Summary
यह प्रोटोकॉल प्रोटिओमिक्स, मेटाबोलॉमिक्स और ग्लाइकोमिक्स सहित आणविक डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले मानव जलीय हास्य और विट्रस तरल बायोप्सी के मानकीकृत संग्रह, एनोटेशन और बायोबैंकिंग के लिए एक एकीकृत बायोरिपोजिटरी प्लेटफॉर्म प्रस्तुत करता है।
Abstract
ट्रांसलेशनल अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण चुनौती ऑपरेटिंग रूम (ओआर) और अनुसंधान प्रयोगशाला में रोगी देखभाल के बीच एक व्यवहार्य और कुशल इंटरफ़ेस स्थापित कर रही है। यहां, हमने आंखों की सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों से जलीय हास्य और विट्रस से आणविक विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले तरल बायोप्सी प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। इस वर्कफ़्लो में, कंप्यूटर, बारकोड स्कैनर और ऑनबोर्ड कोल्ड स्टोरेज सहित लैब उपकरणों से लैस एक मोबाइल ऑपरेटिंग रूम लैब इंटरफ़ेस (एमओआरएलआई) कार्ट का उपयोग मानव जैविक नमूने प्राप्त करने और संग्रहीत करने के लिए किया जाता है। एक वेब-आधारित डेटा गोपनीयता-अनुरूप डेटाबेस प्रत्येक नमूने को उसके जीवनकाल में एनोटेट करने में सक्षम बनाता है, और एक कार्टेशियन समन्वय प्रणाली भंडारण में प्रत्येक बारकोडेड नमूने को ट्रैक करने की अनुमति देती है, जिससे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए नमूनों की त्वरित और सटीक पुनर्प्राप्ति सक्षम होती है। मानव ऊतक के नमूनों का आणविक लक्षण वर्णन न केवल एक नैदानिक उपकरण के रूप में कार्य करता है (उदाहरण के लिए, संक्रामक एंडोफथाल्मिटिस और अन्य गैर-संक्रामक इंट्राओकुलर सूजन के बीच अंतर करने के लिए) बल्कि ट्रांसलेशनल अनुसंधान के एक महत्वपूर्ण घटक का भी प्रतिनिधित्व करता है, जिससे नए दवा लक्ष्यों की पहचान, नए नैदानिक उपकरणों के विकास और व्यक्तिगत चिकित्सीय की अनुमति मिलती है।
Introduction
मानव आंख से तरल बायोप्सी की आणविक प्रोफाइलिंग डीएनए, आरएनए, प्रोटीन, ग्लाइकेन्स और अत्यधिक विशिष्ट ओकुलर ऊतकों से मेटाबोलाइट्स जैसे अणुओं वाले स्थानीय रूप से समृद्ध तरल पदार्थों को पकड़ सकती है। मानव आंख के पीछे के कक्ष में विट्रियस से तरल बायोप्सी एक आम तौर परसुरक्षित प्रक्रिया साबित हुई। वे जीवित मनुष्यों में ओकुलर रोगों के आणविक लक्षण वर्णन की अनुमति देते हैं और 2,3,4 नई नैदानिक औरचिकित्सीय रणनीतियों की पहचान करने की क्षमता प्रदान करते हैं। आंख के पूर्ववर्ती कक्ष में जलीय हास्य में और भी अधिक शल्य चिकित्सा पहुंच होती है और इसे बड़ी संख्या में प्राप्त किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, मोतियाबिंद सर्जरी के दौरान, जो सबसे अधिक बार की जाने वाली सर्जरी में से एक है। हालांकि, प्रोटिओमिक्स, मेटाबोलॉमिक्स और ग्लाइकोमिक्स सहित आणविक डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए मानव जलीय हास्य और विट्रस तरल बायोप्सी के संग्रह, एनोटेशन और बायोबैंकिंग के लिए कोई मानकीकृत प्रोटोकॉल अब तक उपलब्ध नहीं है।
यहां, हमने आंखों की सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों से आणविक विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले तरल बायोप्सी के संग्रह और बायोबैंकिंग के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया। एक मोबाइल ऑपरेटिंग रूम लैब इंटरफेस (एमओआरएलआई) एक शोधकर्ता को ऑपरेटिंग रूम (ओआर) में -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखी बर्फ पर बारकोडेड क्रायोवियल में एकत्र किए गए नमूनों को तुरंत स्नैप-फ्रीज करने में सक्षम बनाता है। यह प्रक्रिया डाउनस्ट्रीम आणविक विश्लेषण के लिए एक उच्च और सुसंगत नमूना गुणवत्ता सुनिश्चित करती है। उत्कृष्ट नमूना गुणवत्ता के अलावा, एक