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Biology

Évaluation de la taille et de la fusion des gouttelettes lipidiques dans les cellules hépatiques bovines

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/65234
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1College of Veterinary Medicine, Henan Agricultural University

Summary

Le présent protocole décrit comment utiliser le rouge d’huile O pour colorer les gouttelettes lipidiques (LD), calculer la taille et le nombre de LD dans un modèle d’hépatocytes gras induits par des acides gras et utiliser BODIPY 493/503 pour observer le processus de fusion de petites LD en grandes LD par imagerie de cellules vivantes.

Abstract

Les gouttelettes lipidiques (LD) sont des organites qui jouent un rôle important dans le métabolisme des lipides et le stockage des lipides neutres dans les cellules. Ils sont associés à une variété de maladies métaboliques, telles que l’obésité, la stéatose hépatique et le diabète. Dans les cellules hépatiques, la taille et le nombre de TA sont des signes de stéatose hépatique. De plus, la réaction de stress oxydatif, l’autophagie cellulaire et l’apoptose s’accompagnent souvent de changements dans la taille et le nombre de LD. En conséquence, les dimensions et la quantité de ML sont à la base de la recherche actuelle concernant le mécanisme de la biogenèse des ML. Ici, dans les cellules hépatiques bovines induites par les acides gras, nous décrivons comment utiliser le rouge d’huile O pour colorer les LD et pour étudier la taille et le nombre de LD. La distribution par taille des TA est analysée statistiquement. Le processus de fusion de petites LD en grandes LD est également observé par un système d’imagerie de cellules vivantes. Les travaux actuels permettent d’observer directement la tendance au changement de taille des TA dans différentes conditions physiologiques.

Introduction

L’accumulation de gouttelettes lipidiques (LD) dans les hépatocytes est la caractéristique typique de la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), qui peut évoluer vers une fibrose hépatique et un carcinome hépatocellulaire. Il a été constaté que la première manifestation de la stéatose hépatique est la stéatose, caractérisée par une accumulation de LD dans le cytoplasme de l’hépatocytes1. La stéatose hépatique est invariablement associée à une augmentation du nombre et/ou à une taille accrue des TA2. On pense que les LD sont générés à partir du réticulum endoplasmique (RE), constitué de triglycérides (TG) comme noyau, et sont entourés de protéines et de phospholipides3. En tant qu’organite subcellulaire responsable du stockage des TG, les LD présentent différentes caractéristiques en ce qui concerne leur taille, leur nombre, leur composition lipidique, leurs protéines et leur interaction avec d’autres organites, qui affectent toutes l’homéostasie énergétique cellulaire4. Le niveau de TG est positivement corrélé avec la taille des LD, et une teneur en TG intracellulaire plus élevée pourrait former des DL plus grandes5. Les LD augmentent en taille grâce à la synthèse locale de TG, à l’incorporation de lipides dans le RE et à la fusion de plusieurs LDs6. Les cellules (adipocytes, hépatocytes, etc.) qui contiennent de grandes LD ont un mécanisme spécial pour augmenter efficacement le stockage des lipides par fusion LD. Les changements dynamiques des LD reflètent les différents états du métabolisme énergétique de la cellule. Il est crucial de développer des méthodologies qui permettent l’observation et l’analyse des différentes LD hépatiques dans les cellules saines et anormales.

Les principaux colorants non fluorescents pour les LD sont le noir B du Soudan et le rouge d’huile O. Le noir B du Soudan colore les lipides neutres, les phospholipides et les stéroïdes7. Oil red O est principalement utilisé pour colorer les LD du muscle squelettique, des cardiomyocytes, du tissu hépatique, des cellules adipeuses, etc.8., et est considéré comme un outil standard pour la détection quantitative de la stéatose hépatique chez la souris et l’homme9. Le changement dynamique des LD est principalement réalisé par teinture par fluorescence. Le rouge du Nil et BODIPY sont tous deux des colorants lipidiques fluorescentscouramment utilisés 10,11. Comparé au rouge du Nil, BODIPY a une perméabilité tissulaire plus forte et se lie mieux avec les LDs12. Les LD marqués BODIPY peuvent être utilisés pour colorer les cellules vivantes et la colocalisation avec d’autres organites13.

