Summary
이 프로토콜은 단백질체학, 대사체학 및 글리코믹스를 포함한 분자 다운스트림 분석을 위한 고품질 인간 방수액 및 유리체 액체 생검의 표준화된 수집, 주석 및 바이오뱅킹을 위한 통합 생물 저장소 플랫폼을 제공합니다.
Abstract
중개 연구의 중요한 과제는 수술실(OR)의 환자 치료와 연구실 간의 실행 가능하고 효율적인 인터페이스를 구축하는 것입니다. 여기에서 우리는 눈 수술을 받는 환자의 방수와 유리체에서 분자 분석을 위한 고품질 액체 생검을 획득하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 이 워크플로에서는 컴퓨터, 바코드 스캐너 및 온보드 냉장 보관을 포함한 실험실 장비가 장착된 모바일 수술실 실험실 인터페이스(MORLI) 카트를 사용하여 인간 생물학적 샘플을 획득하고 보관합니다. 웹 기반 데이터 개인 정보 보호 준수 데이터베이스를 사용하면 수명 기간 동안 각 샘플에 주석을 달 수 있으며, 데카르트 좌표계를 통해 보관 중인 각 바코드 표본을 추적할 수 있으므로 다운스트림 분석을 위한 샘플을 빠르고 정확하게 검색할 수 있습니다. 인체 조직 샘플의 분자 특성 분석은 진단 도구(예: 감염성 안내염과 기타 비감염성 안내 염증을 구별하기 위한)로 사용될 뿐만 아니라 신약 표적 식별, 새로운 진단 도구 개발 및 개인화된 치료법을 가능하게 하는 중개 연구의 중요한 구성 요소입니다.
Introduction
인간의 눈에서 채취한 액체 생검의 분자 프로파일링은 고도로 전문화된 안구 조직에서 DNA, RNA, 단백질, 글리칸 및 대사 산물과 같은 분자를 포함하는 국소 농축 유체를 포착할 수 있습니다. 인간 눈의 후방에서 유리체의 액체 생검을 실시하는 것은 일반적으로 안전한 절차임이 입증되었다1. 그들은 살아있는 인간의 안구 질환의 분자 특성화를 허용하고 새로운 진단 및 치료 전략을 식별할 수 있는 잠재력을 제공합니다 2,3,4. 눈의 전방에 있는 방수는 훨씬 더 높은 수술 접근성을 가지며 예를 들어 가장 자주 수행되는 수술 중 하나인 백내장 수술 중에 많은 양을 얻을 수 있습니다. 그러나 단백질체학, 대사체학 및 글리코믹스를 포함한 분자 다운스트림 분석을 위한 인간 방수액 및 유리체 액체 생검의 수집, 주석 및 바이오뱅킹을 위한 표준화된 프로토콜은 현재까지 사용할 수 없습니다.
여기에서 우리는 눈 수술을 받는 환자의 분자 분석을 위한 고품질 액체 생검의 수집 및 바이오뱅킹을 위한 프로토콜을 개발했습니다. 이동식 수술실 실험실 인터페이스(MORLI)를 통해 연구원은 수술실(OR)의 -80°C에서 드라이아이스에 바코드가 부착된 극저온 액체로 수집된 샘플을 즉시 급속 냉동할 수 있습니다. 이 절차는 다운스트림 분자 분석을 위한 높고 일관된 샘플 품질을 보장합니다. 우수한 시료 품질 외에도 바이오뱅크에서 시료의 정확한 주석이 중요합니다. 당사의 워크플로우는 웹 기반 HIPAA(Health Insurance Portability and Accountability Act)를 준수하는 REDCap(연구 전자 데이터 캡처) 데이터베이스5를 사용하여 연령, 성별, 질병, 질병 단계, 샘플 유형 및 수술의 고유한 특징을 포함하여 각 샘플에 대한 자세한 메타데이터를 저장할 수 있습니다. 이것은 예를 들어, 특정 질병 또는 특정 환자 그룹으로부터의 샘플에 대한 정확한 미래 검색 능력을 허용할 것이다. 또한 냉동고에 있는 각 샘플의 정확한 위치는 데카르트 그리드 시스템을 사용하여 보관되므로 다운스트림 실험을 위한 효율적인 샘플 검색이 가능합니다. DNA, 단백질, 글리칸 및 대사 산물 분석의 예를 보여줍니다.