बायोबैंक में नमूनों की सटीक एनोटेशन महत्वपूर्ण है। वेब-आधारित HIPAA (स्वास्थ्य बीमा पोर्टेबिलिटी और जवाबदेही अधिनियम) -अनुरूप REDCap (अनुसंधान इलेक्ट्रॉनिक डेटा कैप्चर) डेटाबेस5 का उपयोग करते हुए, हमारा वर्कफ़्लो प्रत्येक नमूने के लिए विस्तृत मेटाडेटा के भंडारण की अनुमति देता है, जिसमें आयु, लिंग, बीमारी, रोग चरण, नमूना प्रकार और सर्जरी की अनूठी विशेषताएं शामिल हैं। यह सटीक भविष्य की खोज क्षमता की अनुमति देगा, उदाहरण के लिए, एक विशिष्ट बीमारी या रोगियों के एक विशेष समूह के नमूनों के लिए। इसके अलावा, फ्रीजर में प्रत्येक नमूने का सटीक स्थान कार्टेशियन ग्रिड सिस्टम का उपयोग करके संग्रहीत किया जाता है, जो डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए कुशल नमूना पुनर्प्राप्ति को सक्षम बनाता है। हम डीएनए, प्रोटीन, ग्लाइकन और मेटाबोलाइट विश्लेषण के उदाहरण दिखाते हैं।
हमारा वर्कफ़्लो ओआर और अनुसंधान प्रयोगशाला के बीच एक व्यावहारिक और प्रभावी संबंध का प्रतिनिधित्व करता है और ट्रांसलेशनल अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान आधार प्रदान करता है।
Protocol
प्रोटोकॉल स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय, यूएसए में मानव विषय अनुसंधान (आईआरबी) के लिए संस्थागत समीक्षा बोर्ड के दिशानिर्देशों का पालन करता है।
सावधानी: यह प्रोटोकॉल योग्य नेत्र सर्जनों के लिए एक गाइड है। इंट्राओकुलर विकृतियों के संदर्भ में, जलीय हास्य या विट्रस तरल बायोप्सी की सेटिंग में एक्स्ट्राओकुलर ट्यूमर सीडिंग से इनकार नहीं किया जा सकता है। हालांकि, ट्रांसविट्रल कोरॉइडल ट्यूमर बायोप्सी में एक्स्ट्राओकुलर एक्सटेंशन और ऑर्बिटल भागीदारी का जोखिम बेहद कम है, जो सुरक्षा वर्धित तरीके से और सावधानीपूर्वक प्रवेशस्थल विचार के साथ किया जाता है। यह प्रोटोकॉल कवर नहीं करता है और रेटिनोब्लास्टोमा या उच्च मेटास्टैटिक जोखिम वाले ट्यूमर के मामलों में इसका उल्लंघन किया जा सकता है।
1. नमूना संग्रह से पहले
- संस्थागत समीक्षा बोर्ड की मंजूरी
- प्रयोग की शुरुआत से पहले स्थानीय आईआरबी से अनुमोदन प्राप्त करें और तदनुसार नमूना संग्रह करें।
- जनसंख्या का अध्ययन
- समावेशन मानदंड: उन सभी रोगियों (आयु 0 - 99 वर्ष) को शामिल करें जो संस्थान में इंट्राओकुलर सर्जरी से गुजरते हैं जो रोगी की स्थिति और रोगियों का मूल्यांकन करने के लिए उपयुक्त नैदानिक परीक्षणों के लिए आवश्यक से अधिक जलीय हास्य या विट्रियस तरल की पर्याप्त मात्रा प्रदान करेंगे।
- बहिष्करण मानदंड: उन रोगियों को बाहर करें जो भाग लेने से इनकार करते हैं और गर्भवती महिलाएं।
- सूचित सहमति
- आईआरबी अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए प्रत्येक रोगी से लिखित सूचित सहमति प्राप्त करें।
- हस्ताक्षरित सहमति को एक सुरक्षित डेटाबेस में संग्रहीत करें।
- ट्रेन में कर्मियों (सर्जन, प्रयोगशाला तकनीशियन, ऑपरेटिंग रूम (ओआर) कर्मचारी, वैज्ञानिक) शामिल थे जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है।
- एक नमूना प्रबंधन डेटाबेस सेट करें। REDCap का उपयोग HIPAA-अनुरूप वेब-आधारित नमूना डेटाबेस के रूप में करें जिसे अनुसंधान अध्ययन के लिए डेटा कैप्चर का समर्थन करनेके लिए डिज़ाइन किया गया है।
नोट: यह आलेख व्यापक प्रोग्रामिंग ज्ञान की आवश्यकता के बिना प्रपत्र ों को डिज़ाइन करने, फ़ील्ड ्स को परिभाषित करने, ब्रांचिंग तर्क सेट अप करने और डेटा सत्यापन नियमों को लागू करने के लिए REDCap द्वारा प्रदान किए गए वेब-आधारित इंटरफ़ेस के उपयोग का वर्णन करता है। वैकल्पिक रूप से, अन्य सॉफ्टवेयर, जैसे कि मानक स्प्रेडशीट अनुप्रयोग, भी उपयुक्त हो सकते हैं। - एक शीतलन बॉक्स, सूखी बर्फ, नमूना संग्रह के लिए सिरिंज, और क्रायोवियल की उपलब्धता सुनिश्चित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। बारकोड के साथ क्रायोवियल का उपयोग करें जो शीशियों पर स्थायी रूप से अंकित होते हैं। यह शीशी पर रोगी पहचानकर्ताओं को जोड़ने की आवश्यकता और ठंड की स्थिति में एक लेबल खोने की संभावना को समाप्त करता है।
