Summary
Denne protokollen presenterer en integrert biorepository-plattform for standardisert innsamling, merknad og biobanking av høykvalitets human vandig humor og glassaktige flytende biopsier for molekylære nedstrømsanalyser, inkludert proteomikk, metabolomikk og glykomikk.
Abstract
En kritisk utfordring i translasjonsforskning er å etablere et levedyktig og effektivt grensesnitt mellom pasientbehandling i operasjonssalen (OR) og forskningslaboratoriet. Her utviklet vi en protokoll for innhenting av flytende biopsier av høy kvalitet for molekylære analyser fra vannhumor og glasslegemet fra pasienter som gjennomgår øyekirurgi. I denne arbeidsflyten brukes en Mobile Operating Room Lab Interface (MORLI)-vogn utstyrt med en datamaskin, en strekkodeskanner og laboratorieinstrumenter, inkludert kjølelager ombord, til å innhente og arkivere humane biologiske prøver. En nettbasert database som er kompatibel med personvern gjør det mulig å kommentere hver prøve i løpet av levetiden, og et kartesisk koordinatsystem gjør det mulig å spore hvert strekkodede eksemplar som er lagret, noe som muliggjør rask og nøyaktig henting av prøver for nedstrømsanalyser. Molekylær karakterisering av humane vevsprøver tjener ikke bare som et diagnostisk verktøy (for eksempel for å skille mellom infeksiøs endoftalmitt og annen ikke-smittsom intraokulær betennelse), men representerer også en viktig komponent i translasjonsforskning, som gjør det mulig å identifisere nye legemiddelmål, utvikling av nye diagnostiske verktøy og personlig terapi.
Introduction
Molekylær profilering av flytende biopsier fra det menneskelige øye kan fange lokalt berikede væsker som inneholder molekyler som DNA, RNA, proteiner, glykaner og metabolitter fra høyt spesialiserte okulære vev. Flytende biopsier fra glasslegemet i det bakre kammer i det menneskelige øye viste seg å være en generelt sikker prosedyre1. De tillater molekylær karakterisering av okulære sykdommer hos levende mennesker og gir potensial til å identifisere nye diagnostiske og terapeutiske strategier 2,3,4. Den vandige humor i øyets fremre kammer har enda høyere kirurgisk tilgjengelighet og kan oppnås i stort antall, for eksempel under kataraktkirurgi, som er en av de hyppigst utførte operasjonene. Imidlertid er ingen standardisert protokoll for innsamling, merknad og biobanking av humant vandig humor og glasslegemebiopsier for molekylære nedstrømsanalyser, inkludert proteomikk, metabolomikk og glykomikk, tilgjengelig til nå.
Her utviklet vi en protokoll for innsamling og biobanking av flytende biopsier av høy kvalitet for molekylære analyser fra pasienter som gjennomgår øyekirurgi. Et Mobile Operating Room Lab Interface (MORLI) gjør det mulig for en forsker å umiddelbart snap-fryse de innsamlede prøvene i strekkodede kryovialer på tørris ved -80 °C i operasjonssalen (OR). Denne prosedyren sikrer en høy og konsistent prøvekvalitet for nedstrøms molekylær analyse. I tillegg til utmerket prøvekvalitet er nøyaktig annotering av prøver i en biobank kritisk. Ved hjelp av en nettbasert HIPAA (Health Insurance Portability and Accountability Act)-kompatibel REDCap (forskning elektronisk datafangst) database5, tillater vår arbeidsflyt lagring av detaljerte metadata for hver prøve, inkludert alder, kjønn, sykdom, sykdomsstadium, prøvetype, og unike egenskaper ved operasjonen. Dette vil muliggjøre nøyaktig fremtidig søkekapasitet, for eksempel for prøver fra en bestemt sykdom eller en bestemt gruppe pasienter. I tillegg arkiveres den nøyaktige plasseringen av hver prøve i fryseren ved hjelp av et kartesisk rutenettsystem, noe som muliggjør effektiv prøvehenting for nedstrøms eksperimenter. Vi viser eksempler på DNA-, protein-, glykan- og metabolittanalyser.
