Summary
يقدم هذا البروتوكول منصة مستودع حيوي متكاملة للجمع الموحد والتعليق والبنوك الحيوية للفكاهة المائية البشرية عالية الجودة والخزعات السائلة الزجاجية للتحليلات الجزيئية النهائية ، بما في ذلك البروتينات والأيض والسكريات.
Abstract
يتمثل التحدي الحاسم في البحث الانتقالي في إنشاء واجهة قابلة للتطبيق وفعالة بين رعاية المرضى في غرفة العمليات (OR) ومختبر الأبحاث. هنا ، قمنا بتطوير بروتوكول للحصول على خزعات سائلة عالية الجودة للتحليلات الجزيئية من الخلط المائي والجسم الزجاجي من المرضى الذين يخضعون لجراحة العيون. في سير العمل هذا ، يتم استخدام عربة واجهة مختبر غرفة العمليات المتنقلة (MORLI) المجهزة بجهاز كمبيوتر وماسح ضوئي للرموز الشريطية وأدوات معملية ، بما في ذلك التخزين البارد على متن الطائرة ، للحصول على عينات بيولوجية بشرية وأرشفتها. تتيح قاعدة البيانات المتوافقة مع خصوصية البيانات المستندة إلى الويب التعليق على كل عينة على مدار عمرها ، ويسمح نظام الإحداثيات الديكارتي بتتبع كل عينة مشفرة بالباركود في التخزين ، مما يتيح استرجاع سريع ودقيق للعينات للتحليلات النهائية. لا يعمل التوصيف الجزيئي لعينات الأنسجة البشرية كأداة تشخيصية (على سبيل المثال ، للتمييز بين التهاب باطن المقلة المعدية وغيره من التهابات العين غير المعدية) ولكنه يمثل أيضا مكونا مهما للبحوث الانتقالية ، مما يسمح بتحديد أهداف دوائية جديدة ، وتطوير أدوات تشخيصية جديدة ، وعلاجات شخصية.
Introduction
يمكن أن يلتقط التنميط الجزيئي للخزعات السائلة من العين البشرية السوائل المخصبة محليا التي تحتوي على جزيئات مثل الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتينات والجليكان والمستقلبات من أنسجة العين عالية التخصص. أثبتت الخزعات السائلة من الجسم الزجاجي في الغرفة الخلفية للعين البشرية أنها إجراء آمن بشكل عام1. إنها تسمح بالتوصيف الجزيئي لأمراض العين لدى البشر الأحياء وتوفر إمكانية تحديد استراتيجيات تشخيصية وعلاجية جديدة2،3،4. تتمتع الفكاهة المائية في الغرفة الأمامية للعين بإمكانية وصول جراحية أعلى ويمكن الحصول عليها بأعداد كبيرة ، على سبيل المثال ، أثناء جراحة الساد ، والتي تعد واحدة من أكثر العمليات الجراحية التي يتم إجراؤها بشكل متكرر. ومع ذلك ، لا يتوفر بروتوكول موحد لجمع وشرح والبنوك الحيوية للفكاهة المائية البشرية وخزعات السائل الزجاجي للتحليلات الجزيئية النهائية ، بما في ذلك البروتينات والأيض والسكريات ، حتى الآن.
هنا ، قمنا بتطوير بروتوكول لجمع وتخزين الخزعات السائلة عالية الجودة للتحليلات الجزيئية من المرضى الذين يخضعون لجراحة العيون. تمكن واجهة مختبر غرفة العمليات المتنقلة (MORLI) الباحث من تجميد العينات التي تم جمعها على الفور في كريوفيالات مشفرة على الثلج الجاف عند -80 درجة مئوية في غرفة العمليات (OR). يضمن هذا الإجراء جودة عينة عالية ومتسقة للتحليل الجزيئي النهائي. بالإضافة إلى جودة العينة الممتازة ، يعد التعليق التوضيحي الدقيق للعينات في البنك الحيوي أمرا بالغ الأهمية. باستخدام قاعدة بيانات REDCap (التقاط البيانات الإلكترونية البحثية) المستندة إلى HIPAA (قانون نقل التأمين الصحي والمساءلة)5 ، يسمح سير العمل لدينا بتخزين البيانات الوصفية التفصيلية لكل عينة ، بما في ذلك العمر والجنس والمرض ومرحلة المرض ونوع العينة والميزات الفريدة للجراحة. وسيتيح ذلك قدرة بحث دقيقة في المستقبل، على سبيل المثال، عن عينات من مرض معين أو مجموعة معينة من المرضى. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أرشفة الموقع الدقيق لكل عينة في الفريزر باستخدام نظام الشبكة الديكارتية ، والذي يتيح استرجاع العينات بكفاءة للتجارب النهائية. نعرض أمثلة على تحليلات الحمض النووي والبروتين والجليكان والمستقلب.
