Summary
本稿では、モノクローナル抗体ベースのタンパク質治療薬の質量計算のためのソフトウェアアプリケーションmAbScaleの使用について説明します。
Abstract
バイオ医薬品の塊は、同一性と構造的完全性を検証する手段です。インタクトタンパク質またはタンパク質サブユニットの質量分析(MS)は、バイオ医薬品開発のさまざまな段階に容易な分析ツールを提供します。タンパク質の同一性は、MSからの実験質量が理論質量の事前定義された質量誤差範囲内にある場合に確認されます。タンパク質やペプチドの分子量を計算するための計算ツールはいくつか存在しますが、それらはバイオ医薬品企業に直接適用するように設計されていないか、有料ライセンスによるアクセス制限があるか、タンパク質配列をホストサーバーにアップロードする必要があります。
当社は、モノクローナル抗体(mAb)、二重特異性抗体(bsAb)、抗体薬物複合体(ADC)などの治療用糖タンパク質の平均またはモノアイソトピック質量および元素組成を簡単に決定できるモジュール式質量計算ルーチンを開発しました。このPythonベースの計算フレームワークのモジュール性により、将来的にはワクチン、融合タンパク質、オリゴヌクレオチドなどの他のモダリティにもこのプラットフォームを拡張でき、このフレームワークはトップダウン質量分析データの調査にも役立つ可能性があります。グラフィカルユーザーインターフェース(GUI)を備えたオープンソースのスタンドアロンデスクトップアプリケーションを作成することで、Webベースのツールに機密情報をアップロードできない環境での使用に関する制限を克服したいと考えています。本稿では、このツールであるmAbScaleのアルゴリズムと、さまざまな抗体ベースの治療モダリティへの応用について説明します。
Introduction
過去20年間で、バイオ医薬品は現代の製薬業界の主力となるまでに進化しました。SARS-CoV2のパンデミックやその他の生命を脅かす状態により、バイオ医薬品分子のより迅速かつ広範な開発の必要性がさらに高まっています1,2,3。
バイオ医薬品の分子量は、他の分析アッセイと組み合わせて、分子の同定に重要です。インタクトおよび還元されたサブユニット質量は、QTPP(Quality Target Product Profile)4 に記載されているように、品質を維持することを目的とした制御戦略の一環として、創薬および開発ライフサイクル全体を通じて使用されます。
バイオ医薬品業界における分析開発は、インタクト質量分析のための質量測定と、ペプチドマッピングまたはマルチ特性分析法(MAM)モニタリングを用いた詳細な特性評価に大きく依存しています。最新の質量分析(MS)プラットフォームを利用するこれらの技術の中心にあるのは、高分解能の精密質量(HR/AM)測定を提供する機能です。ほとんどのHR/AM装置は、0.5〜5ppmの範囲の質量精度が得られ、質量範囲に応じてスケーリングされます。インタクトな高分子の質量を正確に測定できるため、高分子治療薬を迅速かつ確実に同定できます。高分子(>10 kDa)の一般的な実験条件では同位体分解能を達成できないため、比較と同定のために平均質量を計算する必要があります5,6。
典型的なインタクトまたはサブユニットタンパク質の質量スペクトルは、翻訳後修飾(PTM)から生じるさまざまな分子形態と、クリップや配列バリアントなどの一次構造の違いに関する複合情報を含む、全体的なプロテオフォームプロファイルを表します。これらの測定は比較的簡単でハイスループットなため、特性評価やインプロセスモニタリングコントロールとして魅力的です7,8。これらの実験のデータ解析では、通常、分子形態(PTMまたは他の分子形態の範囲)の探索空間を定義する必要があります。グリコシル化タンパク質の場合、この検索空間は主にグリコフォームの不均一性によって駆動されます。複数のPTM、ジスルフィド結合構成、および一次構造に沿ったその他のバリエーションの組み合わせにより、考えられるすべての分子形態を計算するのは面倒な作業になります。したがって、可能な分子形態の手動計算は、時間とリソースを消費するプロセスであり、人為的ミスの可能性が高くなります。
ここでは、モノクローナル抗体、bsAb、ADCなどのバイオ医薬品分子の最も重要な特徴を考慮して開発された質量計算ツールを紹介します。このツールを使用すると、質量と元素組成の一貫した計算のために探索空間変数を簡単に組み込むことができます。このツールのモジュール性により、さらに開発し、他のモダリティの質量計算や質量マッチングに適用することができます。
GUIモジュールでは、 図1に示すように、質量計算の入力を指定できます。具体的には、ユーザーは軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を1文字で入力します。重鎖N末端環化およびC末端リジンクリッピングの一般的な修飾がチェックボックスとして含まれています。さらに、化学式/元素組成は、それぞれの Chem Mod テキストボックスを介してこれらのタンパク質鎖に加算/減算できます。これにより、複数の翻訳後修飾を含む元素組成や、ADCの場合は低分子ペイロードを柔軟に追加できます。ほとんどの治療用モノクローナル抗体は軽鎖のグリコシル化部位を除去するように設計されているため、軽鎖のグリコシル化はオプションであり、GUIのチェックボックスを使用して指定できます。