L’incidence de la stéatose hépatique est significativement plus élevée chez les ruminants que chez les monogastriques14. Pendant la période de transition, les vaches laitières connaissent un état de bilan énergétique négatif3. De grandes quantités d’acides gras non estérifiés (acide palmitique, acide oléique, acide linoléique, etc.) sont synthétisées en TG dans les hépatocytes bovins, ce qui entraîne une anomalie fonctionnelle du foie et réduit considérablement la qualité des produits laitiers et l’efficacité de la production15. La présente étude vise à fournir un protocole pour analyser la taille et le nombre de ML, ainsi que pour surveiller la dynamique de fusion des LD. Nous avons construit un modèle de formation de LD en ajoutant différentes concentrations d’acide linoléique (LA) dans les hépatocytes16 et observé les changements dans la taille et le nombre de LD au cours du processus en colorant les LD avec du rouge d’huile O. En outre, le processus de fusion rapide des LD a également été observé par coloration avec BODIPY 493/503.

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Protocol

Toutes les procédures ont été approuvées et exécutées conformément aux normes éthiques du Comité de protection des animaux de l’Université agricole du Henan (province du Henan, Chine).

1. Culture de cellules hépatocytes bovines

  1. Décongeler les cellules hépatocytes primaires17 et centrifuger 400 x g pendant 4 min à température ambiante.
    REMARQUE : Les cellules hépatocytes primaires ont été cultivées et maintenues à la suite d’un rapport publié antérieurement17.
  2. Jeter la solution d’entreposage congelée à l’aide d’une pipette et la suspendre avec 1 mL de milieu contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et le milieu Eagle’s modifié de Dulbecco (DMEM). Ensuite, utilisez une chambre de comptage de cellules pour calculer le nombre de cellules par millilitre, puis calculez la concentration de la suspension cellulaire ci-dessus et ajustez la concentration de la cellule à 1 x 107 cellules / mL.
    1. Ajouter la suspension cellulaire dans une boîte de culture cellulaire de 60 mm contenant 3 mL du milieu ci-dessus. Culture des cellules et incuber à 37 °C et 5% de CO2 pendant 24 h.
  3. Lorsque les cellules atteignent 80%, jetez le milieu et rincez avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis ajoutez 750 μL de trypsine à 0,25% pour digérer les cellules. Incuber les cellules à 37 °C pendant 3 min, puis les neutraliser avec la même quantité de FBS à 10%. Recueillir la suspension cellulaire pour centrifuger à 200 x g pendant 4 min à température ambiante.

2. Coloration O rouge huile

  1. Ajouter 800 μL de milieu de culture contenant 10 % de FBS et de DMEM dans chaque puits de la plaque de culture cellulaire de 24 puits contenant des lamelles de verre. Prélever 50 μL de la suspension cellulaire (obtenue à l’étape 1.3) et l’ajouter à 950 μL de PBS à mélanger. Utilisez une chambre de comptage de cellules pour calculer le nombre de cellules par millilitre, puis calculez la concentration de la suspension cellulaire ci-dessus. Enfin, ajuster la concentration cellulaire à 4 x 104/mL dans chaque puits et incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h.
  2. Après 24 h, jeter le milieu de culture et laver avec du PBS. Suspendre avec 800 μL de milieu d’induction DMEM contenant 1 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA).
  3. Dissoudre un total de 100 μL d’AL (voir le tableau des matières) dans 900 μL d’éthanol anhydre et préparer une solution étalon (100 mmol/L). Ajouter un gradient de 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L et 200 μmol/L LA dans la plaque de 24 puits. Répétez chaque traitement quatre fois. Incuber à 37 °C et 5% deCO2 pendant 24 h.
  4. Retirez le milieu de culture et lavez les cellules avec du PBS trois fois. Fixer avec 400 μL de paraformaldéhyde à 4% pendant 20 min. Jetez la solution fixatrice et lavez-la trois fois avec du PBS.
  5. Incuber les cellules avec de l’alcool isopropylique à 60% pendant 5 min, puis les jeter. Ajouter la solution de travail O rouge huile fraîchement préparée (voir le tableau des matériaux) (rapport 3:2 d’huile rouge O:eau) pendant 20-30 min et jeter la solution de coloration. Lavez les cellules avec du PBS deux à cinq fois jusqu’à ce qu’il n’y ait pas d’excès de solution de colorant.
  6. Ajouter 300 μL de solution de coloration à l’hématoxyline (rapport hématoxyline:eau de 1:10) et re-teindre le noyau pendant 1-2 min. Jetez la solution de colorant et lavez les cellules avec du PBS deux à cinq fois. Retirez les lamelles de verre de la plaque de 24 puits et placez-les sur des lames microscopiques (le côté avec les cellules tournées vers le bas) après avoir déposé 10 μL de mastic pour comprimés (voir le tableau des matériaux) sur la lame.
  7. Après le scellement, observer et imager les LD des cellules sous la lentille à huile du microscope optique (voir Tableau des matériaux). Mesurez le diamètre des LD à l’aide du logiciel cellSens et analysez le nombre et la taille des LD.