- मामले पर सर्जन और लैब तकनीशियन को सूचित करें जो निर्धारित सर्जरी से कम से कम 24 घंटे पहले ओआर में नमूना संग्रह में मदद करेंगे।
2. ऑपरेटिंग रूम में सर्जिकल नमूनों का अधिग्रहण
- मोबाइल ऑपरेटिंग रूम लैब इंटरफ़ेस (MORLI)
- ऑपरेटिंग रूम में एक MORLI स्थापित करें। MORLI में एक फ्लैट लैब बेंच सतह, REDCap डेटाबेस तक पहुंच के साथ बारकोड स्कैनर के साथ एक कंप्यूटर / टैबलेट और सूखी बर्फ के साथ एक शीतलन बॉक्स शामिल है (सामग्री की तालिका देखें)।
सावधानी: सूखी बर्फ बेहद ठंडी होती है। सूखी बर्फ को संभालते समय हमेशा दस्ताने पहनें, और इसे छूने से बचें।
- ऑपरेटिंग रूम में एक MORLI स्थापित करें। MORLI में एक फ्लैट लैब बेंच सतह, REDCap डेटाबेस तक पहुंच के साथ बारकोड स्कैनर के साथ एक कंप्यूटर / टैबलेट और सूखी बर्फ के साथ एक शीतलन बॉक्स शामिल है (सामग्री की तालिका देखें)।
- ओआर में नमूना संग्रह की तैयारी
- MORLI पर कंप्यूटर/टैबलेट में लॉग इन करें और REDCap डेटाबेस खोलें।
- जांचें कि रोगी द्वारा सूचित सहमति पर हस्ताक्षर किए गए हैं और सर्जन के साथ इसकी पुष्टि करें। उसे याद दिलाएं कि एक अघुलनशील नमूना आवश्यक है।
- दस्ताने पहनें। बारकोडेड क्रायोवियल की उचित संख्या प्राप्त करें (जलीय हास्य के लिए 0.5 एमएल और विट्रस नमूनों के लिए 1.9 एमएल) और उन्हें वहां रखें जहां वे आसानी से सुलभ हों।
- जलीय हास्य तरल बायोप्सी का संग्रह
चेतावनी: मानव ऊतक के नमूनों को जैव-खतरनाक सामग्री के रूप में विचार करें, जिसमें शामिल कर्मियों की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगशाला कोट और दस्ताने जैसी उचित सावधानियों की आवश्यकता होती है।
नोट: निम्नलिखित चरणों को केवल एक प्रशिक्षित नेत्र सर्जन द्वारा किया जाना चाहिए। जलीय हास्य तरल बायोप्सी प्राप्त की जा सकती है, उदाहरण के लिए, मोतियाबिंद सर्जरी की शुरुआत में, दुनिया भर में सबसे लगातार सर्जरी में से एक।
नोट: ऑपरेटिंग रूम में देखभाल प्रोटोकॉल के मानक के अनुसार एक बाँझ क्षेत्र बनाए रखा जाता है। रोगी संज्ञाहरण से संबंधित प्रीऑपरेटिव प्रक्रियाएं पूर्ववर्ती कक्ष और विट्रियोरेटिनल सर्जरी के लिए देखभाल चरणों के मानक का पालन करती हैं।- सर्जरी के लिए आंख तैयार करें और लपेटें और बाँझ क्षेत्र के इष्टतम विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक बाँझ ढक्कन स्पेकुलम रखें।
- 1 एमएल सिरिंज से जुड़ी 30-32 ग्राम सुई का उपयोग करके लिम्बस के लंबवत एक पूर्वकाल कक्ष पैरासेंटेसिस करने के लिए एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। इस प्रक्रिया के दौरान आंख को स्थिर करने के लिए एक कपास टिप या छोटे बल का उपयोग करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि सुई और सिरिंज बंद हैं और सिरिंज में कोई दबाव नहीं है (प्लंजर को हिलाकर)। सुनिश्चित करें कि सुई की नोक इंट्राओकुलर संरचनाओं को नुकसान से बचाने के लिए मध्य-पूर्वकाल कक्ष में परिधीय आईरिस पर बनी रहे। मोतियाबिंद सर्जरी के मामले में, तरल बायोप्सी प्राप्त करने के लिए सुई मोतियाबिंद सर्जरी के लिए बनाए गए पैरासेंटेस में से एक के माध्यम से पूर्वकाल कक्ष में भी प्रवेश कर सकती है। - माइक्रोस्कोप के माध्यम से प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन के तहत, मैन्युअल रूप से 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके लगभग 100 μL अघुलनशील जलीय हास्य को एस्पिरेट करें। सिरिंज प्लंजर को सर्जन के गैर-प्रमुख हाथ से या सुई को हिलाए बिना एक प्रशिक्षित सहायक द्वारा स्थानांतरित करें।