يمثل سير العمل لدينا اتصالا عمليا وفعالا بين غرفة العمليات ومختبر الأبحاث ويوفر أساسا قيما للبحث الانتقالي.
Protocol
يتبع البروتوكول المبادئ التوجيهية لمجلس المراجعة المؤسسية لأبحاث الموضوعات البشرية (IRB) في جامعة ستانفورد بالولايات المتحدة الأمريكية.
تنبيه: هذا البروتوكول هو دليل لجراحي العيون المؤهلين. في سياق الأورام الخبيثة داخل العين ، لا يمكن استبعاد بذر الورم خارج العين في وضع الفكاهة المائية أو الخزعات السائلة الزجاجية. ومع ذلك ، فإن خطر التمدد خارج العين والمشاركة المدارية منخفض للغاية في خزعة الورم المشيمي عبر الجسم الزجاجي ، ويتم ذلك بطريقة معززة للسلامة ومع مراعاة موقع الدخول بعناية6. لا يغطي هذا البروتوكول وقد يكون بطلان في حالات الورم الأرومي الشبكي أو الأورام ذات المخاطر النقيلية العالية.
1. قبل جمع العينات
- موافقة مجلس المراجعة المؤسسية
- الحصول على الموافقات من IRB المحلي قبل بدء التجربة وإجراء جمع العينات وفقا لذلك.
- مجتمع الدراسة
- معايير التضمين: تشمل جميع المرضى (الذين تتراوح أعمارهم بين 0 و 99 عاما) الذين يخضعون لجراحة داخل العين في المؤسسة التي ستوفر كمية كافية من الخلط المائي أو السائل الزجاجي تزيد عن تلك المطلوبة لإجراء الاختبارات التشخيصية المناسبة لتقييم حالة المريض والمرضى الذين يرغبون في المشاركة.
- معايير الاستبعاد: استبعاد المرضى الذين يرفضون المشاركة والنساء الحوامل.
- الموافقة المستنيرة
- الحصول على موافقة خطية مستنيرة من كل مريض باتباع البروتوكول المعتمد من IRB.
- أرشفة الموافقة الموقعة في قاعدة بيانات آمنة.
- تدريب الموظفين المعنيين (الجراحين وفنيي المختبرات وموظفي غرفة العمليات (OR) والعلماء) كما هو موضح في هذا البروتوكول.
- إعداد نموذج لإدارة قاعدة البيانات. استخدم REDCap كنموذج لقاعدة بيانات مستندة إلى الويب متوافقة مع HIPAA ومصممة لدعم التقاط البيانات للدراسات البحثية5.
ملاحظة: توضح هذه المقالة استخدام واجهة المستندة إلى الويب التي توفرها REDCap لتصميم النماذج وتعريف الحقول وإعداد منطق التفريع وتطبيق قواعد التحقق من صحة البيانات دون الحاجة إلى معرفة واسعة بالبرمجة. بدلا من ذلك ، قد تكون البرامج الأخرى ، مثل تطبيقات جداول البيانات القياسية ، مناسبة أيضا. - تأكد من توفر صندوق تبريد ، وثلج جاف ، وحقنة لجمع العينات ، و cryovials (انظر جدول المواد). استخدم cryovials مع الرموز الشريطية المحفورة بشكل دائم على القوارير. هذا يلغي الحاجة إلى إضافة معرفات المريض على القارورة وإمكانية فقدان الملصق في ظل ظروف التجميد.
- قم بإخطار الجراح بالحالة وفني المختبر الذي سيساعد في جمع العينات في غرفة العمليات قبل 24 ساعة على الأقل من الجراحة المقررة.
2. اقتناء العينات الجراحية في غرفة العمليات
- واجهة مختبر غرفة العمليات المتنقلة (MORLI)
- إنشاء MORLI في غرفة العمليات. يشتمل MORLI على سطح طاولة مختبر مسطح ، وجهاز كمبيوتر / جهاز لوحي مزود بماسح ضوئي للرموز الشريطية مع إمكانية الوصول إلى قاعدة بيانات REDCap ، وصندوق تبريد به ثلج جاف (انظر جدول المواد).
تنبيه: الثلج الجاف شديد البرودة. احرص دائما على ارتداء القفازات عند التعامل مع الثلج الجاف ، وتجنب لمسه.
- إنشاء MORLI في غرفة العمليات. يشتمل MORLI على سطح طاولة مختبر مسطح ، وجهاز كمبيوتر / جهاز لوحي مزود بماسح ضوئي للرموز الشريطية مع إمكانية الوصول إلى قاعدة بيانات REDCap ، وصندوق تبريد به ثلج جاف (انظر جدول المواد).