Vår arbeidsflyt representerer en praktisk og effektiv forbindelse mellom operasjonssalen og forskningslaboratoriet og gir et verdifullt grunnlag for translasjonsforskning.
Protocol
Protokollen følger retningslinjene til Institutional Review Board for Human Subjects Research (IRB) ved Stanford University, USA.
FORSIKTIG: Denne protokollen er en veiledning for kvalifiserte oftalmiske kirurger. I sammenheng med intraokulære maligniteter kan ekstraokulær tumorsåing i innstillingen av vandig humor eller glassaktige væskebiopsier ikke utelukkes. Imidlertid er risikoen for ekstraokulær forlengelse og orbital involvering ekstremt lav i transvitreal choroidal tumorbiopsi, som gjøres på sikkerhetsforbedret måte og med nøye vurdering av inngangsstedet6. Denne protokollen dekker ikke og kan være kontraindisert i tilfeller av retinoblastom eller svulster med høy metastatisk risiko.
1. Før prøveinnsamling
- Godkjenning av institusjonell nemnd
- Få godkjenninger fra den lokale IRB før starten av forsøket og utfør prøveinnsamling tilsvarende.
- Studiepopulasjon
- Inklusjonskriterier: Inkluder alle pasienter (i alderen 0 - 99 år) som gjennomgår intraokulær kirurgi ved institusjonen som vil gi en tilstrekkelig mengde kammervann eller glassvæske utover det som kreves for passende diagnostiske tester for å evaluere pasientens tilstand og pasienter som ønsker å delta.
- Eksklusjonskriterier: Ekskluder pasienter som takker nei til å delta og gravide.
- Informert samtykke
- Innhente skriftlig informert samtykke fra hver pasient etter den IRB-godkjente protokollen.
- Arkiver det signerte samtykket i en sikret database.
- Tog involvert personell (kirurger, laboratorieteknikere, operasjonsrom (OR) ansatte, forskere) som beskrevet i denne protokollen.
- Konfigurer et eksempel på behandling av database. Bruk RedCap som en HIPAA-kompatibel web-basert sample database som er utviklet for å støtte datafangst for forskningsstudier5.
MERK: Denne artikkelen beskriver bruken av web-basert grensesnitt levert av RedCap å utforme skjemaer, definere felt, sette opp forgrening logikk, og anvende data validering regler uten behov for omfattende programmering kunnskap. Alternativt kan annen programvare, for eksempel standard regnearkapplikasjoner, også være egnet. - Sørg for at det finnes en kjøleboks, tørris, sprøyte for prøvetaking og kryovialer (se Materialfortegnelse). Bruk kryovialer med strekkoder som er permanent etset på hetteglassene. Dette eliminerer behovet for å legge til pasientidentifikatorer på hetteglasset og muligheten for å miste en etikett under fryseforhold.
- Gi beskjed til kirurgen på saken og laboratorieteknikeren som vil hjelpe til med prøveinnsamlingen i OR minst 24 timer før den planlagte operasjonen.
2. Oppkjøp av kirurgiske prøver i operasjonen
- Mobilt grensesnitt for operasjonsrom (MORLI)
- Etablere en MORLI i operasjonssalen. MORLI inkluderer en flat lab benk overflate, en datamaskin / tablett med en strekkodeskanner med tilgang til RedCap databasen, og en kjøleboks med tørris (se Tabell over materialer).
FORSIKTIG: Tørris er ekstremt kaldt. Bruk alltid hansker når du håndterer tørris, og unngå å berøre den.
- Etablere en MORLI i operasjonssalen. MORLI inkluderer en flat lab benk overflate, en datamaskin / tablett med en strekkodeskanner med tilgang til RedCap databasen, og en kjøleboks med tørris (se Tabell over materialer).
- Forberedelse av prøvetaking i operasjonssalen
- Logg deg på datamaskinen / tablet på Morli og åpne RedCap databasen.
