Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie man ölrotes O verwendet, um Lipidtröpfchen (LDs) zu färben, die Größe und Anzahl von LDs in einem Fettsäure-induzierten Fetthepatozytenmodell zu berechnen und BODIPY 493/503 zu verwenden, um den Prozess der Verschmelzung kleiner LDs zu großen LDs durch Lebendzellbildgebung zu beobachten.
Abstract
Lipidtröpfchen (LDs) sind Organellen, die eine wichtige Rolle im Fettstoffwechsel und bei der neutralen Lipidspeicherung in Zellen spielen. Sie werden mit einer Vielzahl von Stoffwechselerkrankungen wie Fettleibigkeit, Fettleber und Diabetes in Verbindung gebracht. In Leberzellen sind Größe und Anzahl der LDs Anzeichen für eine Fettlebererkrankung. Darüber hinaus gehen die oxidative Stressreaktion, die Zellautophagie und die Apoptose oft mit Veränderungen in der Größe und Anzahl der LDs einher. Daher sind die Abmessungen und die Menge der LDs die Grundlage der aktuellen Forschung zum Mechanismus der LD-Biogenese. In dieser Arbeit beschreiben wir in fettsäureinduzierten bovinen Leberzellen, wie man ölrotes O zur Färbung von LDs und zur Untersuchung der Größe und Anzahl von LDs verwendet. Die Größenverteilung der LDs wird statistisch ausgewertet. Der Prozess der Verschmelzung kleiner LDs zu großen LDs wird auch von einem Lebendzell-Bildgebungssystem beobachtet. Die vorliegende Arbeit bietet eine Möglichkeit, den Größenänderungstrend von LDs unter verschiedenen physiologischen Bedingungen direkt zu beobachten.
Introduction
Die Ansammlung von Lipidtröpfchen (LD) in Hepatozyten ist das typische Merkmal der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD), die zu Leberfibrose und hepatozellulärem Karzinom fortschreiten kann. Es wurde festgestellt, dass die früheste Manifestation einer Fettlebererkrankung die Steatose ist, die durch eine LD-Akkumulation im Zytoplasma der Hepatozytengekennzeichnet ist 1. Eine Lebersteatose ist ausnahmslos mit einer erhöhten Anzahl und/oder einer erweiterten Größe von LDs2 verbunden. Es wird angenommen, dass LDs aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) gebildet werden, das aus Triglyceriden (TG) als Kern besteht, und von Proteinen und Phospholipiden umgeben sind3. Als subzelluläre Organelle, die für die TG-Speicherung verantwortlich ist, weisen LDs unterschiedliche Eigenschaften in Bezug auf Größe, Anzahl, Lipidzusammensetzung, Proteine und Interaktion mit anderen Organellen auf, die alle die Zellenergiehomöostase beeinflussen4. Der TG-Spiegel korreliert positiv mit der Größe der LDs, und ein höherer intrazellulärer TG-Gehalt könnte größere LDs bilden5. LDs nehmen durch die lokale Synthese von TG, den Einbau von Lipiden in das ER und die Fusion mehrerer LDs an Größezu 6. Zellen (Adipozyten, Hepatozyten usw.), die große LDs enthalten, verfügen über einen speziellen Mechanismus, um die Lipidspeicherung durch LD-Fusion effizient zu erhöhen. Die dynamischen Veränderungen der LDs spiegeln die unterschiedlichen Zustände des Energiestoffwechsels der Zelle wider. Es ist von entscheidender Bedeutung, Methoden zu entwickeln, die die Beobachtung und Analyse der verschiedenen Leber-LDs in gesunden und abnormen Zellen ermöglichen.
