Summary
Denne protokol præsenterer en integreret biorepository-platform til standardiseret indsamling, annotering og biobanking af høj kvalitet human vandig humor og glasagtige flydende biopsier til molekylære downstream-analyser, herunder proteomics, metabolomics og glycomics.
Abstract
En kritisk udfordring i translationel forskning er at etablere en levedygtig og effektiv grænseflade mellem patientpleje på operationsstuen (OR) og forskningslaboratoriet. Her udviklede vi en protokol til anskaffelse af flydende biopsier af høj kvalitet til molekylære analyser fra den vandige humor og glaslegemet fra patienter, der gennemgår øjenkirurgi. I denne arbejdsgang bruges en Mobile Operating Room Lab Interface (MORLI) vogn udstyret med en computer, en stregkodescanner og laboratorieinstrumenter, herunder køleopbevaring ombord, til at indhente og arkivere humane biologiske prøver. En webbaseret database, der overholder databeskyttelsen, gør det muligt at annotere hver prøve i løbet af dens levetid, og et kartesisk koordinatsystem gør det muligt at spore hver stregkodet prøve i opbevaring, hvilket muliggør hurtig og nøjagtig hentning af prøver til downstream-analyser. Molekylær karakterisering af humane vævsprøver tjener ikke kun som et diagnostisk værktøj (fx at skelne mellem infektiøs endophthalmitis og anden ikke-infektiøs intraokulær inflammation), men repræsenterer også en vigtig komponent i translationel forskning, der muliggør identifikation af nye lægemiddelmål, udvikling af nye diagnostiske værktøjer og personlig terapi.
Introduction
Molekylær profilering af flydende biopsier fra det menneskelige øje kan fange lokalt berigede væsker indeholdende molekyler som DNA, RNA, proteiner, glycaner og metabolitter fra højt specialiserede okulære væv. Flydende biopsier fra glaslegemet i det bageste kammer i det menneskelige øje viste sig at være en generelt sikker procedure1. De tillader molekylær karakterisering af okulære sygdomme hos levende mennesker og giver potentialet til at identificere nye diagnostiske og terapeutiske strategier 2,3,4. Den vandige humor i øjets forreste kammer har endnu højere kirurgisk tilgængelighed og kunne opnås i stort antal, f.eks. under grå stær kirurgi, som er en af de hyppigst udførte operationer. Imidlertid er der ingen standardiseret protokol til indsamling, annotering og biobanking af human vandig humor og glasagtige flydende biopsier til molekylære nedstrømsanalyser, herunder proteomics, metabolomics og glycomics, tilgængelig indtil nu.
Her udviklede vi en protokol til indsamling og biobank af flydende biopsier af høj kvalitet til molekylære analyser fra patienter, der gennemgår øjenoperationer. En Mobile Operating Room Lab Interface (MORLI) gør det muligt for en forsker straks at snapfryse de indsamlede prøver i stregkodede kryoer på tøris ved -80 °C i operationsstuen (OR). Denne procedure sikrer en høj og konsistent prøvekvalitet til downstream molekylær analyse. Ud over fremragende prøvekvalitet er nøjagtig annotering af prøver i en biobank kritisk. Ved hjælp af en webbaseret HIPAA (Health Insurance Portability and Accountability Act) -kompatibel REDCap (forskning elektronisk datafangst)database 5 tillader vores arbejdsgang lagring af detaljerede metadata for hver prøve, herunder alder, køn, sygdom, sygdomsstadium, prøvetype og unikke funktioner i operationen. Dette vil muliggøre nøjagtig fremtidig søgekapacitet, f.eks. efter prøver fra en bestemt sygdom eller en bestemt patientgruppe. Derudover arkiveres den nøjagtige placering af hver prøve i fryseren ved hjælp af et kartesisk gittersystem, som muliggør effektiv prøvehentning til downstream-eksperimenter. Vi viser eksempler på DNA-, protein-, glykan- og metabolitanalyser.