- إعداد جمع العينات في غرفة العمليات
- قم بتسجيل الدخول إلى الكمبيوتر / الجهاز اللوحي على MORLI وافتح قاعدة بيانات REDCap.
- تحقق من توقيع المريض على الموافقة المستنيرة وتأكد من ذلك مع الجراح. ذكره بأن عينة غير مخففة مطلوبة.
- ارتداء القفازات. احصل على العدد المناسب من المبردات المشفرة بالباركود (0.5 مل للخلط المائي و 1.9 مل للعينات الزجاجية) وضعها في مكان يسهل الوصول إليها.
- مجموعة من الخزعات السائلة الفكاهة المائية
تنبيه: اعتبر عينات الأنسجة البشرية مادة خطرة بيولوجيا ، الأمر الذي يتطلب الاحتياطات المناسبة مثل معطف المختبر والقفازات لضمان سلامة الأفراد المعنيين.
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية فقط من قبل جراح عيون مدرب. يمكن الحصول على خزعات سائلة من الفكاهة المائية ، على سبيل المثال ، في بداية جراحة إعتام عدسة العين ، وهي واحدة من أكثر العمليات الجراحية شيوعا في جميع أنحاء العالم.
ملاحظة: يتم الحفاظ على حقل معقم وفقا لمعايير بروتوكولات الرعاية في غرفة العمليات. تتبع إجراءات ما قبل الجراحة المتعلقة بتخدير المريض خطوات الرعاية القياسية لجراحات الغرفة الأمامية والشبكية والجسم الزجاجي.- قم بإعداد وثني العين للجراحة ووضع منظار غطاء معقم للتصور الأمثل للحقل المعقم.
- استخدم مجهر التشغيل لإجراء بزل الغرفة الأمامية بشكل عمودي على الحافة باستخدام إبرة 30-32 جم متصلة بحقنة سعة 1 مل. استخدم طرفا قطنيا أو ملقطا صغيرا لتثبيت العين أثناء هذا الإجراء.
ملاحظة: تأكد من قفل الإبرة والمحقنة وعدم وجود ضغط في المحقنة (عن طريق تحريك المكبس). تأكد من بقاء طرف الإبرة فوق القزحية المحيطية في الغرفة الأمامية الوسطى لتجنب تلف الهياكل داخل العين. في حالة جراحة إعتام عدسة العين ، يمكن أن تدخل إبرة الحصول على الخزعة السائلة أيضا إلى الغرفة الأمامية عبر أحد البزلات التي يتم إنشاؤها لجراحة إعتام عدسة العين. - تحت التصور المباشر عبر المجهر ، قم باستنشاق ما يقرب من 100 ميكرولتر من الفكاهة المائية غير المخففة يدويا باستخدام حقنة سعة 1 مل. حرك مكبس المحقنة بيد الجراح غير المهيمنة أو بواسطة مساعد مدرب دون تحريك الإبرة.
ملاحظة: احصل على أقل من 100 ميكرولتر من الخلط المائي في حالة انهيار الغرفة الأمامية. - قم بإزالة الإبرة بعناية من الغرفة الأمامية.
ملاحظة: في العين البكينية، ضع الإبرة فوق القزحية لتجنب لمس العدسة. الضغط الإيجابي على الكرة الأرضية يمكن أن يزيد من الارتجاع. يساعد تحرير طرف القطن قبل سحب الإبرة على تقليل الارتجاع. - اسحب المكبس للخلف وشاهد كيف يتحرك الهواء والسائل الذي تم جمعه.
- حقن المحقنة في cryovial. الهواء الإضافي ينظف المساحة الميتة للمحقنة.
- استخدم الرمز الشريطي الموجود على cryovial لمسح العينة ضوئيا إلى نموذج REDCap على جهاز كمبيوتر في غرفة العمليات (مزيد من التفاصيل في الخطوات من 3.1 إلى 3.9).
- نقل على الفور cryovial لتجفيف الجليد في مربع التبريد.
- استمر في الجراحة المقررة للمريض (على سبيل المثال ، جراحة إعتام عدسة العين كما هو موضح سابقا7 ).
- مجموعة من الخزعات السائلة الزجاجية
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية فقط من قبل جراح الشبكية والجسم الزجاجي المدرب. يمكن الحصول على خزعات السائل الزجاجي في بداية استئصال الزجاجية8. نظرا لأن الهدف هو جمع عينة زجاجية غير مخففة ، فلن يتم تحضير قاطع استئصال الزجاجية بالسائل1.
ملاحظة: يتم الحفاظ على حقل معقم وفقا لمعايير بروتوكولات الرعاية في غرفة العمليات. تتبع إجراءات ما قبل الجراحة المتعلقة بتخدير المريض خطوات الرعاية القياسية لجراحات الغرفة الأمامية والشبكية والجسم الزجاجي.- قم بإعداد وثني العين للجراحة ووضع منظار غطاء معقم للتصور الأمثل للحقل المعقم.
