Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ביובנק של ביופסיות נוזליות מימיות וזגוגיות אנושיות לאנליזות מולקולריות

Published: September 11, 2023 doi: 10.3791/65804
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 2, 2, 2, 3,4, 5,6,7, 8,9, 2, 1,2,10
1Molecular Surgery Laboratory, Stanford University, 2Department of Ophthalmology, Byers Eye Institute, Stanford University, 3Department of Ophthalmology and Visual Neurosciences, University of Minnesota, 4Retina Consultants of Minnesota, 5Department of Pediatrics, University of Iowa, 6Department of Neurology, University of Iowa, 7The Iowa Neuroscience Institute (INI), University of Iowa, 8Department of Physiology and Pharmacology, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 9Department of Biochemistry and Molecular Biology, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 10Veterans Affairs Palo Alto Health Care System

Summary

פרוטוקול זה מציג פלטפורמה משולבת של מאגר ביולוגי לאיסוף, ביאור וביו-בנקאות סטנדרטיים של הומור מימי אנושי באיכות גבוהה וביופסיות נוזליות בזגוגית עבור אנליזות מולקולריות במורד הזרם, כולל פרוטאומיקה, מטבולומיקה וגליקומיקה.

Abstract

אתגר קריטי במחקר תרגומי הוא יצירת ממשק בר-קיימא ויעיל בין הטיפול בחולה בחדר הניתוח (OR) לבין מעבדת המחקר. כאן פיתחנו פרוטוקול לרכישת ביופסיות נוזליות איכותיות לאנליזות מולקולריות מההומור המימי והזגוגית מחולים שעברו ניתוחי עיניים. בתהליך עבודה זה, עגלת ממשק מעבדת חדר ניתוח נייד (MORLI) המצוידת במחשב, סורק ברקוד וכלי מעבדה, כולל אחסון קר מובנה, משמשת להשגת דגימות ביולוגיות אנושיות ולארכיונן. מסד נתונים מבוסס אינטרנט התואם לפרטיות נתונים מאפשר להוסיף הערות לכל דגימה לאורך חייה, ומערכת קואורדינטות קרטזית מאפשרת מעקב אחר כל דגימה ברקודית באחסון, ומאפשרת אחזור מהיר ומדויק של דגימות לצורך ניתוח במורד הזרם. אפיון מולקולרי של דגימות רקמה אנושית משמש לא רק ככלי אבחוני (למשל, להבחין בין אנדופתלמיטיס זיהומיות לבין דלקות תוך עיניות אחרות שאינן זיהומיות), אלא גם מהווה מרכיב חשוב במחקר תרגומי, המאפשר זיהוי מטרות תרופתיות חדשות, פיתוח כלי אבחון חדשים וטיפולים מותאמים אישית.

Introduction

פרופיל מולקולרי של ביופסיות נוזליות מהעין האנושית יכול ללכוד נוזלים מועשרים מקומית המכילים מולקולות כגון DNA, RNA, חלבונים, גליקנים ומטבוליטים מרקמות עיניים מיוחדות מאוד. ביופסיות נוזליות מהזגוגית בחדר האחורי של העין האנושית הוכיחו את עצמן כהליך בטוח בדרך כלל1. הם מאפשרים אפיון מולקולרי של מחלות עיניים בבני אדם חיים ומציעים את הפוטנציאל לזהות אסטרטגיות אבחון וטיפול חדשניות 2,3,4. ההומור המימי בחדר הקדמי של העין הוא בעל נגישות ניתוחית גבוהה עוד יותר וניתן להשיגו במספרים גדולים, למשל במהלך ניתוח קטרקט, שהוא אחד הניתוחים המבוצעים בתדירות הגבוהה ביותר. עם זאת, אין פרוטוקול סטנדרטי לאיסוף, ביאור וביו-בנקאות של הומור מימי אנושי וביופסיות נוזליות בזגוגית עבור אנליזות מולקולריות במורד הזרם, כולל פרוטאומיקה, מטבולומיקה וגליקומיקה, זמין עד כה.

כאן, פיתחנו פרוטוקול לאיסוף וביו-בנקאות של ביופסיות נוזליות באיכות גבוהה לאנליזות מולקולריות מחולים שעברו ניתוחי עיניים. ממשק מעבדת חדר ניתוח נייד (MORLI) מאפשר לחוקר להקפיא באופן מיידי את הדגימות שנאספו בקריובלים ברקודים על קרח יבש בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס בחדר הניתוח (OR). הליך זה מבטיח איכות דגימה גבוהה ועקבית לאנליזה מולקולרית במורד הזרם. בנוסף לאיכות הדגימה המצוינת, ביאור מדויק של דגימות בביובנק הוא קריטי. באמצעות מסד נתונים מבוסס אינטרנט של HIPAA (Health Insurance Portability and Accountability Act) תואם REDCap (לכידת נתונים אלקטרונית מחקרית)5, זרימת העבודה שלנו מאפשרת אחסון של מטה-נתונים מפורטים עבור כל דגימה, כולל גיל, מין, מחלה, שלב המחלה, סוג הדגימה ותכונות ייחודיות של הניתוח. זה יאפשר יכולת חיפוש עתידית מדויקת, למשל, עבור דגימות ממחלה מסוימת או קבוצה מסוימת של חולים. בנוסף, המיקום המדויק של כל דגימה במקפיא נשמר בארכיון באמצעות מערכת רשת קרטזית, המאפשרת שליפת דגימות יעילה לניסויים במורד הזרם. אנו מציגים דוגמאות של ניתוחי דנ"א, חלבון, גליקן ומטבוליטים.