नोट: पूर्वकाल कक्ष के ढहने की स्थिति में जलीय हास्य के 100 μL से कम प्राप्त करें। - पूर्वकाल कक्ष से सुई को सावधानीपूर्वक हटा दें।
नोट: एक फाकिक आंख में, लेंस को छूने से बचने के लिए आईरिस के ऊपर सुई रखें। ग्लोब पर सकारात्मक दबाव रिफ्लक्स को बढ़ा सकता है। सुई को वापस लेने से पहले कपास की नोक जारी करने से रिफ्लक्स को कम करने में मदद मिलती है। - प्लंजर को वापस खींचें और देखें कि हवा और एकत्रित तरल पदार्थ कैसे आगे बढ़ रहे हैं।
- सिरिंज को क्रायोवियल में इंजेक्ट करें। अतिरिक्त हवा सिरिंज के मृत स्थान को साफ करती है।
- ऑपरेटिंग रूम में कंप्यूटर पर रेडकैप फॉर्म में नमूना स्कैन करने के लिए क्रायोवियल पर बारकोड का उपयोग करें (चरण 3.1 से 3.9 में अधिक विवरण)।
- क्रायोवियल को तुरंत कूलिंग बॉक्स में सूखी बर्फ में स्थानांतरित करें।
- रोगी के लिए निर्धारित सर्जरी जारी रखें (उदाहरण के लिए, मोतियाबिंद सर्जरी जैसा कि पहले वर्णित7 )।
- विट्रियस तरल बायोप्सी का संग्रह।
नोट: निम्नलिखित चरणों को केवल एक प्रशिक्षित विट्रियोरेटिनल सर्जन द्वारा किया जाना चाहिए। विट्रस तरल बायोप्सी एक विट्रोक्टॉमी8 की शुरुआत में प्राप्त की जा सकती है। चूंकि लक्ष्य एक अघुलनशील विट्रियस नमूना एकत्र करना है, इसलिए विट्रोक्टॉमी कटर को द्रव1 के साथ प्राइम नहीं किया जाएगा।
नोट: ऑपरेटिंग रूम में देखभाल प्रोटोकॉल के मानक के अनुसार एक बाँझ क्षेत्र बनाए रखा जाता है। रोगी संज्ञाहरण से संबंधित प्रीऑपरेटिव प्रक्रियाएं पूर्ववर्ती कक्ष और विट्रियोरेटिनल सर्जरी के लिए देखभाल चरणों के मानक का पालन करती हैं।- सर्जरी के लिए आंख तैयार करें और लपेटें और बाँझ क्षेत्र के इष्टतम विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक बाँझ ढक्कन स्पेकुलम रखें।
- देखभाल प्रक्रियाओं के मानक का पालन करते हुए, 23-, 25-, या 27-जी ट्रोकर कैनुला के साथ स्क्लेरोटोमी बनाएं। जलसेक प्रवेशनी डालें और विट्रस गुहा में उचित प्लेसमेंट की नेत्रहीन पुष्टि करें।
- विट्रियस कैविटी में, एक अघुलनशील विट्रस नमूना एकत्र करने के लिए जलसेक के बिना विट्रस कटर को सक्रिय करें। मैन्युअल रूप से एक सिरिंज का उपयोग करके 0.5 से 1.0 एमएल विट्रियस को एस्पिरेट करें जो विट्रस एक्सट्रूज़न कैनुला1 से जुड़ा हुआ है।
- आंख से विट्रस कटर निकालें और द्रव जलसेक चालू करें।
- टयूबिंग के भीतर शेष तरल पदार्थ को सिरिंज में डालें।
- सिरिंज काट दें।
- अनुभाग 2.3 (चरण 2.3.5 से चरण 2.3.9) में एक जलीय हास्य नमूने के लिए वर्णित नमूने को संसाधित करें।
3. ओआर में नमूनों का प्रसंस्करण और डेटाबेस में नमूने जोड़ना
- लैब तकनीशियन को तैयार क्रायोवियल (जलीय हास्य के लिए 0.5 एमएल और विट्रस नमूनों के लिए 1.9 एमएल) लेने के लिए कहें और किसी भी बाँझ या उपकरण को छूने के बिना सर्जन के पास चलें।
- क्रायोवियल खोलने के लिए लैब तकनीशियन से पूछें।
- सिरिंज को सीधे क्रायोवियल में उतारें।
- लैब तकनीशियन से तुरंत क्रायोवियल को फिर से तैयार करने के लिए कहें।
- लैब तकनीशियन को एमओआरएलआई में वापस चलने के लिए कहें और तुरंत शीतलन बॉक्स (-80 डिग्री सेल्सियस) में सूखी बर्फ पर नमूना स्थानांतरित करें। बॉक्स का ढक्कन बंद करें।
- कोई नया नमूना संग्रह प्रपत्र खोलें. फॉर्म के संबंधित क्षेत्र में निम्नलिखित जानकारी दर्ज करें: केस सर्जन, स्थान और संग्रह की तारीख, रोगी पहचानकर्ता संख्या, और अन्य बुनियादी जानकारी, जैसे आयु, लिंग, दाईं या बाईं आंख, निदान, प्रीऑपरेटिव इतिहास (मुफ्त पाठ), प्रक्रिया के बारे में जानकारी (जैसे, सर्जरी का प्रकार), साथ ही नमूने के बारे में जानकारी, जैसे एकत्र किए गए नमूनों की संख्या, नमूने के प्रकार (जलीय हास्य, विट्रस), और वॉल्यूम जैसे अन्य विवरण। बारकोड स्कैनर का उपयोग करके ट्यूब बारकोड जोड़ें।