抗体のインタクト質量分析の典型的なバリエーションは、鎖間ジスルフィド結合を減少させることによって軽鎖を重鎖から分離する還元サブユニット質量分析です。使用される還元剤の強度に応じて、鎖内ジスルフィド結合が切断される場合と切断されない場合があります。ユーザーは、IgGサブタイプに応じて、またはシステイン結合ADC9の場合、ジスルフィド結合の総数を柔軟に入力できます。
このアプリケーションでは、ボトムアップ方式で質量を計算し、元素組成が最初に個々の重鎖と軽鎖について計算されます。次に、計算された元素組成を調整することにより、重鎖(HC)N末端環化Lys-clippingが考慮されます。その後、特定の化学修飾が重鎖および/または軽鎖に適用されます。分析の種類とユーザーが指定したジスルフィド結合パターンに応じて、2つのポリペプチド鎖の水素数が調整されます。グリコシル化HCおよび軽鎖(LC)(オプション)の質量は、ユーザーの入力に基づいて計算されます。最後に、複数の HC 質量と LC 質量が組み合わされ、インタクト質量計算のためにジスルフィド結合数が自動的に更新されます。
インタクトタンパク質などの大きな分子では、一般的な分解能を持つ質量分析計を使用すると、相加的な質量欠陥があるため、モノアイソトピック質量を測定できません。代わりに、公称質量または平均質量が測定または報告されます5,10,11,12,13。平均元素質量は、キュレーション質量に使用されるソースに基づいて変化し得る14,15。元素質量の差は小さいかもしれませんが、高分子分子量の計算では有意な値になることがあります。ソフトウェアアプリケーションでデフォルトで使用される平均元素質量を補足表1に示します。バイオ医薬品の研究開発(R&D)分野のような規制された環境では、質量の変化が規制当局への申請中に分子実体の変化を意味する可能性があるため、一貫した分子質量を維持することが重要です。要素質量の使用に一貫性を持たせるために、要素質量のディクショナリがカンマ区切り値(csv)テキストファイルとしてソフトウェアツールに含まれています:Element_Mass.csv(Supplementary Coding File 1)。同様に、モノクローナル抗体で一般的に見られる糖鎖組成の精選されたリストが含まれています:Glycan.csv(補足コーディングファイル2)。どちらのファイルも実行可能アプリケーションと同じフォルダに保存され、特定の元素質量リストまたは糖鎖ライブラリを使用するようにユーザーが変更できます。
図1:mAbScaleアプリケーションのGUIインターフェース。 GUIモジュールでは、質量計算の入力を指定できます。ユーザーは、軽鎖と重鎖の抗体鎖のアミノ酸配列を1文字で入力します。重鎖N末端環化とC末端リジンクリッピングの一般的な修飾がチェックボックスとして含まれています。化学式/元素組成は、それぞれの ChemMod テキストボックスから追加/削除できます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Protocol
mAbScale のワークフローの概要を 図 2 に示します。各ステップには、より洗練された内部決定分岐、ループ、および組み合わせがあります。計算プロセスを説明する詳細なアルゴリズムワークフローを 補足図1に示します。アプリケーションの出力は、ユーザーが選択したフォルダーにスプレッドシート形式で保存されます。出力ファイルは複数の個別のワークシートで構成されており、ユーザー入力、分子量計算、および平均同位体質量導出の参照として分類できます(出力例は補足表に記載されています)。ユーザー入力ワークシートには、ユーザーが入力したタンパク質アミノ酸配列やその他の情報、平均元素量、糖鎖質量が含まれており、元素組成とさまざまな分子量の計算に使用されます。分子量計算シートには、さまざまな形態の化学組成、グリコシル化および化学修飾の有無にかかわらず還元された質量、およびグリコシル化および化学修飾の有無にかかわらずインタクト質量が含まれます。ハーフ抗体は一次不純物であり、目的のヘテロ二量体に対して同定および定量する必要があるため、ユーザーがユーザー入力ページに2つの異なるHCおよび/または2つの異なるLCを入力すると、ハーフ抗体質量を含むシートが自動的に生成されます。mAbScale のソースコードには、リポジトリ https://github.com/kkhatri99/mAbScale からアクセスできます。
図2:アプリケーションを使用した元素組成と質量の計算に関連するステップの概要。 色分けを使用して、 補足図1で説明したプロセスフローにリンクできます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
1. mAbscaleアプリケーションを開く
- 実行可能ファイルのアイコンをダブルクリックして、ソフトウェアアプリケーションを開きます。