- Kontroller at informert samtykke er signert av pasienten og bekreft dette med kirurgen. Minn ham / henne på at en ufortynnet prøve er nødvendig.
- Bruk hansker. Oppnå riktig antall strekkodede kryovialer (0,5 ml for vandig humor og 1,9 ml for glassprøver) og plasser dem der de er lett tilgjengelige.
- Samling av vandige væskebiopsier
FORSIKTIG: Vurder menneskelige vevsprøver som biologisk farlig materiale, som krever passende forholdsregler som laboratoriefrakk og hansker for å sikre sikkerheten til det involverte personellet.
MERK: Følgende trinn skal kun utføres av en utdannet oftalmisk kirurg. Vandig humor flytende biopsier kan oppnås, for eksempel i begynnelsen av kataraktkirurgi, en av de hyppigste operasjonene over hele verden.
MERK: Et sterilt felt opprettholdes i henhold til standard for pleieprotokoller i operasjonen. Preoperative prosedyrer relatert til pasientanestesi følger standard behandlingstrinn for fremre kammer og vitreoretinale operasjoner.- Forbered og draper øyet for kirurgi og legg et sterilt lokkspekulum for optimal visualisering av det sterile feltet.
- Bruk et operasjonsmikroskop for å utføre en fremre kammerparasentese vinkelrett på limbus ved hjelp av en 30-32 G nål koblet til en 1 ml sprøyte. Bruk en bomullsspiss eller små tang for å stabilisere øyet under denne prosedyren.
MERK: Forsikre deg om at kanylen og sprøyten er låst og at det ikke er trykk i sprøyten (ved å bevege stempelet). Sørg for at spissen av nålen forblir over perifer iris i midten av fremre kammer for å unngå skade på intraokulære strukturer. Ved kataraktkirurgi kan nålen for å oppnå flytende biopsi også komme inn i fremre kammer via en av paracentesene som er opprettet for kataraktkirurgi. - Under direkte visualisering via mikroskopet, aspirer manuelt ca. 100 μL ufortynnet vandig humor ved hjelp av en 1 ml sprøyte. Beveg sprøytestempelet med kirurgens ikke-dominerende hånd eller av en erfaren assistent uten å bevege kanylen.
MERK: Oppnå mindre enn 100 μL vandig humor i tilfelle det fremre kammeret skulle kollapse. - Fjern forsiktig nålen fra det fremre kammeret.
MERK: I et phakic øye, hold nålen over iris for å unngå å berøre linsen. Positivt press på kloden kan øke refluksen. Å slippe bomullsspissen før nålen trekkes ut, bidrar til å redusere refluks. - Trekk stempelet tilbake og se hvordan luften og den oppsamlede væsken beveger seg.
- Injiser sprøyten i kryovialet. Den ekstra luften rydder sprøytens døde rom.
- Bruk strekkoden på cryovial å skanne prøven til RedCap skjemaet på en datamaskin i operasjonen (mer informasjon i trinn 3.1 til 3.9).
- Overfør straks kryovialet til tørris i kjøleboksen.
- Fortsett med operasjonen som er planlagt for pasienten (f.eks. en kataraktoperasjon som tidligere beskrevet7 ).
- Innsamling av flytende biopsier i glasslegemet
MERK: Følgende trinn skal kun utføres av en utdannet vitreoretinal kirurg. Glassaktige flytende biopsier kan oppnås i begynnelsen av en vitrektomi8. Siden målet er å samle en ufortynnet glassprøve, vil vitrektomikutteren ikke primes med væske1.
MERK: Et sterilt felt opprettholdes i henhold til standard for pleieprotokoller i operasjonen. Preoperative prosedyrer relatert til pasientanestesi følger standarden på omsorgstrinnene for fremre kammer og vitreoretinale operasjoner.- Forbered og draper øyet for kirurgi og legg et sterilt lokkspekulum for optimal visualisering av det sterile feltet.