- सबमिट/नेक्स्ट पर क्लिक करें।
- यदि कोई अतिरिक्त नमूने एकत्र किए जाते हैं तो चरण 3.1 से 3.7 दोहराएं।
- जब सभी नमूने सुरक्षित हो जाते हैं, तो REDCap नमूना संग्रह प्रपत्र पर सहेजें और सबमिट करें क्लिक करें. फिर डेटाबेस और कंप्यूटर / टैबलेट से लॉग आउट करें।
4. क्रायोवियल को भंडारण में स्थानांतरित करना
- ओआर से प्रयोगशाला में कूलिंग बॉक्स में सूखी बर्फ पर नमूने ले जाएं और इसे प्रयोगशाला कंप्यूटर के बगल में एक प्रयोगशाला बेंच पर रखें।
- अपने लॉगिन आईडी और पासवर्ड का उपयोग करके लैब कंप्यूटर पर REDCap में लॉग इन करें।
- दस्ताने पहनें। एकत्र किए गए नमूनों में से एक लें और डेटाबेस में क्रायोवियल के बारकोड को स्कैन करें (अनुभाग 5 में अधिक विवरण)। तुरंत नमूने को सूखी बर्फ पर वापस रखें।
- सूखी बर्फ से भरा एक दूसरा कंटेनर प्राप्त करें।
- -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से क्रायोवियल के लिए एक रैक प्राप्त करें। इसे सूखे बर्फ पर दूसरे कंटेनर में रखें।
नोट: 0.5 एमएल जलीय हास्य ट्यूबों के लिए 96-प्रारूप रैक और 1.9 एमएल विट्रस ट्यूबों के लिए 48-प्रारूप रैक की आवश्यकता होगी। - डेटाबेस में रैक के बारकोड को स्कैन करें (अनुभाग 5 में अधिक विवरण)।
- नमूने को रैक में स्थानांतरित करें।
- डेटाबेस में रैक में शीशियों की स्थिति जोड़ें (अनुभाग 5 में अधिक विवरण)।
- सहेजें और सबमिट करें क्लिक करें.
- सूखी बर्फ पर शीशियों के साथ रैक को -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए फ्रिज में ले जाएं। एक समन्वय प्रणाली का उपयोग करके फ्रिज में एक विशिष्ट स्थिति में रैक जोड़ें। यह बाद में आसानी से डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए नमूने प्राप्त करने की अनुमति देगा।
5. नमूना भंडारण फॉर्म
- प्रविष्टि प्रपत्र चरण के दौरान एकत्र किए गए प्रत्येक नमूने के लिए एक संग्रहण प्रपत्र भरें. नया संग्रहण प्रपत्र बनाने और खोलने के लिए नमूना संग्रहण के अंतर्गत खाली वृत्त या "+" पर क्लिक करें.
- रिकॉर्ड अभिलेखीय दिनांक के अंतर्गत वह दिनांक दर्ज करें जब यह प्रपत्र पूर्ण हो चुका है.
- नमूना ट्यूब बारकोड के अंतर्गत ट्यूब बारकोड स्कैन या टाइप करें। तुरंत नमूने को सूखी बर्फ पर वापस रखें।
- चुनें कि क्या एक नमूना बाहर स्थानांतरित किया गया है या यदि नमूना आंतरिक बायोरिपॉजिटरी स्टोरेज में जा रहा है।
- सत्यापित करें कि रोगी से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी और सहमति अनुपालन सत्यापित करें के तहत बॉक्स का चयन करें और सहमति द्वारा सत्यापित सहमति के तहत अपना नाम दर्ज करें।
- रैक में क्रायोवियल के लिए एक मुफ्त और उपयुक्त स्थान का चयन करें। इस स्थिति में क्रायोवियल को रैक में स्थानांतरित करें (उदाहरण के लिए, स्थिति ए 1)। रैक को सूखी बर्फ पर रखें।
- स्थान चरण में, निम्न जानकारी दर्ज करें: फ्रीजर के नीचे फ्रीजर का स्थान, शेल्फ नंबर जहां नमूना शेल्फ के तहत संग्रहीत किया जाएगा, बॉक्स बारकोड के तहत बॉक्स बारकोड, पंक्ति द्वारा बॉक्स में ट्यूब स्थिति (ट्यूब स्थिति (पंक्ति)) और कॉलम (ट्यूब स्थिति (कॉलम)।
नोट: वैकल्पिक रूप से, बॉक्स लेबल के तहत एक बॉक्स लेबल भी दर्ज किया जा सकता है, जो फ्रीजर में बॉक्स को खोजने की सुविधा प्रदान कर सकता है। - उपयोग अनुभाग के अंतर्गत, निम्न जानकारी दर्ज करें: उस प्रोजेक्ट का नाम जिसके लिए नमूना उपयोग किया जाता है (प्रोजेक्ट नाम), निम्न श्रेणियों में से किसी एक में नमूना वॉल्यूम: पूर्ण, आंशिक, निकट-खाली, या खाली (नमूना वॉल्यूम), और भंडारण नोट्स के अंतर्गत लागू होने पर संग्रहण नोट.