우리의 워크플로는 수술실과 연구실 간의 실용적이고 효과적인 연결을 나타내며 중개 연구를 위한 귀중한 기반을 제공합니다.
Protocol
이 프로토콜은 미국 스탠포드 대학의 IRB(Institutional Review Board for Human Subject Research)의 지침을 따릅니다.
주의 : 이 프로토콜은 자격을 갖춘 안과 의사를 위한 안내서입니다. 안내 악성 종양의 맥락에서, 방수액 또는 유리체 액체 생검의 설정에서 안구 외 종양 파종을 배제 할 수 없습니다. 그러나, 유리체강막 맥락막 종양 생검에서는 안구 외 확장 및 안와 침범의 위험이 극히 낮으며, 이는 안전성이 강화된 방식으로 신중한 진입 부위 고려와 함께 수행된다6. 이 프로토콜은 망막모세포종 또는 전이성 위험이 높은 종양의 경우 적용되지 않으며 금기일 수 있습니다.
1. 샘플 채취 전
- 기관 검토 위원회 승인
- 실험을 시작하기 전에 현지 IRB로부터 승인을 받고 그에 따라 샘플 수집을 수행합니다.
- 연구 모집단
- 포함 기준: 환자의 상태를 평가하기 위한 적절한 진단 검사에 필요한 양을 초과하는 적절한 양의 방수액 또는 유리체를 제공하는 기관에서 안내 수술을 받는 모든 환자(0 - 99세)와 참여를 원하는 환자를 포함합니다.
- 제외 기준: 참여를 거부하는 환자와 임산부를 제외합니다.
- 정보에 입각한 동의
- IRB 승인 프로토콜에 따라 각 환자로부터 서면 동의서를 얻습니다.
- 서명된 동의서를 보안 데이터베이스에 보관합니다.
- 이 프로토콜에 설명된 대로 관련 직원(외과의, 실험실 기술자, 수술실(OR) 직원, 과학자)을 교육합니다.
- 샘플 관리 데이터베이스를 설정합니다. REDCap을 연구 연구를 위한 데이터 캡처를 지원하도록 설계된 HIPAA 준수 웹 기반 샘플 데이터베이스로 사용5.
참고: 이 문서에서는 양식을 디자인하고, 필드를 정의하고, 분기 논리를 설정하고, 광범위한 프로그래밍 지식 없이도 데이터 유효성 검사 규칙을 적용하려면 REDCap에서 제공하는 웹 기반 인터페이스를 사용하는 방법을 설명합니다. 대안적으로, 표준 스프레드시트 애플리케이션과 같은 다른 소프트웨어가 또한 적합할 수 있다. - 냉각 상자, 드라이아이스, 샘플 수집을 위한 주사기 및 극저온 액체의 가용성을 보장합니다( 재료 표 참조). 바이알에 영구적으로 에칭되는 바코드가 있는 극저온 혼합물을 사용하십시오. 이렇게 하면 바이알에 환자 식별자를 추가할 필요가 없으며 동결 조건에서 라벨이 손실될 가능성이 없습니다.
- 예정된 수술 최소 24시간 전에 수술실에서 샘플 수집을 도와줄 사례와 실험실 기술자에게 알리십시오.
2. 수술실에서 수술 표본 획득
- 이동식 수술실 실험실 인터페이스(MORLI)
- 수술실에 MORLI를 설치하십시오. MORLI에는 평평한 실험실 벤치 표면, REDCap 데이터베이스에 액세스할 수 있는 바코드 스캐너가 있는 컴퓨터/태블릿, 드라이아이스가 있는 냉각 상자가 포함되어 있습니다( 재료 표 참조).
주의 : 드라이 아이스는 매우 차갑습니다. 드라이아이스를 다룰 때는 항상 장갑을 착용하고 만지지 마십시오.
- 수술실에 MORLI를 설치하십시오. MORLI에는 평평한 실험실 벤치 표면, REDCap 데이터베이스에 액세스할 수 있는 바코드 스캐너가 있는 컴퓨터/태블릿, 드라이아이스가 있는 냉각 상자가 포함되어 있습니다( 재료 표 참조).
- 수술실에서 시료 채취 준비
- MORLI에서 컴퓨터/태블릿에 로그인하고 REDCap 데이터베이스를 엽니다.
- 환자가 정보에 입각한 동의서에 서명했는지 확인하고 외과의와 확인하십시오. 희석되지 않은 샘플이 필요하다는 것을 상기시킵니다.
