,6 x 106 cellen in een totaal van acht experimenten. Directe heldere veldwaarneming (figuur 1) en hematoxyline-eosinekleuring (figuur 2) vergemakkelijkten morfologische karakterisering met lichtmicroscopie. Een uitgebreid cytoplasma was zichtbaar met langwerpige verlengingen en overvloedige intracellulaire microfilamenten, een kenmerk van mesenchymale stromale cellen.
ASC's drukten oppervlaktemarkers uit die specifiek werden gevisualiseerd door indirecte immunofluorescentie in verschillende subpassages (1, 3, 7 en 9) (figuur 3). ASC's waren 100% positief voor CD9-oppervlaktemarkers in alle geteste subpassages. Het percentage is het aantal positieve cellen ten opzichte van het aantal totale cellen geteld in vijf willekeurig genomen microfoto's. De cellen (100%) drukten CD63-markers uit in subpassages 1, 3 en 9 (P-1, P-3, P-9), terwijl 49,3% dat deed in P-7. De CD34-marker was negatief in passages 1, 7 en 9, maar positieve etiketteringsresultaten werden waargenomen in passage 3. Bovendien toonde immunofenotypering door FCM aan dat 98,7% van de celpopulatie positief was voor CD105, terwijl slechts 5,88% de CD31-marker tot expressie bracht (figuur 4).
Ten slotte toonden ASC's die gedurende 12 dagen werden blootgesteld aan een cocktail van differentiatiefactoren hun vermogen om te differentiëren in de richting van de adipogene afstamming (figuur 5). Na 48 uur zagen we de eerste veranderingen in de morfologie; De cellen werden kleiner en vertoonden een afgeronde vorm. Na 7 dagen waren lipideblaasjes zichtbaar, die 12 dagen na differentiatie positief waren voor olierode kleuring.
Figuur 1: Stromale vasculaire fractie (SVF) geëxtraheerd uit vetweefsel van ratten en verteerd met 0,075% collagenase (na 24 uur). (A) SVF (20x). (B) SVF volgde vijf wasbeurten (10x). De cellen die aan het plastic oppervlak zijn gehecht, vertonen een heterogene morfologie: afgerond, stervormig en fibroblastoïde qua uiterlijk (omgekeerde microscoop). De schaalbalk vertegenwoordigt 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Morfologische karakterisering met hematoxyline-eosine kleuring. (A) ASC's, P-1 (10x). (B) ASC's, P-1, (C) P-3 en (D) P-9 (100x). De schaalbalk vertegenwoordigt 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Evaluatie van verschillende expressiemarkers voor ASC's en exosomen door IF. As X: passages 1, 3, 7 en 9. As Y: CD9: antimuis IgG FITC geconjugeerde geit; CD63: geit anti konijn IgG Cy3; en CD34: ezel anti-geit IgG DyeLight 550. Nuclei blauw gekleurd met DraQ7 (40x vergroting, 1x zoom). De schaalbalk vertegenwoordigt 100 μm in elk paneel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: ASC-identificatie door flowcytometrie. (A-C) Monsters geselecteerd op basis van FSC-A vs. SSC-A gating, enkele cellen gated met behulp van SSC-H vs. SSC-A gevolgd door FSC-A vs. FSC-H. (D,E) Autofluorescentiecontrole (niet-gelabelde cellen). (F,G) ASC's gelabeld met respectievelijk anti-CD105 AF-594 (Y610 mCherry; positieve marker) en anti-CD31 AF-680 (R660-APC-A detector; negatieve marker). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Functionele beoordeling van mesenchymale stromale cellen van vetweefsel bij ratten. (A) Controle (10x). (B) Adipogene differentiatie 10x, (C) 20x en (D) 40x. Intracytoplasmatische lipidedruppeltjes positief voor olierode kleurstof na 12 dagen inductie (fasecontrastmicroscopie). De schaalbalk vertegenwoordigt 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de afgelopen vier decennia sinds de ontdekking van MSC's hebben verschillende groepen onderzoekers procedures beschreven voor het verkrijgen van MSC's uit verschillende weefsels en soorten. Een van de voordelen van het gebruik van ratten als diermodel is hun eenvoudige onderhoud en snelle ontwikkeling, evenals het gemak van het verkrijgen van MSC's uit vetweefsel. Verschillende weefselbronnen zijn beschreven voor het verkrijgen van ASC's, zoals visceraal, perirenaal, epididymaal en onderhuids vet 12,13,14,15,16.
Met betrekking tot de extractieprocedure die hier wordt gebruikt, bevelen de auteurs aan dat ratten tussen 350-450 g moeten wegen, haalbaar in de eerste 4 maanden van het leven. Wanneer de dieren tussen de 450-600 g wogen en tot 8 maanden oud waren, was de hoeveelheid vetweefsel per rat (5,5 ± 2,1; gemiddelde ± SD) hoger; het aantal ASC's nam echter niet evenredig toe (gegevens niet getoond). Deze waarnemingen komen overeen met die van González3, die ook populaties met een hogere levensvatbaarheid en kleefkracht verwees naar het kweekoppervlak verkregen uit het onderhuidse weefsel, in vergelijking met andere bronnen. Aan de andere kant vertonen ASC's van biopsieresectie een grotere levensvatbaarheid, frequentie en replicatiecapaciteit in vergelijking met die verkregen door liposuctie7. In de huidige studie was het onderhuidse weefsel van de ratten op de bestudeerde leeftijden zeer schaars. We hebben daarom besloten om het vetweefsel naast de bijbal en het perirenale gebied, die betrokken zijn bij de synthese en secretie van adipokines die relevant zijn voor glucose- en lipidenregulatie, evenals ontsteking16, te verwijderen door chirurgische resectie.