2. シーケンス入力
- 重鎖と軽鎖のシーケンスを、スペースなしで 1 でマークされたそれぞれのテキスト ボックスに入力します。
- bsAb の場合は、2 とマークされたテキスト ボックスの 2 番目のセットに太いチェーンまたは軽いチェーンを追加します。重鎖と軽鎖が同一のモノクローナル抗体については、 2 つの空白を残します。
- これらの重鎖末端バリアントが該当する場合は、[ N-Terminal Cyclization ] チェックボックスまたは [C-Terminal Clipping ] チェックボックスをオンにします。
- ADC分子のリンカーやペイロードなどの化学修飾を、 Heavy Chain Chem Modおよび/または Light Chain Chem Mod テキストボックスに追加します。
- 修飾をCaCl2などの元素組成として指定します。修飾は、それぞれのタンパク質サブユニットまたは鎖に追加されます。
注:化学組成は、元素組成の前に-記号を付けることによって、サブユニットまたは鎖から差し引くこともできます。例えば、-H2Oは、サブユニット組成および質量から水分子を差し引く。
- 修飾をCaCl2などの元素組成として指定します。修飾は、それぞれのタンパク質サブユニットまたは鎖に追加されます。
3. ジスルフィド結合数の指定
- タンパク質分子中のジスルフィド結合の数を、 ジスルフィドの総数とマークされたテキストボックスに指定します。
- 還元の程度(完全または部分的)に応じて、未還元の HC ジスルフィドの数を [ 未還元の HC ジスルフィド ] テキストボックスに入力し、未還元の LC ジスルフィドの数を [未 還元の LC ジスルフィド ] テキストボックスに入力します。
注:モノクローナル抗体サブユニットの低質量分析では、ジスルフィド結合重鎖および軽鎖の還元/分離が行われます。 - モノクローナル抗体の軽鎖にグリコシル化が見られる場合は、[ Light Chain is Glycosylated ]チェックボックスをオンにします。
4. 出力フォルダの設定とアプリケーションの実行
- [ 参照 ]ボタンをクリックして、[出力フォルダ]テキストボックスの 出力フォルダ を選択します。
- ファイル拡張子を付けない出力ファイル名(自動的に.xlsxとして保存)をExcel ファイル(拡張子なし) テキストボックスに入力します。
- [ 送信 ]ボタンをクリックして、アプリケーションを開始します。出力ファイルは、指定されたフォルダにあります。
注:元素質量と糖鎖のリストは、区切りテキストファイルElement_Mass.csv(Supplementary Coding File 1)とGlycan.csv(Supplementary Coding File 2)をそれぞれ編集することでカスタマイズできます。これらのファイルは、アプリケーションを実行するために mAbScale.exe (補足コーディング ファイル 3) 実行可能ファイルと同じフォルダーに配置する必要があります。アプリケーションは、1回の実行後に自動的に閉じられます。2 回目の計算が必要な場合、ユーザーはアプリを再起動する必要があります。
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Representative Results
さまざまなタイプのモノクローナル抗体を表すために、さまざまなモノクローナル抗体を選択しました。市販のモノクローナル抗体標準試料は、同一の重鎖、同一の軽鎖、および Fc 領域に 1 つの N 結合型グリコシル化部位を持つ従来のモノクローナル抗体を表すために選択されました。また、用途を拡大するために、軽鎖 N 結合型グリコシル化を追加したモノクローナル抗体、二重特異性モノクローナル抗体、抗体薬物複合体(ADC)モノクローナル抗体も選択しました。これらの例のモノクローナル抗体の化学組成、計算質量、測定質量、および質量誤差を 表 1 にまとめました。mAbScale によって報告されたタンパク質の化学組成と計算された質量は、タンパク質およびペプチドの一次構造解析プログラムである GPMAW16 によって確認されました。
インタクト質量分析では、モノクローナル抗体サンプルを LC-MS グレードの水で 1 mg/mL に希釈し、分析用に注入しました。還元分析では、まずサンプルをジチスレイトールで処理し、37°Cで15分間インキュベートして、鎖間ジスルフィド結合を切断しました。すべてのサンプルは、質量分析計と組み合わせた Acquity UPLC システムを使用して分析しました。BEH 200 SEC カラムは、水/アセトニトリル(65:35)と 0.1% TFA を移動相とするアイソクラティック分析法を用いて、オンライン脱塩および重鎖と軽鎖の分離に使用しました。質量分析計は陽イオンモードで操作し、データは700〜5,000 m/zのスキャン範囲で取得しました。