- قم بإنشاء عمليات استئصال التصلب باستخدام قنية مبزل 23 أو 25 أو 27-G ، باتباع إجراءات الرعاية القياسية. أدخل قنية التسريب وتأكد بصريا من الموضع المناسب في التجويف الزجاجي.
- في التجويف الزجاجي ، قم بتنشيط القاطع الزجاجي دون تسريب لجمع عينة زجاجية غير مخففة. قم بنضح 0.5 إلى 1.0 مل من الجسم الزجاجي يدويا باستخدام حقنة متصلة بقذف الجسم الزجاجي1.
- قم بإزالة القاطع الزجاجي من العين وقم بتشغيل ضخ السوائل.
- نضح السائل المتبقي داخل الأنبوب إلى المحقنة.
- افصل المحقنة.
- معالجة العينة كما هو موضح لعينة الخلط المائي في القسم 2.3 (الخطوة 2.3.5 إلى الخطوة 2.3.9).
3. معالجة العينات في غرفة العمليات وإضافة عينات إلى قاعدة البيانات
- اطلب من فني المختبر أخذ المبرد المحضر (0.5 مل للخلط المائي و 1.9 مل للعينات الزجاجية) والمشي إلى الجراح دون لمس أي معدات أو معدات معقمة.
- اطلب من فني المختبر فتح المبرد.
- تفريغ المحقنة مباشرة في cryovial.
- اطلب من فني المختبر أن يلخص على الفور cryovial.
- اطلب من فني المختبر العودة إلى MORLI ونقل العينة على الفور إلى الثلج الجاف في صندوق التبريد (-80 درجة مئوية). أغلق غطاء الصندوق.
- افتح نموذج جمع عينة جديد. أدخل المعلومات التالية في الحقل المعني من النموذج: جراح الحالة ، وموقع وتاريخ الجمع ، ورقم معرف المريض ، والمعلومات الأساسية الأخرى ، مثل العمر والجنس والعين اليمنى أو اليسرى والتشخيص والتاريخ قبل الجراحة (نص مجاني) ، ومعلومات حول الإجراء (على سبيل المثال ، نوع الجراحة) ، بالإضافة إلى معلومات حول العينات ، مثل عدد العينات التي تم جمعها ، نوع العينات (الفكاهة المائية ، الجسم الزجاجي) ، وتفاصيل أخرى مثل الأحجام. أضف الرمز الشريطي الأنبوبي باستخدام ماسح الباركود.
- انقر فوق إرسال / التالي.
- كرر الخطوات من 3.1 إلى 3.7 إذا تم جمع أي عينات إضافية.
- عندما يتم تأمين كافة العينات، انقر فوق حفظ وإرسال في نموذج جمع عينات REDCap. ثم قم بتسجيل الخروج من قاعدة البيانات والكمبيوتر / الجهاز اللوحي.
4. نقل cryovials إلى التخزين
- انقل العينات الموجودة على الثلج الجاف في صندوق التبريد من غرفة العمليات إلى المختبر وضعها على مقعد المختبر بجوار كمبيوتر المختبر.
- قم بتسجيل الدخول إلى REDCap على كمبيوتر المختبر باستخدام معرف تسجيل الدخول وكلمة المرور.
- ارتداء القفازات. خذ إحدى العينات التي تم جمعها وامسح الرمز الشريطي للكريوفيال في قاعدة البيانات (مزيد من التفاصيل في القسم 5). ضع العينة على الفور مرة أخرى على الثلج الجاف.
- احصل على حاوية ثانية مملوءة بالثلج الجاف.
- احصل على رف للكريوفيال من الفريزر -80 درجة مئوية. ضعه في الحاوية الثانية على الثلج الجاف.
ملاحظة: ستكون هناك حاجة إلى رف بتنسيق 96 لأنابيب الخلط المائي سعة 0.5 مل ورف بتنسيق 48 للأنابيب الزجاجية سعة 1.9 مل. - امسح الرمز الشريطي للحامل ضوئيا إلى قاعدة البيانات (مزيد من التفاصيل في القسم 5).
- انقل العينة إلى الرف.
- أضف موضع القوارير في الحامل إلى قاعدة البيانات (مزيد من التفاصيل في القسم 5).
- انقر على حفظ وإرسال.
- انقل الرف مع القوارير على الثلج الجاف إلى الثلاجة لتخزينها عند -80 درجة مئوية. أضف الرف إلى موضع معين في الثلاجة باستخدام نظام إحداثيات. سيسمح هذا لاحقا باسترداد العينات لتحليل المصب بسهولة.
