Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתמש בשמן אדום O כדי לצבוע טיפות שומנים (LDs), לחשב את הגודל והמספר של LDs במודל הפטוציטים שומניים המושרה על ידי חומצות שומן, ולהשתמש ב- BODIPY 493/503 כדי לצפות בתהליך של LDs קטנים המתמזגים ל- LDs גדולים על ידי הדמיה של תאים חיים.
Abstract
טיפות שומנים (LDs) הן אברונים הממלאים תפקיד חשוב בחילוף חומרים של שומנים ובאחסון שומנים נייטרלי בתאים. הם קשורים למגוון מחלות מטבוליות, כגון השמנת יתר, מחלת כבד שומני וסוכרת. בתאי כבד, הגדלים והמספרים של LDs הם סימנים למחלת כבד שומני. יתר על כן, תגובת העקה החמצונית, אוטופגיה של תאים ואפופטוזיס מלווים לעתים קרובות בשינויים בגדלים ובמספרים של LDs. כתוצאה מכך, הממדים והכמות של LDs הם הבסיס למחקר הנוכחי לגבי המנגנון של ביוגנזה של LD. כאן, בתאי כבד בקר המושרים על ידי חומצות שומן, אנו מתארים כיצד להשתמש בשמן אדום O כדי להכתים LDs ולחקור את הגדלים והמספרים של LDs. התפלגות הגודל של LDs מנותחת סטטיסטית. התהליך של התמזגות LDs קטנים לתוך LDs גדולים נצפה גם על ידי מערכת הדמיה של תאים חיים. העבודה הנוכחית מספקת דרך לצפות ישירות במגמת שינוי הגודל של LDs בתנאים פיזיולוגיים שונים.
Introduction
הצטברות טיפות שומנים (LD) בהפטוציטים היא המאפיין האופייני של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD), אשר יכולה להתקדם לפיברוזיס בכבד וקרצינומה הפטוצלולרית. נמצא כי הביטוי המוקדם ביותר של מחלת כבד שומני הוא סטאטוזיס, המאופיין הצטברות LD בציטופלסמה של הפטוציטים1. סטאטוזיס בכבד קשורה תמיד למספר מוגבר ו / או גודל מורחב של LDs2. LDs נחשבים להיווצר מן הרשתית האנדופלסמית (ER), המורכבת טריגליצרידים (TG) כמו הליבה, והם מוקפים חלבונים ופוספוליפידים3. כאברונים תת-תאיים האחראים על אחסון TG, LDs מפגינים תכונות שונות לגבי גודלם, מספרם, הרכב השומנים, חלבונים ואינטראקציה עם אברונים אחרים, שכולם משפיעים על הומאוסטזיס אנרגיית התא4. רמת TG מתואמת באופן חיובי עם גודל LDs, ותכולת TG תוך-תאית גבוהה יותר יכולה ליצור LDs5 גדולים יותר. LDs גדלים באמצעות סינתזה מקומית של TG, שילוב שומנים בחדר המיון, ואיחוי של LDsמרובים 6. תאים (אדיפוציטים, הפטוציטים וכו ') המכילים LDs גדולים יש מנגנון מיוחד כדי להגדיל ביעילות את אחסון השומנים על ידי היתוך LD. השינויים הדינמיים של LDs משקפים את מצבי חילוף החומרים השונים של האנרגיה של התא. חיוני לפתח מתודולוגיות המאפשרות תצפית וניתוח של LDs שונים בכבד בתאים בריאים ולא תקינים.
הצבעים העיקריים שאינם פלואורסצנטיים עבור LDs הם סודן שחור B ואדום שמן O. סודן שחור B כתמים שומנים ניטרליים, פוספוליפידים וסטרואידים7. שמן אדום O משמש בעיקר להכתמת LDs של שרירי השלד, קרדיומיוציטים, רקמת כבד, תאי שומן וכו '8., ונחשב לכלי סטנדרטי לזיהוי כמותי של סטאטוזיס בכבד בעכברים ובבני אדם9. השינוי הדינמי של LDs מתבצע בעיקר על ידי צביעה פלואורסצנטית. אדום הנילוס ו BODIPY הם שניהם צבעי שומנים פלואורסצנטייםנפוצים 10,11. בהשוואה לאדום הנילוס, ל-BODIPY יש חדירות רקמות חזקה יותר והוא נקשר טוב יותר עם LDs12. LDs המסומנים BODIPY יכולים לשמש להכתמת תאים חיים וקולוקליזציה עם אברונים אחרים13.