Die wichtigsten nicht-fluoreszierenden Farbstoffe für LDs sind Sudan Black B und Oil Red O. Sudan Black B färbt neutrale Lipide, Phospholipide und Steroide7. Ölrot O wird hauptsächlich zur Färbung von LDs von Skelettmuskeln, Kardiomyozyten, Lebergewebe, Fettzellen usw.verwendet 8. und gilt als Standardwerkzeug für den quantitativen Nachweis von Lebersteatose bei Mäusen und Menschen9. Die dynamische Veränderung von LDs erfolgt hauptsächlich durch Fluoreszenzfärbung. Nilrot und BODIPY sind beides häufig verwendete fluoreszierende Lipidfarbstoffe10,11. Im Vergleich zu Nilrot hat BODIPY eine stärkere Gewebedurchlässigkeit und bindet besser an LDs12. BODIPY-markierte LDs können für die Färbung lebender Zellen und die Kolokalisation mit anderen Organellen verwendet werden13.
Die Inzidenz einer Fettlebererkrankung ist bei Wiederkäuern signifikant höher als bei monogastrischen Tieren14. Während der Übergangszeit erleben Milchkühe einen Zustand negativer Energiebilanz3. In Rinderhepatozyten werden große Mengen an nicht veresterten Fettsäuren (Palmitinsäure, Ölsäure, Linolsäure usw.) zu TGs synthetisiert, was zu Funktionsstörungen der Leber führt und die Qualität der Milchprodukte und die Produktionseffizienz erheblich verringert15. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, ein Protokoll zur Analyse der Größe und Anzahl der LDs sowie zur Überwachung der LD-Fusionsdynamik bereitzustellen. Wir konstruierten ein Modell der LD-Bildung durch Zugabe unterschiedlicher Konzentrationen von Linolsäure (LA) in Hepatozyten16 und beobachteten die Veränderungen in der Größe und der Anzahl der LDs während des Prozesses, indem wir LDs mit ölrotem O färbten. Darüber hinaus wurde der Prozess der schnellen Fusion von LDs auch durch Färbung mit BODIPY 493/503 beobachtet.
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Protocol
Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Standards des Tierpflegekomitees der Henan Agricultural University (Provinz Henan, China) genehmigt und durchgeführt.
1. Rinder-Hepatozyten-Zellkultur
- Tauen Sie die primären Hepatozytenzellen17 auf und zentrifugieren Sie 400 x g für 4 min bei Raumtemperatur.
ANMERKUNG: Die primären Hepatozytenzellen wurden nach einem zuvor veröffentlichten Bericht kultiviert und gepflegt17. - Verwerfen Sie die gefrorene Aufbewahrungslösung mit einer Pipette und suspendieren Sie sie mit 1 ml Medium, das 10 % fötales Kälberserum (FBS) und Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) enthält. Verwenden Sie als Nächstes eine Zellzählkammer, um die Anzahl der Zellen pro Milliliter zu berechnen, und berechnen Sie dann die Konzentration der oben genannten Zellsuspension und stellen Sie die Zellkonzentration auf 1 x 107 Zellen/ml ein.
- Geben Sie die Zellsuspension in eine 60-mm-Zellkulturschale, die 3 ml des oben genannten Mediums enthält. Kultur der Zellen und Inkubation bei 37 °C und 5% CO2 für 24 h.
- Wenn die Zellen auf 80 % angewachsen sind, entsorgen Sie das Medium und spülen Sie es mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab, dann fügen Sie 750 μl 0,25 % Trypsin hinzu, um die Zellen zu verdauen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 3 min und neutralisieren Sie sie dann mit der gleichen Menge von 10% FBS. Sammeln Sie die Zellsuspension, um sie bei 200 x g für 4 min bei Raumtemperatur zu zentrifugieren.
2. Ölrote O-Färbung
- Geben Sie 800 μl Nährmedium mit 10 % FBS und DMEM in jede Vertiefung der 24-Well-Zellkulturplatte, die Glasdeckgläser enthält. Man nehme 50 μl der Zellsuspension (erhalten in Schritt 1.3) und füge sie zu 950 μl PBS hinzu, um sie zu mischen. Verwenden Sie eine Zellzählkammer, um die Anzahl der Zellen pro Milliliter zu berechnen, und berechnen Sie dann die Konzentration der oben genannten Zellsuspension. Zum Schluss wird die Zellkonzentration in jeder Vertiefung auf 4 x 104/ml eingestellt und bei 37 °C und 5 % CO2 für 24 h inkubiert.
