Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man bruger olierød O til at farve lipiddråber (LD'er), beregne størrelsen og antallet af LD'er i en fedtsyre-induceret fedthepatocytmodel og bruge BODIPY 493/503 til at observere processen med små LD'er, der smelter sammen til store LD'er ved levende cellebilleddannelse.
Abstract
Lipiddråber (LD'er) er organeller, der spiller en vigtig rolle i lipidmetabolisme og neutral lipidopbevaring i celler. De er forbundet med en række metaboliske sygdomme, såsom fedme, fedtleversygdom og diabetes. I leverceller er størrelsen og antallet af LD'er tegn på fedtleversygdom. Desuden ledsages den oxidative stressreaktion, celleautofagi og apoptose ofte af ændringer i størrelser og antal LD'er. Som et resultat, dimensionerne og mængden af LD'er er grundlaget for den nuværende forskning vedrørende mekanismen for LD biogenese. Her beskriver vi i fedtsyreinducerede bovin leverceller, hvordan man bruger olierød O til at plette LD'er og undersøge størrelser og antal LD'er. Størrelsesfordelingen af LD'er analyseres statistisk. Processen med små LD'er, der smelter sammen til store LD'er, observeres også af et levende cellebilleddannelsessystem. Det nuværende arbejde giver mulighed for direkte at observere størrelsesændringstendensen for LD'er under forskellige fysiologiske forhold.
Introduction
Akkumulering af lipiddråbe (LD) i hepatocytter er det typiske kendetegn ved ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD), som kan udvikle sig til leverfibrose og hepatocellulært karcinom. Det har vist sig, at den tidligste manifestation af fedtleversygdom er steatose, karakteriseret ved LD-akkumulering i cytoplasmaet af hepatocytten1. Leversteatose er altid forbundet med et øget antal og/eller udvidet størrelse af LD'er2. LD'er menes at være genereret fra det endoplasmatiske retikulum (ER), der består af triglycerid (TG) som kernen, og er omgivet af proteiner og fosfolipider3. Som den subcellulære organel, der er ansvarlig for TG-opbevaring, udviser LD'er forskellige funktioner med hensyn til deres størrelse, antal, lipidsammensætning, proteiner og interaktion med andre organeller, som alle påvirker celleenergihomeostase4. TG-niveauet er positivt korreleret med størrelsen af LD'er, og et højere intracellulært TG-indhold kan danne større LD'er5. LD'er øges i størrelse gennem den lokale syntese af TG, lipidinkorporering i ER og fusion af flere LD'er6. Celler (adipocytter, hepatocytter osv.), Der indeholder store LD'er, har en særlig mekanisme til effektivt at øge lipidlagring ved LD-fusion. De dynamiske ændringer af LD'er afspejler cellens forskellige energimetabolismetilstande. Det er afgørende at udvikle metoder, der tillader observation og analyse af de forskellige hepatiske LD'er i raske og unormale celler.
De vigtigste ikke-fluorescerende farvestoffer til LD'er er Sudan Black B og olierød O. Sudan Black B pletter neutrale lipider, fosfolipider og steroider7. Olie rød O bruges hovedsageligt til farvning af LD'er af skeletmuskulatur, kardiomyocytter, levervæv, fedtceller osv.8., Og betragtes som et standardværktøj til kvantitativ påvisning af leversteatose hos mus og mennesker9. Den dynamiske ændring af LD'er udføres hovedsageligt ved fluorescensfarvning. Nilrød og BODIPY er begge almindeligt anvendte fluorescerende lipidfarvestoffer10,11. Sammenlignet med Nilrød har BODIPY stærkere vævspermeabilitet og binder bedre med LD'er12. BODIPY-mærkede LD'er kan bruges til farvning af levende celler og colokalisering med andre organeller13.