- 장갑을 착용하십시오. 적절한 수의 바코드가 부착된 극저온 액체(방수의 경우 0.5mL, 유리질 샘플의 경우 1.9mL)를 구하여 쉽게 접근할 수 있는 곳에 놓습니다.
- 수액 액체 생검 수집
주의 : 인체 조직 샘플을 생물학적 유해 물질로 간주하여 관련 직원의 안전을 보장하기 위해 실험실 코트 및 장갑과 같은 적절한 예방 조치가 필요합니다.
알림: 다음 단계는 숙련된 안과 의사만 수행해야 합니다. 수액 액체 생검은 예를 들어 전 세계적으로 가장 빈번한 수술 중 하나 인 백내장 수술 초기에 얻을 수 있습니다.
알림: 멸균 필드는 수술실의 표준 치료 프로토콜에 따라 유지됩니다. 환자 마취와 관련된 수술 전 절차는 전방 및 유리체 망막 수술에 대한 표준 치료 단계를 따릅니다.- 수술을 위해 눈을 준비하고 드레이프하고 멸균 부위의 최적 시각화를 위해 멸균 뚜껑 검경을 놓습니다.
- 작동 현미경을 사용하여 1mL 주사기에 연결된 30-32G 바늘을 사용하여 윤부에 수직인 전방 천자를 수행합니다. 이 과정에서 면봉이나 작은 집게를 사용하여 눈을 안정시키십시오.
알림: 바늘과 주사기가 잠겨 있고 주사기에 압력이 가해지지 않았는지 확인하십시오(플런저를 움직여 말입니다). 안구 구조의 손상을 방지하기 위해 바늘 끝이 중간 전방의 주변 홍채 위에 남아 있는지 확인하십시오. 백내장 수술의 경우, 액체 생검을 얻는 바늘은 백내장 수술을 위해 생성 된 천자 중 하나를 통해 전방으로 들어갈 수도 있습니다. - 현미경을 통한 직접 시각화 하에서 1mL 주사기를 사용하여 약 100μL의 희석되지 않은 방수를 수동으로 흡인합니다. 바늘을 움직이지 않고 외과의의 비지배적인 손으로 또는 훈련된 조수로 주사기 플런저를 움직입니다.
알림: 전방이 무너져야 하는 경우에 대비하여 100μL 미만의 방수를 얻으십시오. - 전방에서 바늘을 조심스럽게 제거합니다.
알림: phakic 눈에서는 렌즈를 만지지 않도록 바늘을 홍채 위에 두십시오. 지구에 대한 양압은 역류를 증가시킬 수 있습니다. 바늘을 빼기 전에 면봉을 풀어주면 역류를 줄이는 데 도움이 됩니다. - 플런저를 뒤로 당기고 공기와 수집된 유체가 어떻게 움직이는지 확인합니다.
- 주사기를 극저온 장치에 주입합니다. 여분의 공기는 주사기의 데드 스페이스를 제거합니다.
- 극저온 난자의 바코드를 사용하여 수술실에 있는 컴퓨터의 REDCap 양식으로 샘플을 스캔합니다(자세한 내용은 3.1-3.9단계 참조).
- 즉시 냉동 상자에 있는 드라이아이스로 극저온을 옮깁니다.
- 환자에게 예정된 수술을 계속합니다(예: 앞서 설명한 백내장 수술7 ).
- 유리질 액체 생검 수집
알림: 다음 단계는 훈련된 유리체 망막 외과의만 수행해야 합니다. 유리체 액체 생검은 유리체 절제술시작 시 얻을 수 있다 8. 목표는 희석되지 않은 유리체 샘플을 수집하는 것이기 때문에 유리체 절제술 절단기는 유체1로 프라이밍되지 않습니다.
알림: 멸균 필드는 수술실의 표준 치료 프로토콜에 따라 유지됩니다. 환자 마취와 관련된 수술 전 절차는 전방 및 유리체 망막 수술에 대한 표준 치료 단계를 따릅니다.- 수술을 위해 눈을 준비하고 드레이프하고 멸균 부위의 최적 시각화를 위해 멸균 뚜껑 검경을 놓습니다.
- 표준 치료 절차에 따라 23G, 25G 또는 27G 투관침 캐뉼라로 경화술을 만듭니다. 주입 캐뉼라를 삽입하고 유리체강에 적절한 배치를 육안으로 확인하십시오.