שכיחות מחלת כבד שומני גבוהה משמעותית בבעלי חיים מעלי גירה מאשר בבעלי חיים חד-קיבתיים14. במהלך תקופת המעבר, פרות חולבות חוות מצב של מאזן אנרגיה שלילי3. כמויות גדולות של חומצות שומן לא אסטריות (חומצה פלמיטית, חומצה אולאית, חומצה לינולאית וכו ') מסונתזות ל- TGs בהפטוציטים של בקר, מה שמוביל להפרעות תפקודיות בכבד ומקטין מאוד את איכות מוצרי החלב ואת יעילות הייצור15. המחקר הנוכחי נועד לספק פרוטוקול לניתוח הגודל והמספר של LDs, כמו גם לפקח על דינמיקת היתוך LD. בנינו מודל של היווצרות LD על ידי הוספת ריכוזים שונים של חומצה לינולאית (LA) בהפטוציטים16 וצפינו בשינויים בגודל ובמספר LDs במהלך התהליך על ידי צביעת LDs עם שמן אדום O. בנוסף, תהליך האיחוי המהיר של LDs נצפה גם על ידי צביעה עם BODIPY 493/503.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים אושרו ובוצעו בהתאם לסטנדרטים האתיים של ועדת הטיפול בבעלי חיים של האוניברסיטה החקלאית של הנאן (מחוז הנאן, סין).
1. תרבית תאי הפטוציטים של בקר
- הפשיר את תאי הפטוציטים העיקריים17 ואת הצנטריפוגה 400 x גרם במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: תאי הפטוציטים הראשוניים גודלו בתרבית ונשמרו בעקבות דו"ח17 שפורסם בעבר. - השליכו את תמיסת האחסון הקפואה עם פיפטה והשהו אותה עם 1 מ"ל של מדיום המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ומדיום הנשר של דולבקו (DMEM). לאחר מכן, השתמש בתא ספירת תאים כדי לחשב את מספר התאים למיליליטר, ולאחר מכן חשב את ריכוז תרחיף התאים לעיל והתאם את ריכוז התא ל 1 x 107 תאים / מ"ל.
- הוסף את תרחיף התא לצלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ המכילה 3 מ"ל של התווך הנ"ל. תרבית את התאים ודגרה אותם ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 24 שעות.
- כאשר התאים גדלים ל-80%, יש להשליך את המדיום ולשטוף במי מלח חוצצי פוספט (PBS), ולאחר מכן להוסיף 750 μL של 0.25% טריפסין כדי לעכל את התאים. לדגור על התאים ב 37 ° C במשך 3 דקות, ולאחר מכן לנטרל אותם עם אותה כמות של 10% FBS. אספו את מתלה התא לצנטריפוגה במהירות של 200 x גרם למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
2. שמן אדום O כתמים
- הוסף 800 μL של מדיום תרבית המכיל 10% FBS ו- DMEM לכל באר של צלחת תרבית תאים 24 בארות המכילה כיסויי זכוכית. קח 50 μL של תרחיף התא (מתקבל בשלב 1.3) ולהוסיף אותו 950 μL של PBS כדי לערבב. השתמש בתא ספירת תאים כדי לחשב את מספר התאים למיליליטר, ולאחר מכן חשב את ריכוז תרחיף התאים לעיל. לבסוף, להתאים את ריכוז התא ל 4 x 104 / מ"ל בכל באר לדגור ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 24 שעות.
- לאחר 24 שעות, השליכו את מדיום התרבית ושטפו עם PBS. יש להשהות עם 800 μL של מדיום השראת DMEM המכיל אלבומין בסרום בקר (BSA) במינון 1 מ"ג/מ"ל.