- Lag sklerotomier med en 23-, 25- eller 27-G trokarkanyle, i henhold til standard pleieprosedyrer. Sett inn infusjonskanylen og bekreft visuelt riktig plassering i glasslegemet.
- I glasshulen, aktiver glasslegemet uten infusjon for å samle en ufortynnet glassprøve. Aspirer manuelt 0,5 til 1,0 ml glasslegeme ved hjelp av en sprøyte som er koblet til ekstruderingskanylen i glasslegemet1.
- Fjern glasslegemet fra øyet og slå på væskeinfusjonen.
- Aspirer den gjenværende væsken i slangen inn i sprøyten.
- Koble fra sprøyten.
- Behandle prøven som beskrevet for en vandig humorprøve i pkt. 2.3 (trinn 2.3.5 til trinn 2.3.9).
3. Behandling av prøver i OR og legge prøver til databasen
- Be laboratorieteknikeren om å ta det tilberedte kryovialet (0,5 ml for vandig humor og 1,9 ml for glasslegemeprøver) og gå til kirurgen uten å berøre sterilt OR-utstyr.
- Be laboratorieteknikeren om å åpne kryovialet.
- Slipp sprøyten direkte inn i kryovialet.
- Be laboratorieteknikeren om å umiddelbart oppsummere kryovialet.
- Be laboratorieteknikeren om å gå tilbake til MORLI og umiddelbart overføre prøven til tørris i kjøleboksen (-80 °C). Lukk lokket på esken.
- Åpne et nytt eksempelsamlingsskjema. Skriv inn følgende informasjon i det respektive feltet i skjemaet: sakskirurg, sted og dato for innsamling, pasientidentifikatornummer og annen grunnleggende informasjon, for eksempel alder, kjønn, høyre eller venstre øye, diagnose, preoperativ historie (fritekst), informasjon om prosedyren (f.eks. type operasjon), samt informasjon om prøvene, for eksempel antall prøver samlet, type prøver (vandig humor, glasslegeme) og andre detaljer som volumer. Legg til rørstrekkoden ved hjelp av strekkodeskanneren.
- Klikk på Send / Neste.
- Gjenta trinn 3.1 til 3.7 hvis det samles inn flere prøver.
- Når alle prøvene er sikret, klikker du Lagre og send på RedCap prøveinnsamling skjemaet. Logg deretter ut av databasen og datamaskinen/nettbrettet.
4. Overføre kryovialer til lagring
- Transporter prøvene på tørris i kjøleboksen fra operasjonssalen til laboratoriet og plasser dem på en laboratoriebenk ved siden av en laboratoriedatamaskin.
- Logg deg på RedCap på lab datamaskinen ved hjelp av påloggings-ID og passord.
- Bruk hansker. Ta en av de innsamlede prøvene og skann strekkoden til kryovialet inn i databasen (flere detaljer i avsnitt 5). Legg prøven umiddelbart tilbake på tørris.
- Få tak i en annen beholder fylt med tørris.
- Få tak i et stativ for kryovialene fra fryseren på -80 °C. Plasser den i den andre beholderen på tørris.
MERK: Et rack i 96-format vil være nødvendig for 0,5 ml vandige humorrør og et 48-format rack for 1,9 ml glassrør. - Skann strekkoden til racket til databasen (flere detaljer i avsnitt 5).
- Overfør prøven til stativet.
- Legg til plasseringen av hetteglassene i racket i databasen (flere detaljer i avsnitt 5).
- Klikk på Lagre og send.
- Transporter stativet med hetteglassene på tørris til kjøleskapet for oppbevaring ved -80 °C. Legg stativet til en bestemt posisjon i kjøleskapet ved hjelp av et koordinatsystem. Dette vil senere tillate å hente prøver for nedstrøms analyse enkelt.
5. Eksempel på lagringsskjema
- Fyll ut et lagringsskjema for hver prøve som samles inn i løpet av innmeldingsskjemafasen. Klikk på den tomme sirkelen eller "+" under Sample Storage for å opprette og åpne et nytt lagringsskjema.