זרימת העבודה שלנו מייצגת קשר מעשי ויעיל בין OR לבין מעבדת המחקר ומספקת בסיס רב ערך למחקר תרגומי.

Protocol

הפרוטוקול עוקב אחר הנחיות מועצת הביקורת המוסדית לחקר נושאים אנושיים (IRB) באוניברסיטת סטנפורד, ארה"ב.

זהירות: פרוטוקול זה הוא מדריך למנתחי עיניים מוסמכים. בהקשר של ממאירויות תוך עיניות, לא ניתן לשלול זריעת גידול חוץ-עיני במסגרת הומור מימי או ביופסיות נוזליות בזגוגית. עם זאת, הסיכון להארכה חוץ-עינית ומעורבות אורביטלית נמוך ביותר בביופסיית גידול כורואידי טרנסוויטריאלי, הנעשית באופן בטיחותי משופר ותוך התחשבות זהירה באתר הכניסה6. פרוטוקול זה אינו מכסה ועשוי להיות התווית במקרים של רטינובלסטומה או גידולים עם סיכון גרורתי גבוה.

1. לפני איסוף הדגימות

  1. אישור ועדת ביקורת מוסדית
    1. השג את האישורים מה- IRB המקומי לפני תחילת הניסוי ובצע איסוף דגימות בהתאם.
  2. אוכלוסיית המחקר
    1. קריטריוני הכללה: כלול את כל המטופלים (בגילאי 0 - 99 שנים) העוברים ניתוח תוך עיני במוסד שיספק כמות מספקת של הומור מימי או נוזל זגוגית מעבר לזו הנדרשת לבדיקות אבחון מתאימות להערכת מצבו של המטופל וחולים המעוניינים להשתתף.
    2. קריטריוני החרגה: לא לכלול מטופלים המסרבים להשתתף ונשים בהריון.

  1. הסכמה מדעת
    1. קבל הסכמה מדעת בכתב מכל מטופל בהתאם לפרוטוקול המאושר IRB.
    2. אחסן את ההסכמה החתומה בארכיון במסד נתונים מאובטח.
    3. הרכבת כללה כוח אדם (מנתחים, טכנאי מעבדה, צוות חדר ניתוח (OR), מדענים) כמתואר בפרוטוקול זה.
    4. הגדר מסד נתונים לניהול לדוגמה. השתמש ב- REDCap כמסד נתונים לדוגמה מבוסס אינטרנט תואם HIPAA המיועד לתמוך בלכידת נתונים עבור מחקרים5.
      הערה: מאמר זה מתאר את השימוש בממשק מבוסס האינטרנט שסופק על-ידי REDCap כדי לעצב טפסים, להגדיר שדות, להגדיר לוגיקת הסתעפות ולהחיל כללי אימות נתונים ללא צורך בידע נרחב בתיכנות. לחלופין, תוכנות אחרות, כגון יישומי גיליון אלקטרוני סטנדרטיים, עשויות גם הן להתאים.
    5. ודא את זמינותם של קופסת קירור, קרח יבש, מזרק לאיסוף דגימות וקריביאלים (ראה טבלת חומרים). השתמש cryovials עם ברקודים כי הם חרוטים לצמיתות על בקבוקונים. זה מבטל את הצורך להוסיף מזהי מטופל על הבקבוקון ואת האפשרות לאבד תווית בתנאי הקפאה.
    6. הודע למנתח על המקרה ולטכנאי המעבדה שיעזור באיסוף הדגימות לפחות 24 שעות לפני הניתוח המתוכנן.