Forekomsten af fedtleversygdom er signifikant højere hos drøvtyggere end hos enmavede dyr14. I overgangsperioden oplever malkekøer en tilstand af negativ energibalance3. Store mængder ikke-esterificerede fedtsyrer (palmitinsyre, oliesyre, linolsyre osv.) syntetiseres til TG'er i bovin hepatocytter, hvilket fører til leverfunktionel abnormitet og i høj grad reducerer kvaliteten af mejeriprodukter og produktionseffektiviteten15. Denne undersøgelse har til formål at tilvejebringe en protokol til analyse af størrelsen og antallet af LD'er samt at overvåge LD-fusionsdynamikken. Vi konstruerede en model af LD-dannelse ved at tilføje forskellige koncentrationer af linolsyre (LA) i hepatocytter16 og observerede ændringerne i størrelsen og antallet af LD'er under processen ved farvning af LD'er med olierød O. Derudover blev processen med hurtig fusion af LD'er også observeret ved farvning med BODIPY 493/503.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt og udført i overensstemmelse med de etiske standarder fra Animal Care Committee of Henan Agricultural University (Henan-provinsen, Kina).
1. Bovin hepatocytcellekultur
- Optø de primære hepatocytceller17 og centrifuger 400 x g i 4 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: De primære hepatocytceller blev dyrket og vedligeholdt efter en tidligere offentliggjort rapport17. - Kassér den frosne opbevaringsopløsning med en pipette og opslæd den med 1 ml medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM). Brug derefter et celletællekammer til at beregne antallet af celler pr. milliliter, og beregn derefter koncentrationen af ovenstående cellesuspension og juster cellekoncentrationen til 1 x 107 celler / ml.
- Cellesuspensionen tilsættes i en 60 mm cellekulturskål indeholdende 3 ml af ovennævnte medium. Cellerne dyrkes og inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 24 timer.
- Når cellerne vokser til 80%, kasseres mediet og skylles med fosfatbufret saltvand (PBS), og tilsæt derefter 750 μL 0,25% trypsin for at fordøje cellerne. Inkuber cellerne ved 37 °C i 3 minutter, og neutralisere dem derefter med samme mængde 10% FBS. Opsaml cellesuspensionen for at centrifugere ved 200 x g i 4 minutter ved stuetemperatur.
2. Olierød O-farvning
- Der tilsættes 800 μL dyrkningsmedium indeholdende 10% FBS og DMEM i hvert hul på 24-brønds cellekulturpladen, der indeholder glasdæksler. Der udtages 50 μL af cellesuspensionen (opnået i trin 1.3) og tilsættes til 950 μL PBS for at blande. Brug et celletællingskammer til at beregne antallet af celler pr. milliliter, og beregn derefter koncentrationen af ovennævnte cellesuspension. Til sidst justeres cellekoncentrationen til 4 x 104/ml i hvert hul og inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 24 timer.
- Efter 24 timer kasseres dyrkningsmediet og vaskes med PBS. Suspenderes med 800 μl DMEM-induktionsmedium indeholdende 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA).
- I alt 100 μL LA (se materialetabellen) opløses i 900 μL vandfri ethanol og fremstilles en standardopløsning (100 mmol/l). Der tilsættes en gradient på 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L og 200 μmol/L LA i 24-brøndspladen. Gentag hver behandling fire gange. Der inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer.
- Fjern dyrkningsmediet og vask cellerne med PBS tre gange. Fastgør med 400 μL 4% paraformaldehyd i 20 min. Kassér fikseringsopløsningen og vask den med PBS tre gange.
- Inkuber cellerne med 60% isopropylalkohol i 5 min, og kassér det derefter. Tilsæt frisklavet olierød O-arbejdsløsning (se materialetabel) (3: 2-forhold mellem olie rød O: vand) i 20-30 minutter og kassér farvningsopløsningen. Vask cellerne med PBS to til fem gange, indtil der ikke er overskydende farvestofopløsning.
- Tilsæt 300 μL hæmatoxylinfarvningsopløsning (hæmatoxylin:vandforhold på 1:10) og genfarvning af kernen i 1-2 minutter. Kassér farvestofopløsningen og vask cellerne med PBS to til fem gange. Tag glasdækslerne ud af pladen med 24 brønde, og læg dem på mikroskopiske dias (siden med cellerne nedad) efter at have tabt 10 μL tabletforseglingsmiddel (se materialetabellen) på diaset.