- Skriv inn datoen da dette skjemaet er fylt ut, under Postarkivdato.
- Skann eller skriv inn rørstrekkoden under Specimen Tube Barcode. Legg prøven umiddelbart tilbake på tørris.
- Velg om en prøve skal flyttes ut eller om prøven skal inn i intern biodepotlagring.
- Kontroller at skriftlig informert samtykke ble innhentet fra pasienten, og merk av i boksen under Bekreft samtykkesamsvar og skriv inn navnet ditt under Samtykke bekreftet av.
- Velg et gratis og passende sted for cryovial i stativet. Overfør kryovialet i denne posisjonen til stativet (f.eks. posisjon A1). Hold stativet på tørris.
- I plasseringsfasen angir du følgende informasjon: plasseringen av fryseren under Fryser, hyllenummeret der prøven skal lagres under Hylle, strekkoden i boksen under Strekkodeboks, rørposisjonen i boksen etter rad (Tube Position (Row)) og kolonnen (Tube Position (Column)).
MERK: Eventuelt kan en boksetikett også legges inn under Box Label, noe som kan gjøre det lettere å finne boksen i fryseren. - Under Bruk-delen angir du følgende informasjon: navnet på prosjektet som eksemplet brukes til (prosjektnavn), prøvevolumet i en av følgende kategorier: fullstendig, delvis, nesten tom eller tom (prøvevolum) og lagringsnotater hvis aktuelt under lagringsnotater.
MERK: Datoen, klokkeslettet og brukeren som sist åpnet skjemaet, fylles ut automatisk for å sikre en kjede av forvaring som kan gjennomgås og revideres etter behov. - Bekreft at skjemaet er fylt ut ved å klikke Fyll ut under Fullført?.
- Klikk Lagre &; Avslutt skjema. Dette vil bringe deg tilbake til pasientoversikten.
- For hvert rør som ble samlet inn, generer du et nytt prøveinnsamlingsskjema ved å klikke på "+" under Prøvelagring. Gjenta deretter trinn 5.1 til 5.10.
- Klikk Lagre og avslutt for å fylle ut skjemaet og logge ut av databasen og datamaskinen/nettbrettet.
- Overfør prøvestativet (på tørris) til kjøleskapet på forhåndsspesifisert posisjon.
6. Henting av kirurgiske prøver for nedstrømsanalyse
MERK: Prøver blir ofte arkivert i flere år før de analyseres. Den strekkodede cryovials og søkbare RedCap database system tillater å finne og lokalisere hver prøve enkelt for nedstrøms analyse.
- Identifiser eksempler av interesse for eksperimentet ved hjelp av søkefunksjonen i databasen. Dette vil tillate å finne for eksempel alle vandige humorprøver fra pasienter mellom 20 og 40 år med diabetisk retinopati.
- Få plasseringen av kryovialene av interesse (fryser, hylle / rack, prøvestativ, koordinater i stativet). Skriv dem ned, skriv dem ut eller ha dem tilgjengelig på en mobil datamaskin/nettbrett for å lette funnet prøvene i fryseren.
- Merk eksemplene som brukt i databasen.
- Klikk Lagre og Avslutt for å fylle ut skjemaet og logge ut av RedCap og datamaskinen / nettbrettet.
Representative Results
De innsamlede flytende biopsiprøvene kan bli utsatt for en rekke molekylære analyser, inkludert analyse av DNA, proteiner, glykaner og metabolitter. Det er tidligere vist at langtidslagring over flere år ved -70 °C ikke påvirket integriteten til den proteomiske profilen9 signifikant. Den RedCap databasen muliggjør enkel og rask gjenfinning av prøver. Databasen kan søkes etter prøver fra en bestemt pasientgruppe, for eksempel alle pasienter med diabetisk retinopati. Databasen vil da gi strekkodene til rørene og posisjonene som er lagret. Til nå har vi samlet inn og arkivert mer enn 1000 flytende biopsier. Databasen tillot oss raskt å finne prøvene for nedstrøms analyser 3,10 og bidro til å utføre følgende eksperimenter.