नोट: अंतिम बार प्रपत्र एक्सेस करने वाली तिथि, समय और उपयोगकर्ता को हिरासत की एक श्रृंखला सुनिश्चित करने के लिए स्वतः पॉप्युलेट किया जाता है जिसकी आवश्यकतानुसार समीक्षा और ऑडिट किया जा सकता है। - पूर्ण के अंतर्गत पूर्ण करें क्लिक करके पुष्टि करें कि प्रपत्र पूर्ण हो गया है?
- प्रपत्र सहेजें और बाहर निकलें क्लिक करें. यह आपको रोगी अवलोकन पर वापस लाएगा।
- एकत्र की गई प्रत्येक ट्यूब के लिए, नमूना भंडारण के तहत "+" पर क्लिक करके एक और नमूना संग्रह फॉर्म उत्पन्न करें। फिर चरण 5.1 से 5.10 दोहराएँ।
- प्रपत्र को पूरा करने के लिए सहेजें और बाहर निकलें क्लिक करें और डेटाबेस और कंप्यूटर/टैबलेट से लॉग आउट करें.
- नमूना रैक (सूखी बर्फ पर) को पूर्वनिर्दिष्ट स्थिति में फ्रिज में स्थानांतरित करें।
6. डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए सर्जिकल नमूनों की पुनर्प्राप्ति।
नोट: नमूनों का विश्लेषण करने से पहले उन्हें अक्सर कई वर्षों तक संग्रहीत किया जाता है। बारकोडेड क्रायोवियल और खोज योग्य रेडकैप डेटाबेस सिस्टम डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए प्रत्येक नमूने को आसानी से खोजने और खोजने की अनुमति देता है।
- डेटाबेस के खोज फ़ंक्शन का उपयोग करके प्रयोग के लिए रुचि के नमूने की पहचान करें। यह मधुमेह रेटिनोपैथी के साथ 20 से 40 वर्ष के बीच के रोगियों से सभी जलीय हास्य नमूने खोजने की अनुमति देगा।
- रुचि के क्रायोवियल (फ्रीजर, शेल्फ / रैक, नमूना रैक, रैक के भीतर निर्देशांक) का स्थान प्राप्त करें। उन्हें लिखें, उन्हें प्रिंट करें, या फ्रीजर में नमूनों की खोज की सुविधा के लिए उन्हें मोबाइल कंप्यूटर / टैबलेट पर उपलब्ध कराएं।
- डेटाबेस में उपयोग किए गए नमूने चिह्नित करें।
- प्रपत्र को पूरा करने के लिए सहेजें और बाहर निकलें क्लिक करें और REDCap और कंप्यूटर/टैबलेट से लॉग आउट करें.
Representative Results
एकत्र किए गए तरल बायोप्सी नमूनों को डीएनए, प्रोटीन, ग्लाइकेन और मेटाबोलाइट्स के विश्लेषण सहित विभिन्न आणविक विश्लेषणों के अधीन किया जा सकता है। यह पहले दिखाया गया है कि -70 डिग्री सेल्सियस पर कई वर्षों में दीर्घकालिक भंडारण ने प्रोटिओमिक प्रोफाइल9 की अखंडता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं किया। REDCap डेटाबेस नमूने की सरल और त्वरित पुनर्प्राप्ति सक्षम बनाता है। डेटाबेस को रोगियों के एक विशिष्ट समूह से नमूने के लिए खोजा जा सकता है, उदाहरण के लिए, मधुमेह रेटिनोपैथी वाले सभी रोगी। डेटाबेस तब ट्यूबों के बारकोड और भंडारण में स्थिति प्रदान करेगा। अब तक, हमने 1,000 से अधिक तरल बायोप्सी एकत्र और संग्रहीत किए हैं। डेटाबेस ने हमें डाउनस्ट्रीम विश्लेषण 3,10 के लिए नमूने जल्दी से खोजने की अनुमति दी और निम्नलिखित प्रयोगों को करने में मदद की।
एक 17 वर्षीय महिला रेटिना और ऑप्टिक तंत्रिका सूजन के साथ प्रस्तुत की गई। वह इम्युनोकॉम्प्रोमाइज्ड थी, और संक्रमण के लिए चिंता थी। जलीय हास्य को उसकी दाहिनी आंख से एकत्र किया गया और डीएनए पीसीआर विश्लेषण के लिए भेजा गया। परिणाम साइटोमेगालोवायरस के लिए सकारात्मक थे और हर्पीस सिम्प्लेक्स वायरस और टोक्सोप्लाज्मोसिस के लिए नकारात्मक थे। ये निष्कर्ष बताते हैं कि जलीय हास्य तरल बायोप्सी इंट्राओकुलर सूजन के गैर-संक्रामक रूपों से संक्रामक को अलग करने में मदद कर सकती है, जो उचित चिकित्सा का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटिओम के निष्पक्ष और अर्ध-मात्रात्मक विश्लेषण को सक्षम बनाता है। विट्रोक्टॉमी से गुजरने वाले रोगी के विट्रस से तरल बायोप्सी में, तकनीक 484 अद्वितीय प्रोटीन की पहचान करने में सक्षम थी, जिसमें पूरक सी 3 (सी 3), ऑप्टिसिन (ओपीटीसी), और कोलेजन टाइप II अल्फा 1 (सीओएल 2 ए 1) (चित्रा 1 ए) शामिल हैं।
ग्लाइकोप्रोटिओमिक्स मल्टीप्लेक्स एलिसा ( सामग्री की तालिका देखें) 11 का उपयोग करके तीन विट्रस तरल बायोप्सी का विश्लेषण किया गया था। परख ने 500 मानव प्रोटीन के ग्लाइकोसिलेशन प्रोफाइल का पता लगाया, विभिन्न जैविक मार्गों, जैसे चयापचय, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, सेल आसंजन और एक्टिन संगठन (चित्रा 1 बी) को कैप्चर किया।