- להמיס סך של 100 μL של LA (ראה טבלה של חומרים) ב 900 μL של אתנול נטול מים ולהכין פתרון סטנדרטי (100 mmol / L). הוסף שיפוע של 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L ו-200 μmol/L LA לצלחת בעלת 24 הקידוחים. חזור על כל טיפול ארבע פעמים. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך 24 שעות.
- הסר את מדיום התרבית ושטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים. תקן עם 400 μL של 4% paraformaldehyde במשך 20 דקות. השליכו את התמיסה המקבעת ושטפו אותה עם PBS שלוש פעמים.
- לדגור על התאים עם 60% אלכוהול איזופרופיל במשך 5 דקות, ולאחר מכן להשליך אותו. מוסיפים תמיסת עבודה טרייה שהוכנה בשמן אדום O (ראו טבלת חומרים) (יחס של 3:2 שמן אדום O:water) למשך 20-30 דקות ומשליכים את תמיסת הצביעה. לשטוף את התאים עם PBS פעמיים עד חמש פעמים עד שאין תמיסת צבע עודפת.
- הוסף 300 μL של תמיסת צביעת hematoxylin (hematoxylin: יחס מים של 1:10) וצבע מחדש את הגרעין למשך 1-2 דקות. השליכו את תמיסת הצבע ושטפו את התאים עם PBS פעמיים עד חמש פעמים. הוציאו את כיסויי הזכוכית מהצלחת בעלת 24 הקידוחים והניחו אותם על שקופיות מיקרוסקופיות (הצד עם התאים פונים כלפי מטה) לאחר הטלת 10 מיקרוליטר של חומר איטום טבליות (ראו טבלת חומרים) על המגלשה.
- לאחר האיטום, התבוננו ודמיינו את ה-LDs של התאים מתחת לעדשת השמן של המיקרוסקופ האופטי (ראו טבלת חומרים). למדוד את הקוטר של LDs על ידי תוכנת cellSens ולנתח את המספר והגודל של LDs.
3. מדידת גודל ומספר LDs
- לכידת תמונות: הפעל את המחשב ואת מתג המיקרוסקופ ברצף, מקם את השקופית על פלטפורמת הטעינה, פתח את תוכנת ניתוח התמונות (ראה טבלת חומרים) וחבר את המחשב כדי להציג את התמונה.
- מצא את התמונות בעוצמה נמוכה וטפטף כמות מתאימה של שמן ארז על שקופית ההדמיה. התאם את גורם התצפית ל- 100x, הגדר חשיפה אוטומטית ולכוד את התמונות על ידי התאמת שדה הראייה המתאים. בחר שלוש שקופיות תאים מוכתמים עבור כל קבוצה להדמיה.
- מדידת קוטר: בחר באופן אקראי 60 LDs לכל תמונה כדי למדוד את הקטרים. לאחר המדידה של כל תמונה, שמור את התמונות והפק את תוצאות המדידה בטבלה לניתוח הבא של הגודל הממוצע ויחס ההתפלגות של LDs.
- מדידת כמות: בחר שלוש תמונות לכל שקופית מוכתמת ומצולמת, ובחר באופן אקראי שלושה תאים למדידת כמות בכל תמונה. ספור ונתח את מספר LDs סביב התא, וחשב את המספר הממוצע של LDs בתא.
4. תצפית דינמית של היתוך LD
- בצע את השלבים לתרבית תאים כפי שהוזכר בשלבים 1.1-1.3. כאשר התאים גדלים ל 80%, להשליך את המדיום ולשטוף עם PBS, ולאחר מכן לעכל אותם עם 750 μL של טריפסין במשך 3 דקות. לאחר מכן, להוסיף 750 μL של בינוני, צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר, ולהשליך את supernatant.
- להשהות את התאים ב 1 מ"ל של מדיום תרבית, לספור, ולהתאים את ריכוז התא ל 5 x 105 תאים / מ"ל בצלחת 35 מ"מ. תרבית ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 24 שעות.