- 유리체 구멍에서 주입 없이 유리체 절단기를 활성화하여 희석되지 않은 유리체 샘플을 수집합니다. 유리체 압출 캐뉼라 1에 연결된 주사기를 사용하여 0.5 내지1.0 mL의 유리체를 수동으로 흡인한다.
- 유리체 절단기를 눈에서 제거하고 유체 주입을 켭니다.
- 튜브 내에 남아 있는 유체를 주사기로 흡인합니다.
- 주사기를 분리합니다.
- 섹션 2.3(단계 2.3.5 내지 단계 2.3.9)에서 수성 유머 표본에 대해 설명된 대로 샘플을 처리합니다.
3. 수술실에서 시료 처리 및 데이터베이스에 시료 추가
- 실험실 기술자에게 준비된 극저온 액체(방수의 경우 0.5mL, 유리체 샘플의 경우 1.9mL)를 채취하여 멸균 수술실 장비를 건드리지 않고 외과의에게 걸어가도록 요청하십시오.
- 실험실 기술자에게 극저온 액체를 열도록 요청하십시오.
- 주사기를 극저온 액체에 직접 내립니다.
- 실험실 기술자에게 극저온 상태를 즉시 요약하도록 요청하십시오.
- 실험실 기술자에게 MORLI로 돌아가 즉시 샘플을 냉각 상자(-80°C)의 드라이아이스로 옮기도록 요청하십시오. 상자의 뚜껑을 닫습니다.
- 새 샘플 수집 양식을 엽니다. 양식의 각 필드에 다음 정보를 입력합니다: 사례 외과의, 수집 위치 및 날짜, 환자 식별자 번호 및 연령, 성별, 오른쪽 또는 왼쪽 눈, 진단, 수술 전 이력(자유 텍스트), 절차에 대한 정보(예: 수술 유형) 및 수집된 샘플 수와 같은 샘플에 대한 정보, 샘플의 유형(수성액, 유리체) 및 부피와 같은 기타 세부 사항. 바코드 스캐너를 사용하여 튜브 바코드를 추가합니다.
- Submit/ Next(제출/다음)를 클릭합니다.
- 추가 샘플이 수집되는 경우 3.1-3.7단계를 반복합니다.
- 모든 샘플이 보호되면 REDCap 샘플 수집 양식에서 저장 및 제출 을 클릭합니다. 그런 다음 데이터베이스와 컴퓨터/태블릿에서 로그아웃합니다.
4. cryovials를 저장소로 옮기기
- 냉각 상자에 담긴 드라이아이스에 담긴 샘플을 수술실에서 실험실로 운반하고 실험실 컴퓨터 옆의 실험실 벤치에 놓습니다.
- 로그인 ID와 암호를 사용하여 실험실 컴퓨터에서 REDCap에 로그인합니다.
- 장갑을 착용하십시오. 수집된 샘플 중 하나를 채취하여 극저온 바코드를 데이터베이스로 스캔합니다(자세한 내용은 섹션 5 참조). 즉시 샘플을 드라이 아이스에 다시 놓습니다.
- 드라이 아이스로 채워진 두 번째 용기를 얻습니다.
- -80°C 냉동고에서 극저온 판독용 랙을 얻습니다. 드라이 아이스의 두 번째 용기에 넣으십시오.
알림: 96mL 방수관에는 0.5형식 랙이 필요하고 48mL 유리관에는 1.9형식 랙이 필요합니다. - 랙의 바코드를 데이터베이스로 스캔합니다(자세한 내용은 섹션 5 참조).
- 샘플을 랙으로 옮깁니다.
- 랙에 있는 바이알의 위치를 데이터베이스에 추가합니다(자세한 내용은 섹션 5 참조).
- Save and submit(저장 및 제출)을 클릭합니다.
- 드라이아이스에 담긴 바이알이 있는 랙을 냉장고로 운반하여 -80°C에서 보관합니다. 좌표계를 사용하여 냉장고의 특정 위치에 랙을 추가합니다. 이렇게 하면 나중에 다운스트림 분석을 위해 샘플을 쉽게 검색할 수 있습니다.
5. 샘플 저장 형태
- 입력 양식 단계에서 수집된 각 샘플에 대한 저장 양식을 작성하십시오. 빈 원을 클릭하거나 Sample Storage 아래의 "+"를 클릭하여 새 스토리지 양식을 만들고 엽니다.