2. רכישת דגימות כירורגיות בחדר ניתוח

  1. ממשק מעבדה ניידת לחדר ניתוח (MORLI)
    1. להקים MORLI בחדר הניתוח. MORLI כולל משטח ספסל מעבדה שטוח, מחשב/טאבלט עם סורק ברקוד עם גישה למסד הנתונים REDCap, וקופסת קירור עם קרח יבש (ראו טבלת חומרים).
      אזהרה: קרח יבש הוא קר מאוד. יש ללבוש תמיד כפפות בעת טיפול בקרח יבש, ולהימנע מלגעת בו.
  2. הכנת איסוף דגימות בחדר המיון
    1. היכנס למחשב/טאבלט ב- MORLI ופתח את מסד הנתונים REDCap.
    2. יש לבדוק כי נחתמה הסכמה מדעת על ידי המטופל ולאשר זאת עם המנתח. הזכירו לו שנדרשת דגימה לא מדוללת.
    3. יש ללבוש כפפות. השג את המספר המתאים של קריובלים ברקודיים (0.5 מ"ל עבור הומור מימי ו -1.9 מ"ל עבור דגימות זגוגית) ומקם אותם במקום שבו הם נגישים בקלות.
  3. אוסף ביופסיות נוזליות של הומור מימי
    זהירות: יש להתייחס לדגימות רקמה אנושית כאל חומר מסוכן ביולוגית, הדורש אמצעי זהירות מתאימים כגון מעיל מעבדה וכפפות כדי להבטיח את שלומם של אנשי הצוות המעורבים.
    הערה: השלבים הבאים צריכים להתבצע רק על ידי מנתח עיניים מיומן. ביופסיות נוזליות של הומור מימי ניתן להשיג, למשל, בתחילת ניתוח קטרקט, אחד הניתוחים השכיחים ביותר בעולם.
    הערה: שדה סטרילי נשמר על פי פרוטוקולי הטיפול הסטנדרטיים בחדר הניתוח. הליכים טרום ניתוחיים הקשורים להרדמת המטופל עוקבים אחר שלבי הטיפול הסטנדרטיים עבור ניתוחי חדר קדמי וזגוגית.
    1. הכינו ועטפו את העין לניתוח והניחו ספקולום עפעף סטרילי להדמיה אופטימלית של השדה הסטרילי.
    2. השתמש במיקרוסקופ הפעלה כדי לבצע paracentesis החדר הקדמי בניצב ללימבוס באמצעות מחט 30-32 G מחובר מזרק 1 מ"ל. השתמש קצה כותנה או מלקחיים קטנים כדי לייצב את העין במהלך הליך זה.
      הערה: ודא שהמחט והמזרק נעולים ושאין לחץ במזרק (על ידי הזזת הבוכנה). ודא כי קצה המחט נשאר מעל הקשתית ההיקפית בחדר הקדמי האמצעי כדי למנוע נזק למבנים תוך עיניים. במקרה של ניתוח קטרקט, המחט לקבלת הביופסיה הנוזלית יכולה להיכנס גם לחדר הקדמי דרך אחד הפרסנטים שנוצרו עבור ניתוח הקטרקט.
    3. תחת הדמיה ישירה באמצעות המיקרוסקופ, לשאוף ידנית כ 100 μL של הומור מימי לא מדולל באמצעות מזרק 1 מ"ל. הזיזו את בוכנת המזרק ביד הלא דומיננטית של המנתח או על ידי עוזר מיומן מבלי להזיז את המחט.
      הערה: יש להשיג פחות מ-100 μL של הומור מימי למקרה שהחדר הקדמי יקרוס.
    4. בזהירות להסיר את המחט מן החדר הקדמי.
      הערה: בעין פאקית, שמור את המחט מעל הקשתית כדי למנוע נגיעה בעדשה. לחץ חיובי על כדור הארץ יכול להגביר ריפלוקס. שחרור קצה הכותנה לפני משיכת המחט עוזר להפחית ריפלוקס.
    5. משכו לאחור את הבוכנה וראו כיצד האוויר והנוזל שנאסף נעים.
    6. להזריק את המזרק לתוך cryovial. תוספת האוויר מפנה את החלל המת של המזרק.
    7. השתמש בברקוד על ההקפאה כדי לסרוק את הדגימה לטופס REDCap במחשב בחדר הניתוח (פרטים נוספים בשלבים 3.1 עד 3.9).
    8. העבירו מיד את הקריוביאל לקרח יבש בקופסת הקירור.
    9. המשך עם הניתוח המתוכנן למטופל (למשל, ניתוח קטרקט כמתואר לעיל7 ).
  4. אוסף ביופסיות נוזליות בזגוגית
    הערה: השלבים הבאים צריכים להתבצע רק על ידי מנתח זגוגית מיומן. ביופסיות נוזליות בזגוגית ניתן לקבל בתחילת ויטרקטומיה8. מכיוון שהמטרה היא לאסוף דגימת זגוגית לא מדוללת, חותך הוויטרקטומיה לא יהיה דרוך עם נוזל1.
    הערה: שדה סטרילי נשמר על פי פרוטוקולי הטיפול הסטנדרטיים בחדר הניתוח. הליכים טרום ניתוחיים הקשורים להרדמת המטופל עוקבים אחר שלבי הטיפול הסטנדרטיים בניתוחי חדר קדמי וזגוגית.
    1. הכינו ועטפו את העין לניתוח והניחו ספקולום עפעף סטרילי להדמיה אופטימלית של השדה הסטרילי.
    2. צור סקלרוטומיות עם צינורית טרוקאר 23, 25 או 27-G, בהתאם לנהלי הטיפול הסטנדרטיים. הכנס את צינורית העירוי ולאשר חזותית את המיקום המתאים בחלל הזגוגית.
    3. בחלל הזגוגית, הפעל את חותך הזגוגית ללא עירוי כדי לאסוף דגימת זגוגית לא מדוללת. שאפו ידנית 0.5 עד 1.0 מ"ל של זגוגית באמצעות מזרק המחובר לצינורית שחול הזגוגית1.
    4. הסר את חותך הזגוגית מהעין והפעל את עירוי הנוזלים.
    5. שאפו את הנוזל שנותר בתוך הצינור לתוך המזרק.
    6. נתקו את המזרק.
    7. עבד את הדגימה כמתואר עבור דגימת הומור מימי בסעיף 2.3 (שלב 2.3.5 עד שלב 2.3.9).