- כאשר התאים גדלו ל 80%, לשנות את המדיום ל DMEM + 150 μmol / L LA במשך 24 שעות, ולהמשיך את התרבית באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2 לצבור LDs.
- לאחר 24 שעות, הסר את מדיום התרבות. שטפו את התאים הדבקים עם PBS ודגרו עליהם עם 10 מיקרוגרם/מ"ל BODIPY 493/503 בדיקה פלואורסצנטית נייטרלית (ראו טבלת חומרים) בחושך למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים בצלחת תרבית עם PBS שלוש פעמים ולהוסיף DMEM + 150 μmol / L LA.
הערה: יש להימנע מחשיפה לאור במהלך ולאחר צביעת BODIPY של 10 מיקרוגרם/מ"ל; 1 מ"ג / מ"ל BODIPY היה מדולל עם PBS (1:100). - הניחו את צלחת התרבית בחריץ המיקרוסקופ של תחנת התא החי (ראו טבלת חומרים) כדי לצפות בשינויים הדינמיים של LDs. הפעילו את עוצמת תחנת העבודה של התא החי בהתאם לרצף ההתחלה והימנעו מאור.
- הפעל את החשמל, מקור אור השידור, מקור כוח המיקרוסקופ, מקור אור פלואורסצנטי של מנורת כספית, מקור כוח מצלמה של התקן מצומד טעינה (CCD), מקור כוח מארח המחשב, שסתום CO 2 ואינקובטור CO2 .
- הוסיפו מים מזוקקים לחריץ ברציף ההעמסה, והבטיחו שלא לעבור את פתח האוורור.
- הפעל את המחשב והפעל את "NIS-Elements". ראשית, מצא את שדה הראייה המתאים בעדשת 4x אובייקטיבית, ולאחר מכן התאם אותו לעדשת 40x אובייקטיבית ברצף. בחר E100 לתצפית על הדגימה במיקרוסקופ ו- L100 לתצוגה מקדימה וצילום הדגימה במחשב.
הערה: E100 ו-L100 הם לחצני כוונון מיקרוסקופ בתחנת העבודה של התא החי (ראו טבלת חומרים), המייצגים את העינית ואת מסך המחשב, בהתאמה. - תכנן את הפרמטרים כגון ערוץ פלואורסצנטי (למשל, Ph-40x, Fluorescein isothiocyanate [FITC], תריס) וזמן הצילום הצפוי לניסוי. הגדר את זמן הצילום בזמן, כולל זמן מרווח הצילום של 5 דקות בין כל שתי תמונות וזמן צילום כולל של 6 שעות.
הערה: צילום לאורך זמן צריך להשתמש בפונקציית ייצוב המיקוד של מערכת המיקוד המושלמת (PFS). לשם כך, תחילה להתאים את שדה הראייה ואת אורך המיקוד, ולאחר מכן לחץ על PFS על מסך המחשב, ולבסוף להתאים את ספירלת המיקוד העדינה. - בחר מצבי ערוץ שונים, ערוץ יחיד או כולם, בחר שדה ראייה אחר, לחץ על תצוגה מקדימה, התאם את שדה הראייה, הגדר פרמטרים אלה ולחץ על התחל לרוץ כדי להתחיל לצלם. קח צילום מבחן במשך 5 דקות הראשון; זה יכול לקחת זמן רב לאחר הניתוח הוא נורמלי.
- לאחר ביצוע הצילום, בחר קובץ > שמירה בשם > שמור הקלד > פורמט avi כדי לייצא את הנתונים לסרטון בפורמט 'avi'. השתמש בפורמט התמונה '.nd2' כדי לשמור את תוכנית הנתונים ולייצא את התמונות.
- לכיבוי המכשיר, כבה אותו בסדר הפוך.
5. סטטיסטיקה וניתוח תוצאות
- נתח את הנתונים באמצעות ANOVA חד-כיוונית. דווח על התוצאות כממוצע ± שגיאת תקן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הצביעה של תאי LDs מוצגת באיור 1. הנקודות האדומות משקפות LDs של תאים, והנקודות הכחולות משקפות את הגרעינים. ניתן לראות כי הגודל והמספר של LDs בכל תמונה שונים תחת הטיפול של לוס אנג'לס.