- 기록 보관 날짜 아래에 이 양식이 작성된 날짜를 입력합니다.
- Specimen Tube Barcode(표본 튜브 바코드) 아래에 튜브 바코드를 스캔하거나 입력합니다. 즉시 샘플을 드라이 아이스에 다시 놓습니다.
- 검체가 외부로 이송되는지 또는 검체가 내부 생물 저장소 저장소로 이동할지 여부를 선택합니다.
- 환자로부터 서면 동의서를 받았는지 확인하고 Verify Consent Compliance(동의 규정 준수 확인) 아래의 확인란을 선택하고 Consent verified by(동의 확인자) 아래에 이름을 입력합니다.
- 랙에서 극저온 이온에 적합한 자유 위치를 선택하십시오. 이 위치의 극저온 액체를 랙(예: 위치 A1)으로 옮깁니다. 랙을 드라이 아이스에 보관하십시오.
- 위치 단계에서 냉동실 아래의 냉동고 위치, 선반 아래에 샘플이 저장될 선반 번호, 박스 바코드 아래의 박스 바코드, 행 별 상자 내 튜브 위치(튜브 위치(행)) 및 열(튜브 위치(열))과 같은 정보를 입력합니다.
알림: 선택적으로 상자 라벨 아래에 상자 라벨을 입력할 수도 있으며, 이를 통해 냉동실에서 상자를 쉽게 찾을 수 있습니다. - 사용량 섹션에서 샘플이 사용되는 프로젝트 이름(프로젝트 이름), 전체, 부분, 거의 비어 있거나 비어 있는 범주(표본 볼륨) 중 하나의 표본 볼륨, 스토리지 메모 아래에 해당하는 경우 보관 메모 등의 정보를 입력합니다.
참고: 양식에 마지막으로 액세스한 날짜, 시간 및 사용자가 자동으로 채워져 필요에 따라 검토 및 감사할 수 있는 관리 연속성을 보장합니다. - Complete(완료)에서 Complete(완료)를 클릭하여 양식이 완료되었는지 확인합니다.
- Save & Exit Form(저장 및 종료 양식)을 클릭합니다. 그러면 환자 개요로 돌아갑니다.
- 수집된 모든 튜브에 대해 Sample Storage에서 "+"를 클릭하여 다른 샘플 수집 양식을 생성합니다. 그런 다음 5.1-5.10단계를 반복합니다.
- Save and Exit(저장 및 종료)를 클릭하여 양식을 작성하고 데이터베이스와 컴퓨터/태블릿에서 로그아웃합니다.
- 샘플 랙(드라이아이스)을 미리 지정된 위치의 냉장고로 옮깁니다.
6. 다운스트림 분석을 위한 수술 표본 검색
참고: 표본은 분석되기 전에 몇 년 동안 보관되는 경우가 많습니다. 바코드가 부착된 극저온 액체와 검색 가능한 REDCap 데이터베이스 시스템을 통해 다운스트림 분석을 위해 각 샘플을 쉽게 찾고 찾을 수 있습니다.
- 데이터베이스의 검색 기능을 사용하여 실험에 대한 관심 샘플을 식별합니다. 이를 통해 예를 들어 당뇨병성 망막병증이 있는 20세에서 40세 사이의 환자로부터 모든 방수액 샘플을 찾을 수 있습니다.
- 관심 있는 극저온의 위치(냉동고, 선반/랙, 샘플 랙, 랙 내 좌표)를 얻습니다. 그것들을 기록하거나, 인쇄하거나, 모바일 컴퓨터/태블릿에서 사용할 수 있도록 하여 냉동실에서 샘플을 쉽게 찾을 수 있도록 합니다.
- 데이터베이스에서 사용된 샘플을 표시합니다.
- 저장 및 종료를 클릭하여 양식을 작성하고 REDCap 및 컴퓨터/태블릿에서 로그아웃합니다.
Representative Results
수집된 액체 생검 표본은 DNA, 단백질, 글리칸 및 대사 산물 분석을 포함한 다양한 분자 분석을 받을 수 있습니다. -70°C에서 수년에 걸친 장기 보관은 프로테오믹 프로파일의 무결성에 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다9. REDCap 데이터베이스를 사용하면 샘플을 간단하고 빠르게 검색할 수 있습니다. 데이터베이스는 특정 그룹의 환자, 예를 들어 당뇨병성 망막증을 앓고 있는 모든 환자로부터의 샘플을 검색할 수 있습니다. 그런 다음 데이터베이스는 튜브의 바코드와 보관 위치를 제공합니다. 지금까지 우리는 1,000개 이상의 액체 생검을 수집하고 보관했습니다. 이 데이터베이스는 다운스트림 분석 3,10을 위한 샘플을 신속하게 찾을 수 있게 해주었고 다음 실험을 수행하는 데 도움이 되었습니다.
망막 및 시신경 염증을 보인 17세 여성. 그녀는 면역력이 약했고 감염에 대한 우려가있었습니다. 그녀의 오른쪽 눈에서 방수를 채취하여 DNA PCR 분석을 위해 보냈습니다. 결과는 거대세포바이러스에 대해 양성이었고 단순 포진 바이러스 및 톡소플라스마증에 대해 음성이었습니다. 이러한 결과는 방수액 생검이 감염성 형태의 안구 내 염증과 비감염성 형태의 안구 내 염증을 구별하는 데 도움이 될 수 있음을 보여주며, 이는 적절한 치료법을 선택하는 데 중요합니다.
액체 크로마토그래피-질량 분석법은 프로테옴의 편향되지 않은 반정량적 분석을 가능하게 합니다. 유리체 절제술을 받는 환자의 유리체에서 채취한 액체 생검에서 이 기술은 보체 C3(C3), 옵티신(OPTC) 및 콜라겐 유형 II 알파 1(COL2A1)을 포함한 484개의 고유한 단백질을 식별할 수 있었습니다(그림 1A).
3개의 유리체 액체 생검을 glycoproteomics multiplex ELISA를 사용하여 분석했습니다( 재료 표 참조)11. 이 분석은 500개 인간 단백질의 당화 프로파일을 검출하여 대사, 면역 반응, 세포 부착 및 액틴 조직과 같은 다양한 생물학적 경로를 포착했습니다(그림 1B).
푸리에 변환된 질량 분석법12 ( 재료 표 참조)와 결합된 모세관 전기영동을 사용하는 대사체학 스크리닝은 3개의 수성 유머 액체 생검 샘플에서 292개의 서로 다른 대사산물을 식별했습니다. 경로 분석( 재료 표 참조)13 은 아미노산 대사, 요소 주기 및 카르니틴 합성을 포함한 다양한 대사 경로를 확인했습니다(그림 1C).
그림 1: 대표적인 결과 . (A) 액체 크로마토그래피 및 탠덤 질량분석법(LC-MS/MS)을 사용한 인간 유리체액의 단백질체학 분석은 단일 액체 생검에서 484개의 고유한 단백질을 식별했습니다. 단백질 수준은 스펙트럼 수에 따라 표시되고 순위가 매겨집니다. 대표적인 단백질은 파란색으로 강조 표시됩니다. (B) glycoproteomics multiplex ELISA는 3개의 유리체 액체 생검에서 500개의 고유한 단백질의 당화 수준을 검출했습니다. STRING 단백질 상호작용 분석은 단백질 상호작용 클러스터를 식별했습니다(최소 10개의 단백질이 있는 클러스터가 표시됨). 각 클러스터에 대해 가장 크게 강화된 경로가 표시됩니다. (C) 질량 분석법을 사용한 대사체학 분석은 3개의 수액 액체 생검에서 292개의 서로 다른 대사 산물을 식별했습니다. 각 점은 하나의 표본을 나타냅니다. 막대의 높이는 대사산물의 평균 개수에 해당하며, 오차 막대는 표준편차를 나타낸다. 오른쪽 패널은 상당히 풍부한 경로를 보여줍니다. 검출된 대사산물(분자)의 수와 각 경로의 총 대사산물 수(분모)가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
환자의 수술 표본은 살아있는 인간 2,3,4,14의 질병에 대한 직접적인 분자 특성화를 허용하고 인간 질병 15,16을 완전히 요약하지 않는 세포 및 동물 질병 모델의 한계를 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다. 인체 조직의 분자 분석은 신약 표적 선정을 개선하고 임상 시험 및 약물 승인 성공률을 높이는 데 기여할 수 있다17. 또한, 이 접근법은 얻어진 조직이 각 개인의 고유한 게놈, 후성유전체학, 대사체, 글리코믹 및 프로테오믹 지문을 보유하기 때문에 개인화된 의학의 가능성을 제공합니다 2,18,19.
높고 일관된 시료 품질은 모든 분자 분석 응용 분야의 기본입니다. 이전 연구에서는 시료 채취 후 즉각적인 냉동과 반복적인 동결/해동 주기를 피하는 것이 높은 시료 품질에 매우 중요하다는 것을 보여주었습니다 9,20. -70°C에서 수년에 걸친 장기 보관은 프로테오믹 프로파일의 무결성에 유의한 영향을 미치지 않았다9. 표준화된 프로토콜은 편향을 줄이고 과학적 데이터의 비교 가능성을 개선하기 위한 중요한 토대이며, 특히 여러 사람(외과의, 기술자 등) 또는 다른 기관이 샘플링 프로세스에 관여하는 경우 더욱 그렇습니다. 샘플 품질 외에도 샘플의 주석은 분자 결과와 임상 데이터의 상관 관계를 허용하기 위해 표준화가 필요한 또 다른 중요한 요소입니다. 우리의 프로토콜은 이를 달성하기 위해 세 가지 필수 원칙에 의존합니다: 1) 안과 의사에 의한 방수액 및 유리체 액체 생검을 위한 표준화된 샘플링 절차, 2) 실험실 직원에 의한 수술실에서 샘플의 즉각적인 처리 및 스냅 동결, 3) 연구자가 나중에 실험을 위해 샘플을 빠르게 찾을 수 있도록 하는 웹 기반 데이터베이스의 각 샘플에 대한 메타데이터 주석.
유리체 표본(20) 외에도, 이 워크플로우는 또한 분자 분석을 위한 수성 유머 액체 생검의 표준화된 수집을 확립한다. 방수액은 눈의 전방에서 접근하기 쉽고 복잡한 액체로, 전방의 안구 질환뿐만 아니라 망막 질환을 포함한 눈의 후방 부분의 안구 질환을 반영합니다18,21. 예를 들어 전 세계적으로 가장 빈번하게 수행되는 수술 중 하나인 백내장 수술 중에 많은 수의 방수액 샘플을 수집할 수 있다는 사실과 함께 이러한 기능은 인간의 눈에서 액체 생검을 위한 흥미로운 소스가 됩니다. 이 워크플로우에서 설정된 각 샘플의 표준화된 메타데이터 주석은 또한 프로테옴 데이터와 전향적 임상 추적 데이터의 상관 관계를 허용할 수 있습니다. 이것은 미래 환자의 예후를 추정하는 데 도움이 될 수 있는 새로운 예후 바이오마커를 식별할 수 있는 흥미로운 기회를 제공합니다.
그러나 인간 수술 표본의 분자 분석에도 중요한 한계가 있습니다. 예를 들어, 복잡한 실험 조작은 종종 동물 및 세포 모델에서만 가능합니다. 해결책은 동물 또는 세포 모델의 분자 프로파일을 인간 질병의 분자 프로파일과 비교하는 것일 수 있습니다. 이 전략은 인간 질병과 상관관계가 있고 임상 시험에서 성공할 가능성이 있는 가장 유망한 후보를 식별하기 위해 동물 또는 세포 모델에서 검증할 수 있는 중복 단백질 바이오마커 및 치료 표적을 식별할 수 있습니다 4,16.
결론적으로, 당사의 워크플로는 OR과 연구실 간의 실용적인 인터페이스를 구축하여 분자 다운스트림 분석을 위한 고품질 수술 표본의 표준화되고 높은 처리량의 수집, 주석 및 저장을 가능하게 하여 향후 중개 연구를 위한 귀중한 기반을 제공합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
VBM은 NIH 보조금(R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 및 P30EY026877), Stanford Center for Optic Disc Drusen 및 Research to Prevent Blindness, New York, USA의 지원을 받습니다. JW와 DR은 미국 유리체 망막 수술 재단의 지원을 받습니다. DR은 룬드벡 재단(Lundbeck Foundation)이 후원하는 DARE 펠로우십(DARE Fellowship)의 지원을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 68-0703-12 | used for aqueous humor samples |
| 1 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | - | for aqueous humor biopsies |
| 1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-7643 | used for vitreous samples |
| 3 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | - | for vitreous biopsies |
| 30-32-gauge needle | surgical grade, whatever available in hospital | - | for aqueous humor biopsies |
| Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS) | Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan | - | - |
| Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system | Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA | - | for vitreous biopsies |
| Cooling box | Standard styrofoam box, whatever available in lab | - | - |
| Dry ice | Whatever available in lab | - | - |
| Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable | Zebra Symbol | DS9208-SR4NNU21Z | Barcode scanner |
| Human Glycosylation Antibody Array L3 | RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA | GAH-GCM-L3 | - |
| Mac mini | Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA | - | - |
| MetaboAnalyst software | Pang et al., 2021, PMID: 34019663 | - | - |
| Rack for 0.5ml tubes, 96-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 66-51026 | for aqueous humor samples |
| Rack for 1.9ml tubes, 48-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-9451 | for vitreous samples |
| REDCap browser-based sample database | REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org | - | - |
References
- Mishra, K., et al. Intraoperative complications with vitreous biopsy for molecular proteomics. Ophthalmic Surgeries, Lasers Imaging Retina. 54 (1), 32-36 (2023).
- Velez, G., Bassuk, A. G., Colgan, D., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Therapeutic drug repositioning using personalized proteomics of liquid biopsies. JCI Insight. 2 (24), (2017).
- Velez, G., et al. Liquid biopsy proteomics of uveal melanoma reveals biomarkers associated with metastatic risk. Molecular Cancer. 20 (1), 39 (2021).
- Wert, K. J., et al. Metabolite therapy guided by liquid biopsy proteomics delays retinal neurodegeneration. EBioMedicine. 52, 102636 (2020).
- Harris, P. A., et al. The REDCap consortium: Building an international community of software platform partners. Journal of Biomedical Informatics. 95, 103208 (2019).
- Finn, A. P., Materin, M. A., Mruthyunjaya, P. Choroidal tumor biopsy: A review of the current state and a glance into future techniques. Retina. 38 Suppl 1, S79-S87 (2018).
- Tarantola, R. M., Graff, J. M., Somani, R., Mahajan, V. B. Temporal approach for small-gauge pars plana vitrectomy combined with anterior segment surgery. Retina. 32 (8), 1614-1623 (2012).
- Mahajan, V. B., et al. Sutureless triplanar sclerotomy for 23-gauge vitrectomy. Archives in Ophthalmology. 129 (5), 585-590 (2011).
- Mitchell, B. L., Yasui, Y., Li, C. I., Fitzpatrick, A. L., Lampe, P. D. Impact of freeze-thaw cycles and storage time on plasma samples used in mass spectrometry based biomarker discovery projects. Cancer Informatics. 1 (1), 98-104 (2005).
- Velez, G., et al. Proteomic insight into the pathogenesis of CAPN5-vitreoretinopathy. Science Reports. 9 (1), 7608 (2019).
- Montgomery, M. R., Hull, E. E. Alterations in the glycome after HDAC inhibition impact oncogenic potential in epigenetically plastic SW13 cells. BMC Cancer. 19 (1), 79 (2019).
- Okamoto, N., et al. Comparison of serum metabolomics pathways and patterns between patients with major depressive disorder with and without type 2 diabetes mellitus: An exploratory study. Journal of Integrated Neuroscience. 22 (1), 13 (2023).
- Pang, Z., et al. MetaboAnalyst 5.0: narrowing the gap between raw spectra and functional insights. Nucleic Acids Research. 49 (W1), W388-W396 (2021).
- Wolf, J., et al. The Human Eye Transcriptome Atlas: A searchable comparative transcriptome database for healthy and diseased human eye tissue. Genomics. 114 (2), 110286 (2022).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
- Wolf, J., et al. Comparative transcriptome analysis of human and murine choroidal neovascularization identifies fibroblast growth factor inducible-14 as phylogenetically conserved mediator of neovascular age-related macular degeneration. Biochimca et Biophysica Acta Molecular Basis of Diseases. 1868 (4), 166340 (2022).
- Dowden, H., Munro, J. Trends in clinical success rates and therapeutic focus. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (7), 495-496 (2019).
- Li, H. T., et al. Characterizing DNA methylation signatures of retinoblastoma using aqueous humor liquid biopsy. Nature Communication. 13 (1), 5523 (2022).
- Velez, G., et al. Personalized proteomics for precision health: identifying biomarkers of vitreoretinal disease. Translational Vision Science and Technology. 7 (5), 12 (2018).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Applications. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Rinsky, B., et al. Analysis of the aqueous humor proteome in patients with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 62 (10), 18 (2021).