5. نموذج تخزين العينة
- أكمل نموذج تخزين لكل عينة يتم جمعها أثناء مرحلة نموذج الإدخال. انقر فوق الدائرة الفارغة أو "+" ضمن نموذج التخزين لإنشاء نموذج تخزين جديد وفتحه.
- أدخل تاريخ إكمال هذا النموذج ضمن تاريخ أرشفة السجل.
- امسح أو اكتب الرمز الشريطي للأنبوب ضمن الرمز الشريطي لأنبوب العينة. ضع العينة على الفور مرة أخرى على الثلج الجاف.
- حدد ما إذا كان سيتم نقل عينة للخارج أو إذا كانت العينة ستنتقل إلى تخزين المستودع الحيوي الداخلي.
- تحقق من الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المريض وحدد المربع الموجود أسفل التحقق من الامتثال للموافقة وأدخل اسمك ضمن تم التحقق من الموافقة بواسطة.
- حدد موقعا مجانيا ومناسبا للكريوفيال في الرف. انقل المبرد في هذا الموضع إلى الحامل (على سبيل المثال ، الموضع A1). الحفاظ على الرف على الثلج الجاف.
- في مرحلة الموقع ، أدخل المعلومات التالية: موقع الفريزر أسفل الفريزر ، ورقم الرف حيث سيتم تخزين العينة تحت الرف ، والرمز الشريطي للصندوق أسفل الرمز الشريطي للصندوق ، وموضع الأنبوب في المربع حسب الصف (موضع الأنبوب (الصف)) والعمود (موضع الأنبوب (العمود)).
ملاحظة: اختياريا ، يمكن أيضا إدخال ملصق الصندوق ضمن Box Label ، مما قد يسهل العثور على الصندوق في الفريزر. - ضمن قسم الاستخدام ، أدخل المعلومات التالية: اسم المشروع الذي يتم استخدام العينة له (اسم المشروع)، وحجم العينة في إحدى الفئات التالية: كامل أو جزئي أو شبه فارغ أو فارغ (حجم العينة)، وملاحظات التخزين إن أمكن ضمن ملاحظات التخزين.
ملاحظة: يتم ملء التاريخ والوقت والمستخدم الذي قام آخر مرة بالوصول إلى النموذج تلقائيا لضمان سلسلة العهدة التي يمكن مراجعتها وتدقيقها حسب الحاجة. - تأكد من اكتمال النموذج بالنقر فوق إكمال ضمن مكتمل؟.
- انقر فوق حفظ وإنهاء النموذج. سيعيدك هذا إلى نظرة عامة على المريض.
- لكل أنبوب تم جمعه، قم بإنشاء نموذج آخر لجمع العينات بالنقر فوق "+" ضمن تخزين العينات. ثم كرر الخطوات من 5.1 إلى 5.10.
- انقر فوق حفظ وإنهاء لإكمال النموذج وتسجيل الخروج من قاعدة البيانات والكمبيوتر/الجهاز اللوحي.
- انقل رف العينات (على الثلج الجاف) إلى الثلاجة في الموضع المحدد مسبقا.
6. استرجاع العينات الجراحية لتحليل المصب
ملاحظة: غالبا ما يتم أرشفة العينات لعدة سنوات قبل تحليلها. تسمح cryovials المشفرة الشريطية ونظام قاعدة بيانات REDCap القابل للبحث بالعثور على كل عينة وتحديد موقعها بسهولة لتحليل المصب.
- تحديد العينات ذات الأهمية للتجربة باستخدام وظيفة البحث في قاعدة البيانات. سيسمح ذلك بالعثور على سبيل المثال ، جميع عينات الخلط المائي من المرضى الذين تتراوح أعمارهم بين 20 و 40 عاما المصابين باعتلال الشبكية السكري.
- احصل على موقع المبردات ذات الأهمية (الفريزر ، الرف / الرف ، رف العينات ، الإحداثيات داخل الرف). قم بتدوينها أو طباعتها أو إتاحتها على جهاز كمبيوتر محمول / جهاز لوحي لتسهيل العثور على العينات في الفريزر.
- ضع علامة على العينات كما هي مستخدمة في قاعدة البيانات.
- انقر فوق حفظ وإنهاء لإكمال النموذج وتسجيل الخروج من REDCap والكمبيوتر / الجهاز اللوحي.