De huidige protocollen voor het isoleren van van vetweefsel afgeleide MSC's zijn gebaseerd op enzymvrije verwerkingsprocedures, zoals explantatiecultuur17, evenals het gebruik van enzymatische behandelingen om bijna totale weefseldisaggregatiete bereiken 18. De voorgestelde procedure is relatief eenvoudig en omvat mechanische desaggregatie, enzymatische desaggregatie en opeenvolgende wasbeurten aan de celsuspensie. Dit laatste wordt uitgevoerd om zoveel mogelijk niet-verwante cellen uit de voorlopercellen te verwijderen en zo minimale expressie (<5%) van hun oppervlaktemarkers te verkrijgen. Interessant is dat de te verkrijgen hoeveelheden SVF kunnen afhangen van het type collagenase dat wordt gebruikt bij de enzymatische desaggregatie van vetweefsel. Type I collagenase wordt sterk aanbevolen voor adipocytenisolatie, hoewel het gebruik van type II19 en type VIII ook wordt gemeld20,21. In het huidige werk gebruikten we collagenase type IV, met een lage enzymatische activiteit, meestal gebruikt om pancreasweefsel te verwerken. Zo wordt een lagere opbrengst van ASC's verkregen, maar is er ook minder membraanschade. Dit kan de expressie van sommige oppervlaktemarkeringen en dus hun functionaliteit wijzigen. Aan de andere kant maakte de lage splitratio die werd gebruikt bij de uitbreiding van de cultuur de vorming van kolonies en een grotere proliferatieve capaciteit mogelijk.
Volgens de morfologie zijn er drie hoofdtypen mesenchymale cellen: kleine cellen, langwerpige cellen en grote, afgeplatte cellen met grote kernen die zich langzaam vermenigvuldigen. Deze vormen zijn waarschijnlijk gerelateerd aan intrinsieke kwaliteiten, zoals hun differentiatiepotentieel22. De morfologie waargenomen in primaire culturen van ASC's is consistent met de resultaten gerapporteerd door deze auteurs. Een overvloedig aantal microfilamenten in het cytoplasma was ook zichtbaar in alle geëvalueerde stadia, wat de fibroblastoïde morfologie van de ASC's verkregen in de studiebevestigt 23,24,25. Bovendien is immunofenotypering vereist om de mesenchymale aard van de geïsoleerde cellen te bevestigen. De ISCT en de IFATS bevelen het gebruik van sommige markers aan, hoewel er ook andere alternatieven mogelijk zijn. Het is bekend dat MSC's grote hoeveelheden exosomen26 kunnen produceren, kleine blaasjes die worden uitgescheiden in het extracellulaire medium met een bepaald eiwitgehalte. Vanwege hun endosomale oorsprong bevatten ze fusie- en membraantransporteiwitten (GTPases, annexinen en flottielje), tetraspaninen (CD9, CD63, CD81 en CD82), onder andere, ook uitgedrukt op het oppervlak van de cellen waaruit ze afkomstig zijn17,18. Een beperking van dit onderzoek is dat een breed panel van markers niet wordt geëvalueerd. Het gebruik van ten minste twee positieve en negatieve markers in dezelfde test wordt echter geaccepteerd.
In dit werk onthulde indirecte immunofluorescentie met exosomale markers een positief signaal van ASC's naar CD9- en CD63-markers in subpassages 1, 3, 7 en 9. Aangezien het signaal dat in passage 7 werd waargenomen zwak was, zou het belangrijk zijn om de markers te gebruiken die door de ISCT en de IFATS worden aanbevolen om betere resultaten te verkrijgen. CD34 is een oppervlakteantigeen dat wordt erkend als een endotheel- en hematopoëtische celmarker en een positieve marker van vetweefsel SVF-afgeleide cellen. De expressie ervan op native ASC's correleert echter negatief met celexpansie in vitro27. CD34+ celpercentage is afhankelijk van de methode van vetweefseloogst, de mate van vasculaire bloeding en de daaropvolgende verterings- en isolatietechnieken. Hoewel ASC's consequent verschillende markers uitdrukken, is aangetoond dat hun dynamiek verandert tijdens in vitro expansie28,29, zoals blijkt uit de resultaten die zijn verkregen met de voorgestelde methodologie.
Op dit moment is er geen gestandaardiseerd protocol voor het verkrijgen van ASC's. De resultaten zijn variabel, omdat verschillende factoren de morfologie en functionaliteit ervan wijzigen. De leeftijd en gezondheidstoestand van de donor, de bron en de kweekomstandigheden van de ASC's zijn enkele van deze factoren. De voorgestelde methodologie is gericht op de standaardisatie van een reproduceerbare methodologie die de doeleinden van diverse onderzoeken dekt. De wetenschappelijke gemeenschap streeft ernaar nieuwe therapeutische opties te vinden voor de diagnose, controle en behandeling van verschillende metabole ziekten, waaronder diabetes. Daarom is de openbaarmaking van methodologische procedures ook relevant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.
Acknowledgments
De auteurs zijn het Mexicaanse Instituut voor Sociale Zekerheid (IMSS) en het Kinderziekenhuis van Mexico, Federico Gomez (HIMFG) en de Bioterio-medewerkers van de IMSS Research Coordination dankbaar voor de steun die is gegeven om dit project uit te voeren. We danken de National Council of Science and Technology voor de AOC (815290) beurs en Antonio Duarte Reyes voor de technische ondersteuning in het audiovisuele materiaal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
- González, M. Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , Universidad de León. PhD thesis, http://hdl.handle.net/10612/3600 (2014).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221 (2013).
- Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
- Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
- Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
- Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
- Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765 (2019).
- Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126 (2021).
- Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
- Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
- Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
- Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
- Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
- Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
- He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).