- Nach 24 Stunden das Nährmedium verwerfen und mit PBS waschen. Mit 800 μl DMEM-Induktionsmedium mit 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) suspendieren.
- Insgesamt 100 μl LA (siehe Materialtabelle) werden in 900 μl wasserfreiem Ethanol gelöst und eine Standardlösung (100 mmol/L) hergestellt. Fügen Sie einen Gradienten von 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L und 200 μmol/L LA in die 24-Well-Platte ein. Wiederholen Sie jede Behandlung viermal. Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2 für 24 h.
- Entfernen Sie das Nährmedium und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Mit 400 μl 4%igem Paraformaldehyd für 20 min fixieren. Entsorgen Sie die Fixierlösung und waschen Sie sie dreimal mit PBS.
- Inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang mit 60%igem Isopropylalkohol und entsorgen Sie ihn dann. Frisch zubereitete ölrote O-Arbeitslösung (siehe Materialtabelle) (3:2-Verhältnis ölrotes O:Wasser) für 20-30 min zugeben und die Färbelösung verwerfen. Waschen Sie die Zellen zwei- bis fünfmal mit PBS, bis keine überschüssige Farbstofflösung mehr vorhanden ist.
- Fügen Sie 300 μl Hämatoxylin-Färbelösung hinzu (Hämatoxylin:Wasser-Verhältnis von 1:10) und färben Sie den Zellkern für 1-2 Minuten erneut. Verwerfen Sie die Farbstofflösung und waschen Sie die Zellen zwei- bis fünfmal mit PBS. Nehmen Sie die Glasdeckgläser von der 24-Well-Platte heraus und legen Sie sie auf mikroskopisch kleine Objektträger (die Seite mit den Zellen nach unten), nachdem Sie 10 μl Tablettendichtmittel (siehe Materialtabelle) auf den Objektträger getropft haben.
- Nach dem Versiegeln werden die LDs der Zellen unter der Öllinse des Lichtmikroskops beobachtet und abgebildet (siehe Materialtabelle). Messen Sie den Durchmesser der LDs mit der cellSens-Software und analysieren Sie die Anzahl und Größe der LDs.
3. Messung der Größe und Anzahl der LDs
- Bilder aufnehmen: Schalten Sie den Computer und den Mikroskopschalter nacheinander ein, legen Sie den Objektträger auf die Ladeplattform, öffnen Sie die Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle) und schließen Sie den Computer an, um das Bild anzuzeigen.
- Suchen Sie die Bilder bei geringer Leistung und tropfen Sie eine angemessene Menge Zedernöl auf den Objektträger. Stellen Sie den Beobachtungsfaktor auf 100x ein, stellen Sie die automatische Belichtung ein und nehmen Sie die Bilder auf, indem Sie das entsprechende Sichtfeld anpassen. Wählen Sie für jede Gruppe drei Objektträger mit gefärbten Zellen für die Bildgebung aus.
- Durchmessermessung: Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 60 LDs für jedes Bild aus, um die Durchmesser zu messen. Speichern Sie nach der Messung jedes Bildes die Bilder und geben Sie die Messergebnisse in einer Tabelle aus, um anschließend die durchschnittliche Größe und das Verteilungsverhältnis der LDs zu analysieren.
- Mengenmessung: Wählen Sie drei Bilder für jeden gefärbten und fotografierten Objektträger aus und wählen Sie nach dem Zufallsprinzip drei Zellen für die Mengenmessung in jedem Bild aus. Zählen und analysieren Sie die Anzahl der LDs um die Zelle herum, und berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der LDs in der Zelle.
4. Dynamische Beobachtung der LD-Fusion
- Befolgen Sie die Schritte zur Zellkultur, wie in den Schritten 1.1-1.3 beschrieben. Wenn die Zellen zu 80 % gewachsen sind, entsorgen Sie das Medium und spülen Sie es mit PBS aus, dann verdauen Sie sie 3 Minuten lang mit 750 μl Trypsin. Als nächstes fügen Sie 750 μl des Mediums hinzu, zentrifugieren Sie bei 200 x g für 4 min bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand.