Protien Metrics, Inc.(PMi)Byosのインタクトおよびリダクションワークフローを使用して、インタクトおよび還元された生スペクトルをそれぞれ処理しました。タンパク質質量範囲は、インタクト質量デコンボリューションでは 143,000-163,000 Da、HC 質量デコンボリューションでは 47,000-53,000 Da、LC 質量デコンボリューションでは 20,000-27,000 Da に設定しました。自動質量/ピークピッキングでは、質量ピーク間の最小差を 15 Da に設定し、質量ピークの最大数を 10 に制限しました。予想される糖鎖のリストを質量一致タブに入力/選択し、質量一致許容度の上限を 10 Da に設定しました。
計算された質量と測定された質量の間の小さな質量誤差は、通常の質量誤差許容基準(インタクトモノクローナル抗体で≤10 Da、還元型重鎖と軽鎖でそれぞれ ≤5 Da)内であり、計算された質量が正確であることが示唆されました17。
ADC の理論質量を計算するために、リンカー/ペイロード元素組成による化学修飾を特定のモノクローナル抗体サブユニットに添加することができます。ただし、出力には1つの薬剤負荷率質量の分子量のみが含まれます。薬物負荷率の異なる抗体の複合分子量は、ユーザーが手動で添加する必要があります。これらの機能は、このプロジェクトのオープンソースの性質上、mAbScale の新しいバージョンで追加したり、コミュニティのサポートで変更したりできます。
表 1:さまざまなモノクローナル抗体のサブユニットおよび分子形態について、計算質量と測定質量の比較。 この表は、モノクローナル抗体の例の化学組成、計算質量、測定質量、質量誤差をまとめたものです。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図1:mAbScaleの詳細なアルゴリズムワークフロー。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表 1:mAbScale14,15 で使用した計算された平均元素質量。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル1:元素質量のリスト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Supplementary Coding File 2: 糖鎖一覧このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル3:バンドルされたアプリケーション-mAbScale実行可能ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
mAbScaleは、質量計算と元素計算のビルディングブロックを柔軟に変更できる直感的なユーザーインターフェースを提供します。ユーザーは、アプリケーションを使用し、正しい質量を導き出し、結果を解釈するために、標的分子の基本的な理解を持っていることが期待されます。例えば、デフォルトの糖鎖データベースは、治療用抗体のFc部分に一般的に見出される88個のN-結合型糖鎖を含み、アプリケーションは、データベースに含まれるすべての可能なグリコフォーム質量を計算するので、インタクト質量または還元質量の多数の行のために、インタクトまたは還元質量出力シートは、圧倒的であり得る、19。ほとんどの治療用モノクローナル抗体は、Fab領域のグリコシル化を除去するように設計されていますが、一部のモノクローナル抗体はこのグリコシル化部位を保持している可能性があり、これによりグリコシル化プロテオフォームの総数がさらに増加する可能性があります。ユーザーは、特定の分子に最も適したグリコフォームに焦点を当てた糖鎖データベースをキュレーションして、アウトプットの複雑さを軽減し、質量ピーク同定のために結果を測定質量とより適切に一致させることを推奨します。
bsAbsでは、軽鎖と重鎖の不均一性により、複雑さのレベルがさらに高まります。このソフトウェアアプリケーションは、提供されたLCおよびHC配列およびグリコフォームとの可能なすべての順列および組み合わせを生成し、ハーフ抗体などの抗体サブユニットのミスペアリングまたは不完全なペアリングからすべての潜在的な副産物を生成することを可能にします。これにより、使用に最も適したプロテオフォームを除外するかどうかはユーザーに委ねられます。ソフトウェア出力は、グリコシル化出力と非グリコシル化出力を別々のワークシートに分割するため、ユーザーは簡単に確認できます。また、インタクト分子量と還元分子量も分離され、bsAbのハーフ抗体の組み合わせはすべて専用のワークシートに記載され、処理結果の取り込みがさらに簡素化されます。
現在のソフトウェアバージョンの制限は、ペイロードの化学構造がHeavy Chain Chem ModおよびLight Chain Chem Modテキストボックスに入力されるため、アプリケーションが一度に1つの薬物対抗体比のみでADC質量を計算することです。薬物抗体比(DAR)ごとに、再計算のために元素組成をユーザーが入力する必要があります。