Vores arbejdsgang repræsenterer en praktisk og effektiv forbindelse mellem operationsstuen og forskningslaboratoriet og giver et værdifuldt grundlag for translationel forskning.
Protocol
Protokollen følger retningslinjerne fra Institutional Review Board for Human Subjects Research (IRB) ved Stanford University, USA.
FORSIGTIG: Denne protokol er en vejledning til kvalificerede øjenkirurger. I forbindelse med intraokulære maligniteter kan ekstraokulær tumorsåning i indstillingen af vandig humor eller glasagtige flydende biopsier ikke udelukkes. Imidlertid er risikoen for ekstraokulær forlængelse og orbital involvering ekstremt lav i transvitreal choroidal tumorbiopsi, der udføres på sikkerhedsforbedret måde og med omhyggelig overvejelse af indgangsstedet6. Denne protokol dækker ikke og kan være kontraindiceret i tilfælde af retinoblastom eller tumorer med høj metastatisk risiko.
1. Før prøveindsamling
- Godkendelse af bedømmelsesudvalg for institutioner
- Få godkendelserne fra den lokale IRB inden eksperimentets start, og udfør prøveindsamlingen i overensstemmelse hermed.
- Studiepopulation
- Inklusionskriterier: Inkluder alle patienter (i alderen 0 - 99 år), der gennemgår intraokulær kirurgi på institutionen, der vil give en tilstrækkelig mængde vandig humor eller glasagtig væske ud over det, der kræves til passende diagnostiske tests til evaluering af patientens tilstand og patienter, der ønsker at deltage.
- Eksklusionskriterier: Ekskluder patienter, der afviser at deltage, og gravide kvinder.
- Informeret samtykke
- Få skriftligt informeret samtykke fra hver patient efter den IRB-godkendte protokol.
- Arkiver det underskrevne samtykke i en sikret database.
- Træn involveret personale (kirurger, laboranter, operationsstuepersonale, forskere) som beskrevet i denne protokol.
- Opret en eksempeladministrationsdatabase. Brug REDCap som en HIPAA-kompatibel webbaseret eksempeldatabase, der er designet til at understøtte datafangst til forskningsundersøgelser5.
BEMÆRK: I denne artikel beskrives brugen af den webbaserede grænseflade, der leveres af REDCap, til at designe formularer, definere felter, konfigurere forgreningslogik og anvende datavalideringsregler uden behov for omfattende programmeringskendskab. Alternativt kan anden software, såsom standard regnearksapplikationer, også være egnet. - Sørg for, at der er køleboks, tøris, sprøjte til prøveopsamling og kryoer til rådighed (se materialetabellen). Brug cryovials med stregkoder, der er permanent ætset på hætteglassene. Dette eliminerer behovet for at tilføje patientidentifikatorer på hætteglasset og muligheden for at miste en etiket under fryseforhold.
- Underret kirurgen om sagen og laboratorieteknikeren, der vil hjælpe med prøveindsamlingen i OR mindst 24 timer før den planlagte operation.
2. Erhvervelse af kirurgiske prøver i operationsstuen
- Mobil grænseflade til operationsstuens laboratorium (MORLI)
- Opret en MORLI i operationsstuen. MORLI inkluderer en flad laboratoriebænkoverflade, en computer/tablet med en stregkodescanner med adgang til REDCap-databasen og en køleboks med tøris (se materialetabel).
FORSIGTIG: Tøris er ekstremt koldt. Brug altid handsker, når du håndterer tøris, og undgå at røre ved den.
- Opret en MORLI i operationsstuen. MORLI inkluderer en flad laboratoriebænkoverflade, en computer/tablet med en stregkodescanner med adgang til REDCap-databasen og en køleboks med tøris (se materialetabel).
- Forberedelse af prøveindsamling i regionerne i den yderste periferi
- Log ind på computeren/tabletten på MORLI og åbn REDCap-databasen.