- Suspendieren Sie die Zellen in 1 ml Nährmedium, zählen Sie und stellen Sie die Zellkonzentration auf 5 x 105 Zellen/ml in einer 35-mm-Schale ein. Kultur bei 37 °C und 5% CO2 für 24 h.
- Wenn die Zellen auf 80 % gewachsen sind, wechseln Sie das Medium für 24 h auf DMEM + 150 μmol/L LA und setzen Sie die Kultur in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 fort, um die LDs zu akkumulieren.
- Entfernen Sie nach 24 Stunden das Nährmedium. Waschen Sie die adhärenten Zellen mit PBS und inkubieren Sie sie mit der neutralen Fluoreszenzsonde BODIPY 493/503 mit 10 μg/ml (siehe Materialtabelle) im Dunkeln für 30 min. Nach der Inkubation werden die Zellen in der Kulturschale dreimal mit PBS gewaschen und DMEM + 150 μmol/L LA zugegeben.
Anmerkungen: Vermeiden Sie Lichteinwirkung während und nach der 10 μg/ml BODIPY-Färbung; 1 mg/ml BODIPY wurde mit PBS (1:100) verdünnt. - Stellen Sie die Kulturschale in die Nut des Mikroskops der Station für lebende Zellen (siehe Materialtabelle), um die dynamischen Veränderungen der LDs zu beobachten. Schalten Sie die Workstation der lebenden Zelle entsprechend der Startreihenfolge ein und vermeiden Sie Licht.
- Schalten Sie die Stromversorgung, die Transmissionslichtquelle, die Mikroskopstromquelle, die Quecksilberlampen-Leuchtstofflampe, die Stromquelle der CCD-Kamera (Charge-Coupled Device), die Computer-Host-Stromquelle, das CO 2 -Ventil und den CO2 -Inkubator ein.
- Geben Sie destilliertes Wasser in die Nut auf der Ladefläche und achten Sie darauf, dass es nicht über die Lüftungsöffnung geht.
- Schalten Sie den Computer ein und führen Sie "NIS-Elements" aus. Suchen Sie zuerst das entsprechende Sichtfeld auf der 4-fach-Objektivlinse und stellen Sie es dann nacheinander auf die 40-fach-Objektivlinse ein. Wählen Sie E100 für die Beobachtung der Probe im Mikroskop und L100 für die Vorschau und das Fotografieren der Probe am Computer.
HINWEIS: E100 und L100 sind Mikroskop-Einstelltasten an der Workstation der lebenden Zelle (siehe Materialtabelle), die das Okular bzw. den Computerbildschirm darstellen. - Entwerfen Sie die Parameter wie den Fluoreszenzkanal (z. B. Ph-40x, Fluoresceinisothiocyanat [FITC], Shutter) und die erwartete Aufnahmezeit für das Experiment. Stellen Sie die Aufnahmezeit zeitlich ein, einschließlich der Aufnahmeintervallzeit von 5 Minuten zwischen jeweils zwei Bildern und einer Gesamtaufnahmezeit von 6 h.
Anmerkungen: Für Langzeitaufnahmen muss die Fokusstabilisierungsfunktion des Perfect Focus System (PFS) verwendet werden. Stellen Sie dazu zuerst das Sichtfeld und die Fokuslänge ein, klicken Sie dann auf dem Computerbildschirm auf PFS und stellen Sie schließlich die Feinfokusspirale ein. - Wählen Sie verschiedene Kanalmodi aus, einen Kanal oder alle, wählen Sie ein anderes Sichtfeld aus, klicken Sie auf Vorschau, passen Sie das Sichtfeld an, stellen Sie diese Parameter ein und klicken Sie auf Start Running , um die Aufnahme zu starten. Machen Sie zuerst eine Testaufnahme für 5 Minuten; Es kann lange dauern, bis die Operation normal ist.
- Nachdem die Aufnahme durchgeführt wurde, wählen Sie Datei > Speichern unter, > Speichertyp > AVI-Format , um die Daten in ein Video im AVI-Format zu exportieren. Verwenden Sie das Bildformat '.nd2', um das Datenprogramm zu speichern und die Fotos zu exportieren.