3. Mesure de la taille et du nombre de TA

  1. Capturer des images : Allumez successivement l’ordinateur et l’interrupteur du microscope, placez la lame sur la plate-forme de chargement, ouvrez le logiciel d’analyse d’images (voir Tableau des matériaux) et connectez l’ordinateur pour visualiser l’image.
    1. Trouvez les images à faible puissance et versez une quantité appropriée d’huile de cèdre sur la lame d’imagerie. Ajustez le facteur d’observation à 100x, réglez l’exposition automatique et capturez les images en ajustant le champ de vision approprié. Sélectionnez trois lames de cellules colorées pour chaque groupe à des fins d’imagerie.
  2. Mesure du diamètre : sélectionnez au hasard 60 LD pour chaque image afin de mesurer les diamètres. Après la mesure de chaque image, enregistrez les images et extrayez les résultats de la mesure dans un tableau pour l’analyse ultérieure de la taille moyenne et du rapport de distribution des LD.
  3. Mesure de la quantité : sélectionnez trois images pour chaque diapositive colorée et photographiée, et sélectionnez au hasard trois cellules pour mesurer la quantité dans chaque image. Comptez et analysez le nombre de TA autour de la cellule, et calculez le nombre moyen de LD dans la cellule.

4. Observation dynamique de la fusion LD

  1. Suivez les étapes de culture cellulaire mentionnées aux étapes 1.1-1.3. Lorsque les cellules atteignent 80%, jetez le milieu et rincez avec du PBS, puis digérez-les avec 750 μL de trypsine pendant 3 min. Ensuite, ajoutez 750 μL du milieu, centrifugez à 200 x g pendant 4 min à température ambiante et jetez le surnageant.
  2. Suspendre les cellules dans 1 mL de milieu de culture, compter et ajuster la concentration cellulaire à 5 x 105 cellules/mL dans une boîte de 35 mm. Culture à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h.
  3. Lorsque les cellules ont atteint 80%, changer le milieu en DMEM + 150 μmol/L LA pendant 24 h, et poursuivre la culture dans un incubateur à 37°C et 5% CO2 pour accumuler les LDs.
  4. Après 24 h, retirer le milieu de culture. Lavez les cellules adhérentes avec du PBS et incuber avec une sonde fluorescente neutre BODIPY 493/503 de 10 μg/mL (voir le tableau des matériaux) dans l’obscurité pendant 30 min. Après l’incubation, laver les cellules dans la boîte de culture avec du PBS trois fois et ajouter DMEM + 150 μmol/L LA.
    REMARQUE : Éviter l’exposition à la lumière pendant et après la coloration BODIPY à 10 μg/mL; BODIPY à 1 mg/mL a été dilué avec du PBS (1:100).
  5. Placez la capsule de culture dans la rainure du microscope de la station de cellules vivantes (voir Tableau des matériaux) pour observer les changements dynamiques des TA. Allumez l’alimentation du poste de travail de la cellule vivante en fonction de la séquence de départ et évitez la lumière.
    1. Mettez sous tension l’alimentation, la source lumineuse de transmission, la source d’alimentation du microscope, la source de lumière fluorescente à lampe au mercure, la source d’alimentation de la caméra à couplage de charge (CCD), la source d’alimentation hôte de l’ordinateur, la vanne CO 2 et l’incubateur de CO2 .
  6. Ajoutez de l’eau distillée à la rainure sur la plate-forme de chargement, en veillant à ne pas passer par-dessus l’évent d’aération.
  7. Allumez l’ordinateur et exécutez « NIS-Elements ». Tout d’abord, trouvez le champ de vision approprié sur l’objectif 4x, puis ajustez-le successivement sur l’objectif 40x. Sélectionnez E100 pour observer l’échantillon au microscope et L100 pour prévisualiser et photographier l’échantillon sur l’ordinateur.
    REMARQUE : E100 et L100 sont des boutons de réglage du microscope sur le poste de travail de la cellule vivante (voir le tableau des matériaux), représentant respectivement l’oculaire et l’écran d’ordinateur.
  8. Concevoir les paramètres tels que le canal de fluorescence (p. ex., Ph-40x, isothiocyanate de fluorescéine [FITC], obturateur) et le temps de prise de vue prévu pour l’expérience. Réglez le temps de prise de vue dans le temps, y compris l’intervalle de prise de vue de 5 minutes entre deux images et un temps de prise de vue total de 6 h.
    REMARQUE: La prise de vue de longue durée doit utiliser la fonction de stabilisation de mise au point parfaite (PFS). Pour cela, ajustez d’abord le champ de vision et la longueur de mise au point, puis cliquez sur PFS sur l’écran de l’ordinateur, et enfin ajustez la spirale de mise au point fine.
  9. Sélectionnez différents modes de chaîne, un seul canal ou tous, sélectionnez un champ de vision différent, cliquez sur Aperçu, ajustez le champ de vision, définissez ces paramètres et cliquez sur Démarrer l’exécution pour commencer la prise de vue. Faites d’abord un essai pendant 5 minutes; Cela peut prendre beaucoup de temps après que l’opération est normale.
  10. Une fois la prise de vue effectuée, choisissez Fichier > Enregistrer sous > Enregistrer le type > format avi pour exporter les données vers une vidéo au format 'avi'. Utilisez le format d’image '.nd2' pour enregistrer le programme de données et exporter les photos.
  11. Pour éteindre la machine, éteignez-la dans l’ordre inverse.

