Summary
В настоящем протоколе описывается, как использовать масляный красный O для окрашивания липидных капель (LD), вычислять размер и количество LD в модели жирных гепатоцитов, индуцированной жирными кислотами, и использовать BODIPY 493/503 для наблюдения за процессом слияния малых LD в большие LD с помощью визуализации живых клеток.
Abstract
Липидные капли (LD) представляют собой органеллы, которые играют важную роль в липидном обмене и хранении нейтральных липидов в клетках. Они связаны с различными метаболическими заболеваниями, такими как ожирение, жировая болезнь печени и диабет. В клетках печени размеры и количество LD являются признаками жировой болезни печени. Более того, реакция окислительного стресса, клеточная аутофагия и апоптоз часто сопровождаются изменениями размеров и количества LD. В результате, размеры и количество ЛД являются основой современных исследований механизма биогенеза ЛД. Здесь, в клетках печени крупного рогатого скота, индуцированных жирными кислотами, мы описываем, как использовать масляный красный O для окрашивания LD и для исследования размеров и количества LD. Статистически проанализировано распределение LD по размерам. Процесс слияния малых LD в большие LD также наблюдается с помощью системы визуализации живых клеток. Текущая работа дает возможность непосредственно наблюдать тенденцию изменения размера LD в различных физиологических условиях.
Introduction
Накопление липидных капель (ЛД) в гепатоцитах является типичной характеристикой неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП), которая может прогрессировать до фиброза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Установлено, что самым ранним проявлением жировой болезни печени является стеатоз, характеризующийся накоплением ЛД в цитоплазме гепатоцита1. Стеатоз печени неизменно связан с увеличением количества и/или увеличением размераLDs2. Считается, что LD генерируются эндоплазматическим ретикулумом (ER), состоящим из триглицеридов (TG) в качестве ядра, и окружены белками и фосфолипидами3. Как субклеточная органелла, ответственная за хранение ТГ, LD проявляют различные особенности в отношении их размера, количества, липидного состава, белков и взаимодействия с другими органеллами, все из которых влияют на энергетический гомеостазклетки 4. Уровень ТГ положительно коррелирует с размером ЛД, и более высокое внутриклеточное содержание ТГ может образовывать более крупные ЛД5. ЛД увеличиваются в размерах за счет локального синтеза ТГ, включения липидов в ЭР и слияния нескольких ЛД6. Клетки (адипоциты, гепатоциты и т. д.), содержащие большие ЛД, имеют специальный механизм для эффективного увеличения накопления липидов путем слияния ЛД. Динамические изменения LD отражают различные состояния энергетического метаболизма клетки. Крайне важно разработать методологии, которые позволяют наблюдать и анализировать различные печеночные LD в здоровых и аномальных клетках.
Основными нефлуоресцентными красителями для LD являются суданский черный B и масляный красный O. Sudan Black B окрашивает нейтральные липиды, фосфолипиды и стероиды7. Масляный красный O в основном используется для окрашивания LD скелетных мышц, кардиомиоцитов, ткани печени, жировых клеток и т.Д. 8., и считается стандартным инструментом для количественного выявления стеатоза печени у мышей и людей9. Динамическое изменение LD в основном осуществляется флуоресцентным окрашиванием. Нильский красный и BODIPY являются широко используемыми флуоресцентными липидными красителями10,11. По сравнению с нильским красным, BODIPY обладает более сильной проницаемостью для тканей и лучше связывается с LDs12. LD, меченные BODIPY, могут быть использованы для окрашивания живых клеток и колокализации с другими органеллами13.