- Efter forsegling observeres og afbildes cellernes LD'er under olielinsen i det optiske mikroskop (se materialetabel). Mål diameteren af LD'erne ved hjælp af cellSens-software og analyser antallet og størrelsen af LD'erne.
3. Måling af størrelsen og antallet af LD'er
- Tag billeder: Tænd computeren og mikroskopkontakten successivt, placer diaset på indlæsningsplatformen, åbn billedanalysesoftwaren (se materialetabellen), og tilslut computeren for at se billedet.
- Find billederne ved lav effekt, og dryp en passende mængde cedertræolie på billeddiaset. Juster observationsfaktoren til 100x, indstil automatisk eksponering, og tag billederne ved at justere det relevante synsfelt. Vælg tre farvede celledias for hver gruppe til billeddannelse.
- Diametermåling: Vælg tilfældigt 60 LD'er for hvert billede for at måle diametrene. Efter målingen af hvert billede skal du gemme billederne og output måleresultaterne i en tabel til efterfølgende analyse af den gennemsnitlige størrelse og fordelingsforhold for LD'er.
- Mængdemåling: Vælg tre billeder for hvert plettet og fotograferet dias, og vælg tilfældigt tre celler til mængdemåling i hvert billede. Tæl og analyser antallet af LD'er omkring cellen, og beregn det gennemsnitlige antal LD'er i cellen.
4. Dynamisk observation af LD-fusion
- Følg cellekulturtrinnene som nævnt i trin 1.1-1.3. Når cellerne vokser til 80%, kasseres mediet og skylles med PBS, og fordøjes derefter med 750 μL trypsin i 3 min. Derefter tilsættes 750 μL af substratet, centrifugeres ved 200 x g i 4 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten kasseres.
- Suspender cellerne i 1 ml dyrkningsmedium, tæl og juster cellekoncentrationen til 5 x 105 celler / ml i en 35 mm skål. Kultur ved 37 °C og 5% CO2 i 24 timer.
- Når cellerne er vokset til 80%, ændres substratet til DMEM + 150 μmol/L LA i 24 timer, og kulturen fortsættes i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2 for at akkumulere LD'erne.
- Efter 24 timer fjernes kulturmediet. De vedhængende celler vaskes med PBS og inkuberes med 10 μg/ml BODIPY 493/503 neutral fluorescerende sonde (se materialetabel) i mørke i 30 minutter. Efter inkubation vaskes cellerne i dyrkningsskålen med PBS tre gange, og DMEM + 150 μmol/L LA tilsættes.
BEMÆRK: Undgå lyseksponering under og efter 10 μg/ml BODIPY-farvning; 1 mg/ml BODIPY blev fortyndet med PBS (1:100). - Placer kulturskålen i rillen i mikroskopet på den levende cellestation (se materialetabel) for at observere de dynamiske ændringer af LD'er. Tænd for strømmen til den levende cellearbejdsstation i henhold til startsekvensen, og undgå lys.
- Tænd for strømmen, transmissionslyskilden, mikroskopets strømkilde, kviksølvlampens fluorescerende lyskilde, CCD-kameraets strømkilde (charge-coupled device), computerens værtsstrømkilde, CO 2 ventil og CO2 -inkubator.
- Tilsæt destilleret vand til rillen på læsseplatformen, og sørg for ikke at gå over luftudluftningen.
- Tænd computeren og kør "NIS-Elements". Find først det passende synsfelt på 4x objektivobjektivet, og juster det derefter successivt til 40x objektivobjektivet. Vælg E100 for at observere prøven i mikroskopet og L100 for at få vist og fotografere prøven på computeren.
BEMÆRK: E100 og L100 er mikroskopjusteringsknapper på arbejdsstationen med levende celler (se materialetabellen), der repræsenterer henholdsvis okularet og computerskærmen. - Design parametrene såsom fluorescenskanal (f.eks. Ph-40x, fluoresceinisothiocyanat [FITC], lukker) og forventet optagetid for eksperimentet. Indstil optagetiden i tid, herunder optageintervallet på 5 min mellem hvert andet billede og en samlet optagetid på 6 timer.
BEMÆRK: Langtidsoptagelse skal bruge det perfekte fokussystem (PFS) fokusstabiliseringsfunktion. For dette skal du først justere synsfeltet og fokuslængden, derefter klikke på PFS på computerskærmen og til sidst justere finfokusspiralen. - Vælg forskellige kanaltilstande, enkelt kanal eller alle, vælg et andet synsfelt, klik på forhåndsvisning, juster synsfeltet, indstil disse parametre, og klik på start kørsel for at begynde at optage. Tag et testskud i 5 minutter først; Det kan tage lang tid efter, at operationen er normal.
- Når optagelsen er udført, skal du vælge Filer > Gem som > Gem skriv > avi-format for at eksportere dataene til en video i 'avi'-format. Brug billedformatet '.nd2' til at gemme dataprogrammet og eksportere fotos.
- For at slukke for maskinen skal du slukke den i omvendt rækkefølge.
5. Statistik og resultatanalyse
- Analysér dataene ved hjælp af envejs ANOVA. Rapportér resultaterne som gennemsnittet ± standardfejl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farvningen af celle LD'er er vist i figur 1. De røde prikker afspejler celle LD'er, og de blå prikker afspejler kernerne. Det kan ses, at størrelsen og antallet af LD'er i hvert billede er forskellige under behandlingen af LA.
Med stigningen i LA-dosering viste den gennemsnitlige diameter og antallet af LD'er en signifikant stigende tendens afhængigt af LA-koncentrationen (figur 2). Som vist i figur 2A var antallet af LD'er pr. celle negativt korreleret med forskellige koncentrationer af LA. Det mediane LD-tal pr. celle var 136 for den 100 μmol/l LA-behandlede gruppe, faldende til 118 og 105 for henholdsvis 150 μmol/l og 200 μmol/l LA-behandlede grupper. Den gennemsnitlige diameter af LD'er i kontrolgruppen var 0,72 μm, 1,38 μm for den 100 μmol/L LA behandlede gruppe, 1,51 μm for 150 μmol/L LA behandlet gruppe og 1,64 μm for den 200 μmol/L LA behandlede gruppe (figur 2B).
I denne undersøgelse blev LD'er med en diameter <1 μm defineret som små, og LD'er med en diameter >4 μm blev defineret som store. Det blev konstateret, at fordelingsandelene af LD'er også ændrede sig med LA-koncentrationen, som vist i figur 3; andelen af små LD'er faldt, og andelen af store LD'er steg. Andelen af LD'er med lille diameter var 43,33% ved 100 μmol / L LA, 36,43% ved 150 mmol / L LA og 29,8% ved 200 mmol / L LA. For LD'er med stor diameter var den højeste andel 6,11% i 200 mmol / L LA, derefter 3,15% og 1,48% i henholdsvis 150 og 100 mmol / L LA. I 200 μmol/L LA gruppen blev der tydeligvis observeret superstore LD'er (diameter >5 μm), der tegnede sig for ca. 6,30%, højere end 100 μmol/L LA (5,93%) og 150 μmol/L LA (4,82%) grupperne. Resultaterne viste, at en høj koncentration af LA øgede størrelsen af LD'er og reducerede antallet af LD'er. I mellemtiden steg andelen af store LD'er, og andelen af små LD'er faldt.
Store LD'er blev generelt dannet ved fusion af små LD'er. LD-fusion gennem levende cellebilleddannelse blev observeret for at bevise dette (figur 4). Cellerne blev behandlet med 150 μmol/l LA i 24 timer og farvet med BODIPY. Under den normale cellevæksttilstand ved 37 °C og 5% CO2 blev cellerne observeret kontinuerligt i 6 timer med en arbejdsstation med levende celler. Billederne blev taget hvert 5. minut. Som vist i figur 4 var der i de første 15 minutter stadig tydelige mindre LD'er. Derefter begyndte LD'erne langsomt at smelte sammen fra 20 minutter og blev helt smeltet sammen til større LD'er med 35 minutter.