- Kontroller, at informeret samtykke er underskrevet af patienten, og bekræft det med kirurgen. Mind ham / hende om, at der kræves en ufortyndet prøve.
- Brug handsker. Få det passende antal stregkodede kryoialer (0,5 ml for vandig humor og 1,9 ml for glasagtige prøver), og placer dem, hvor de er let tilgængelige.
- Indsamling af vandige humor flydende biopsier
FORSIGTIG: Betragt humane vævsprøver som biofarligt materiale, hvilket kræver passende forholdsregler såsom laboratoriefrakke og handsker for at sikre det involverede personales sikkerhed.
BEMÆRK: Følgende trin bør kun udføres af en uddannet øjenkirurg. Vandig humor flydende biopsier kan opnås for eksempel i begyndelsen af grå stær kirurgi, en af de hyppigste operationer verden over.
BEMÆRK: Et sterilt felt opretholdes i henhold til standard plejeprotokoller i operationsstuen. Præoperative procedurer relateret til patientbedøvelse følger standard plejetrin for forreste kammer og vitreoretinale operationer.- Forbered og draperer øjet til kirurgi og placer et sterilt lågspekulum for optimal visualisering af det sterile felt.
- Brug et operationsmikroskop til at udføre en forreste kammerparacentese vinkelret på limbussen ved hjælp af en 30-32 G nål forbundet til en 1 ml sprøjte. Brug en bomuldsspids eller små tang til at stabilisere øjet under denne procedure.
BEMÆRK: Sørg for, at kanylen og sprøjten er låst, og at der ikke er tryk i sprøjten (ved at flytte stemplet). Sørg for, at spidsen af nålen forbliver over den perifere iris i midten af det forreste kammer for at undgå beskadigelse af intraokulære strukturer. I tilfælde af grå stær kirurgi, nålen til at opnå den flydende biopsi kan også komme ind i det forreste kammer via en af de paracenteseses, der er skabt til grå stær kirurgi. - Under direkte visualisering via mikroskopet aspireres manuelt ca. 100 μL ufortyndet vandig humor ved hjælp af en 1 ml sprøjte. Flyt sprøjtestemplet med kirurgens ikke-dominerende hånd eller af en uddannet assistent uden at flytte nålen.
BEMÆRK: Få mindre end 100 μL vandig humor, hvis det forreste kammer skulle kollapse. - Fjern forsigtigt nålen fra det forreste kammer.
BEMÆRK: I et phakisk øje skal nålen holdes over iris for at undgå at røre linsen. Positivt pres på kloden kan øge tilbagesvaling. Frigivelse af bomuldsspidsen, før nålen trækkes tilbage, hjælper med at reducere tilbagesvaling. - Træk stemplet tilbage og se, hvordan luften og den opsamlede væske bevæger sig.
- Injicer sprøjten i cryovial. Den ekstra luft rydder sprøjtens døde rum.
- Brug stregkoden på kryovialen til at scanne prøven til REDCap-formularen på en computer på operationsstuen (flere detaljer i trin 3.1 til 3.9).
- Overfør straks cryovial til tøris i køleboksen.
- Fortsæt med den operation, der er planlagt for patienten (f.eks. en grå stær operation som tidligere beskrevet7 ).
- Indsamling af glasagtige flydende biopsier
BEMÆRK: Følgende trin bør kun udføres af en uddannet vitreoretinal kirurg. Glasagtige flydende biopsier kan opnås i begyndelsen af en vitrektomi8. Da målet er at samle en ufortyndet glasagtig prøve, vil vitrektomiskæreren ikke blive primet med væske1.
BEMÆRK: Et sterilt felt opretholdes i henhold til standard plejeprotokoller i operationsstuen. Præoperative procedurer relateret til patientbedøvelse følger standardplejetrinnene for forreste kammer og vitreoretinale operationer.- Forbered og draperer øjet til kirurgi og placer et sterilt lågspekulum for optimal visualisering af det sterile felt.