3. עיבוד דגימות בחדר המיון והוספת דגימות למאגר

  1. בקשו מטכנאי המעבדה לקחת את הקריוביאל המוכן (0.5 מ"ל להומור מימי ו-1.9 מ"ל לדגימות זגוגית) וללכת למנתח מבלי לגעת בציוד או סטרילי כלשהו.
  2. בקש מטכנאי המעבדה לפתוח את הקריוביאלי.
  3. לפרוק את המזרק ישירות לתוך cryovial.
  4. בקש מטכנאי המעבדה לסכם מיד את ההקפאה.
  5. בקשו מטכנאי המעבדה לחזור ל-MORLI ולהעביר מיד את הדגימה לקרח יבש בקופסת הקירור (-80°C). סגור את מכסה הקופסה.
  6. פתח טופס אוסף דוגמאות חדש. הזן את המידע הבא בשדה המתאים של הטופס: מנתח מקרה, מיקום ותאריך האיסוף, מספר מזהה המטופל ומידע בסיסי אחר, כגון גיל, מין, עין ימין או שמאל, אבחון, היסטוריה לפני הניתוח (טקסט חופשי), מידע על ההליך (למשל, סוג הניתוח), כמו גם מידע על הדגימות, כגון מספר הדגימות שנאספו, סוג הדגימות (הומור מימי, זגוגית), ופרטים אחרים כגון כרכים. הוסף את ברקוד הצינור באמצעות סורק הברקוד.
  7. לחץ על שלח/הבא.
  8. חזור על שלבים 3.1 עד 3.7 אם נאספות דגימות נוספות.
  9. כאשר כל הדגימות מאובטחות, לחץ על שמור ושלח בטופס איסוף הדוגמאות של REDCap. לאחר מכן התנתק ממסד הנתונים ומהמחשב/טאבלט.

4. העברת קריובלים לאחסון

  1. העבירו את הדגימות על קרח יבש בקופסת הקירור מחדר הניתוח למעבדה והניחו אותן על ספסל מעבדה ליד מחשב מעבדה.
  2. היכנס ל- REDCap במחשב המעבדה באמצעות מזהה הכניסה והסיסמה שלך.
  3. יש ללבוש כפפות. קח את אחת הדגימות שנאספו וסרוק את הברקוד של הקריוביאל לתוך מסד הנתונים (פרטים נוספים בסעיף 5). מיד להחזיר את הדגימה על קרח יבש.
  4. השג מיכל שני מלא קרח יבש.
  5. השג מדף עבור cryovials מהמקפיא -80 °C. מניחים אותו במיכל השני על קרח יבש.
    הערה: יהיה צורך בארון תקשורת בפורמט 96 עבור צינורות הומור מימי בנפח 0.5 מ"ל ובארון תקשורת בפורמט 48 עבור צינורות הזגוגית בנפח 1.9 מ"ל.
  6. סרוק את הברקוד של ארון התקשורת למסד הנתונים (פרטים נוספים בסעיף 5).
  7. העבר את הדגימה לארון התקשורת.
  8. הוסף את מיקום הבקבוקונים בארון התקשורת למסד הנתונים (פרטים נוספים בסעיף 5).
  9. לחץ על שמור ושלח.
  10. העבירו את המדף עם הבקבוקונים על קרח יבש למקרר לאחסון בטמפרטורה של -80°C. הוסיפו את המדף למיקום מסוים במקרר באמצעות מערכת קואורדינטות. זה יאפשר מאוחר יותר לאחזר דגימות לניתוח במורד הזרם בקלות.