Заболеваемость жировой болезнью печени значительно выше у жвачных животных, чем у животных с моногастричными желудками14. В переходный период у дойных коров наблюдается состояние отрицательного энергетическогобаланса3. Большое количество неэтерифицированных жирных кислот (пальмитиновая кислота, олеиновая кислота, линолевая кислота и др.) синтезируется в ТГ в гепатоцитах крупного рогатого скота, что приводит к функциональной патологии печени и значительно снижает качество молочных продуктов и эффективность производства15. Настоящее исследование направлено на предоставление протокола для анализа размера и количества LD, а также для мониторинга динамики слияния LD. Мы построили модель образования LD путем добавления различных концентраций линолевой кислоты (LA) в гепатоцитах16 и наблюдали изменения размера и количества LD в процессе, окрашивая LD масляным красным O. Кроме того, процесс быстрого слияния LDs также наблюдался при окрашивании BODIPY 493/503.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были одобрены и выполнены в соответствии с этическими стандартами Комитета по уходу за животными Хэнаньского сельскохозяйственного университета (провинция Хэнань, Китай).
1. Культура клеток гепатоцитов крупного рогатого скота
- Разморозьте первичные клетки гепатоцитов17 и центрифугу 400 x g в течение 4 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные клетки гепатоцитов культивировали и поддерживали в соответствии с ранее опубликованным отчетом17. - Откажитесь от замороженного раствора для хранения с помощью пипетки и суспендируйте его с 1 мл среды, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и модифицированную среду Дульбекко Eagle's (DMEM). Затем используйте камеру подсчета клеток, чтобы рассчитать количество клеток на миллилитр, а затем рассчитайте концентрацию вышеуказанной клеточной суспензии и отрегулируйте концентрацию клеток до 1 x 107 клеток / мл.
- Добавьте клеточную суспензию в чашку для культивирования клеток диаметром 60 мм, содержащую 3 мл вышеуказанной среды. Культивируют клетки и инкубируют их при 37 °C и 5%CO2 в течение 24 ч.
- Когда клетки вырастут до 80%, выбросьте среду и промойте фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), затем добавьте 750 мкл 0,25% трипсина для переваривания клеток. Инкубируют клетки при 37 °C в течение 3 мин, затем нейтрализуют их таким же количеством 10% FBS. Соберите клеточную суспензию в центрифуге при 200 х г в течение 4 мин при комнатной температуре.
2. Масляно-красное окрашивание O
- Добавьте 800 мкл питательной среды, содержащей 10% FBS и DMEM, в каждую лунку 24-луночной пластины для культивирования клеток, содержащей стеклянные покровные стекла. Возьмите 50 мкл клеточной суспензии (полученной на этапе 1.3) и добавьте ее к 950 мкл PBS для перемешивания. Используйте камеру подсчета клеток, чтобы рассчитать количество клеток на миллилитр, а затем рассчитайте концентрацию вышеуказанной суспензии клеток. Наконец, отрегулируйте концентрацию клеток до 4 x 104 / мл в каждой лунке и инкубируйте при 37 ° C и 5% CO2 в течение 24 часов.
- Через 24 ч культуральную среду выбросить и промыть ПБС. Суспендировать 800 мкл индукционной среды DMEM, содержащей 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA).
- Растворите в общей сложности 100 мкл LA (см. Таблицу материалов) в 900 мкл безводного этанола и приготовьте стандартный раствор (100 ммоль/л). Добавьте градиент 0 мкмоль/л, 100 мкмоль/л, 150 мкмоль/л и 200 мкмоль/л LA в 24-луночную пластину. Повторите каждую обработку четыре раза. Инкубировать при 37 °C и 5%CO2 в течение 24 ч.
- Удалите питательную среду и трижды промойте клетки PBS. Закрепите 400 мкл 4% параформальдегида в течение 20 мин. Откажитесь от фиксирующего раствора и трижды промойте его ПБС.
- Инкубируйте клетки с 60% изопропиловым спиртом в течение 5 мин, затем выбросьте его. Добавьте свежеприготовленный масляный красный рабочий раствор О (см. Таблицу материалов) (соотношение масляного красного О 3:2) на 20-30 мин и откажитесь от красящего раствора. Промойте клетки PBS от двух до пяти раз, пока не исчезнут излишки раствора красителя.