Representative Results
يمكن إخضاع عينات الخزعة السائلة التي تم جمعها لمجموعة متنوعة من التحليلات الجزيئية ، بما في ذلك تحليل الحمض النووي والبروتينات والجليكان والمستقلبات. لقد ثبت من قبل أن التخزين طويل الأجل على مدى عدة سنوات عند -70 درجة مئوية لم يؤثر بشكل كبير على سلامة الملف البروتيني9. تتيح قاعدة بيانات REDCap استرجاع العينات بشكل بسيط وسريع. يمكن البحث في قاعدة البيانات عن عينات من مجموعة محددة من المرضى ، على سبيل المثال ، جميع المرضى الذين يعانون من اعتلال الشبكية السكري. ستوفر قاعدة البيانات بعد ذلك الرموز الشريطية للأنابيب والمواضع في التخزين. حتى الآن ، قمنا بجمع وأرشفة أكثر من 1000 خزعة سائلة. سمحت لنا قاعدة البيانات بالعثور بسرعة على عينات لتحليلات المصب 3,10 وساعدت في إجراء التجارب التالية.
امرأة تبلغ من العمر 17 عاما مصابة بالتهاب في شبكية العين والعصب البصري. كانت تعاني من نقص المناعة ، وكان هناك قلق من العدوى. تم جمع الفكاهة المائية من عينها اليمنى وإرسالها لتحليل الحمض النووي PCR. كانت النتائج إيجابية للفيروس المضخم للخلايا وسلبية لفيروس الهربس البسيط وداء المقوسات. توضح هذه النتائج أن الخزعات السائلة للفكاهة المائية يمكن أن تساعد في التمييز بين الأشكال المعدية وغير المعدية للالتهاب داخل العين ، وهو أمر بالغ الأهمية لاختيار العلاج المناسب.
يتيح قياس الطيف الكتلي اللوني السائل إجراء تحليل غير متحيز وشبه كمي للبروتين. في خزعة سائلة من الجسم الزجاجي لمريض يخضع لاستئصال الزجاجية ، تمكنت التقنية من تحديد 484 بروتينا فريدا ، بما في ذلك Complement C3 (C3) و Opticin (OPTC) و Collagen Type II Alpha 1 (COL2A1) (الشكل 1A).
تم تحليل ثلاث خزعات سائلة زجاجية باستخدام مضاعف غليكوبروتيوميكس ELISA (انظر جدول المواد)11. كشف الفحص عن ملامح الجليكوزيل ل 500 بروتين بشري ، والتقط مجموعة متنوعة من المسارات البيولوجية ، مثل التمثيل الغذائي ، والاستجابة المناعية ، والتصاق الخلايا ، وتنظيم الأكتين (الشكل 1 ب).
حددت شاشة الأيض باستخدام الرحلان الكهربائي الشعري إلى جانب مطياف الكتلة المحول فورييه12 (انظر جدول المواد) 292 مستقلبا مختلفا في ثلاث عينات خزعة سائلة من الفكاهة المائية. حدد تحليل المسار (انظر جدول المواد)13 مجموعة متنوعة من المسارات الأيضية ، بما في ذلك استقلاب الأحماض الأمينية ودورة اليوريا وتخليق الكارنيتين (الشكل 1C).
الشكل 1: النتائج التمثيلية . (أ) حدد تحليل البروتيوميات للفكاهة الزجاجية البشرية باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة وقياس الطيف الكتلي الترادفي (LC-MS/MS) 484 بروتينا فريدا في خزعة سائلة واحدة. يتم عرض مستويات البروتين وترتيبها بناء على التهم الطيفية. يتم تمييز البروتينات التمثيلية باللون الأزرق. (ب) اكتشف مضاعف الجليكوبروتيوميكس ELISA مستويات الجليكوزيل ل 500 بروتين فريد في ثلاث خزعات سائلة زجاجية. حدد تحليل تفاعل البروتين STRING مجموعات من تفاعلات البروتين (يتم عرض مجموعات تحتوي على 10 بروتينات على الأقل). يتم عرض المسار الأكثر إثراء لكل مجموعة. (ج) حدد تحليل الأيض باستخدام قياس الطيف الكتلي 292 مستقلبا مختلفا في ثلاث خزعات سائلة من الفكاهة المائية. تمثل كل نقطة عينة واحدة. يتوافق ارتفاع الشريط مع متوسط عدد المستقلبات ، ويمثل شريط الخطأ الانحراف المعياري. تظهر اللوحة اليمنى مسارات غنية بشكل كبير. يتم عرض عدد المستقلبات المكتشفة (البسط) وكذلك العدد الإجمالي للمستقلبات في كل مسار (المقام). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
تسمح العينات الجراحية من المرضى بالتوصيف الجزيئي المباشر للمرض في البشر الأحياء2،3،4،14 ، وقد تساعد في التغلب على قيود نماذج أمراض الخلايا والحيوانات التي لا تلخص بشكل كامل المرض البشري15،16. يمكن أن يحسن التحليل الجزيئي للأنسجة البشرية اختيار أهداف دوائية جديدة وقد يساهم في ارتفاع معدل نجاح التجارب السريرية والموافقة على الأدوية17. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر هذا النهج إمكانية الطب الشخصي ، حيث يحتفظ النسيج الذي تم الحصول عليه بالبصمة الجينومية الفريدة ، واللاجينومية ، والأيضية ، والجليكومية ، والبروتينية لكل فرد2،18،19.
تعد جودة العينة العالية والمتسقة أمرا أساسيا لجميع تطبيقات التحليل الجزيئي. أظهرت الدراسات السابقة أن التجميد الفوري بعد استرجاع العينة وتجنب دورات التجميد / الذوبان المتكررة أمر بالغ الأهمية لصفات العينةالعالية 9,20. لم يؤثر التخزين طويل الأجل على مدى عدة سنوات عند -70 درجة مئوية بشكل كبير على سلامة الملف البروتيني9. يعد البروتوكول الموحد أساسا مهما لتقليل التحيز وتحسين قابلية مقارنة البيانات العلمية ، خاصة عندما يشارك العديد من الأشخاص (الجراحين والفنيين وغيرهم) أو مؤسسات مختلفة في عملية أخذ العينات. بصرف النظر عن جودة العينة ، يعد شرح العينات عاملا مهما آخر يتطلب التوحيد القياسي للسماح بربط النتائج الجزيئية بالبيانات السريرية. يعتمد بروتوكولنا على ثلاثة مبادئ أساسية لتحقيق ذلك: 1) إجراء موحد لأخذ العينات للفكاهة المائية وخزعات السائل الزجاجي من قبل جراح العيون ، 2) المعالجة الفورية والتجميد المفاجئ للعينات في غرفة العمليات من قبل موظفي المختبر ، و 3) شرح البيانات الوصفية لكل عينة في قاعدة بيانات على شبكة الإنترنت تسمح للباحثين بالعثور بسرعة على عينات للتجارب اللاحقة.
بالإضافة إلى العينات الزجاجية20 ، يؤسس سير العمل هذا أيضا مجموعة موحدة من خزعات سائل الفكاهة المائية للتحليل الجزيئي. الخلط المائي هو سائل معقد يمكن الوصول إليه للغاية في الغرفة الأمامية للعين لا يعكس فقط أمراض العين الأمامية ولكن أيضا في الجزء الخلفي من العين ، بما في ذلك أمراض الشبكية18,21. إلى جانب حقيقة أنه يمكن جمع عدد كبير من عينات الفكاهة المائية ، على سبيل المثال ، أثناء جراحة الساد ، وهي واحدة من أكثر العمليات الجراحية التي يتم إجراؤها بشكل متكرر في جميع أنحاء العالم ، فإن هذه الميزات تجعلها مصدرا مثيرا للاهتمام للخزعات السائلة من العين البشرية. يمكن أن يسمح شرح البيانات الوصفية الموحدة لكل عينة تم إنشاؤها في سير العمل هذا أيضا بربط بيانات البروتينات ببيانات المتابعة السريرية المستقبلية. وهذا يوفر فرصة مثيرة لتحديد المؤشرات الحيوية النذير الجديدة التي قد تساعد في تقدير التشخيص للمرضى في المستقبل.
ومع ذلك ، فإن التحليل الجزيئي للعينات الجراحية البشرية له أيضا قيود مهمة. على سبيل المثال ، غالبا ما تكون التلاعب التجريبية المعقدة ممكنة فقط في النماذج الحيوانية والخلوية. قد يكون الحل هو مقارنة المظهر الجزيئي للنماذج الحيوانية أو الخلوية مع المرض البشري. يمكن لهذه الاستراتيجية تحديد المؤشرات الحيوية للبروتين المتداخلة والأهداف العلاجية التي يمكن التحقق من صحتها في الحيوانات أو نماذج الخلايا لتحديد المرشحين الواعدين الذين يرتبطون بالأمراض البشرية ومن المرجح أن ينجحوا في التجارب السريرية 4,16.