עם העלייה במינון LA, הקוטר הממוצע והמספר של LDs הראו מגמת עלייה משמעותית, בהתאם לריכוז LA (איור 2). כפי שניתן לראות באיור 2A, מספר LDs לכל תא היה בקורלציה שלילית עם ריכוזים שונים של LA. מספר ה-LD החציוני לתא היה 136 עבור הקבוצה שטופלה ב-100 μmol/L LA, וירד ל-118 ו-105 עבור הקבוצות שטופלו ב-150 μmol/L ו-200 μmol/L LA, בהתאמה. הקוטר הממוצע של LDs בקבוצת הביקורת היה 0.72 מיקרומטר, 1.38 מיקרומטר בקבוצה שטופלה ב-100 μmol/L LA, 1.51 מיקרומטר בקבוצה שטופלה ב-150 μmol/L LA ו-1.64 מיקרומטר בקבוצה שטופלה ב-200 μmol/L LA (איור 2B).
במחקר זה, LDs בקוטר <1 מיקרומטר הוגדרו כקטנים, ו-LDs בקוטר >4 מיקרומטר הוגדרו כגדולים. נמצא כי פרופורציות ההתפלגות של LDs השתנו גם עם ריכוז LA, כפי שניתן לראות באיור 3; חלקם של LDs קטנים ירד, וחלקם של LDs גדולים גדל. חלקם של LDs בקוטר קטן היה 43.33% ב-100 μmol/L LA, 36.43% ב-150 μmol/L LA, ו-29.8% ב-200 μmol/L LA. עבור LDs בקוטר גדול, השיעור הגבוה ביותר היה 6.11% ב- 200 μmol / L LA, ולאחר מכן 3.15% ו- 1.48% ב- 150 ו- 100 μmol / L LA, בהתאמה. בקבוצה של 200 μmol/L LA נצפו בבירור LDs גדולים במיוחד (קוטר >5 מיקרומטר), המהווים כ-6.30%, גבוה יותר מהקבוצות של 100 μmol/L LA (5.93%) ו-150 μmol/L LA (4.82%). התוצאות הצביעו על כך שריכוז גבוה של LA הגדיל את גודל ה- LDs והקטין את מספר ה- LDs. בינתיים, חלקם של LDs גדולים גדל, ואת חלקם של LDs קטנים ירד.
LDs גדולים נוצרו בדרך כלל באמצעות מיזוג של LDs קטנים. היתוך LD באמצעות הדמיה של תאים חיים נצפה כדי להוכיח זאת (איור 4). התאים טופלו ב-150 μmol/L LA במשך 24 שעות והוכתמו ב-BODIPY. במצב גידול תאים רגיל ב 37 ° C ו 5% CO2, התאים נצפו ברציפות במשך 6 שעות עם תחנת עבודה של תאים חיים. התמונות צולמו כל 5 דקות. כפי שניתן לראות באיור 4, ב-15 הדקות הראשונות עדיין היו LDs קטנים יותר. לאחר מכן, ה-LDs החלו להתמזג בהדרגה מ-20 דקות, והתמזגו לחלוטין ל-LDs גדולים יותר ב-35 דקות.