फोरियर ट्रांसफॉर्म्ड मास स्पेक्ट्रोमेट्री12 (सामग्री की तालिका देखें) के साथ युग्मित केशिका वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके एक मेटाबोलॉमिक्स स्क्रीन ने तीन जलीय हास्य तरल बायोप्सी नमूनों में 292 विभिन्न मेटाबोलाइट्स की पहचान की। एक मार्ग विश्लेषण (सामग्री की तालिका देखें) 13 ने अमीनो एसिड चयापचय, यूरिया चक्र और कार्निटाइन संश्लेषण (चित्रा 1 सी) सहित विभिन्न चयापचय मार्गों की पहचान की।
चित्र 1: प्रतिनिधि परिणाम । (ए) तरल क्रोमैटोग्राफी और टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) का उपयोग करके मानव विट्रियस हास्य के प्रोटिओमिक्स विश्लेषण ने एकल तरल बायोप्सी में 484 अद्वितीय प्रोटीन की पहचान की। वर्णक्रमीय गणना के आधार पर प्रोटीन का स्तर दिखाया और रैंक किया जाता है। प्रतिनिधि प्रोटीन नीले रंग में हाइलाइट किए जाते हैं। (बी) एक ग्लाइकोप्रोटिओमिक्स मल्टीप्लेक्स एलिसा ने तीन विट्रस तरल बायोप्सी में 500 अद्वितीय प्रोटीन के ग्लाइकोसिलेशन स्तर का पता लगाया। एक स्ट्रिंग प्रोटीन इंटरैक्शन विश्लेषण ने प्रोटीन इंटरैक्शन के समूहों की पहचान की (कम से कम 10 प्रोटीन वाले क्लस्टर दिखाए गए हैं)। प्रत्येक क्लस्टर के लिए सबसे महत्वपूर्ण समृद्ध मार्ग दिखाया गया है। (सी) मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण ने तीन जलीय हास्य तरल बायोप्सी में 292 विभिन्न मेटाबोलाइट्स की पहचान की। प्रत्येक बिंदु एक नमूने का प्रतिनिधित्व करता है। बार की ऊंचाई मेटाबोलाइट्स की औसत संख्या से मेल खाती है, त्रुटि पट्टी मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती है। दाहिना पैनल काफी समृद्ध मार्ग दिखाता है। पता लगाए गए मेटाबोलाइट्स (प्रगणक) की संख्या के साथ-साथ प्रत्येक मार्ग (भाजक) में मेटाबोलाइट्स की कुल संख्या दिखाई गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
रोगियों के सर्जिकल नमूनेजीवित मनुष्यों 2,3,4,14 में बीमारी के प्रत्यक्ष आणविक लक्षण वर्णन की अनुमति देते हैं, और सेल और पशु रोग मॉडल की सीमाओं को दूर करने में मदद कर सकते हैं जो मानव रोग 15,16 को पूरी तरह से पुन: उत्पन्न नहीं करते हैं। मानव ऊतक का आणविक विश्लेषण नए दवा लक्ष्यों के चयन में सुधार कर सकता है और नैदानिक परीक्षणों औरदवा अनुमोदन की उच्च सफलता दर में योगदान कर सकता है। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण व्यक्तिगत चिकित्सा की क्षमता प्रदान करता है, क्योंकि प्राप्त ऊतकप्रत्येक व्यक्ति के अद्वितीय जीनोमिक, एपिजेनोमिक, मेटाबोलिक, ग्लाइकोमिक और प्रोटिओमिक फिंगरप्रिंट को बरकरार रखता है।
सभी आणविक विश्लेषण अनुप्रयोगों के लिए उच्च और सुसंगत नमूना गुणवत्ता मौलिक है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि नमूना पुनर्प्राप्ति के बाद तत्काल ठंड और बार-बार फ्रीज / पिघलने चक्र से बचना उच्च नमूना गुणों 9,20 के लिए महत्वपूर्ण है। -70 डिग्री सेल्सियस पर कई वर्षों में दीर्घकालिक भंडारण ने प्रोटिओमिक प्रोफाइल9 की अखंडता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं किया। एक मानकीकृत प्रोटोकॉल पूर्वाग्रह को कम करने और वैज्ञानिक डेटा की तुलनात्मकता में सुधार करने के लिए एक महत्वपूर्ण आधार है, खासकर जब कई लोग (सर्जन, तकनीशियन और अन्य) या विभिन्न संस्थान नमूना प्रक्रिया में शामिल होते हैं। नमूना गुणवत्ता के अलावा, नमूनों का एनोटेशन एक और महत्वपूर्ण कारक है जिसे नैदानिक डेटा के साथ आणविक निष्कर्षों के सहसंबंध की अनुमति देने के लिए मानकीकरण की आवश्यकता होती है। हमारा प्रोटोकॉल इसे पूरा करने के लिए तीन आवश्यक सिद्धांतों पर निर्भर करता है: 1) एक नेत्र सर्जन द्वारा जलीय हास्य और विट्रस तरल बायोप्सी के लिए एक मानकीकृत नमूना प्रक्रिया, 2) प्रयोगशाला कर्मियों द्वारा ओआर में नमूनों का तत्काल प्रसंस्करण और स्नैप-फ्रीजिंग, और 3) एक वेब-आधारित डेटाबेस में प्रत्येक नमूने का एक मेटाडेटा एनोटेशन जो शोधकर्ताओं को बाद के प्रयोगों के लिए नमूने जल्दी से खोजने की अनुमति देता है।