- Добавьте 300 мкл раствора для окрашивания гематоксилином (соотношение гематоксилин к воде 1:10) и повторно окрашивайте ядро в течение 1-2 мин. Откажитесь от раствора красителя и промойте клетки PBS от двух до пяти раз. Выньте стеклянные покровные стекла из 24-луночной пластины и поместите их на микроскопические предметные стекла (сторона клетками вниз), капнув на предметное стекло 10 мкл герметика для таблеток (см. Таблицу материалов).
- После герметизации наблюдайте и визуализируйте LD клеток под масляной линзой оптического микроскопа (см. Таблицу материалов). Измерьте диаметр LD с помощью программного обеспечения cellSens и проанализируйте количество и размер LD.
3. Измерение размера и количества LD
- Захват изображений: Последовательно включите компьютер и переключатель микроскопа, поместите предметное стекло на загрузочную платформу, откройте программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблицу материалов) и подключите компьютер для просмотра изображения.
- Найдите изображения с низким энергопотреблением и капните необходимое количество кедрового масла на слайд изображения. Отрегулируйте коэффициент наблюдения до 100x, установите автоматическую экспозицию и сделайте снимки, отрегулировав соответствующее поле зрения. Выберите три слайда окрашенных ячеек для каждой группы для визуализации.
- Измерение диаметра: Случайным образом выберите 60 LD для каждого изображения, чтобы измерить диаметры. После измерения каждого изображения сохраните изображения и выведите результаты измерений в таблицу для последующего анализа среднего размера и коэффициента распределения LD.
- Измерение количества: выберите три изображения для каждого окрашенного и сфотографированного слайда и случайным образом выберите три ячейки для измерения количества на каждом изображении. Подсчитайте и проанализируйте количество LD вокруг ячейки и рассчитайте среднее количество LD в ячейке.
4. Динамическое наблюдение за синтезом ЛД
- Следуйте шагам культивирования клеток, как указано в шагах 1.1-1.3. Когда клетки вырастут до 80%, выбросьте среду и промойте PBS, затем переварите их 750 мкл трипсина в течение 3 мин. Затем добавьте 750 мкл среды, центрифугу при 200 x g в течение 4 мин при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
- Суспендируйте клетки в 1 мл питательной среды, подсчитайте и отрегулируйте концентрацию клеток до 5 x10,5 клеток/мл в чашке диаметром 35 мм. Культивируют при 37 °С и 5%СО2 в течение 24 ч.
- Когда клетки вырастут до 80%, меняют среду на DMEM + 150 мкмоль/л LA в течение 24 ч и продолжают культивирование в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 для накопления LD.
- Через 24 ч удаляют питательную среду. Вымойте адгезивные клетки PBS и инкубируйте их нейтральным флуоресцентным зондом BODIPY 493/503 10 мкг/мл (см. Таблицу материалов) в темноте в течение 30 мин. После инкубации трижды промойте клетки в посуде для культивирования с PBS и добавьте DMEM + 150 мкмоль/л LA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте воздействия света во время и после окрашивания BODIPY 10 мкг / мл; 1 мг/мл BODIPY разбавляли PBS (1:100). - Поместите чашку для культивирования в канавку микроскопа станции живой клетки (см. Таблицу материалов), чтобы наблюдать за динамическими изменениями LD. Включите питание рабочей станции с живой клеткой в соответствии с начальной последовательностью и избегайте света.
- Включите питание, источник пропускающего света, источник питания микроскопа, источник люминесцентного света ртутной лампы, источник питания камеры с зарядовой связью (ПЗС), источник питания хоста компьютера, клапан CO 2 и инкубатор CO2.
- Добавьте дистиллированную воду в канавку на грузовой платформе, следя за тем, чтобы она не проходила через вентиляционное отверстие.
- Включите компьютер и запустите «NIS-Elements». Сначала найдите подходящее поле зрения на 4-кратном объективе, а затем последовательно отрегулируйте его на 40-кратный объектив. Выберите E100 для наблюдения образца в микроскопе и L100 для предварительного просмотра и фотографирования образца на компьютере.