في الختام ، يؤسس سير العمل لدينا واجهة عملية بين غرفة العمليات ومختبر الأبحاث الذي يسمح بجمع العينات الجراحية عالية الجودة والتعليق عليها وتخزينها بشكل موحد وعالي الإنتاجية للتحليل الجزيئي النهائي ، مما يوفر أساسا قيما للبحوث الانتقالية المستقبلية.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يتم دعم VBM من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (R01EY031952 و R01EY031360 و R01EY030151 و P30EY026877) ، ومركز ستانفورد للقرص البصري Drusen ، وأبحاث الوقاية من العمى ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية. يتم دعم JW و DR من قبل مؤسسة جراحة الشبكية والجسم الزجاجي ، الولايات المتحدة الأمريكية. يتم دعم DR من قبل زمالة DARE ، التي ترعاها مؤسسة Lundbeck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 68-0703-12 | used for aqueous humor samples |
| 1 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | - | for aqueous humor biopsies |
| 1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-7643 | used for vitreous samples |
| 3 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | - | for vitreous biopsies |
| 30-32-gauge needle | surgical grade, whatever available in hospital | - | for aqueous humor biopsies |
| Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS) | Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan | - | - |
| Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system | Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA | - | for vitreous biopsies |
| Cooling box | Standard styrofoam box, whatever available in lab | - | - |
| Dry ice | Whatever available in lab | - | - |
| Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable | Zebra Symbol | DS9208-SR4NNU21Z | Barcode scanner |
| Human Glycosylation Antibody Array L3 | RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA | GAH-GCM-L3 | - |
| Mac mini | Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA | - | - |
| MetaboAnalyst software | Pang et al., 2021, PMID: 34019663 | - | - |
| Rack for 0.5ml tubes, 96-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 66-51026 | for aqueous humor samples |
| Rack for 1.9ml tubes, 48-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-9451 | for vitreous samples |
| REDCap browser-based sample database | REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org | - | - |
References
- Mishra, K., et al. Intraoperative complications with vitreous biopsy for molecular proteomics. Ophthalmic Surgeries, Lasers Imaging Retina. 54 (1), 32-36 (2023).
- Velez, G., Bassuk, A. G., Colgan, D., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Therapeutic drug repositioning using personalized proteomics of liquid biopsies. JCI Insight. 2 (24), (2017).
- Velez, G., et al. Liquid biopsy proteomics of uveal melanoma reveals biomarkers associated with metastatic risk. Molecular Cancer. 20 (1), 39 (2021).
- Wert, K. J., et al. Metabolite therapy guided by liquid biopsy proteomics delays retinal neurodegeneration. EBioMedicine. 52, 102636 (2020).
- Harris, P. A., et al. The REDCap consortium: Building an international community of software platform partners. Journal of Biomedical Informatics. 95, 103208 (2019).
- Finn, A. P., Materin, M. A., Mruthyunjaya, P. Choroidal tumor biopsy: A review of the current state and a glance into future techniques. Retina. 38 Suppl 1, S79-S87 (2018).
- Tarantola, R. M., Graff, J. M., Somani, R., Mahajan, V. B. Temporal approach for small-gauge pars plana vitrectomy combined with anterior segment surgery. Retina. 32 (8), 1614-1623 (2012).
- Mahajan, V. B., et al. Sutureless triplanar sclerotomy for 23-gauge vitrectomy. Archives in Ophthalmology. 129 (5), 585-590 (2011).
- Mitchell, B. L., Yasui, Y., Li, C. I., Fitzpatrick, A. L., Lampe, P. D. Impact of freeze-thaw cycles and storage time on plasma samples used in mass spectrometry based biomarker discovery projects. Cancer Informatics. 1 (1), 98-104 (2005).
- Velez, G., et al. Proteomic insight into the pathogenesis of CAPN5-vitreoretinopathy. Science Reports. 9 (1), 7608 (2019).
- Montgomery, M. R., Hull, E. E. Alterations in the glycome after HDAC inhibition impact oncogenic potential in epigenetically plastic SW13 cells. BMC Cancer. 19 (1), 79 (2019).
- Okamoto, N., et al. Comparison of serum metabolomics pathways and patterns between patients with major depressive disorder with and without type 2 diabetes mellitus: An exploratory study. Journal of Integrated Neuroscience. 22 (1), 13 (2023).
- Pang, Z., et al. MetaboAnalyst 5.0: narrowing the gap between raw spectra and functional insights. Nucleic Acids Research. 49 (W1), W388-W396 (2021).
- Wolf, J., et al. The Human Eye Transcriptome Atlas: A searchable comparative transcriptome database for healthy and diseased human eye tissue. Genomics. 114 (2), 110286 (2022).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
- Wolf, J., et al. Comparative transcriptome analysis of human and murine choroidal neovascularization identifies fibroblast growth factor inducible-14 as phylogenetically conserved mediator of neovascular age-related macular degeneration. Biochimca et Biophysica Acta Molecular Basis of Diseases. 1868 (4), 166340 (2022).
- Dowden, H., Munro, J. Trends in clinical success rates and therapeutic focus. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (7), 495-496 (2019).
- Li, H. T., et al. Characterizing DNA methylation signatures of retinoblastoma using aqueous humor liquid biopsy. Nature Communication. 13 (1), 5523 (2022).
- Velez, G., et al. Personalized proteomics for precision health: identifying biomarkers of vitreoretinal disease. Translational Vision Science and Technology. 7 (5), 12 (2018).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Applications. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Rinsky, B., et al. Analysis of the aqueous humor proteome in patients with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 62 (10), 18 (2021).