5. טופס אחסון לדוגמה

  1. מלא טופס אחסון עבור כל דגימה שנאספת במהלך שלב טופס הכניסה. לחץ על העיגול הריק או על "+" תחת אחסון לדוגמה כדי ליצור ולפתוח טופס אחסון חדש.
  2. הזן את התאריך שבו טופס זה הושלם תחת תאריך ארכיון רשומה.
  3. סרוק או הקלד את ברקוד הצינור תחת ברקוד צינור הדגימה. מיד להחזיר את הדגימה על קרח יבש.
  4. בחר אם דגימה מועברת החוצה או אם הדגימה עוברת לאחסון ביולוגי פנימי.
  5. ודא שהתקבלה הסכמה מדעת בכתב מהמטופל ובחר בתיבה תחת אמת תאימות הסכמה והזן את שמך תחת הסכמה שאומתה על-ידי.
  6. בחר מיקום פנוי ומתאים עבור הקריוביאל בארון התקשורת. העבר את הקריוביאל במיקום זה למדף (לדוגמה, מיקום A1). יש לשמור את המדף על קרח יבש.
  7. בשלב מיקום, הזן את המידע הבא: מיקום המקפיא תחת מקפיא, מספר המדף שבו תישמר הדגימה תחת מדף, ברקוד הקופסה תחת ברקוד תיבה, מיקום הצינור בתיבה לפי שורה (מיקום צינור (שורה)) ועמודה (מיקום צינור (עמודה)).
    הערה: לחלופין, ניתן להזין תווית קופסה גם תחת תווית תיבה, מה שעשוי להקל על מציאת הקופסה במקפיא.
  8. תחת המקטע שימוש , הזן את המידע הבא: שם הפרוייקט שעבורו משמשת הדגימה (שם פרוייקט), אמצעי האחסון של הדגימה באחת מהקטגוריות הבאות: מלא, חלקי, כמעט ריק או ריק (אמצעי אחסון לדוגמה), והערות אחסון אם רלוונטי תחת הערות אחסון.
    הערה: התאריך, השעה והמשתמש שניגשו לאחרונה לטופס מאוכלסים באופן אוטומטי כדי להבטיח שרשרת משמורת שניתן לבדוק ולבקר לפי הצורך.
  9. אשר שהטופס הושלם על-ידי לחיצה על השלם תחת השלם?.
  10. לחץ על שמור וצא מטופס. זה יחזיר אותך לסקירה הכללית של המטופל.
  11. עבור כל צינור שנאסף, צור טופס איסוף דגימות נוסף על ידי לחיצה על "+" תחת אחסון לדוגמה. לאחר מכן חזרו על שלבים 5.1 עד 5.10.
  12. לחץ על שמור וצא כדי למלא את הטופס ולהתנתק ממסד הנתונים ומהמחשב/טאבלט.
  13. מעבירים את מדף הדגימות (על קרח יבש) למקרר במיקום שצוין מראש.

6. שליפת דגימות כירורגיות לניתוח במורד הזרם

הערה: דגימות מאוחסנות לעתים קרובות בארכיון במשך מספר שנים לפני שהן מנותחות. הקריביאלים המקודדים ומערכת מסד הנתונים REDCap הניתנים לחיפוש מאפשרים למצוא ולאתר כל דגימה בקלות לצורך ניתוח במורד הזרם.

  1. זהה דוגמאות מעניינות לניסוי באמצעות פונקציית החיפוש של מסד הנתונים. זה יאפשר למצוא למשל, את כל דגימות הומור מימי מחולים בין 20 ל 40 שנים עם רטינופתיה סוכרתית.
  2. השג את המיקום של הקריובלים המעניינים (מקפיא, מדף/מתלה, מדף לדוגמה, קואורדינטות בתוך ארון התקשורת). רשמו אותם, הדפיסו אותם או דאגו שיהיו זמינים במחשב/טאבלט נייד כדי להקל על מציאת הדגימות במקפיא.
  3. סמן את הדגימות כמשמשות במסד הנתונים.
  4. לחץ על שמור וצא כדי למלא את הטופס ולהתנתק מ- REDCap ומהמחשב/טאבלט.

Representative Results

דגימות הביופסיה הנוזלית שנאספו יכולות להיות נתונות למגוון ניתוחים מולקולריים, כולל ניתוח DNA, חלבונים, גליקנים ומטבוליטים. הוכח בעבר כי אחסון לטווח ארוך במשך מספר שנים ב -70 ° C לא השפיע באופן משמעותי על שלמות הפרופיל הפרוטאומי9. מסד הנתונים REDCap מאפשר אחזור פשוט ומהיר של דגימות. ניתן לחפש במאגר דגימות מקבוצה מסוימת של חולים, למשל, כל החולים עם רטינופתיה סוכרתית. לאחר מכן המאגר יספק את הברקודים של הצינורות ואת המיקומים באחסון. עד כה אספנו ושמרנו יותר מ-1,000 ביופסיות נוזליות. מסד הנתונים אפשר לנו למצוא במהירות את הדגימות לניתוחים במורד הזרם 3,10 ועזר לבצע את הניסויים הבאים.