- Opret sklerotomier med en 23-, 25- eller 27-G trocarkanyle efter standardplejeprocedurerne. Indsæt infusionskanylen og bekræft visuelt den passende placering i glaslegemet.
- I glaslegemet skal du aktivere glaslegemeskæreren uden infusion for at opsamle en ufortyndet glasagtig prøve. Manuelt aspireres 0,5 til 1,0 ml glaslegeme manuelt ved hjælp af en sprøjte, der er forbundet til glaslegemeekstruderingskanylen1.
- Fjern glaslegemet fra øjet og tænd væskeinfusionen.
- Opsug den resterende væske i slangen ind i sprøjten.
- Afbryd sprøjten.
- Prøven behandles som beskrevet for en vandig humorprøve i punkt 2.3 (trin 2.3.5 til trin 2.3.9).
3. Behandling af prøver i operationsstuen og tilføjelse af prøver til databasen
- Bed laboratorieteknikeren om at tage den forberedte kryoviale (0,5 ml for vandig humor og 1,9 ml for glasagtige prøver) og gå til kirurgen uden at røre ved sterilt OR-udstyr.
- Bed laboratorieteknikeren om at åbne kryovialen.
- Tøm sprøjten direkte ind i cryovialen.
- Bed laboratorieteknikeren om straks at opsummere kryovialen.
- Bed laboratorieteknikeren om at gå tilbage til MORLI og straks overføre prøven til tøris i køleboksen (-80 °C). Luk låget på kassen.
- Åbn en ny prøvesamlingsformular. Indtast følgende oplysninger i det respektive felt i formularen: sagsbehandler, sted og dato for indsamling, patientidentifikationsnummer og andre grundlæggende oplysninger, såsom alder, køn, højre eller venstre øje, diagnose, præoperativ historie (fritekst), oplysninger om proceduren (f.eks. operationstype) samt oplysninger om prøverne, såsom antal indsamlede prøver, type prøver (vandig humor, glasagtig) og andre detaljer såsom mængder. Tilføj rørets stregkode ved hjælp af stregkodescanneren.
- Klik på Send / Næste.
- Gentag trin 3.1 til 3.7, hvis der indsamles yderligere prøver.
- Når alle eksempler er sikret, skal du klikke på Gem og send i formularen REDCap-eksempelindsamling. Log derefter ud af databasen og computeren/tabletten.
4. Overførsel af kryoialer til opbevaring
- Transporter prøverne på tøris i køleboksen fra operationsstuen til laboratoriet, og læg dem på en laboratoriebænk ved siden af en laboratoriecomputer.
- Log ind på REDCap på laboratoriecomputeren ved hjælp af dit login-id og din adgangskode.
- Brug handsker. Tag en af de indsamlede prøver og scan stregkoden på kryovialet ind i databasen (flere detaljer i afsnit 5). Læg straks prøven tilbage på tøris.
- Få en anden beholder fyldt med tøris.
- Få fat i et stativ til kryoialerne fra -80 °C fryseren. Placer den i den anden beholder på tøris.
BEMÆRK: Der kræves et 96-format rack til 0,5 ml vandige humorrør og et 48-format rack til 1,9 ml glasagtige rør. - Scan stregkoden på stativet til databasen (flere detaljer i afsnit 5).
- Overfør prøven til stativet.
- Tilføj placeringen af hætteglassene i stativet til databasen (flere detaljer i afsnit 5).
- Klik på Gem og send.
- Transporter stativet med hætteglassene på tøris til køleskabet til opbevaring ved -80 °C. Tilføj stativet til en bestemt position i køleskabet ved hjælp af et koordinatsystem. Dette vil senere gøre det muligt nemt at hente prøver til downstream-analyse.
5. Formular til opbevaring af prøver
- Udfyld en lagerformular for hver prøve, der indsamles i indtastningsformularfasen. Klik på den tomme cirkel eller "+" under Prøvelager for at oprette og åbne en ny lagerformular.