En 17 år gammel kvinne presenterte retinal og optisk nervebetennelse. Hun var immunsupprimert, og det var bekymring for infeksjon. Vandig humor ble hentet fra høyre øye og sendt til DNA-PCR-analyse. Resultatene var positive for cytomegalovirus og negative for Herpes simplex-virus og toksoplasmose. Disse funnene illustrerer at vandige væskebiopsier kan bidra til å skille smittsomme fra ikke-smittsomme former for intraokulær betennelse, noe som er avgjørende for å velge riktig terapi.
Væskekromatografi-massespektrometri muliggjør en objektiv og semi-kvantitativ analyse av proteomet. I en flytende biopsi fra glasslegemet til en pasient som gjennomgikk vitrektomi, var teknikken i stand til å identifisere 484 unike proteiner, inkludert komplement C3 (C3), optikkin (OPTC) og kollagen type II alfa 1 (COL2A1) (figur 1A).
Tre glassaktige flytende biopsier ble analysert ved hjelp av en glykoproteomikk multiplex ELISA (se materialtabell)11. Analysen oppdaget glykosyleringsprofilene til 500 humane proteiner, og fanget en rekke biologiske veier, for eksempel metabolisme, immunrespons, celleadhesjon og aktinorganisasjon (figur 1B).
En metabolomics skjerm ved hjelp av kapillær elektroforese kombinert med Fourier transformert massespektrometri12 (se tabell over materialer) identifiserte 292 forskjellige metabolitter i tre vandige humor flytende biopsiprøver. En veianalyse (se materialtabell)13 identifiserte en rekke metabolske veier, inkludert aminosyremetabolisme, ureasyklus og karnitinsyntese (figur 1C).
Figur 1: Representative resultater . (A) Proteomikkanalyse av human glassaktig humor ved bruk av væskekromatografi og tandemmassespektrometri (LC-MS / MS) identifiserte 484 unike proteiner i en enkelt flytende biopsi. Proteinnivåer vises og rangeres basert på spektrale tellinger. Representative proteiner er uthevet i blått. (B) En glykoproteomikk multiplex ELISA påviste glykosyleringsnivåer på 500 unike proteiner i tre glassaktige flytende biopsier. En STRING-proteininteraksjonsanalyse identifiserte klynger av proteininteraksjoner (klynger med minst 10 proteiner er vist). Den mest signifikant berikede banen er vist for hver klynge. (C) Metabolomics analyse ved hjelp av massespektrometri identifiserte 292 forskjellige metabolitter i tre vandige humor flytende biopsier. Hvert punkt representerer ett utvalg. Barens høyde tilsvarer gjennomsnittlig antall metabolitter, feillinjen representerer standardavviket. Det høyre panelet viser betydelig berikede veier. Antall påviste metabolitter (teller) samt totalt antall metabolitter i hver vei (nevner) er vist. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Kirurgiske prøver fra pasienter tillater direkte molekylær karakterisering av sykdom hos levende mennesker 2,3,4,14, og kan bidra til å overvinne begrensningene i celle- og dyresykdomsmodeller som ikke fullt ut rekapitulerer menneskelig sykdom 15,16. Molekylær analyse av humant vev kan forbedre utvelgelsen av nye legemiddelmål og kan bidra til en høyere suksessrate for kliniske studier og legemiddelgodkjenning17. I tillegg gir denne tilnærmingen potensialet for personlig medisin, da det oppnådde vevet beholder det unike genomiske, epigenomiske, metabolomiske, glykomiske og proteomiske fingeravtrykket til hver enkeltperson 2,18,19.
Høy og konsistent prøvekvalitet er grunnleggende for alle molekylære analyseapplikasjoner. Tidligere studier har vist at umiddelbar frysing etter prøveuthenting og unngåelse av gjentatte fryse-/tinesykluser er kritisk for høy prøvekvalitet 9,20. Langtidslagring over flere år ved -70 °C påvirket ikke integriteten til den proteomiske profilen9 signifikant. En standardisert protokoll er et viktig grunnlag for å redusere skjevhet og forbedre sammenlignbarheten av vitenskapelige data, spesielt når flere personer (kirurger, teknikere og andre) eller forskjellige institusjoner er involvert i prøvetakingsprosessen. Bortsett fra prøvekvaliteten er annotering av prøver en annen viktig faktor som krever standardisering for å tillate korrelasjon av molekylære funn med kliniske data. Vår protokoll er avhengig av tre viktige prinsipper for å oppnå dette: 1) en standardisert prøvetakingsprosedyre for vandig humor og glassaktige flytende biopsier av en oftalmisk kirurg, 2) umiddelbar behandling og snap-frysing av prøver i OR av laboratoriepersonell, og 3) en metadatamerknad av hver prøve i en nettbasert database som gjør det mulig for forskere å raskt finne prøver for senere eksperimenter.
I tillegg til glasslegemeprøver20, etablerer denne arbeidsflyten også den standardiserte samlingen av vandige væskebiopsier for molekylær analyse. Den vandige humor er en svært tilgjengelig, kompleks væske i øyets fremre kammer som ikke bare reflekterer okulære sykdommer i det fremre, men også av det bakre segmentet av øyet, inkludert retinal sykdom18,21. Sammen med det faktum at et høyt antall vandige humorprøver kan samles inn, for eksempel under kataraktkirurgi, en av de hyppigst utførte operasjonene over hele verden, gjør disse funksjonene det til en interessant kilde for flytende biopsier fra det menneskelige øye. Den standardiserte metadataannotasjonen for hver prøve som er etablert i denne arbeidsflyten, kan også tillate korrelasjon av proteomdata med prospektive kliniske oppfølgingsdata. Dette gir spennende mulighet til å identifisere nye prognostiske biomarkører som kan bidra til å estimere prognosen for fremtidige pasienter.
Imidlertid har molekylær analyse av humane kirurgiske prøver også viktige begrensninger. For eksempel er komplekse eksperimentelle manipulasjoner ofte bare mulige i dyre- og cellemodeller. En løsning kan være å sammenligne den molekylære profilen til dyre- eller cellemodeller med den menneskelige sykdommen. Denne strategien kan identifisere overlappende proteinbiomarkører og terapeutiske mål som kan valideres i dyr eller cellemodeller for å identifisere de mest lovende kandidatene som korrelerer med menneskelig sykdom og sannsynligvis vil lykkes i kliniske studier 4,16.
Avslutningsvis etablerer arbeidsflyten vårt et praktisk grensesnitt mellom OR og forskningslaboratoriet som tillater standardisert innsamling, merknad og lagring av kirurgiske prøver av høy kvalitet for molekylær nedstrømsanalyse, noe som gir et verdifullt grunnlag for fremtidig translasjonsforskning.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
VBM støttes av NIH-tilskudd (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 og P30EY026877), Stanford Center for Optic Disc Drusen, og Research to Prevent Blindness, New York, USA. JW og DR støttes av VitreoRetinal Surgery Foundation, USA. DR er støttet av DARE Fellowship, som er sponset av Lundbeck Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 68-0703-12 | used for aqueous humor samples |
| 1 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | - | for aqueous humor biopsies |
| 1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-7643 | used for vitreous samples |
| 3 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | - | for vitreous biopsies |
| 30-32-gauge needle | surgical grade, whatever available in hospital | - | for aqueous humor biopsies |
| Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS) | Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan | - | - |
| Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system | Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA | - | for vitreous biopsies |
| Cooling box | Standard styrofoam box, whatever available in lab | - | - |
| Dry ice | Whatever available in lab | - | - |
| Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable | Zebra Symbol | DS9208-SR4NNU21Z | Barcode scanner |
| Human Glycosylation Antibody Array L3 | RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA | GAH-GCM-L3 | - |
| Mac mini | Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA | - | - |
| MetaboAnalyst software | Pang et al., 2021, PMID: 34019663 | - | - |
| Rack for 0.5ml tubes, 96-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 66-51026 | for aqueous humor samples |
| Rack for 1.9ml tubes, 48-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-9451 | for vitreous samples |
| REDCap browser-based sample database | REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org | - | - |
References
- Mishra, K., et al. Intraoperative complications with vitreous biopsy for molecular proteomics. Ophthalmic Surgeries, Lasers Imaging Retina. 54 (1), 32-36 (2023).