- Um das Gerät auszuschalten, schalten Sie es in umgekehrter Reihenfolge aus.
5. Statistik und Ergebnisanalyse
- Analysieren Sie die Daten mithilfe der unidirektionalen ANOVA. Geben Sie die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardfehler an.
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Representative Results
Die Färbung von Zell-LDs ist in Abbildung 1 dargestellt. Die roten Punkte spiegeln die LDs der Zellen wider, und die blauen Punkte spiegeln die Zellkerne wider. Es ist ersichtlich, dass die Größe und Anzahl der LDs in jedem Bild unter der Behandlung von LA unterschiedlich sind.
Mit der Erhöhung der LA-Dosierung zeigten der durchschnittliche Durchmesser und die Anzahl der LDs einen signifikant ansteigenden Trend, abhängig von der LA-Konzentration (Abbildung 2). Wie in Abbildung 2A dargestellt, korrelierte die Anzahl der LDs pro Zelle negativ mit unterschiedlichen Konzentrationen von LA. Die mediane LD-Zahl pro Zelle betrug 136 für die mit 100 μmol/l LA behandelte Gruppe und sank auf 118 bzw. 105 für die mit 150 μmol/l bzw. 200 μmol/l LA behandelten Gruppen. Der durchschnittliche Durchmesser der LDs in der Kontrollgruppe betrug 0,72 μm, 1,38 μm für die mit 100 μmol/l LA behandelte Gruppe, 1,51 μm für die mit 150 μmol/l LA behandelte Gruppe und 1,64 μm für die mit 200 μmol/l LA behandelte Gruppe (Abbildung 2B).
In dieser Studie wurden LDs mit einem Durchmesser <1 μm als klein und LDs mit einem Durchmesser >4 μm als groß definiert. Es wurde festgestellt, dass sich auch die Verteilungsverhältnisse der LDs mit der LA-Konzentration änderten, wie in Abbildung 3 dargestellt. der Anteil der kleinen LDs nahm ab, und der Anteil der großen LDs nahm zu. Der Anteil der LDs mit kleinem Durchmesser betrug 43,33 % bei 100 μmol/L LA, 36,43 % bei 150 μmol/L LA und 29,8 % bei 200 μmol/L LA. Bei LDs mit großem Durchmesser betrug der höchste Anteil 6,11 % in 200 μmol/L LA, dann 3,15 % und 1,48 % in 150 bzw. 100 μmol/L LA. In der 200 μmol/L LA-Gruppe wurden offensichtlich supergroße LDs (Durchmesser >5 μm) beobachtet, die etwa 6,30 % ausmachten und damit höher waren als die Gruppen mit 100 μmol/L LA (5,93 %) und 150 μmol/L LA (4,82 %). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine hohe Konzentration von LA die Größe der LDs erhöht und die Anzahl der LDs verringert. Währenddessen nahm der Anteil der großen LDs zu, während der Anteil der kleinen LDs abnahm.
Große LDs wurden in der Regel durch die Fusion kleiner LDs gebildet. Die LD-Fusion durch Lebendzell-Bildgebung wurde beobachtet, um dies zu beweisen (Abbildung 4). Die Zellen wurden 24 h lang mit 150 μmol/L LA behandelt und mit BODIPY gefärbt. Unter den normalen Zellwachstumsbedingungen bei 37 °C und 5% CO2 wurden die Zellen kontinuierlich für 6 h mit einem Lebendzellarbeitsplatz beobachtet. Die Bilder wurden alle 5 Minuten aufgenommen. Wie in Abbildung 4 zu sehen ist, gab es in den ersten 15 Minuten noch deutlich kleinere LDs. Dann begannen die LDs ab 20 min langsam zu verschmelzen und waren nach 35 min vollständig zu größeren LDs verschmolzen.