נערה בת 17 סבלה מדלקת ברשתית ובעצב הראייה. היא הייתה מדוכאת חיסון והיה חשש לזיהום. הומור מימי נאסף מעינה הימנית ונשלח לבדיקת DNA PCR. התוצאות היו חיוביות עבור Cytomegalovirus ושליליות עבור וירוס הרפס סימפלקס וטוקסופלזמוזיס. ממצאים אלה ממחישים כי ביופסיות נוזליות של הומור מימי יכולות לסייע בהבחנה בין צורות זיהומיות ללא זיהומיות של דלקת תוך עינית, שהיא קריטית לבחירת הטיפול המתאים.

ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית מאפשרת ניתוח בלתי משוחד וכמותי למחצה של הפרוטאום. בביופסיה נוזלית מהזגוגית של מטופל שעבר כריתת זגוגית, הטכניקה הצליחה לזהות 484 חלבונים ייחודיים, כולל משלים C3 (C3), אופטיצין (OPTC) וקולגן מסוג II אלפא 1 (COL2A1) (איור 1A).

שלוש ביופסיות נוזליות בזגוגית נותחו באמצעות מולטיפלקס גליקופרוטאומיקה ELISA (ראה טבלת חומרים)11. הבדיקה זיהתה פרופילי גליקוזילציה של 500 חלבונים אנושיים, ולוכדת מגוון מסלולים ביולוגיים, כגון חילוף חומרים, תגובה חיסונית, הידבקות תאים וארגון אקטין (איור 1B).

מסך מטבולומיקה באמצעות אלקטרופורזה נימית יחד עם ספקטרומטריית מסה מותמרת פורייה12 (ראה טבלת חומרים) זיהה 292 מטבוליטים שונים בשלוש דגימות ביופסיה נוזלית של הומור מימי. ניתוח מסלולים (ראו טבלת חומרים)13 זיהה מגוון מסלולים מטבוליים, כולל מטבוליזם של חומצות אמינו, מחזור אוריאה וסינתזה של קרניטין (איור 1C).

Figure 1
איור 1: תוצאות מייצגות . (A) ניתוח פרוטאומיקה של הומור הזגוגית האנושי באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסות טנדם (LC-MS/MS) זיהה 484 חלבונים ייחודיים בביופסיה נוזלית אחת. רמות החלבונים מוצגות ומדורגות על סמך ספירות ספקטרליות. חלבונים מייצגים מודגשים בכחול. (B) מולטיפלקס גליקופרוטאומיקה ELISA זיהה רמות גליקוזילציה של 500 חלבונים ייחודיים בשלוש ביופסיות נוזליות זגוגיות. ניתוח אינטראקציה של חלבוני STRING זיהה אשכולות של אינטראקציות חלבונים (מוצגים אשכולות עם לפחות 10 חלבונים). המסלול המועשר באופן המשמעותי ביותר מוצג עבור כל אשכול. (C) ניתוח מטבולומיקה באמצעות ספקטרומטריית מסות זיהה 292 מטבוליטים שונים בשלוש ביופסיות נוזליות מימיות. כל נקודה מייצגת מדגם אחד. גובה הבר מתאים למספר הממוצע של מטבוליטים, סרגל השגיאה מייצג את סטיית התקן. הפאנל הימני מציג מסלולים מועשרים משמעותית. מספר המטבוליטים שזוהו (נומרטור) וכן המספר הכולל של מטבוליטים בכל מסלול (מכנה) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

דגימות כירורגיות מחולים מאפשרות אפיון מולקולרי ישיר של מחלות בבני אדם חיים 2,3,4,14, ועשויות לסייע להתגבר על המגבלות של מודלים של מחלות תאים ובעלי חיים שאינם מחזירים באופן מלא מחלות אנושיות 15,16. אנליזה מולקולרית של רקמות אנושיות עשויה לשפר את בחירת מטרות התרופות החדשות ולתרום לשיעור הצלחה גבוה יותר של ניסויים קליניים ואישור תרופות17. בנוסף, גישה זו מציעה את הפוטנציאל לרפואה מותאמת אישית, שכן הרקמה המתקבלת שומרת על טביעת האצבע הגנומית, האפיגנומית, המטבולית, הגליקומית והפרוטאומית הייחודית של כל אדם 2,18,19.