विट्रस नमूने20 के अलावा, यह वर्कफ़्लो आणविक विश्लेषण के लिए जलीय हास्य तरल बायोप्सी के मानकीकृत संग्रह को भी स्थापित करता है। जलीय हास्य आंख के पूर्ववर्ती कक्ष में एक अत्यधिक सुलभ, जटिल तरल पदार्थ है जो न केवल पूर्वकाल के ओकुलर रोगों को दर्शाता है, बल्कि आंख के पीछे के खंड को भी दर्शाता है, जिसमें रेटिना रोग18,21 भी शामिल है। इस तथ्य के साथ कि जलीय हास्य के नमूनों की एक उच्च संख्या एकत्र की जा सकती है, उदाहरण के लिए, मोतियाबिंद सर्जरी के दौरान, दुनिया भर में सबसे अधिक बार की जाने वाली सर्जरी में से एक, ये विशेषताएं इसे मानव आंखों से तरल बायोप्सी के लिए एक दिलचस्प स्रोत बनाती हैं। इस वर्कफ़्लो में स्थापित प्रत्येक नमूने का मानकीकृत मेटाडेटा एनोटेशन संभावित नैदानिक अनुवर्ती डेटा के साथ प्रोटिओम डेटा के सहसंबंध की भी अनुमति दे सकता है। यह नए रोगसूचक बायोमाकर्स की पहचान करने का रोमांचक अवसर प्रदान करता है जो भविष्य के रोगियों के लिए रोग का अनुमान लगाने में मदद कर सकता है।
हालांकि, मानव शल्य चिकित्सा नमूनों के आणविक विश्लेषण में भी महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, जटिल प्रयोगात्मक जोड़तोड़ अक्सर केवल पशु और कोशिका मॉडल में संभव होते हैं। एक समाधान मानव रोग के साथ पशु या कोशिका मॉडल के आणविक प्रोफ़ाइल की तुलना करना हो सकता है। यह रणनीति अतिव्यापी प्रोटीन बायोमाकर्स और चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान कर सकती है जिन्हें जानवरों या सेल मॉडल में मान्य किया जा सकता है ताकि सबसे आशाजनक उम्मीदवारों की पहचान की जा सके जो मानव रोग से संबंधित हैं औरनैदानिक परीक्षणों में सफल होने की संभावना है।
अंत में, हमारा वर्कफ़्लो ओआर और अनुसंधान प्रयोगशाला के बीच एक व्यावहारिक इंटरफ़ेस स्थापित करता है जो आणविक डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए मानकीकृत और उच्च-थ्रूपुट संग्रह, एनोटेशन और उच्च गुणवत्ता वाले सर्जिकल नमूनों के भंडारण की अनुमति देता है, जो भविष्य के ट्रांसलेशनल अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान आधार प्रदान करता है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
वीबीएम एनआईएच अनुदान (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 और P30EY026877), स्टैनफोर्ड सेंटर फॉर ऑप्टिक डिस्क ड्रूसन, और रिसर्च टू प्रिवेंट ब्लाइंडनेस, न्यूयॉर्क, यूएसए द्वारा समर्थित है। जेडब्ल्यू और डीआर विट्रोरेटिनल सर्जरी फाउंडेशन, यूएसए द्वारा समर्थित हैं। डीआर को डेयर फैलोशिप द्वारा समर्थित किया जाता है, जिसे लुंडबेक फाउंडेशन द्वारा प्रायोजित किया जाता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 68-0703-12 | used for aqueous humor samples |
| 1 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | - | for aqueous humor biopsies |
| 1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-7643 | used for vitreous samples |
| 3 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | - | for vitreous biopsies |
| 30-32-gauge needle | surgical grade, whatever available in hospital | - | for aqueous humor biopsies |
| Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS) | Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan | - | - |
| Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system | Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA | - | for vitreous biopsies |
| Cooling box | Standard styrofoam box, whatever available in lab | - | - |
| Dry ice | Whatever available in lab | - | - |
| Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable | Zebra Symbol | DS9208-SR4NNU21Z | Barcode scanner |
| Human Glycosylation Antibody Array L3 | RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA | GAH-GCM-L3 | - |
| Mac mini | Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA | - | - |
| MetaboAnalyst software | Pang et al., 2021, PMID: 34019663 | - | - |
| Rack for 0.5ml tubes, 96-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 66-51026 | for aqueous humor samples |
| Rack for 1.9ml tubes, 48-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-9451 | for vitreous samples |
| REDCap browser-based sample database | REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org | - | - |
References
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