5. Statistiques et analyse des résultats

  1. Analysez les données à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle. Déclarez les résultats sous forme de moyenne ±erreur-type.

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Representative Results

La coloration des LD cellulaires est illustrée à la figure 1. Les points rouges reflètent les LD cellulaires et les points bleus reflètent les noyaux. On peut voir que la taille et le nombre de TA dans chaque image sont différents sous le traitement de LA.

Avec l’augmentation de la dose d’AL, le diamètre moyen et le nombre de DL ont montré une tendance à la hausse significative, en fonction de la concentration de LA (Figure 2). Comme le montre la figure 2A, le nombre de DL par cellule était négativement corrélé avec différentes concentrations d’AL. Le nombre médian de LD par cellule était de 136 pour le groupe traité à 100 μmol/L d’AL, diminuant à 118 et 105 pour les groupes traités à 150 μmol/L et 200 μmol/L d’AL, respectivement. Le diamètre moyen des DL dans le groupe témoin était de 0,72 μm, 1,38 μm pour le groupe traité à 100 μmol/L d’AL, de 1,51 μm pour le groupe traité à 150 μmol/L d’AL et de 1,64 μm pour le groupe traité à 200 μmol/L d’AL (figure 2B).

Dans cette étude, les LD d’un diamètre <1 μm ont été définies comme petites, et les LD d’un diamètre >4 μm ont été définies comme grandes. Il a été constaté que les proportions de distribution des LD changeaient également avec la concentration de LA, comme le montre la figure 3; la proportion de petites TA a diminué, et la proportion de TA de grande taille a augmenté. La proportion de LD de petit diamètre était de 43,33 % à 100 μmol/L LA, de 36,43 % à 150 μmol/L d’AL et de 29,8 % à 200 μmol/L LA. Pour les LD de grand diamètre, la proportion la plus élevée était de 6,11 % dans 200 μmol/L d’AL, puis de 3,15 % et de 1,48 % dans les AL de 150 et 100 μmol/L, respectivement. Dans le groupe 200 μmol/L LA, des DL très grandes (diamètre >5 μm) ont évidemment été observées, représentant environ 6,30 %, soit plus que les groupes 100 μmol/L LA (5,93 %) et 150 μmol/L LA (4,82 %). Les résultats ont indiqué qu’une concentration élevée d’AL augmentait la taille des TA et diminuait le nombre de TA. Parallèlement, la proportion de TA de grande taille a augmenté, et la proportion de petites TA a diminué.

Les grandes LD ont généralement été formées par la fusion de petites LD. La fusion des LD par imagerie de cellules vivantes a été observée pour le prouver (Figure 4). Les cellules ont été traitées avec 150 μmol/L de LA pendant 24 h et colorées avec BODIPY. Dans des conditions normales de croissance cellulaire à 37 °C et 5% de CO2, les cellules ont été observées en continu pendant 6 heures avec un poste de travail de cellules vivantes. Les images ont été capturées toutes les 5 minutes. Comme le montre la figure 4, au cours des 15 premières minutes, il y avait encore des TA plus petites évidentes. Ensuite, les LD ont lentement commencé à fusionner à partir de 20 minutes et ont été complètement fusionnées en LD plus grandes en 35 minutes.

Figure 1
Figure 1 : Gouttelettes lipidiques. Cellules hépatocytes cultivées à différentes concentrations de LA et colorées avec du rouge d’huile O. Les points rouges reflétaient les LD colorés en rouge huile, et les points bleu-violet reflétaient le noyau avec de l’hématoxyline. Trois lames de verre ont été sélectionnées pour la coloration et l’imagerie dans chaque traitement. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Nombre et taille des TA. Cellules hépatocytes cultivées dans un gradient de concentration de 0 à 200 μmol/L LA et colorées au rouge huileux O. (A) Nombre moyen de LD par cellule. Le nombre de TA dans 27 cellules a été compté dans chaque groupe. (B) Le diamètre moyen des LD dans une cellule. La taille de 60 TA a été comptée dans chaque groupe. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Proportion de LD. Cellules hépatocytes cultivées à différentes concentrations de LA et colorées au rouge d’huile O. Le rapport de proportion de LD de différentes tailles a été calculé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Fusion LD. Des cellules hépatocytes ont été cultivées avec 150 μmol/L de LA et incubées avec la sonde BODIPY 493/503. Après une observation continue pendant 6 h sous une image d’agrandissement 40x, les LD sous la fluorescence et les champs lumineux ont été photographiés. Les images ont été capturées toutes les 5 minutes. Fusion a été marqué avec des cases rouges. Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Selon les états pathologiques, les TA hépatiques subissent d’énormes changements dans leur taille et leur nombre. Les LD sont largement présents dans les cellules hépatocytes et jouent un rôle clé dans la santé et les maladies du foie18. La quantité et la taille des TA sont à la base des recherches actuelles sur la biogenèse des DL19. La taille et le nombre de DL pour les cellules et les tissus reflètent leur capacité à stocker et à libérer de l’énergie. Les changements dynamiques des LD maintiennent la stabilité des activités métaboliques lipidiques20,21. Une accumulation anormale de TA se produit dans diverses conditions pathologiques et peut être un indicateur de maladie métabolique22,23. Ce protocole fournit une méthode précise pour mesurer la taille et la quantité de LD dans un modèle de cellules hépatocytes induites par des acides gras et observer la fusion des LD de manière plus efficace et intuitive.

L’étude de la taille et des changements dynamiques des TA est d’une grande importance pour comprendre l’apparition de maladies liées aux troubles du métabolisme lipidique et une intervention efficace. Dans cette expérience, les étapes clés ont été la mesure et l’analyse de la taille et de la quantité de TA. Tout d’abord, différentes concentrations de LA ont été utilisées pour induire l’accumulation de LD dans les hépatocytes. D’autres acides gras, tels que l’oléate et le palmitate, pourraient également être utilisés pour provoquer une accumulation de LD dans les cellules hépatocytes24,25. Après le traitement avec différentes concentrations d’AL, il a été constaté que la taille des ML était augmentée de manière dose-dépendante. Ces résultats ont indiqué que la coloration au rouge d’huile O mesurait avec précision le diamètre des LD. Il a également été constaté qu’une concentration élevée d’AL pourrait augmenter la proportion de TA de grande taille, ce qui suggère que les petites TA fusionnent rapidement les unes avec les autres. La fusion rapide est l’un des changements dynamiques des TA; La fusion rapide LD peut se produire en quelques minutes ou même des dizaines de secondes, et elle est principalement médiée par ses phospholipides de surface et sa protéine22,26. Dans la présente étude, la fusion LD a été clairement observée de 20 min à 35 min en utilisant le marquage BODIPY 493/503 par un poste de travail de cellule vivante. L’intervalle de prise de vue entre les images peut être réglé de quelques secondes à quelques minutes, et le temps total de prise de vue peut être réglé de 1 heure à plusieurs jours, ce qui facilite l’observation des changements dynamiques des LD dans différentes cellules.

En ce qui concerne l’analyse de la taille des LD, la coloration au rouge huile O est plus pratique et moins chère que la coloration fluorescente, et est plus largement utilisée pour mesurer la taille apparente des LDs9. Il n’a pas besoin d’être traité contre la lumière. De plus, les exigences en matière d’équipement ne sont pas difficiles à atteindre et la lentille à huile d’un microscope optique ordinaire peut être utilisée pour la photo-observation. À l’aide de cette méthode, les chercheurs peuvent sélectionner plusieurs groupes d’images pour mesurer au hasard la taille et la quantité de TA; Il est simple et pratique à utiliser, et peut augmenter la taille de l’échantillon et réduire l’erreur. De plus, en fonction de la taille de LD mesurée et analysée, le rapport de distribution des différentes tailles de LD peut être directement observé. L’analyse statistique peut être effectuée par la méthode ci-dessus après coloration au rouge d’huile, et cette méthode peut également être appliquée à d’autres cellules, y compris un large éventail de cellules affectées par l’accumulation de lipides. Au début de la teinture, il a été constaté que l’huile rouge O n’était pas facile à nettoyer après la teinture et qu’il y avait des résidus importants de chargeurs de colorant. Dans la dernière étape, le colorant a été filtré et le temps de teinture approprié a été sélectionné par des tests continus. Après la teinture, l’augmentation des temps de nettoyage pourrait éviter le problème ci-dessus.

Le colorant fluorescent BODIPY 493/503 est l’une des sondes les plus courantes pour la visualisation LD27. Dans cette étude, la fusion LD a été réalisée en étiquetant le LD vert avec BODIPY et en observant le processus avec un poste de travail de cellule vivante. Le rouge du Nil est également un colorant fluorescent couramment utilisé pour les lipides neutres, mais sa large bande d’excitation (450-560 nm), sa coloration non spécifique, sa faible perméabilité tissulaire et d’autres défauts peuvent affecter les résultats de la coloration LD dans une certaine mesure. Par rapport à la coloration par fluorescence rouge du Nil, la bande d’excitation de BODIPY 493/503 était plus étroite (460-490 nm), et elle pouvait être co-marquée avec divers colorants fluorescents11. Deuxièmement, BODIPY évite efficacement l’interférence des pigments végétaux28. Enfin, BODIPY présente une forte perméabilité tissulaire, une faible sensibilité à la polarité environnementale et n’est pas facile à étancher12 ; par conséquent, il est largement utilisé dans la coloration par fluorescence des LD. Cependant, l’analyse de la fusion LD présente certaines limites. Afin d’obtenir une image d’observation continue des cellules vivantes, la lentille ne peut pas être déplacée, de sorte que seule une fusion LD locale peut être observée dans la vision, et l’efficacité de fusion LD de la cellule entière ne peut pas être analysée avec plus de précision.

En conclusion, cette étude fournit une méthode simple et reproductible pour la morphologie et l’analyse de la taille des LD, qui peut être largement appliquée à l’analyse des LD dans l’étude du métabolisme des lipides cellulaires. Ce travail a également prouvé le processus de fusion des LD, jetant les bases d’une étude plus approfondie des TA à l’avenir.

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Disclosures

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue conjointement par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (U1904116).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin Gibco 25200072 reagent
4% paraformaldehyde Solarbio P1110 reagent
BODIPY 493/503 invitrogen 2295015 reagent
Cedar oil Solarbio C7140 reagent
cell counting chamber equipment
cell culture dish Corning 353002 material
cell sens software  Olympus IX73 software
Centrifuge Eppendorf equipment
DMEM HyClone SH30022.01 reagent
Fetal Bovine Serum Gibco 2492319 reagent
hematoxylin DingGuo AR0712 reagent
Image view image analysis sodtware
linoleic acid Solarbio SL8520 reagent
Live Cell Station Nikon A1 HD25 equipment
NIS-Elements  Nikon software
oil red O Solarbio G1260 reagent
optical microscope Olympus IX73 equipment
Penicillin & Streptomycin 100× NCM Biotech CLOOC5 reagent
Phosphate Buffered Saline HyClone SH30258.01 reagent
Pipette Eppendorf equipment
Sealing agent Solarbio S2150 reagent

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Biologie numéro 193
Évaluation de la taille et de la fusion des gouttelettes lipidiques dans les cellules hépatiques bovines
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Yang, J., Kang, F., Wei, A., Lu, W., … More

Yang, J., Kang, F., Wei, A., Lu, W., Zhang, X., Han, L. Evaluation of Lipid Droplet Size and Fusion in Bovine Hepatic Cells. J. Vis. Exp. (193), e65234, doi:10.3791/65234 (2023).

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