ПРИМЕЧАНИЕ: E100 и L100 - это кнопки регулировки микроскопа на рабочей станции с живой клеткой (см. Таблицу материалов), представляющие окуляр и экран компьютера соответственно. - Разработайте такие параметры, как канал флуоресценции (например, Ph-40x, изотиоцианат флуоресцеина [FITC], затвор) и ожидаемое время съемки для эксперимента. Установите время съемки во времени, включая интервал съемки 5 минут между каждыми двумя изображениями и общее время съемки 6 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: При длительной съемке необходимо использовать функцию стабилизации фокусировки идеальной системы фокусировки (PFS). Для этого сначала отрегулируйте поле зрения и фокусное расстояние, затем нажмите на PFS на экране компьютера и, наконец, отрегулируйте тонкую спираль фокусировки. - Выберите различные режимы каналов, один канал или все, выберите другое поле зрения, нажмите «Предварительный просмотр», отрегулируйте поле зрения, установите эти параметры и нажмите « Начать работу », чтобы начать съемку. Сначала сделайте пробный снимок в течение 5 минут; Это может занять много времени после того, как операция станет нормальной.
- После того, как съемка будет выполнена, выберите «Файл» > «Сохранить как» > «Сохранить тип > формате avi», чтобы экспортировать данные в видео в формате «avi». Используйте формат изображения «.nd2» для сохранения программы данных и экспорта фотографий.
- Чтобы выключить машину, выключите ее в обратном порядке.
5. Статистика и анализ результатов
- Анализируйте данные с помощью одностороннего ANOVA. Сообщайте результаты как среднее ± стандартной ошибки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Окрашивание клеточных LD показано на рисунке 1. Красные точки отражают LD клеток, а синие точки отражают ядра. Видно, что размер и количество ЛД на каждом снимке различны при лечении ЛК.
С увеличением дозировки ЛК средний диаметр и количество ЛД показали тенденцию к значительному увеличению в зависимости от концентрации ЛК (рис. 2). Как показано на рисунке 2A, количество LD на клетку отрицательно коррелировало с различными концентрациями LA. Медиана LD на клетку составила 136 для группы, получавшей 100 мкмоль/л LA, снизившись до 118 и 105 для групп, получавших 150 мкмоль/л и 200 мкмоль/л LA, соответственно. Средний диаметр LD в контрольной группе составлял 0,72 мкм, 1,38 мкм для группы, получавшей 100 мкмоль/л LA, 1,51 мкм для группы, получавшей 150 мкмоль/л LA, и 1,64 мкм для группы, обработанной LA 200 мкмоль/л (рис. 2B).
В этом исследовании LD диаметром <1 мкм были определены как маленькие, а LD диаметром >4 мкм были определены как большие. Было обнаружено, что пропорции распределения LD также изменялись в зависимости от концентрации LA, как показано на рисунке 3; доля малых ЛД уменьшилась, а доля крупных ЛД увеличилась. Доля LD малого диаметра составила 43,33% при 100 мкмоль/л LA, 36,43% при 150 мкмоль/л LA и 29,8% при 200 мкмоль/л LA. Для LD большого диаметра наибольшая доля составила 6,11% в 200 мкмоль/л LA, затем 3,15% и 1,48% в 150 и 100 мкмоль/л LA соответственно. В группе 200 мкмоль/л LA, очевидно, наблюдались сверхбольшие LD (диаметр >5 мкм), что составляет около 6,30%, что выше, чем в группах 100 мкмоль/л LA (5,93%) и 150 мкмоль/л LA (4,82%). Результаты показали, что высокая концентрация ЛК увеличивала размер ЛД и уменьшала количество ЛД. При этом доля крупных ЛД увеличилась, а доля малых ЛД уменьшилась.