איכות דגימה גבוהה ועקבית היא בסיסית לכל יישומי הניתוח המולקולרי. מחקרים קודמים הראו כי הקפאה מיידית לאחר שליפת הדגימה והימנעות ממחזורי הקפאה/הפשרה חוזרים ונשנים הם קריטיים לאיכויות מדגם גבוהות 9,20. אחסון לטווח ארוך במשך מספר שנים ב -70 ° C לא השפיע באופן משמעותי על שלמות הפרופיל הפרוטאומי9. פרוטוקול סטנדרטי הוא בסיס חשוב להפחתת הטיה ולשיפור יכולת ההשוואה של נתונים מדעיים, במיוחד כאשר מספר אנשים (מנתחים, טכנאים ואחרים) או מוסדות שונים מעורבים בתהליך הדגימה. מלבד איכות הדגימה, ביאור הדגימות הוא גורם חשוב נוסף הדורש סטנדרטיזציה כדי לאפשר התאמה של ממצאים מולקולריים עם נתונים קליניים. הפרוטוקול שלנו מסתמך על שלושה עקרונות חיוניים כדי להשיג זאת: 1) הליך דגימה סטנדרטי לביופסיות נוזליות מימיות וזגוגיות על ידי מנתח עיניים, 2) עיבוד מיידי והקפאה מהירה של דגימות בחדר הניתוח על ידי אנשי מעבדה, ו -3) ביאור מטא נתונים של כל דגימה במסד נתונים מבוסס אינטרנט המאפשר לחוקרים למצוא במהירות דגימות לניסויים מאוחרים יותר.

בנוסף לדגימות זגוגית20, תהליך עבודה זה גם מבסס את האוסף הסטנדרטי של ביופסיות נוזליות הומור מימי לאנליזה מולקולרית. ההומור המימי הוא נוזל נגיש ומורכב ביותר בחדר הקדמי של העין שאינו משקף רק מחלות עיניים של החלק הקדמי אלא גם של החלק האחורי של העין, כולל מחלת רשתית18,21. יחד עם העובדה שניתן לאסוף מספר גבוה של דגימות הומור מימיות, למשל במהלך ניתוח קטרקט, אחד הניתוחים המבוצעים בתדירות הגבוהה ביותר בעולם, תכונות אלה הופכות אותו למקור מעניין לביופסיות נוזליות מהעין האנושית. ביאור המטה-נתונים המתוקנן של כל מדגם שנקבע בתהליך עבודה זה יכול גם לאפשר התאמה של נתוני פרוטאום עם נתוני מעקב קליני פרוספקטיבי. זה מספק הזדמנות מרגשת לזהות סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים חדשים שעשויים לעזור להעריך את הפרוגנוזה עבור חולים עתידיים.

עם זאת, לניתוח מולקולרי של דגימות כירורגיות אנושיות יש גם מגבלות חשובות. לדוגמה, מניפולציות ניסיוניות מורכבות אפשריות לעתים קרובות רק במודלים של בעלי חיים ותאים. פתרון עשוי להיות השוואת הפרופיל המולקולרי של מודלים של בעלי חיים או תאים עם זה של מחלות אנושיות. אסטרטגיה זו יכולה לזהות סמנים ביולוגיים חופפים של חלבונים ומטרות טיפוליות שניתן לאמת בבעלי חיים או במודלים תאיים כדי לזהות את המועמדים המבטיחים ביותר המתואמים עם מחלות אנושיות וצפויים להצליח בניסויים קליניים 4,16.

לסיכום, זרימת העבודה שלנו יוצרת ממשק מעשי בין חדר הניתוח לבין מעבדת המחקר המאפשר איסוף, ביאור ואחסון סטנדרטיים ובעלי תפוקה גבוהה של דגימות כירורגיות באיכות גבוהה לניתוח מולקולרי במורד הזרם, ומספק בסיס רב ערך למחקר תרגומי עתידי.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