- Velez, G., Bassuk, A. G., Colgan, D., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Therapeutic drug repositioning using personalized proteomics of liquid biopsies. JCI Insight. 2 (24), (2017).
- Velez, G., et al. Liquid biopsy proteomics of uveal melanoma reveals biomarkers associated with metastatic risk. Molecular Cancer. 20 (1), 39 (2021).
- Wert, K. J., et al. Metabolite therapy guided by liquid biopsy proteomics delays retinal neurodegeneration. EBioMedicine. 52, 102636 (2020).
- Harris, P. A., et al. The REDCap consortium: Building an international community of software platform partners. Journal of Biomedical Informatics. 95, 103208 (2019).
- Finn, A. P., Materin, M. A., Mruthyunjaya, P. Choroidal tumor biopsy: A review of the current state and a glance into future techniques. Retina. 38 Suppl 1, S79-S87 (2018).
- Tarantola, R. M., Graff, J. M., Somani, R., Mahajan, V. B. Temporal approach for small-gauge pars plana vitrectomy combined with anterior segment surgery. Retina. 32 (8), 1614-1623 (2012).
- Mahajan, V. B., et al. Sutureless triplanar sclerotomy for 23-gauge vitrectomy. Archives in Ophthalmology. 129 (5), 585-590 (2011).
- Mitchell, B. L., Yasui, Y., Li, C. I., Fitzpatrick, A. L., Lampe, P. D. Impact of freeze-thaw cycles and storage time on plasma samples used in mass spectrometry based biomarker discovery projects. Cancer Informatics. 1 (1), 98-104 (2005).
- Velez, G., et al. Proteomic insight into the pathogenesis of CAPN5-vitreoretinopathy. Science Reports. 9 (1), 7608 (2019).
- Montgomery, M. R., Hull, E. E. Alterations in the glycome after HDAC inhibition impact oncogenic potential in epigenetically plastic SW13 cells. BMC Cancer. 19 (1), 79 (2019).
- Okamoto, N., et al. Comparison of serum metabolomics pathways and patterns between patients with major depressive disorder with and without type 2 diabetes mellitus: An exploratory study. Journal of Integrated Neuroscience. 22 (1), 13 (2023).
- Pang, Z., et al. MetaboAnalyst 5.0: narrowing the gap between raw spectra and functional insights. Nucleic Acids Research. 49 (W1), W388-W396 (2021).
- Wolf, J., et al. The Human Eye Transcriptome Atlas: A searchable comparative transcriptome database for healthy and diseased human eye tissue. Genomics. 114 (2), 110286 (2022).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
- Wolf, J., et al. Comparative transcriptome analysis of human and murine choroidal neovascularization identifies fibroblast growth factor inducible-14 as phylogenetically conserved mediator of neovascular age-related macular degeneration. Biochimca et Biophysica Acta Molecular Basis of Diseases. 1868 (4), 166340 (2022).
- Dowden, H., Munro, J. Trends in clinical success rates and therapeutic focus. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (7), 495-496 (2019).
- Li, H. T., et al. Characterizing DNA methylation signatures of retinoblastoma using aqueous humor liquid biopsy. Nature Communication. 13 (1), 5523 (2022).
- Velez, G., et al. Personalized proteomics for precision health: identifying biomarkers of vitreoretinal disease. Translational Vision Science and Technology. 7 (5), 12 (2018).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Applications. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Rinsky, B., et al. Analysis of the aqueous humor proteome in patients with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 62 (10), 18 (2021).