Большие LD обычно образовывались в результате слияния малых LD. Слияние LD с помощью визуализации живых клеток было обнаружено, чтобы доказать это (рис. 4). Клетки обрабатывали 150 мкмоль/л LA в течение 24 ч и окрашивали BODIPY. При нормальных условиях роста клеток при 37 ° C и 5% CO2 клетки наблюдались непрерывно в течение 6 часов с рабочей станцией с живыми клетками. Снимки делались каждые 5 минут. Как показано на рисунке 4, в первые 15 минут все еще были очевидны меньшие LD. Затем LD медленно начали сливаться с 20 минут и были полностью слиты в более крупные LD через 35 минут.
Рисунок 1: Липидные капли. Клетки гепатоцитов культивируют в различных концентрациях ЛК и окрашивают масляным красным О. Красные точки отражали LD, окрашенные масляным красным цветом, а сине-фиолетовые точки отражали ядро с гематоксилином. Три предметных стекла были выбраны для окрашивания и визуализации в каждой процедуре. Масштабная линейка = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Количество и размер LD. Клетки гепатоцитов, культивируемые в градиенте концентрации от 0 до 200 мкмоль/л LA и окрашенные масляным красным O. (A) Среднее количество LD на клетку. В каждой группе подсчитывалось количество LD в 27 клетках. (B) Средний диаметр LD в ячейке. В каждой группе подсчитывалось по 60 LD. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Доля LD. Клетки гепатоцитов, культивируемые в различных концентрациях ЛК и окрашенные масляным красным О. Рассчитано соотношение долей ЛД разного размера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Термоядерный синтез LD. Клетки гепатоцитов культивировали с 150 мкмоль/л LA и инкубировали с помощью зонда BODIPY 493/503. После непрерывного наблюдения в течение 6 ч под изображением с 40-кратным увеличением были сфотографированы LD под флуоресцентным и ярким полями. Снимки делались каждые 5 минут. Фьюжн был отмечен красными рамками. Масштабная линейка = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В зависимости от патологических состояний печеночные ЛД претерпевают колоссальные изменения в своих размерах и количестве. ЛД широко присутствуют в клетках гепатоцитов и играют ключевую роль в здоровье и заболеваниях печени18. Количество и размер ЛД лежат в основе современных исследований биогенеза ЛД19. Размер и количество LD для клеток и тканей отражают их способность накапливать и высвобождать энергию. Динамические изменения ЛД поддерживают стабильность липидной метаболической активности20,21. Аномальное накопление ЛД происходит при различных патологических состояниях и может быть показателем метаболического заболевания22,23. Этот протокол обеспечивает точный метод измерения размера и количества LD в модели клеток гепатоцитов, индуцированной жирными кислотами, и более эффективно и интуитивно наблюдать за слиянием LD.
Изучение размеров и динамических изменений ЛД имеет большое значение для понимания возникновения заболеваний, связанных с нарушениями липидного обмена, и эффективного вмешательства. В этом эксперименте ключевыми этапами были измерение и анализ размера и количества LD. Во-первых, различные концентрации LA использовались для индукции накопления LD в гепатоцитах. Другие жирные кислоты, такие как олеат и пальмитат, также могут быть использованы для того, чтобы вызвать накопление LD в клетках гепатоцитов24,25. После лечения различными концентрациями ЛК было обнаружено, что размер ЛД увеличивался дозозависимым образом. Эти результаты показали, что масляно-красное окрашивание O точно измеряло диаметр LD. Также было обнаружено, что высокая концентрация ЛК может увеличить долю ЛД большого размера, предполагая, что малые ЛД быстро сливаются друг с другом. Быстрое слияние является одним из динамических изменений LD; Быстрое слияние LD может происходить в течение нескольких минут или даже десятков секунд, и оно в основном опосредовано его поверхностными фосфолипидами и белком22,26. В настоящем исследовании слияние LD четко наблюдалось от 20 до 35 минут с использованием маркировки BODIPY 493/503 на рабочей станции с живой клеткой. Интервал съемки между снимками может быть установлен от нескольких секунд до минут, а общее время съемки может быть установлено от 1 часа до нескольких дней, что обеспечивает удобство для наблюдения за динамическими изменениями LD в разных ячейках.