איור 1: טיפות שומנים. תאי הפטוציטים שגודלו בתרבית בריכוזים שונים של LA ומוכתמים בשמן אדום O. הנקודות האדומות שיקפו LDs מוכתמים באדום שמן, והנקודות הכחולות-סגולות שיקפו את הגרעין עם המטוקסילין. בכל טיפול נבחרו שלוש שקופיות זכוכית להצבעה והדמיה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מספר וגודל LDs. תאי הפטוציטים שגודלו בתרבית בשיפוע ריכוז מ-0 עד 200 μmol/L LA ומוכתמים באדום שמן O. (A) מספר ממוצע של LDs לתא. מספר ה-LDs ב-27 תאים נספר בכל קבוצה. (B) הקוטר הממוצע של LDs בתא. גודלם של 60 LDs נספר בכל קבוצה. *P < 0.05; **P < 0.01; עמ' < 0.001; עמ' < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: פרופורציית LD. תאי הפטוציטים שגודלו בתרבית בריכוזים שונים של LA ומוכתמים בשמן אדום O. חושב יחס פרופורציה של LDs בגדלים שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: היתוך LD. תאי הפטוציטים גודלו בתרבית עם 150 μmol/L LA והודגרו עם הבדיקה BODIPY 493/503. לאחר תצפית רצופה במשך 6 שעות תחת תמונת הגדלה של פי 40, צולמו ה-LDs מתחת לפלואורסצנטיות ושדות בהירים. התמונות צולמו כל 5 דקות. היתוך סומן בתיבות אדומות. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בהתאם למצבים פתולוגיים, LDs בכבד עוברים שינויים עצומים בגודל ובמספר. LDs נמצאים באופן נרחב בתאי הפטוציטים וממלאים תפקיד מפתח בבריאות הכבד ובמחלות18. הכמות והגודל של LDs הם הבסיס למחקר הנוכחי על הביוגנזה של LDs19. הגודל והמספר של LDs עבור תאים ורקמות משקפים את יכולתם לאחסן ולשחרר אנרגיה. השינויים הדינמיים של LDs שומרים על יציבות הפעילות המטבולית של שומנים20,21. הצטברות חריגה של LDs מתרחשת בתנאים פתולוגיים שונים ויכולה להיות אינדיקטור למחלה מטבולית22,23. פרוטוקול זה מספק שיטה מדויקת למדוד את הגודל והכמות של LDs במודל תאי הפטוציטים המושרה על ידי חומצות שומן ולצפות באיחוי של LDs בצורה יעילה ואינטואיטיבית יותר.
כדי ללמוד את גודל ושינויים דינמיים של LDs הוא בעל משמעות רבה להבנת התרחשות של מחלות הקשורות הפרעות מטבוליזם שומנים התערבות יעילה. בניסוי זה, שלבי המפתח היו מדידה וניתוח של גודל וכמות LDs. ראשית, ריכוזים שונים של LA שימשו כדי לגרום להצטברות LD בהפטוציטים. חומצות שומן אחרות, כגון אולאט ופלמיטט, יכולות לשמש גם כדי לגרום להצטברות LD בתאי הפטוציטים24,25. לאחר הטיפול בריכוזים שונים של LA, נמצא כי גודל ה- LDs גדל באופן תלוי מינון. תוצאות אלה הצביעו על כך שצבע O אדום שמן מדד במדויק את הקוטר של LDs. נמצא גם כי ריכוז גבוה של LA יכול להגדיל את חלקם של LDs גדולים, דבר המצביע על כך ש- LDs קטנים התמזגו זה עם זה במהירות. היתוך מהיר הוא אחד השינויים הדינמיים ב- LDs; היתוך מהיר של LD עשוי להתרחש תוך מספר דקות או אפילו עשרות שניות, והוא מתווך בעיקר על ידי פוספוליפידים על פני השטח וחלבון22,26. במחקר הנוכחי, היתוך LD נצפה בבירור בין 20 דקות ל -35 דקות באמצעות תיוג BODIPY 493/503 על ידי תחנת עבודה של תאים חיים. ניתן להגדיר את מרווח הצילום בין תמונות תוך מספר שניות עד דקות, וניתן להגדיר את זמן הצילום הכולל משעה למספר ימים, מה שמספק נוחות להתבוננות בשינויים הדינמיים של LDs בתאים שונים.
במונחים של ניתוח צביעה של גודל LDs, צביעת O אדום שמן נוחה יותר וזולה יותר מאשר צביעה פלואורסצנטית, והוא נמצא בשימוש נרחב יותר כדי למדוד את הגודל הנראה של LDs9. זה לא צריך להיות מטופל נגד אור. יתר על כן, דרישות הציוד אינן קשות להשגה, ואת עדשת שמן של מיקרוסקופ אופטי רגיל ניתן להשתמש עבור תצפית צילום. באמצעות שיטה זו, החוקרים יכולים לבחור כמה קבוצות של תמונות כדי למדוד באופן אקראי את הגודל והכמות של LDs; זה פשוט ונוח לתפעול, והוא יכול להגדיל את גודל המדגם ולהפחית את השגיאה. יתר על כן, על פי גודל LD שנמדד ונותח, ניתן לראות ישירות את יחס ההתפלגות של גדלי LD שונים. ניתוח סטטיסטי יכול להתבצע בשיטה הנ"ל לאחר צביעת O אדום שמן, ושיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על תאים אחרים, כולל מגוון רחב של תאים המושפעים מהצטברות שומנים. בשלב הצביעה המוקדם, נמצא כי O אדום שמן לא היה קל לניקוי לאחר הצביעה, והיו שאריות גדולות של מגזיני צבע. בשלב מאוחר יותר סונן הצבע, וזמן הצביעה המתאים נבחר באמצעות בדיקות רציפות. לאחר הצביעה, הארכת זמני הניקוי יכולה למנוע את הבעיה הנ"ל.
צבע פלואורסצנטי BODIPY 493/503 הוא אחד הגשושיות הנפוצות ביותר להדמיית LD27. במחקר זה, היתוך LD בוצע על ידי תיוג LD ירוק עם BODIPY והתבוננות בתהליך עם תחנת עבודה של תאים חיים. אדום הנילוס הוא גם צבע פלואורסצנטי נפוץ עבור שומנים ניטרליים, אך פס העירור הרחב שלו (450-560 ננומטר), צביעה לא ספציפית, חדירות רקמות ירודה וחסרונות אחרים עשויים להשפיע על התוצאות של צביעת LD במידה מסוימת. בהשוואה לכתמים פלואורסצנטיים אדומים של הנילוס, רצועת העירור של BODIPY 493/503 הייתה צרה יותר (460-490 ננומטר), וניתן היה לתייג אותה יחד עם צבעים פלואורסצנטיים שונים11. שנית, BODIPY נמנע ביעילות מהתערבות של פיגמנטים צמחיים28. לבסוף, BODIPY יש חדירות רקמות חזקה, רגישות נמוכה קוטביות הסביבה, והוא לא קל להרוות12; לכן, הוא נמצא בשימוש נרחב צביעת פלואורסצנטיות של LDs. עם זאת, ניתוח של היתוך LD יש מגבלות מסוימות. על מנת לקבל תמונת תצפית רציפה של תאים חיים, לא ניתן להזיז את העדשה, ולכן ניתן לצפות רק באיחוי LD מקומי בראייה, ולא ניתן לנתח את יעילות היתוך LD של התא כולו בצורה מדויקת יותר.
לסיכום, מחקר זה מספק שיטה פשוטה וניתנת לשחזור עבור מורפולוגיה LD וניתוח גודל, אשר ניתן ליישם באופן נרחב על ניתוח LD בחקר מטבוליזם שומנים בתאים. עבודה זו גם הוכיחה את התהליך של היתוך LD, והניחה את הבסיס למחקר נוסף של LDs בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך במשותף על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (U1904116).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
References
- Fujimoto, T., Parton, R. G. Not just fat: the structure and function of the lipid droplet. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838 (2011).
- Grasselli, E., et al. Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine. Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).
- Herdt, T. H. Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).
- Pino-de la Fuente, F., et al. Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism. Life Sciences. 298, 120522 (2022).
- O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells. Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).
- Gao, G., et al. Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).
- Tütüncü Konyar, S. Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum. Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).
- Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio. Micron. 39 (7), 819-824 (2008).
- Duan, X., et al. The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore. Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, É Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review. Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).
- Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States. Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).
- Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. Journal of Visualized Experiments. (171), e62543 (2021).
- Liu, L., et al. Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).
- Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Sanjabi, B., et al. Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes. Scientific Reports. 5, 8816 (2015).
- Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis. Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).
- Yang, A., Mottillo, E. P. Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics. Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626 (2020).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Fei, W., et al. A role for phosphatidic acid in the formation of "supersized" lipid droplets. PLoS Genetics. 7 (7), e1002201 (2011).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Wang, J., et al. Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecules. 23 (7), 1594 (2018).