Figur 1: Lipiddråber. Hepatocytceller dyrket i forskellige koncentrationer af LA og farvet med olierød O. De røde prikker reflekterede LD'er farvet med olierød, og de blålilla prikker reflekterede kernen med hæmatoxylin. Tre glasglas blev udvalgt til farvning og billeddannelse i hver behandling. Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Antal og størrelse af LD'er. Hepatocytceller dyrket i en koncentrationsgradient fra 0 til 200 μmol / L LA og farvet med olierød O. (A) Gennemsnitligt antal LD'er pr. Celle. Antallet af LD'er i 27 celler blev talt i hver gruppe. (B) Den gennemsnitlige diameter af LD'er i en celle. Størrelsen på 60 LD'er blev talt i hver gruppe. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: LD-andel. Hepatocytceller dyrket i forskellige koncentrationer af LA og farvet med olierød O. Andelen af LD'er af forskellig størrelse blev beregnet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: LD-fusion. Hepatocytceller blev dyrket med 150 μmol / L LA og inkuberet med BODIPY 493/503-sonden. Efter kontinuerlig observation i 6 timer under et 40x forstørrelsesbillede blev LD'erne under fluorescens- og lyse felter fotograferet. Billederne blev taget hvert 5. minut. Fusion blev markeret med røde felter. Skalabjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Afhængigt af de patologiske tilstande gennemgår hepatiske LD'er enorme ændringer i deres størrelse og antal. LD'er er bredt til stede i hepatocytceller og spiller en nøglerolle i leverens sundhed og sygdom18. Mængden og størrelsen af LD'er er grundlaget for den nuværende forskning om biogenese af LD'er19. Størrelsen og antallet af LD'er for celler og væv afspejler deres evne til at lagre og frigive energi. De dynamiske ændringer af LD'er opretholder stabiliteten af lipidmetaboliske aktiviteter20,21. En unormal ophobning af LD'er forekommer under forskellige patologiske tilstande og kan være en indikator for metabolisk sygdom22,23. Denne protokol giver en nøjagtig metode til at måle størrelsen og mængden af LD'er i en fedtsyre-induceret hepatocytcellemodel og observere fusionen af LD'er mere effektivt og intuitivt.
At studere størrelsen og dynamiske ændringer af LD'er er af stor betydning for forståelsen af forekomsten af sygdomme relateret til lipidmetabolismeforstyrrelser og effektiv intervention. I dette eksperiment var de vigtigste trin måling og analyse af størrelsen og mængden af LD'er. For det første blev forskellige koncentrationer af LA anvendt til at inducere LD-akkumulering i hepatocytter. Andre fedtsyrer, såsom oleat og palmitat, kunne også anvendes til at forårsage LD-akkumulering i hepatocytceller24,25. Efter behandling med forskellige koncentrationer af LA blev det konstateret, at størrelsen af LD'er blev øget på en dosisafhængig måde. Disse resultater viste, at den olierøde O-farvning nøjagtigt målte diameteren af LD'er. Det blev også konstateret, at en høj koncentration af LA kunne øge andelen af store LD'er, hvilket tyder på, at små LD'er smeltede hurtigt sammen. Hurtig fusion er en af de dynamiske ændringer i LD'er; LD hurtig fusion kan forekomme inden for få minutter eller endda tiere sekunder, og det medieres hovedsageligt af dets overfladefosfolipider og protein22,26. I den foreliggende undersøgelse blev LD-fusion tydeligt observeret fra 20 min til 35 min ved hjælp af BODIPY 493/503-mærkning af en levende cellearbejdsstation. Optagelsesintervallet mellem billeder kan indstilles på få sekunder til minutter, og den samlede optagetid kan indstilles fra 1 time til flere dage, hvilket giver bekvemmelighed til at observere de dynamiske ændringer af LD'er i forskellige celler.