VBM נתמך על ידי מענקי NIH (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 ו-P30EY026877), מרכז סטנפורד לדיסק אופטי דרוסן, ומחקר למניעת עיוורון, ניו יורק, ארה"ב. JW ו- DR נתמכים על ידי הקרן לניתוחי זגוגית, ארה"ב. DR נתמכת על ידי מלגת DARE, הממומנת על ידי קרן לונדבק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 68-0703-12 used for aqueous humor samples
1 mL syringe surgical grade, whatever available in hospital - for aqueous humor biopsies
1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 65-7643 used for vitreous samples
3 mL syringe surgical grade, whatever available in hospital - for vitreous biopsies
30-32-gauge needle surgical grade, whatever available in hospital - for aqueous humor biopsies
Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS) Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan - -
Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA - for vitreous biopsies
Cooling box Standard styrofoam box, whatever available in lab - -
Dry ice Whatever available in lab - -
Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable Zebra Symbol  DS9208-SR4NNU21Z Barcode scanner
Human Glycosylation Antibody Array L3  RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA GAH-GCM-L3 -
Mac mini Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA - -
MetaboAnalyst software Pang et al., 2021, PMID: 34019663 - -
Rack for 0.5ml tubes, 96-Format Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 66-51026 for aqueous humor samples
Rack for 1.9ml tubes, 48-Format Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 65-9451 for vitreous samples
REDCap browser-based sample database REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mishra, K., et al. Intraoperative complications with vitreous biopsy for molecular proteomics. Ophthalmic Surgeries, Lasers Imaging Retina. 54 (1), 32-36 (2023).
  2. Velez, G., Bassuk, A. G., Colgan, D., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Therapeutic drug repositioning using personalized proteomics of liquid biopsies. JCI Insight. 2 (24), (2017).
  3. Velez, G., et al. Liquid biopsy proteomics of uveal melanoma reveals biomarkers associated with metastatic risk. Molecular Cancer. 20 (1), 39 (2021).
  4. Wert, K. J., et al. Metabolite therapy guided by liquid biopsy proteomics delays retinal neurodegeneration. EBioMedicine. 52, 102636 (2020).
  5. Harris, P. A., et al. The REDCap consortium: Building an international community of software platform partners. Journal of Biomedical Informatics. 95, 103208 (2019).
  6. Finn, A. P., Materin, M. A., Mruthyunjaya, P. Choroidal tumor biopsy: A review of the current state and a glance into future techniques. Retina. 38 Suppl 1, S79-S87 (2018).
  7. Tarantola, R. M., Graff, J. M., Somani, R., Mahajan, V. B. Temporal approach for small-gauge pars plana vitrectomy combined with anterior segment surgery. Retina. 32 (8), 1614-1623 (2012).
  8. Mahajan, V. B., et al. Sutureless triplanar sclerotomy for 23-gauge vitrectomy. Archives in Ophthalmology. 129 (5), 585-590 (2011).
  9. Mitchell, B. L., Yasui, Y., Li, C. I., Fitzpatrick, A. L., Lampe, P. D. Impact of freeze-thaw cycles and storage time on plasma samples used in mass spectrometry based biomarker discovery projects. Cancer Informatics. 1 (1), 98-104 (2005).
  10. Velez, G., et al. Proteomic insight into the pathogenesis of CAPN5-vitreoretinopathy. Science Reports. 9 (1), 7608 (2019).
  11. Montgomery, M. R., Hull, E. E. Alterations in the glycome after HDAC inhibition impact oncogenic potential in epigenetically plastic SW13 cells. BMC Cancer. 19 (1), 79 (2019).
  12. Okamoto, N., et al. Comparison of serum metabolomics pathways and patterns between patients with major depressive disorder with and without type 2 diabetes mellitus: An exploratory study. Journal of Integrated Neuroscience. 22 (1), 13 (2023).
  13. Pang, Z., et al. MetaboAnalyst 5.0: narrowing the gap between raw spectra and functional insights. Nucleic Acids Research. 49 (W1), W388-W396 (2021).
  14. Wolf, J., et al. The Human Eye Transcriptome Atlas: A searchable comparative transcriptome database for healthy and diseased human eye tissue. Genomics. 114 (2), 110286 (2022).
  15. Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
  16. Wolf, J., et al. Comparative transcriptome analysis of human and murine choroidal neovascularization identifies fibroblast growth factor inducible-14 as phylogenetically conserved mediator of neovascular age-related macular degeneration. Biochimca et Biophysica Acta Molecular Basis of Diseases. 1868 (4), 166340 (2022).
  17. Dowden, H., Munro, J. Trends in clinical success rates and therapeutic focus. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (7), 495-496 (2019).
  18. Li, H. T., et al. Characterizing DNA methylation signatures of retinoblastoma using aqueous humor liquid biopsy. Nature Communication. 13 (1), 5523 (2022).
  19. Velez, G., et al. Personalized proteomics for precision health: identifying biomarkers of vitreoretinal disease. Translational Vision Science and Technology. 7 (5), 12 (2018).
  20. Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Applications. 8 (3-4), 209-217 (2014).
  21. Rinsky, B., et al. Analysis of the aqueous humor proteome in patients with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 62 (10), 18 (2021).

Tags

ביולוגיה גיליון 199 הומור מימי זגוגית ביופסיה נוזלית חדרי ניתוח מאגר ביולוגי עיניים רפואה מותאמת אישית פרוטאומיקה גליקופרוטאומיקה מטבולומיקה אנדופטלמיטיס
ביובנק של ביופסיות נוזליות מימיות וזגוגיות אנושיות לאנליזות מולקולריות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wolf, J., Chemudupati, T., Kumar,… More

Wolf, J., Chemudupati, T., Kumar, A., Rasmussen, D. K., Wai, K. M., Chang, R. T., Montague, A. A., Tang, P. H., Bassuk, A. G., Dufour, A., Mruthrunjaya, P., Mahajan, V. B. Biobanking of Human Aqueous and Vitreous Liquid Biopsies for Molecular Analyses. J. Vis. Exp. (199), e65804, doi:10.3791/65804 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter