Summary
El presente protocolo describe cómo usar O rojo aceite para teñir gotas de lípidos (LD), calcular el tamaño y el número de LD en un modelo de hepatocitos grasos inducido por ácidos grasos, y usar BODIPY 493/503 para observar el proceso de pequeños LD que se fusionan en LD grandes mediante imágenes de células vivas.
Abstract
Las gotitas de lípidos (LD) son orgánulos que desempeñan un papel importante en el metabolismo de los lípidos y el almacenamiento de lípidos neutros en las células. Se asocian con una variedad de enfermedades metabólicas, como la obesidad, la enfermedad del hígado graso y la diabetes. En las células hepáticas, los tamaños y el número de LD son signos de enfermedad del hígado graso. Además, la reacción de estrés oxidativo, la autofagia celular y la apoptosis a menudo se acompañan de cambios en los tamaños y números de LDs. Como resultado, las dimensiones y la cantidad de LD son la base de la investigación actual sobre el mecanismo de la biogénesis de LD. Aquí, en células hepáticas bovinas inducidas por ácidos grasos, describimos cómo usar el aceite rojo O para teñir LD e investigar los tamaños y números de LDs. La distribución de tamaño de los LD se analiza estadísticamente. El proceso de fusión de LD pequeños en LD grandes también se observa mediante un sistema de imágenes de células vivas. El trabajo actual proporciona una manera de observar directamente la tendencia de cambio de tamaño de las LD bajo diferentes condiciones fisiológicas.
Introduction
La acumulación de gotitas de lípidos (LD) en los hepatocitos es la característica típica de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), que puede progresar a fibrosis hepática y carcinoma hepatocelular. Se ha encontrado que la manifestación más temprana de la enfermedad del hígado graso es la esteatosis, caracterizada por la acumulación de LD en el citoplasma del hepatocito1. La esteatosis hepática se asocia invariablemente con un aumento del número y/o tamaño expandido de LDs2. Se cree que los LD se generan a partir del retículo endoplásmico (RE), que consiste en triglicéridos (TG) como núcleo, y están rodeados de proteínas y fosfolípidos3. Como orgánulo subcelular responsable del almacenamiento de TG, los LD exhiben diferentes características en cuanto a su tamaño, número, composición lipídica, proteínas e interacción con otros orgánulos, todos los cuales afectan la homeostasis de la energía celular4. El nivel de TG se correlaciona positivamente con el tamaño de los LD, y un mayor contenido de TG intracelular podría formar LDs más grandes5. Los LD aumentan de tamaño a través de la síntesis local de TG, la incorporación de lípidos en el RE y la fusión de múltiples LD6. Las células (adipocitos, hepatocitos, etc.) que contienen LD grandes tienen un mecanismo especial para aumentar eficientemente el almacenamiento de lípidos por fusión de LD. Los cambios dinámicos de los LD reflejan los diferentes estados del metabolismo energético de la célula. Es crucial desarrollar metodologías que permitan la observación y el análisis de los diversos LD hepáticos en células sanas y anormales.
Los principales colorantes no fluorescentes para LD son Sudan Black B y oil red O. Sudan Black B tiñe lípidos neutros, fosfolípidos y esteroides7. El aceite rojo O se utiliza principalmente para teñir LDs de músculo esquelético, cardiomiocitos, tejido hepático, células adiposas, etc.8., y se considera una herramienta estándar para la detección cuantitativa de esteatosis hepática en ratones y humanos9. El cambio dinámico de LDs se lleva a cabo principalmente por teñido fluorescente. El rojo del Nilo y el BODIPY son colorantes lipídicos fluorescentes de uso común10,11. En comparación con el rojo del Nilo, BODIPY tiene una permeabilidad tisular más fuerte y se une mejor con LD12. Los LD marcados con BODIPY se pueden utilizar para teñir células vivas y colocalizar con otros orgánulos13.
La incidencia de hígado graso es significativamente mayor en animales rumiantes que en animales monogástricos14. Durante el período de transición, las vacas lecheras experimentan un estado de balance energético negativo3. Grandes cantidades de ácidos grasos no esterificados (ácido palmítico, ácido oleico, ácido linoleico, etc.) se sintetizan en TG en hepatocitos bovinos, lo que conduce a una anomalía funcional hepática y reduce en gran medida la calidad de los productos lácteos y la eficiencia de la producción15. El presente estudio tiene como objetivo proporcionar un protocolo para analizar el tamaño y el número de LD, así como para monitorear la dinámica de fusión LD. Construimos un modelo de formación de LD agregando diferentes concentraciones de ácido linoleico (LA) en hepatocitos16 y observamos los cambios en el tamaño y el número de LDs durante el proceso al teñir LDs con O rojo aceite. Además, el proceso de fusión rápida de LDs también se observó mediante tinción con BODIPY 493/503.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados y realizados de acuerdo con los estándares éticos del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Agrícola de Henan (provincia de Henan, China).
1. Cultivo de células de hepatocitos bovinos
- Descongelar las células de hepatocitos primarios17 y centrifugar 400 x g durante 4 min a temperatura ambiente.
NOTA: Las células hepatocitos primarias fueron cultivadas y mantenidas después de un informe previamente publicado17. - Deseche la solución de almacenamiento congelada con una pipeta y suspenda con 1 ml de medio que contenga 10% de suero bovino fetal (FBS) y medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). A continuación, utilice una cámara de conteo de células para calcular el número de células por mililitro, y luego calcule la concentración de la suspensión celular anterior y ajuste la concentración de células a 1 x 107 células / ml.
- Añadir la suspensión celular en una placa de cultivo celular de 60 mm que contenga 3 ml del medio anterior. Cultivar las células e incubarlas a 37 °C y 5% deCO2 durante 24 h.
- Cuando las células crezcan hasta el 80%, deseche el medio y enjuague con solución salina tamponada con fosfato (PBS), luego agregue 750 μL de tripsina al 0.25% para digerir las células. Incubar las células a 37 °C durante 3 min, luego neutralizarlas con la misma cantidad de FBS al 10%. Recoger la suspensión de la celda para centrifugar a 200 x g durante 4 min a temperatura ambiente.
2. Tinción de O rojo aceite
- Agregue 800 μL de medio de cultivo que contenga 10% de FBS y DMEM en cada pocillo de la placa de cultivo celular de 24 pocillos que contiene cubreobjetos de vidrio. Tome 50 μL de la suspensión celular (obtenida en el paso 1.3) y agréguela a 950 μL de PBS para mezclar. Use una cámara de conteo de celdas para calcular el número de celdas por mililitro y luego calcule la concentración de la suspensión celular anterior. Finalmente, ajustar la concentración celular a 4 x 104/mL en cada pocillo e incubar a 37 °C y 5% deCO2 durante 24 h.
- Después de 24 h, desechar el medio de cultivo y lavar con PBS. Suspender con 800 μL de medio de inducción DMEM que contenga 1 mg/ml de albúmina sérica bovina (ASC).
- Disolver un total de 100 μL de LA (ver Tabla de materiales) en 900 μL de etanol anhidro y preparar una solución patrón (100 mmol/L). Agregue un gradiente de 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L y 200 μmol/L LA en la placa de 24 pocillos. Repita cada tratamiento cuatro veces. Incubar a 37 °C y 5% deCO2 durante 24 h.
- Retire el medio de cultivo y lave las células con PBS tres veces. Fijar con 400 μL de paraformaldehído al 4% durante 20 min. Deseche la solución fijadora y lávela con PBS tres veces.
- Incubar las células con alcohol isopropílico al 60% durante 5 minutos, luego desecharlo. Agregue la solución de trabajo de aceite rojo O recién preparada (consulte la Tabla de materiales) (proporción 3: 2 de aceite rojo O: agua) durante 20-30 minutos y deseche la solución de tinción. Lave las células con PBS de dos a cinco veces hasta que no haya exceso de solución de colorante.