Abbildung 1: Lipidtröpfchen. Hepatozytenzellen, die in verschiedenen Konzentrationen von LA kultiviert und mit ölrotem O gefärbt wurden. Die roten Punkte reflektierten LDs, die mit Ölrot gefärbt waren, und die blau-violetten Punkte reflektierten den Zellkern mit Hämatoxylin. Bei jeder Behandlung wurden drei Objektträger für die Färbung und Bildgebung ausgewählt. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Anzahl und Größe der LDs. Hepatozytenzellen, die in einem Konzentrationsgradienten von 0 bis 200 μmol/L LA kultiviert und mit Ölrot O gefärbt wurden. (A) Durchschnittliche Anzahl von LDs pro Zelle. In jeder Gruppe wurde die Anzahl der LDs in 27 Zellen gezählt. (B) Der durchschnittliche Durchmesser von LDs in einer Zelle. In jeder Gruppe wurde die Größe von 60 LDs gezählt. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: LD-Anteil. Hepatozytenzellen, die in verschiedenen LA-Konzentrationen kultiviert und mit ölrotem O gefärbt wurden, wurden berechnet. Das Verhältnisverhältnis von LDs unterschiedlicher Größe wurde berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: LD-Fusion. Hepatozytenzellen wurden mit 150 μmol/L LA kultiviert und mit der Sonde BODIPY 493/503 inkubiert. Nach kontinuierlicher Beobachtung für 6 h unter einem 40-fachen Vergrößerungsbild wurden die LDs unter den Fluoreszenz- und Hellfeldern fotografiert. Die Bilder wurden alle 5 Minuten aufgenommen. Fusion wurde mit roten Kästchen markiert. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Abhängig von den pathologischen Zuständen verändern sich die hepatischen LDs enorm in ihrer Größe und Anzahl. LDs sind in Hepatozytenzellen weit verbreitet und spielen eine Schlüsselrolle bei der Gesundheit und Erkrankung der Leber18. Die Menge und Größe der LDs sind die Grundlage der aktuellen Forschung zur Biogenese der LDs19. Die Größe und Anzahl der LDs für Zellen und Gewebe spiegelt ihre Fähigkeit wider, Energie zu speichern und freizusetzen. Die dynamischen Veränderungen der LDs erhalten die Stabilität der Lipidstoffwechselaktivitäten20,21. Eine abnorme Anhäufung von LDs tritt unter verschiedenen pathologischen Zuständen auf und kann ein Indikator für eine Stoffwechselerkrankung sein22,23. Dieses Protokoll bietet eine genaue Methode, um die Größe und Menge von LDs in einem Fettsäure-induzierten Hepatozytenzellmodell zu messen und die Fusion von LDs effizienter und intuitiver zu beobachten.
Die Untersuchung der Größe und der dynamischen Veränderungen von LDs ist von großer Bedeutung für das Verständnis des Auftretens von Krankheiten, die mit Fettstoffwechselstörungen und einer effektiven Intervention zusammenhängen. In diesem Experiment waren die wichtigsten Schritte die Messung und Analyse der Größe und Menge der LDs. Zunächst wurden unterschiedliche Konzentrationen von LA verwendet, um die LD-Akkumulation in Hepatozyten zu induzieren. Andere Fettsäuren wie Oleat und Palmitat könnten ebenfalls verwendet werden, um eine LD-Akkumulation in Hepatozytenzellen zu verursachen24,25. Nach der Behandlung mit unterschiedlichen LA-Konzentrationen zeigte sich, dass die Größe der LDs dosisabhängig erhöht war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die ölrote O-Färbung den Durchmesser von LDs genau gemessen hat. Es wurde auch festgestellt, dass eine hohe Konzentration von LA den Anteil großer LDs erhöhen kann, was darauf hindeutet, dass kleine LDs schnell miteinander fusionieren. Die schnelle Fusion ist eine der dynamischen Veränderungen in LDs; Die LD-Schnellfusion kann innerhalb weniger Minuten oder sogar Dutzende von Sekunden erfolgen und wird hauptsächlich durch ihre Oberflächenphospholipide und das Protein22,26 vermittelt. In der vorliegenden Studie wurde die LD-Fusion von 20 min bis 35 min mittels BODIPY 493/503 Markierung durch eine lebende Zell-Workstation eindeutig beobachtet. Das Aufnahmeintervall zwischen den Bildern kann in wenigen Sekunden bis Minuten eingestellt werden, und die Gesamtaufnahmezeit kann von 1 Stunde bis zu mehreren Tagen eingestellt werden, was die Beobachtung der dynamischen Änderungen von LDs in verschiedenen Zellen erleichtert.
In Bezug auf die Färbeanalyse der Größe von LDs ist die ölrote O-Färbung bequemer und billiger als die Fluoreszenzfärbung und wird häufiger verwendet, um die scheinbare Größe von LDs9 zu messen. Es muss nicht gegen Licht behandelt werden. Darüber hinaus sind die Anforderungen an die Ausrüstung nicht schwer zu erfüllen, und die Öllinse eines gewöhnlichen optischen Mikroskops kann für die Fotobeobachtung verwendet werden. Mit dieser Methode können die Forscher mehrere Bildgruppen auswählen, um die Größe und Menge der LDs nach dem Zufallsprinzip zu messen. Es ist einfach und bequem zu bedienen und kann die Stichprobengröße erhöhen und den Fehler reduzieren. Darüber hinaus kann anhand der gemessenen und analysierten LD-Größe das Verteilungsverhältnis verschiedener LD-Größen direkt beobachtet werden. Die statistische Analyse kann nach der obigen Methode nach der Ölrot-O-Färbung durchgeführt werden, und diese Methode kann auch auf andere Zellen angewendet werden, einschließlich einer Vielzahl von Zellen, die von der Lipidakkumulation betroffen sind. In der frühen Färbephase stellte sich heraus, dass Ölrot O nach dem Färben nicht leicht zu reinigen war und erhebliche Farbmagazinrückstände vorhanden waren. In der späteren Phase wurde der Farbstoff gefiltert und durch kontinuierliche Tests die geeignete Färbezeit ausgewählt. Nach dem Färben könnte durch eine Verlängerung der Reinigungszeiten das oben genannte Problem vermieden werden.
Der Fluoreszenzfarbstoff BODIPY 493/503 ist eine der gebräuchlichsten Sonden für die LD-Visualisierung27. In dieser Studie wurde die LD-Fusion durchgeführt, indem die LD grün mit BODIPY markiert und der Prozess mit einer lebenden Zellstation beobachtet wurde. Nilrot ist auch ein häufig verwendeter Fluoreszenzfarbstoff für neutrale Lipide, aber seine breite Anregungsbande (450-560 nm), seine unspezifische Färbung, seine schlechte Gewebepermeabilität und andere Mängel können die Ergebnisse der LD-Färbung bis zu einem gewissen Grad beeinflussen. Im Vergleich zur Nilrot-Fluoreszenzfärbung war die Anregungsbande von BODIPY 493/503 schmaler (460-490 nm) und konnte mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen komarkiert werden11. Zweitens vermeidet BODIPY effektiv die Interferenz von Pflanzenpigmenten28. Schließlich hat BODIPY eine starke Gewebepermeabilität, eine geringe Empfindlichkeit gegenüber Umweltpolarität und ist nicht leicht zu löschen12; Daher wird es häufig bei der Fluoreszenzfärbung von LDs verwendet. Die Analyse der LD-Fusion weist jedoch gewisse Einschränkungen auf. Um ein kontinuierliches Beobachtungsbild lebender Zellen zu erhalten, kann die Linse nicht bewegt werden, so dass nur eine lokale LD-Fusion in der Vision beobachtet werden kann und die LD-Fusionseffizienz der gesamten Zelle nicht genauer analysiert werden kann.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie eine einfache und reproduzierbare Methode zur Analyse der LD-Morphologie und -Größe bietet, die in großem Umfang auf die LD-Analyse bei der Untersuchung des zellulären Fettstoffwechsels angewendet werden kann. Diese Arbeit bewies auch den Prozess der LD-Fusion und legte den Grundstein für die weitere Erforschung von LDs in der Zukunft.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde gemeinsam von der National Natural Science Foundation of China (U1904116) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
References
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