Med hensyn til farvningsanalysen af størrelsen på LD'er er olierød O-farvning mere praktisk og billigere end fluorescerende farvning og bruges mere bredt til at måle den tilsyneladende størrelse af LD'er9. Det behøver ikke at blive behandlet mod lys. Desuden er udstyrskravene ikke svære at opnå, og olielinsen i et almindeligt optisk mikroskop kan bruges til fotoobservation. Ved hjælp af denne metode kan forskerne vælge flere grupper af billeder til tilfældigt at måle størrelsen og mængden af LD'er; Det er enkelt og praktisk at betjene og kan øge prøvestørrelsen og reducere fejlen. Desuden kan fordelingsforholdet mellem forskellige LD-størrelser ifølge den målte og analyserede LD-størrelse observeres direkte. Statistisk analyse kan udføres ved ovenstående metode efter olierød O-farvning, og denne metode kan også anvendes på andre celler, herunder en bred vifte af celler, der er påvirket af lipidakkumulering. I den tidlige farvningsfase blev det konstateret, at olierød O ikke var let at rengøre efter farvning, og der var betydelige rester af farvemagasiner. I det senere trin blev farvestoffet filtreret, og den passende farvningstid blev valgt gennem kontinuerlige tests. Efter farvning kan forøgelse af rengøringstiderne undgå ovenstående problem.
BODIPY 493/503 fluorescerende farvestof er en af de mest almindelige sonder til LD-visualisering27. I denne undersøgelse blev LD-fusion udført ved at mærke LD grøn med BODIPY og observere processen med en levende cellearbejdsstation. Nilrød er også et almindeligt anvendt fluorescerende farvestof til neutrale lipider, men dets brede excitationsbånd (450-560 nm), ikke-specifik farvning, dårlig vævspermeabilitet og andre mangler kan påvirke resultaterne af LD-farvning til en vis grad. Sammenlignet med Nilrød fluorescensfarvning var excitationsbåndet for BODIPY 493/503 smallere (460-490 nm), og det kunne co-mærkes med forskellige fluorescerende farvestoffer11. For det andet undgår BODIPY effektivt interferens fra plantepigmenter28. Endelig har BODIPY stærk vævspermeabilitet, lav følsomhed over for miljøpolaritet og er ikke let at slukke12; derfor anvendes det i vid udstrækning til fluorescensfarvning af LD'er. Analysen af LD-fusion har dog visse begrænsninger. For at opnå et kontinuerligt observationsbillede af levende celler kan linsen ikke flyttes, så kun en lokal LD-fusion kan observeres i visionen, og LD-fusionseffektiviteten af hele cellen kan ikke analyseres mere præcist.
Afslutningsvis giver denne undersøgelse en enkel og reproducerbar metode til LD-morfologi og størrelsesanalyse, som i vid udstrækning kan anvendes til LD-analyse ved undersøgelse af cellulær lipidmetabolisme. Dette arbejde beviste også processen med LD-fusion og lagde grundlaget for yderligere undersøgelse af LD'er i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet i fællesskab af National Natural Science Foundation of China (U1904116).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
References
- Fujimoto, T., Parton, R. G. Not just fat: the structure and function of the lipid droplet. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838 (2011).
- Grasselli, E., et al. Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine. Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).
- Herdt, T. H. Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).
- Pino-de la Fuente, F., et al. Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism. Life Sciences. 298, 120522 (2022).
- O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells. Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).
- Gao, G., et al. Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).
- Tütüncü Konyar, S. Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum. Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).
- Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio. Micron. 39 (7), 819-824 (2008).
- Duan, X., et al. The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore. Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, É Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review. Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).
- Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States. Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).
- Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. Journal of Visualized Experiments. (171), e62543 (2021).
- Liu, L., et al. Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).
- Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Sanjabi, B., et al. Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes. Scientific Reports. 5, 8816 (2015).
- Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis. Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).
- Yang, A., Mottillo, E. P. Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics. Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626 (2020).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Fei, W., et al. A role for phosphatidic acid in the formation of "supersized" lipid droplets. PLoS Genetics. 7 (7), e1002201 (2011).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Wang, J., et al. Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecules. 23 (7), 1594 (2018).