С точки зрения окрашивающего анализа размера LD, масляно-красное окрашивание O более удобно и дешево, чем флуоресцентное окрашивание, и более широко используется для измерения кажущегося размера LDs9. Его не нужно обрабатывать против света. Кроме того, требования к оборудованию нетрудно достичь, и масляная линза обычного оптического микроскопа может быть использована для фотонаблюдения. Используя этот метод, исследователи могут выбрать несколько групп изображений для случайного измерения размера и количества LD; Он прост и удобен в эксплуатации, может увеличить размер выборки и уменьшить погрешность. Кроме того, в соответствии с измеренным и проанализированным размером LD можно непосредственно наблюдать коэффициент распределения различных размеров LD. Статистический анализ может быть проведен вышеуказанным методом после окрашивания масляного красного O, и этот метод также может быть применен к другим клеткам, включая широкий спектр клеток, пораженных накоплением липидов. На ранней стадии окрашивания было обнаружено, что масляно-красный O нелегко очистить после окрашивания, и в нем остались значительные остатки красителя. На более поздней стадии краситель фильтровали, и соответствующее время окрашивания выбиралось путем непрерывных испытаний. После окрашивания увеличение времени очистки может избежать вышеуказанной проблемы.
Флуоресцентный краситель BODIPY 493/503 является одним из наиболее распространенных зондов для визуализации LD27. В этом исследовании слияние LD проводилось путем маркировки зеленого LD с помощью BODIPY и наблюдения за процессом с рабочей станцией с живой клеткой. Нильский красный также является широко используемым флуоресцентным красителем для нейтральных липидов, но его широкая полоса возбуждения (450-560 нм), неспецифическое окрашивание, плохая проницаемость тканей и другие недостатки могут в некоторой степени повлиять на результаты окрашивания LD. По сравнению с окрашиванием нильским красным флуоресцентным окрашиванием полоса возбуждения BODIPY 493/503 была более узкой (460-490 нм), и она могла быть помечена различными флуоресцентными красителями11. Во-вторых, BODIPY эффективно избегает вмешательства растительных пигментов28. Наконец, BODIPY обладает высокой проницаемостью тканей, низкой чувствительностью к полярности окружающей среды и нелегко гасить12; поэтому он широко используется при флуоресцентном окрашивании LD. Однако анализ слияния LD имеет определенные ограничения. Чтобы получить непрерывное наблюдательное изображение живых клеток, хрусталик нельзя перемещать, поэтому в зрении можно наблюдать только локальное слияние LD, а эффективность слияния LD всей клетки не может быть проанализирована более точно.
В заключение, это исследование представляет собой простой и воспроизводимый метод анализа морфологии и размера ЛД, который может быть широко применен к анализу ЛД при изучении клеточного липидного обмена. Эта работа также доказала процесс слияния LD, заложив основу для дальнейшего изучения LD в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано совместно Национальным фондом естественных наук Китая (U1904116).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
References
- Fujimoto, T., Parton, R. G. Not just fat: the structure and function of the lipid droplet. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838 (2011).
- Grasselli, E., et al. Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine. Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).
- Herdt, T. H. Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).
- Pino-de la Fuente, F., et al. Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism. Life Sciences. 298, 120522 (2022).
- O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells. Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).
- Gao, G., et al. Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).
- Tütüncü Konyar, S. Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum. Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).
- Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio. Micron. 39 (7), 819-824 (2008).
- Duan, X., et al. The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore. Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, É Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review. Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).
- Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States. Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).
- Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. Journal of Visualized Experiments. (171), e62543 (2021).
- Liu, L., et al. Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).
- Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Sanjabi, B., et al. Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes. Scientific Reports. 5, 8816 (2015).
- Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis. Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).
- Yang, A., Mottillo, E. P. Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics. Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626 (2020).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Fei, W., et al. A role for phosphatidic acid in the formation of "supersized" lipid droplets. PLoS Genetics. 7 (7), e1002201 (2011).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Wang, J., et al. Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecules. 23 (7), 1594 (2018).