- Angiv den dato, hvor denne formular er udfyldt, under Postarkiveringsdato.
- Scan eller skriv tubestregkoden under Specimen Tube Barcode. Læg straks prøven tilbage på tøris.
- Vælg, om en prøve skal udleveres, eller om prøven skal til intern biorepository-lagring.
- Kontroller, at der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra patienten, og markér feltet under Bekræft overholdelse af samtykke, og indtast dit navn under Samtykke bekræftet af.
- Vælg et frit og passende sted til cryovial i stativet. Overfør kryovialen i denne position til stativet (f.eks. position A1). Opbevar stativet på tøris.
- I fasen Placering skal du angive følgende oplysninger: fryserens placering under Fryser, hyldenummeret, hvor prøven skal opbevares, under Hylde, kassens stregkode under Kassestregkode, rørpositionen i kassen for række (Rørposition (række)) og kolonne (Rørposition (kolonne)).
BEMÆRK: Eventuelt kan en kasseetiket også indtastes under Box Label, hvilket kan gøre det lettere at finde kassen i fryseren. - Angiv følgende oplysninger under afsnittet Anvendelse : navnet på det projekt, som eksemplet bruges til (Projektnavn), prøvevolumen i en af følgende kategorier: fuld, delvis, næsten tom eller tom (Specimen Volume) og lagernotaer, hvis det er relevant, under Lagernoter.
BEMÆRK: Dato, klokkeslæt og bruger, der sidst åbnede formularen, udfyldes automatisk for at sikre en leverandørkæde, der kan gennemgås og revideres efter behov. - Bekræft, at formularen er udfyldt, ved at klikke på Fuldfør under Fuldført?.
- Klik på Gem & Afslut formular. Dette bringer dig tilbage til patientoversigten.
- For hvert rør, der blev indsamlet, skal du generere en anden prøveindsamlingsformular ved at klikke på "+" under Prøvelager. Gentag derefter trin 5.1 til 5.10.
- Klik på Gem og afslut for at udfylde formularen og logge af databasen og computeren/tabletten.
- Overfør prøveristen (på tøris) til køleskabet i den forudbestemte position.
6. Udtagning af kirurgiske prøver til downstream-analyse
BEMÆRK: Prøver arkiveres ofte i flere år, før de analyseres. De stregkodede kryovialer og det søgbare REDCap-databasesystem gør det nemt at finde og lokalisere hver prøve til downstream-analyse.
- Identificer eksempler af interesse for eksperimentet ved hjælp af databasens søgefunktion. Dette vil gøre det muligt at finde f.eks. alle vandige humorprøver fra patienter mellem 20 og 40 år med diabetisk retinopati.
- Få placeringen af de kryovialer, der er af interesse (fryser, hylde/rack, prøvestativ, koordinater i stativet). Skriv dem ned, udskriv dem, eller hav dem tilgængelige på en mobil computer/tablet for at gøre det lettere at finde prøverne i fryseren.
- Markér eksemplerne som brugt i databasen.
- Klik på Gem og afslut for at udfylde formularen og logge af REDCap og computeren/tabletten.
Representative Results
De indsamlede flydende biopsiprøver kan underkastes en række molekylære analyser, herunder analyse af DNA, proteiner, glykaner og metabolitter. Det er tidligere påvist, at langtidsopbevaring over flere år ved -70 °C ikke signifikant påvirkede integriteten af den proteomiske profil9. REDCap-databasen muliggør enkel og hurtig hentning af prøver. Databasen kan søges efter prøver fra en specifik gruppe patienter, fx alle patienter med diabetisk retinopati. Databasen vil derefter give stregkoderne på rørene og positionerne på lager. Indtil nu har vi indsamlet og arkiveret mere end 1.000 flydende biopsier. Databasen gjorde det muligt for os hurtigt at finde prøverne til downstream-analyser 3,10 og hjalp med at udføre følgende eksperimenter.
