JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Hindi was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

TIRF माइक्रोस्कोपी के साथ रेटिना द्विध्रुवी कक्ष में इमेजिंग exocytosis

1, 1

1Cellular and Molecular Physiology, Yale University School of Medicine

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Biology. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.161.240.10, User IP: 54.161.240.10, User IP Hex: 916582410

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    इस वीडियो में, हम का प्रदर्शन कैसे लेबल और एकल synaptic पुटिका और सुनहरीमछली रेटिना द्विध्रुवी कुल आंतरिक reflectance प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRF) का उपयोग कर कक्षों में exocytosis तस्करी कल्पना.

    Date Published: 6/09/2009, Issue 28; doi: 10.3791/1305

    Cite this Article

    Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy. J. Vis. Exp. (28), e1305, doi:10.3791/1305 (2009).

    Abstract

    कुल आंतरिक reflectance प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRF) है कि फ्लोरोसेंट अणु है कि कांच के रूप में एक उच्च अपवर्तक सूचकांक पदार्थ करीबी रहे हैं की चुनिंदा इमेजिंग द्वारा कोशिका झिल्ली पर हो रहा घटनाओं के अध्ययन की अनुमति देता है एक तकनीक है

    Protocol

    भाग 1: विच्छेदन और द्विध्रुवी सेल अलगाव

    1. तालिका 2 में सूचीबद्ध समाधानों में तैयार 'ringers के पीएच (बाह्य) समाधान 7.4 NaOH के साथ समायोजित किया जाना चाहिए और आंतरिक समाधान के पीएच CsOH के साथ 7.2 करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से आंतरिक समाधान को सुरक्षित रखें और यह 4 पर रखने ° उपयोग करें जब तक सी;
    2. विच्छेदन के लिए पहले कम से कम 30 मिनट के लिए एक सुनहरीमछली डार्क अनुकूल;
    3. (, सिग्मा, सेंट लुइस, MO प्रकार वी hyaluronidase, 1100 इकाइयों में कम 2 Ca + घंटी / एमएल) और एल सिस्टीन (0.5 मिलीग्राम / एमएल के 10 एमएल जबकि पशु काले adapts, hyaluronidase की 5 एमएल तैयार + कम Ca 2 में घंटी) समाधान और papain (lyophilized पाउडर, 40 इकाइयों / एमएल वजन, पाचन समाधान के 5 एमएल के लिए सिग्मा, सेंट लुइस, MO) ;
    4. शल्य कैंची के साथ त्वरित शिरच्छेद द्वारा सुनहरीमछली euthanize और और एक # 11 स्केलपेल ब्लेड के साथ मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को नष्ट;
    5. # 7 घुमावदार Dumont संदंश की मदद के साथ अतिरिक्त आंख की मांसपेशियों को नष्ट करने और परितारिका कैंची के साथ ऑप्टिक तंत्रिका काटने आँखों निकालें;
    6. प्लेस एक फिल्टर पेपर और पंचर # 11 स्केलपेल ब्लेड के टिप के साथ scleral किनारी का एक टुकड़ा पर नजर बल्ब;
    7. हवा निकाल पूरे अंदर vannas कैंची की एक जोड़ी के ब्लेड का परिचय और पूरे पूर्वकाल खंड में कटौती दूर;
    8. शेष ऑप्टिक कप के शीर्ष पर एक फिल्टर पेपर का छोटा सा टुकड़ा प्लेस और शीशे हास्य के साथ कागज सोख क्रम में कुछ दबाव डालती;
    9. यह करने के लिए संलग्न रेटिना के साथ फिल्टर पेपर लिफ्ट और vannas कैंची की एक सममूल्य के साथ ऑप्टिक तंत्रिका कटौती,
    10. फिल्टर hyaluronidase और # 7 Dumont चिमटी की मदद के साथ फिल्टर पेपर से रेटिना बंद समाधान छील के साथ एक 35 मिमी प्लास्टिक संस्कृति डिश में रेटिना युक्त कागज प्लेस;
    11. 4-6 टुकड़ों में एक औद्योगिक कार्बन इस्पात ब्लेड एकल धार के आधे के साथ रेटिना कट और इसे 20 मिनट के लिए hyaluronidase समाधान में बैठते हैं;
    12. जबकि hyaluronidase के लिए इंतज़ार कर को प्रभावी करने के लिए, papain एल सिस्टीन समाधान के 5 एमएल जोड़ने और जब तक तरल पारदर्शी हो जाता है बैठने के (लगभग 5-10 मिनट);
    13. कम 2 Ca + घंटी है धो 3x रेटिना के टुकड़े और उन्हें 30-35 मिनट के लिए papain समाधान में बैठ;
    14. धो कम 2 Ca + घंटी है 3x रेटिना के टुकड़े और उन्हें 4 में उपयोग करें जब तक दुकान ° सी में एक 35 मिमी प्लास्टिक संस्कृति पकवान युक्त कम 2 Ca + घंटी है;
    15. कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए, एक microcentrifuge कम Ca 2 + घंटी है 500 एमएल युक्त ट्यूब में रेटिना का एक टुकड़ा डाल दिया और धीरे धीरे यह एक गिलास हदबंदी विंदुक के साथ ऊपर और नीचे pipetting द्वारा रेटिना triturate, ध्यान से किसी भी हवाई बुलबुले का उत्पादन नहीं. हदबंदी pipettes एक Bunsen बर्नर के साथ एक गिलास पाश्चर विंदुक की नोक हीटिंग और थोड़ा यह संरचनात्मक संदंश की मदद से झुका के द्वारा गढ़े हैं;
    16. एक घर बनाया रिकॉर्डिंग पहले से कम 2 Ca + घंटी की 2 एमएल के साथ भरा कक्ष रेटिना निलंबन की एक बूंद जोड़ने के द्वारा अलग कक्षों प्लेट. कक्ष के मध्य में एक परिपत्र पूरे के साथ एक 35 मिमी प्लास्टिक पकवान संस्कृति और 1.78 अपवर्तक सूचकांक (PlanOptik जर्मनी) गिलास नीचे एक सिलिकॉन elastomer (184 Sylgard के साथ चिपके के एक परिपत्र coverslip के नीचे आधे के होते हैं, डॉव Corning , मिडलैंड, एमआई).