インタクトタンパク質の質量を計算する機能は、いくつかのアプリケーションによって提供されますが、それらは商用ライセンスを購入する必要があるか、タンパク質配列をアップロードする必要があるウェブベースのツールです16,20,21。これらのアプリケーションでは、カスタムの化学修飾を追加したり、ジスルフィドなどの分子内結合を簡単に組み込んだりするための柔軟性が非常に限られています。さらに、医薬品開発やその他の制御された環境など、専有情報や機密情報が関与する場合、バイオ医薬品の配列情報を外部サーバーにアップロードできないため、Webベースのアプリケーションの価値は制限されます。その結果、研究者は手作業による計算やプログラムによるルーチンに頼らざるを得ませんが、柔軟性に欠け、普及が難しく、不整合が生じる可能性があります。
私たちは、分子量と元素組成を計算するためのオープンソースのフレームワークを開発し、既存のアプリケーションに関連する制限を軽減することに重点を置いています。GUIを備えたスタンドアロンのデスクトップアプリケーションは、外部サーバーへの機密情報のアップロードに関連する制限を克服し、ユーザーが簡単にアクセスできるようにします。このツールは、モノクローナル抗体、bsAb、ADCなど、最も一般的なバイオ医薬品モダリティに使用できます。さらに、変更の範囲とソース元素質量は、ユーザーのニーズに合わせて簡単にカスタマイズできます。このワークフローの柔軟性により、将来的には、非モノクローナル抗体タンパク質治療薬、マルチサブユニットワクチン、オリゴヌクレオチドやmRNAなど、他の治療モダリティへの応用も視野に入れています。このフレームワークをオープンソースにすることで、コミュニティを他のモダリティへのさらなる開発と適応に巻き込み、トップダウンMSデータ調査のための理論的断片の計算などの機能を追加したいと考えています。
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Disclosures
このソフトウェアは、Apache 2.0ライセンスの下でリリースされています。GlaxoSmithKline Research & Development Limitedの著作権(2022年)。無断転載を禁じます。Apacheライセンス、バージョン2.0(以下「ライセンス」)に基づいてライセンスされています。ライセンスに準拠しない限り、このファイルを使用することはできません。本ライセンスの写しは、http://www.apache.org/licenses/LICENSE-2.0 で入手できます。適用法で義務付けられている場合、または書面で合意されていない限り、本ライセンスに基づいて配布されるソフトウェアは、明示または黙示を問わず、いかなる種類の保証または条件もなく、「現状のまま」で配布されます。本ライセンスに基づく許可および制限を規定する特定の文言については、本ライセンスを参照してください。L.C.はグラクソ・スミスクライン(GSK)の従業員です。T.H.とK.K.はGSKの従業員としてこのソフトウェアを開発し、現在はそれぞれメルクとモデルナの関連会社です。
Acknowledgments
著者らは、データ検証に協力してくれたRobert Schuster氏に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquity UPLC system | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
| Antibody-drug conjugate (ADC) | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| BEH 200 SEC column | Waters Corp., Milford, MA | 176003904 | |
| Bispecific mAb | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| Byos | Protein Metrics, Cupertino, CA | https://proteinmetrics.com/byos/ Version 4.5 |
|
| GPMAW | GPMAW | http://www.gpmaw.com/ | |
| LC-MS grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | W6-1 | |
| mAb standard | Waters Corp., Milford, MA | 186009125 | Waters Humanized mAb Mass Check Standard |
| mAbScale | GlaxoSmithKline | Apache License, Version 2.0 | |
| Xevo G2 Q-TOF mass spectrometer | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
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