En 17-årig kvinde præsenteret med retinal og optisk nervebetændelse. Hun var immunkompromitteret, og der var bekymring for infektion. Vandig humor blev indsamlet fra hendes højre øje og sendt til DNA-PCR-analyse. Resultaterne var positive for cytomegalovirus og negative for herpes simplex virus og toxoplasmose. Disse resultater illustrerer, at vandige humor flydende biopsier kan hjælpe med at skelne infektiøse fra ikke-infektiøse former for intraokulær inflammation, hvilket er afgørende for at vælge den passende terapi.
Væskekromatografi-massespektrometri muliggør en upartisk og semikvantitativ analyse af proteomet. I en flydende biopsi fra glaslegemet hos en patient, der gennemgik vitrektomi, var teknikken i stand til at identificere 484 unikke proteiner, herunder komplement C3 (C3), Opticin (OPTC) og kollagen type II alfa 1 (COL2A1) (figur 1A).
Tre glasagtige flydende biopsier blev analyseret ved hjælp af en glycoproteomics multiplex ELISA (se materialetabel)11. Assayet detekterede glykosyleringsprofilerne for 500 humane proteiner og fangede en række biologiske veje, såsom metabolisme, immunrespons, celleadhæsion og actinorganisation (figur 1B).
En metabolomics screening ved hjælp af kapillær elektroforese kombineret med Fourier transformeret massespektrometri12 (se tabel over materialer) identificerede 292 forskellige metabolitter i tre vandige humor flydende biopsiprøver. En vejanalyse (se materialetabel)13 identificerede en række metaboliske veje, herunder aminosyremetabolisme, urinstofcyklus og carnitinsyntese (figur 1C).
Figur 1: Repræsentative resultater . (A) Proteomics analyse af human glaslegeme humor ved hjælp af væskekromatografi og tandem massespektrometri (LC-MS / MS) identificeret 484 unikke proteiner i en enkelt flydende biopsi. Proteinniveauer vises og rangeres baseret på spektraltællinger. Repræsentative proteiner fremhæves med blåt. (B) En glycoproteomics multiplex ELISA detekterede glycosyleringsniveauer af 500 unikke proteiner i tre glasagtige flydende biopsier. En STRING-proteininteraktionsanalyse identificerede klynger af proteininteraktioner (klynger med mindst 10 proteiner vises). Den mest markant forbedrede vej vises for hver klynge. (C) Metabolomics analyse ved hjælp af massespektrometri identificeret 292 forskellige metabolitter i tre vandige humor flydende biopsier. Hvert punkt repræsenterer en prøve. Barens højde svarer til det gennemsnitlige antal metabolitter, fejllinjen repræsenterer standardafvigelsen. Det højre panel viser betydeligt forbedrede stier. Antallet af påviste metabolitter (tæller) samt det samlede antal metabolitter i hver vej (nævner) vises. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Kirurgiske prøver fra patienter tillader direkte molekylær karakterisering af sygdom hos levende mennesker 2,3,4,14 og kan hjælpe med at overvinde begrænsningerne i celle- og dyresygdomsmodeller, der ikke fuldt ud rekapitulerer menneskelig sygdom 15,16. Molekylær analyse af humant væv kan forbedre udvælgelsen af nye lægemiddelmål og kan bidrage til en højere succesrate for kliniske forsøg og lægemiddelgodkendelse17. Derudover giver denne tilgang potentialet for personlig medicin, da det opnåede væv bevarer det unikke genomiske, epigenomiske, metabolomiske, glycomiske og proteomiske fingeraftryk af hver enkelt person 2,18,19.