- Añadir 300 μL de solución de tinción de hematoxilina (relación hematoxilina:agua de 1:10) y volver a teñir el núcleo durante 1-2 min. Deseche la solución de colorante y lave las células con PBS de dos a cinco veces. Saque los cubreobjetos de vidrio de la placa de 24 pocillos y colóquelos en portaobjetos microscópicos (el lado con las celdas hacia abajo) después de dejar caer 10 μL de sellador de tabletas (consulte la Tabla de materiales) sobre el portaobjetos.
- Después del sellado, observe y obtenga imágenes de los LD de las células bajo la lente de aceite del microscopio óptico (consulte la Tabla de materiales). Mida el diámetro de los LD con el software cellSens y analice el número y el tamaño de los LD.
3. Medición del tamaño y número de LD
- Capturar imágenes: Encienda el interruptor de la computadora y el microscopio sucesivamente, coloque la diapositiva en la plataforma de carga, abra el software de análisis de imágenes (consulte Tabla de materiales) y conecte la computadora para ver la imagen.
- Encuentre las imágenes a baja potencia y gotee una cantidad adecuada de aceite de cedro en la diapositiva de imágenes. Ajuste el factor de observación a 100x, establezca la exposición automática y capture las imágenes ajustando el campo de visión adecuado. Seleccione tres portaobjetos de celdas teñidas para cada grupo para obtener imágenes.
- Medición del diámetro: seleccione aleatoriamente 60 LD para cada imagen para medir los diámetros. Después de la medición de cada imagen, guarde las imágenes y envíe los resultados de la medición en una tabla para el posterior análisis del tamaño promedio y la relación de distribución de los LD.
- Medición de cantidad: seleccione tres imágenes para cada diapositiva teñida y fotografiada, y seleccione aleatoriamente tres celdas para la medición de cantidad en cada imagen. Cuente y analice el número de LD alrededor de la célula, y calcule el número promedio de LD en la célula.
4. Observación dinámica de la fusión LD
- Siga los pasos del cultivo celular como se menciona en los pasos 1.1-1.3. Cuando las células crezcan al 80%, deseche el medio y enjuague con PBS, luego digiera con 750 μL de tripsina durante 3 min. A continuación, agregue 750 μL del medio, centrifugar a 200 x g durante 4 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
- Suspender las células en 1 ml de medio de cultivo, contar y ajustar la concentración celular a 5 x 105 células/ml en una placa de 35 mm. Cultivo a 37 °C y 5%CO2 durante 24 h.
- Cuando las células hayan crecido al 80%, cambie el medio a DMEM + 150 μmol/L LA durante 24 h, y continúe el cultivo en una incubadora a 37 °C y 5% deCO2 para acumular los LDs.
- Después de 24 h, retire el medio de cultivo. Lave las células adherentes con PBS e incubarlas con una sonda fluorescente neutra BODIPY 493/503 de 10 μg/ml (consulte la Tabla de materiales) en la oscuridad durante 30 min. Después de la incubación, lave las células en la placa de cultivo con PBS tres veces y agregue DMEM + 150 μmol / L LA.
NOTA: Evite la exposición a la luz durante y después de la tinción BODIPY de 10 μg/ml; 1 mg/ml de BODIPY se diluyó con PBS (1:100). - Coloque la placa de cultivo en la ranura del microscopio de la estación de células vivas (consulte la Tabla de materiales) para observar los cambios dinámicos de los LD. Encienda la alimentación de la estación de trabajo de células vivas de acuerdo con la secuencia inicial y evite la luz.
- Encienda la alimentación, la fuente de luz de transmisión, la fuente de alimentación del microscopio, la fuente de luz fluorescente de la lámpara de mercurio, la fuente de alimentación de la cámara del dispositivo de carga acoplada (CCD), la fuente de alimentación del host de la computadora, la válvula de CO 2 y la incubadora de CO2.
- Agregue agua destilada a la ranura en la plataforma de carga, asegurándose de no pasar por la salida de aire.
- Encienda la computadora y ejecute "NIS-Elements". Primero, encuentre el campo de visión apropiado en la lente del objetivo 4x, luego ajústelo a la lente del objetivo 40x sucesivamente. Seleccione E100 para observar la muestra en el microscopio y L100 para previsualizar y fotografiar la muestra en el ordenador.
NOTA: E100 y L100 son botones de ajuste del microscopio en la estación de trabajo de celda viva (consulte la Tabla de materiales), que representan el ocular y la pantalla de la computadora, respectivamente. - Diseñe los parámetros como el canal de fluorescencia (por ejemplo, Ph-40x, isotiocianato de fluoresceína [FITC], obturador) y el tiempo de disparo esperado para el experimento. Establezca el tiempo de disparo en el tiempo, incluido el tiempo de intervalo de disparo de 5 minutos entre cada dos imágenes y un tiempo de disparo total de 6 h.
NOTA: El disparo prolongado debe utilizar la función de estabilización de enfoque del sistema de enfoque perfecto (PFS). Para esto, primero ajuste el campo de visión y la longitud del enfoque, luego haga clic en PFS en la pantalla de la computadora y finalmente ajuste la espiral de enfoque fino. - Seleccione diferentes modos de canal, un solo canal o todos, seleccione un campo de visión diferente, haga clic en vista previa, ajuste el campo de visión, establezca estos parámetros y haga clic en comenzar a ejecutar para comenzar a disparar. Tome una foto de prueba durante 5 minutos primero; Puede tomar mucho tiempo después de que la operación sea normal.
- Después de realizar la grabación, elija Archivo > Guardar como > Guardar tipo > formato avi para exportar los datos a un video en formato 'avi'. Utilice el formato de imagen '.nd2' para guardar el programa de datos y exportar las fotos.
- Para apagar la máquina, apáguela en orden inverso.
5. Estadísticas y análisis de resultados
- Analice los datos con ANOVA unidireccional. Notifique los resultados como la media ± error estándar.
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Representative Results
La tinción de las LD celulares se muestra en la Figura 1. Los puntos rojos reflejan las LD de las celdas, y los puntos azules reflejan los núcleos. Se puede ver que el tamaño y el número de LD en cada imagen son diferentes bajo el tratamiento de LA.
Con el aumento en la dosis de LA, el diámetro promedio y el número de LD mostraron una tendencia significativamente creciente, dependiendo de la concentración de LA (Figura 2). Como se muestra en la Figura 2A, el número de LD por célula se correlacionó negativamente con diferentes concentraciones de LA. La mediana del número de LD por célula fue de 136 para el grupo tratado con 100 μmol/L LA, disminuyendo a 118 y 105 para los grupos tratados con 150 μmol/L y 200 μmol/L LA, respectivamente. El diámetro promedio de los LD en el grupo control fue de 0,72 μm, 1,38 μm para el grupo tratado con 100 μmol/L LA, 1,51 μm para el grupo tratado con 150 μmol/L LA y 1,64 μm para el grupo tratado con 200 μmol/L LA (Figura 2B).
En este estudio, los LD con un diámetro <1 μm se definieron como pequeños, y los LD con un diámetro >4 μm se definieron como grandes. Se encontró que las proporciones de distribución de LDs también cambiaron con la concentración de LA, como se muestra en la Figura 3; la proporción de LD pequeñas disminuyó, y la proporción de LD grandes aumentó. La proporción de LD de diámetro pequeño fue de 43,33% a 100 μmol/L LA, 36,43% a 150 μmol/L LA, y 29,8% a 200 μmol/L LA. Para los LD de gran diámetro, la proporción más alta fue de 6.11% en 200 μmol / L LA, luego 3.15% y 1.48% en 150 y 100 μmol / L LA, respectivamente. En el grupo de 200 μmol / L LA, obviamente se observaron LD súper grandes (diámetro >5 μm), que representan aproximadamente 6.30%, más alto que los grupos de 100 μmol / L LA (5.93%) y 150 μmol / L LA (4.82%). Los resultados indicaron que una alta concentración de AL aumentó el tamaño de los LD y disminuyó el número de LD. Mientras tanto, la proporción de LD grandes aumentó, y la proporción de LD pequeños disminuyó.
Los LD grandes generalmente se formaron a través de la fusión de LD pequeños. Se observó que la fusión de LD a través de imágenes de células vivas demostró esto (Figura 4). Las células fueron tratadas con 150 μmol/L LA durante 24 h y teñidas con BODIPY. En la condición normal de crecimiento celular a 37 °C y 5% deCO2, las células se observaron continuamente durante 6 h con una estación de trabajo de células vivas. Las imágenes fueron capturadas cada 5 minutos. Como se muestra en la Figura 4, en los primeros 15 minutos, todavía había LD más pequeños obvios. Luego, los LD comenzaron a fusionarse lentamente a partir de 20 minutos, y se fusionaron completamente en LD más grandes a los 35 minutos.
Figura 1: Gotas de lípidos. Células hepatocitos cultivadas en diferentes concentraciones de LA y teñidas con aceite rojo O. Los puntos rojos reflejaban LDs teñidos con rojo aceite, y los puntos azul-púrpura reflejaban el núcleo con hematoxilina. Se seleccionaron tres portaobjetos de vidrio para la tinción y la obtención de imágenes en cada tratamiento. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Número y tamaño de los LD. Células hepatocitos cultivadas en un gradiente de concentración de 0 a 200 μmol/L LA y teñidas con O. (A) Número promedio de LD por célula. El número de LD en 27 células se contó en cada grupo. (B) El diámetro promedio de LDs en una célula. El tamaño de 60 LD se contó en cada grupo. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Proporción de LD. Células hepatocitos cultivadas en diferentes concentraciones de LA y teñidas con O. Se calculó la proporción de LD de diferentes tamaños. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Fusión LD. Las células de hepatocitos se cultivaron con 150 μmol/L LA y se incubaron con la sonda BODIPY 493/503. Después de una observación continua durante 6 h bajo una imagen de aumento de 40x, se fotografiaron los LD bajo la fluorescencia y los campos brillantes. Las imágenes fueron capturadas cada 5 minutos. La fusión estaba marcada con cajas rojas. Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Dependiendo de los estados patológicos, los LD hepáticos experimentan cambios tremendos en su tamaño y número. Las LD están ampliamente presentes en las células hepatocitos y desempeñan un papel clave en la salud y enfermedad hepática18. La cantidad y el tamaño de las LD son la base de la investigación actual sobre la biogénesis de las LD19. El tamaño y el número de LD para células y tejidos reflejan su capacidad para almacenar y liberar energía. Los cambios dinámicos de las LDs mantienen la estabilidad de las actividades metabólicas lipídicas20,21. Una acumulación anormal de LDs ocurre en diversas condiciones patológicas y puede ser un indicador de enfermedad metabólica22,23. Este protocolo proporciona un método preciso para medir el tamaño y la cantidad de LD en un modelo de células de hepatocitos inducido por ácidos grasos y observar la fusión de LD de manera más eficiente e intuitiva.
Estudiar el tamaño y los cambios dinámicos de las LD es de gran importancia para comprender la aparición de enfermedades relacionadas con los trastornos del metabolismo de los lípidos y la intervención efectiva. En este experimento, los pasos clave fueron la medición y el análisis del tamaño y la cantidad de LD. En primer lugar, se utilizaron diferentes concentraciones de LA para inducir la acumulación de LD en los hepatocitos. Otros ácidos grasos, como el oleato y el palmitato, también podrían ser utilizados para causar acumulación de LD en células hepatocitos24,25. Después del tratamiento con diferentes concentraciones de LA, se encontró que el tamaño de las LD aumentó de manera dependiente de la dosis. Estos resultados indicaron que la tinción O de rojo aceite midió con precisión el diámetro de los LD. También se encontró que una alta concentración de LA podría aumentar la proporción de LD de gran tamaño, lo que sugiere que los LD pequeños se fusionaron entre sí rápidamente. La fusión rápida es uno de los cambios dinámicos en los LD; La fusión rápida LD puede ocurrir en pocos minutos o incluso decenas de segundos, y está mediada principalmente por sus fosfolípidos superficiales y la proteína22,26. En el presente estudio, la fusión de LD se observó claramente de 20 min a 35 min utilizando el etiquetado BODIPY 493/503 por una estación de trabajo de células vivas. El intervalo de disparo entre imágenes se puede configurar en unos pocos segundos o minutos, y el tiempo total de disparo se puede configurar de 1 hora a varios días, lo que proporciona comodidad para observar los cambios dinámicos de LD en diferentes celdas.
En términos del análisis de tinción del tamaño de los LD, la tinción O de rojo aceite es más conveniente y más barata que la tinción fluorescente, y se usa más ampliamente para medir el tamaño aparente de LD9. No necesita ser tratado contra la luz. Además, los requisitos del equipo no son difíciles de lograr, y la lente de aceite de un microscopio óptico ordinario se puede utilizar para la observación fotográfica. Usando este método, los investigadores pueden seleccionar varios grupos de imágenes para medir aleatoriamente el tamaño y la cantidad de LDs; Es simple y conveniente de operar, y puede aumentar el tamaño de la muestra y reducir el error. Además, de acuerdo con el tamaño de LD medido y analizado, se puede observar directamente la relación de distribución de diferentes tamaños de LD. El análisis estadístico se puede llevar a cabo por el método anterior después de la tinción de O rojo aceite, y este método también se puede aplicar a otras células, incluida una amplia gama de células afectadas por la acumulación de lípidos. En la etapa temprana de teñido, se encontró que el rojo aceite O no era fácil de limpiar después del teñido, y había residuos sustanciales de revistas de tinte. En la etapa posterior, se filtró el tinte y se seleccionó el tiempo de teñido apropiado a través de pruebas continuas. Después del teñido, aumentar los tiempos de limpieza podría evitar el problema anterior.
El colorante fluorescente BODIPY 493/503 es una de las sondas más comunes para la visualización LD27. En este estudio, la fusión de LD se realizó marcando el verde LD con BODIPY y observando el proceso con una estación de trabajo de células vivas. El rojo del Nilo también es un colorante fluorescente de uso común para los lípidos neutros, pero su amplia banda de excitación (450-560 nm), la tinción no específica, la mala permeabilidad del tejido y otras deficiencias pueden afectar los resultados de la tinción LD hasta cierto punto. En comparación con la tinción de fluorescencia del rojo del Nilo, la banda de excitación de BODIPY 493/503 era más estrecha (460-490 nm), y podía ser co-marcada con varios colorantes fluorescentes11. En segundo lugar, BODIPY evita eficazmente la interferencia de pigmentos vegetales28. Finalmente, BODIPY tiene una fuerte permeabilidad tisular, baja sensibilidad a la polaridad ambiental y no es fácil de apagar12; por lo tanto, es ampliamente utilizado en la tinción fluorescente de LDs. Sin embargo, el análisis de la fusión LD tiene ciertas limitaciones. Para obtener una imagen de observación continua de las células vivas, la lente no se puede mover, por lo que solo se puede observar una fusión LD local en la visión, y la eficiencia de fusión LD de toda la célula no se puede analizar con mayor precisión.
En conclusión, este estudio proporciona un método simple y reproducible para la morfología de LD y el análisis de tamaño, que se puede aplicar ampliamente al análisis de LD en el estudio del metabolismo de los lípidos celulares. Este trabajo también demostró el proceso de fusión de LD, sentando las bases para un mayor estudio de LD en el futuro.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada conjuntamente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (U1904116).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
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