Høj og ensartet prøvekvalitet er grundlæggende for alle molekylære analyseapplikationer. Tidligere undersøgelser har vist, at øjeblikkelig frysning efter prøveudtagning og undgåelse af gentagne fryse-/optøningscyklusser er afgørende for høje prøvekvaliteter 9,20. Langtidsopbevaring over flere år ved -70 °C påvirkede ikke signifikant integriteten af den proteomiske profil9. En standardiseret protokol er et vigtigt fundament for at reducere bias og forbedre sammenligneligheden af videnskabelige data, især når flere personer (kirurger, teknikere og andre) eller forskellige institutioner er involveret i prøveudtagningsprocessen. Bortset fra prøvekvaliteten er annotering af prøver en anden vigtig faktor, der kræver standardisering for at muliggøre korrelation af molekylære fund med kliniske data. Vores protokol er afhængig af tre væsentlige principper for at opnå dette: 1) en standardiseret prøveudtagningsprocedure for vandig humor og glasagtige flydende biopsier af en øjenkirurg, 2) øjeblikkelig behandling og snapfrysning af prøver i operationsstuen af laboratoriepersonale og 3) en metadataannotering af hver prøve i en webbaseret database, der giver forskere mulighed for hurtigt at finde prøver til senere eksperimenter.
Ud over glasagtige prøver20 etablerer denne arbejdsgang også den standardiserede samling af vandige humor flydende biopsier til molekylær analyse. Den vandige humor er en meget tilgængelig, kompleks væske i øjets forreste kammer, der ikke kun afspejler okulære sygdomme i det forreste, men også i det bageste segment af øjet, herunder retinal sygdom18,21. Sammen med det faktum, at et stort antal vandige humorprøver kunne indsamles, f.eks. under grå stær-kirurgi, en af de hyppigst udførte operationer på verdensplan, gør disse funktioner det til en interessant kilde til flydende biopsier fra det menneskelige øje. Den standardiserede metadataannotering for hver prøve, der er etableret i denne arbejdsgang, kan også muliggøre korrelation af proteomdata med potentielle kliniske opfølgningsdata. Dette giver en spændende mulighed for at identificere nye prognostiske biomarkører, som kan hjælpe med at estimere prognosen for fremtidige patienter.
Imidlertid har molekylær analyse af humane kirurgiske prøver også vigtige begrænsninger. For eksempel er komplekse eksperimentelle manipulationer ofte kun mulige i dyre- og cellemodeller. En løsning kan være at sammenligne dyre- eller cellemodellers molekylære profil med den humane sygdomsprofil. Denne strategi kan identificere overlappende proteinbiomarkører og terapeutiske mål, der kan valideres i dyr eller cellemodeller for at identificere de mest lovende kandidater, der korrelerer med menneskelig sygdom og sandsynligvis vil lykkes i kliniske forsøg 4,16.
Afslutningsvis etablerer vores arbejdsgang en praktisk grænseflade mellem operationsstuen og forskningslaboratoriet, der muliggør standardiseret og høj gennemstrømningsindsamling, annotering og opbevaring af kirurgiske prøver af høj kvalitet til molekylær downstream-analyse, hvilket giver et værdifuldt fundament for fremtidig translationel forskning.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
VBM støttes af NIH-bevillinger (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 og P30EY026877), Stanford Center for Optic Disc Drusen og Research to Prevent Blindness, New York, USA. JW og DR er støttet af VitreoRetinal Surgery Foundation, USA. DR er støttet af DARE Fellowship, som er støttet af Lundbeckfonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 68-0703-12 | used for aqueous humor samples |
| 1 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | - | for aqueous humor biopsies |
| 1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-7643 | used for vitreous samples |
| 3 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | - | for vitreous biopsies |
| 30-32-gauge needle | surgical grade, whatever available in hospital | - | for aqueous humor biopsies |
| Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS) | Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan | - | - |
| Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system | Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA | - | for vitreous biopsies |
| Cooling box | Standard styrofoam box, whatever available in lab | - | - |
| Dry ice | Whatever available in lab | - | - |
| Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable | Zebra Symbol | DS9208-SR4NNU21Z | Barcode scanner |
| Human Glycosylation Antibody Array L3 | RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA | GAH-GCM-L3 | - |
| Mac mini | Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA | - | - |
| MetaboAnalyst software | Pang et al., 2021, PMID: 34019663 | - | - |
| Rack for 0.5ml tubes, 96-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 66-51026 | for aqueous humor samples |
| Rack for 1.9ml tubes, 48-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-9451 | for vitreous samples |
| REDCap browser-based sample database | REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org | - | - |
References
- Mishra, K., et al. Intraoperative complications with vitreous biopsy for molecular proteomics. Ophthalmic Surgeries, Lasers Imaging Retina. 54 (1), 32-36 (2023).
- Velez, G., Bassuk, A. G., Colgan, D., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Therapeutic drug repositioning using personalized proteomics of liquid biopsies. JCI Insight. 2 (24), (2017).
- Velez, G., et al. Liquid biopsy proteomics of uveal melanoma reveals biomarkers associated with metastatic risk. Molecular Cancer. 20 (1), 39 (2021).
- Wert, K. J., et al. Metabolite therapy guided by liquid biopsy proteomics delays retinal neurodegeneration. EBioMedicine. 52, 102636 (2020).
- Harris, P. A., et al. The REDCap consortium: Building an international community of software platform partners. Journal of Biomedical Informatics. 95, 103208 (2019).
- Finn, A. P., Materin, M. A., Mruthyunjaya, P. Choroidal tumor biopsy: A review of the current state and a glance into future techniques. Retina. 38 Suppl 1, S79-S87 (2018).
- Tarantola, R. M., Graff, J. M., Somani, R., Mahajan, V. B. Temporal approach for small-gauge pars plana vitrectomy combined with anterior segment surgery. Retina. 32 (8), 1614-1623 (2012).
- Mahajan, V. B., et al. Sutureless triplanar sclerotomy for 23-gauge vitrectomy. Archives in Ophthalmology. 129 (5), 585-590 (2011).
- Mitchell, B. L., Yasui, Y., Li, C. I., Fitzpatrick, A. L., Lampe, P. D. Impact of freeze-thaw cycles and storage time on plasma samples used in mass spectrometry based biomarker discovery projects. Cancer Informatics. 1 (1), 98-104 (2005).
- Velez, G., et al. Proteomic insight into the pathogenesis of CAPN5-vitreoretinopathy. Science Reports. 9 (1), 7608 (2019).
- Montgomery, M. R., Hull, E. E. Alterations in the glycome after HDAC inhibition impact oncogenic potential in epigenetically plastic SW13 cells. BMC Cancer. 19 (1), 79 (2019).
- Okamoto, N., et al. Comparison of serum metabolomics pathways and patterns between patients with major depressive disorder with and without type 2 diabetes mellitus: An exploratory study. Journal of Integrated Neuroscience. 22 (1), 13 (2023).
- Pang, Z., et al. MetaboAnalyst 5.0: narrowing the gap between raw spectra and functional insights. Nucleic Acids Research. 49 (W1), W388-W396 (2021).
- Wolf, J., et al. The Human Eye Transcriptome Atlas: A searchable comparative transcriptome database for healthy and diseased human eye tissue. Genomics. 114 (2), 110286 (2022).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
- Wolf, J., et al. Comparative transcriptome analysis of human and murine choroidal neovascularization identifies fibroblast growth factor inducible-14 as phylogenetically conserved mediator of neovascular age-related macular degeneration. Biochimca et Biophysica Acta Molecular Basis of Diseases. 1868 (4), 166340 (2022).
- Dowden, H., Munro, J. Trends in clinical success rates and therapeutic focus. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (7), 495-496 (2019).
- Li, H. T., et al. Characterizing DNA methylation signatures of retinoblastoma using aqueous humor liquid biopsy. Nature Communication. 13 (1), 5523 (2022).
- Velez, G., et al. Personalized proteomics for precision health: identifying biomarkers of vitreoretinal disease. Translational Vision Science and Technology. 7 (5), 12 (2018).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Applications. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Rinsky, B., et al. Analysis of the aqueous humor proteome in patients with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 62 (10), 18 (2021).