    भाग 2: द्विध्रुवी सेल लोड हो रहा है और बाहर धो

    TIRF इमेजिंग synaptic vesicles के बाहर का सबसे अच्छा एक बहुत ही उच्च NA उद्देश्य और एक संवेदनशील कैमरे के साथ एक उद्देश्य प्रकार TIRFM माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है. हमारे प्रयोगों के लिए, हम एक EMCCD (झरना 512B, नट वैज्ञानिक, Tucson, AZ) के साथ 1.65 एनए उद्देश्य (ए पी ओ x100 हे मानव संसाधन, 1.65 एनए, ओलिंप, जापान) का उपयोग करना चुनते हैं. बहुत ही उच्च NA उद्देश्य के उपयोग के उच्च अपवर्तक ग्लास coverslips और विसर्जन द्रव (गंधक के साथ di-iodomethane) का उपयोग जरूरी है. हमारे शर्तों के तहत, उत्तेजना प्रकाश एक लगभग 50 एनएम के निरंतर लंबाई के साथ एक तेजी से खस्ताहाल क्षेत्र तक ही सीमित है.

    1. उच्च अपवर्तक सूचकांक तरल (एम श्रृंखला, अपवर्तक सूचकांक = 1.7800, Cargille लैब्स, Cedar Grove, न्यू जर्सी) के एक खुर्दबीन उद्देश्य के लिए ड्रॉप जोड़ें;
    2. रिकॉर्डिंग कक्ष खुर्दबीन उद्देश्य के शीर्ष पर ध्यान प्लेस और ध्यान से जमीन इलेक्ट्रोड और superfusion बाहर निकलें कक्ष पाइप माउंट;
    3. चैम्बर माइक्रोस्कोप पर 10-20 मिनट के लिए बैठने के लिए कोशिकाओं को सिंक और नीचे का पालन की अनुमति;
    4. इस बीच में, 1mm ® ((±)- ,5,7,8 6-hydroxy-2-tetramethylchromane-2 कार्बोक्जिलिक एसिड trolox 5 एमएल तैयार, सिग्मा, सेंट लुइस, एमओ) समाधान में उच्च + K घंटी है . Sonicate जब तक भंग;
    5. कम 2 Ca + घंटी में एक ADVASEP 7 मिमी (सिग्मा, सेंट लुइस, MO): ADVASEP-7 धोने समाधान के 15 एमएल तैयार. नोट करें कि-7 ADVASEP उपयोग वैकल्पिक है और अगर वांछित छोड़े गए किया जा सकता है है;
    6. Superfusion ली पर्जnes और जोड़ने के ADVASEP-7 धोने समाधान, कम Ca 2 + घंटी और नियंत्रण घंटी superfusion प्रणाली के लिए है;
    7. पतली दीवारों borosilicate ग्लास (डब्ल्यूपीआई, Sarasota, FL Kwik-Fil ® TW150-3) से लोड हो रहा है pipettes खींचो. Puffer विंदुक resistances MΩ 1.5-2.5 रेंज में हैं;
    8. समाधान; FM1-43 ® (Invitrogen, Carlsbad, सीए - (4 styryl (dibutylamino)) pyridinium dibromide, "विशेष पैकेजिंग" एन (3 triethylammoniumpropyl) -4) तैयार करें. सबसे पहले, FM1-43 के एक शीशी (100 मिलीग्राम) ® 160 μL आसुत पानी जोड़कर एक 1 मिमी शेयर करना. इस शेयर 4 ° C में रखा जा सकता है एक सप्ताह के लिए. फिर, 1 एमएल उच्च + K है घंटी + 1mm trolox ® ® FM1-43 के 5 μL जोड़ने. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से समाधान को सुरक्षित रखें और यह 4 पर रखने ° उपयोग करें जब तक सी;
    9. पर मुड़ें खुर्दबीन उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश और बरकरार द्विध्रुवी कोशिकाओं के लिए खोज. थोड़ा माइक्रोस्कोप का दोहन करने के लिए सुनिश्चित करें कि न्यूरॉन्स मजबूती कक्ष के नीचे से जुड़े होते हैं;
    10. Superfusion कलम करीब सेल करने के लिए ब्याज की स्थिति और लगातार कम Ca 2 + घंटी के साथ तैयारी perfuse;
    11. बंद कमरे की लाइट बंद करें और एक लाल लंबे समय से गुजारें फिल्टर (यानी RG630, Schott, जर्मनी) जोड़ने के लिए ऑप्टिकल पथ एफएम डाई की उत्तेजना को कम करने के लिए;
    12. एफएम डाई समाधान के 10 μL के साथ एक लोड हो रहा है विंदुक भरें micromanipulator में पिपेट माउंट और तैयारी पर overpressure बिना विंदुक है जब तक यह द्विध्रुवी सेल आप लोड करना चाहते हैं के रूप में एक ही फोकल हवाई जहाज़ पर है कम. सुनिश्चित करें कि आप कम से कम दो इलेक्ट्रोड धारकों है: एफएम डाई के लिए इस्तेमाल एक पैच clamping के लिए नहीं इस्तेमाल किया जा सकता है या फिर यह intracellular समाधान दूषित हो सकता है;
    13. अक्षतंतु टर्मिनल से करीब 10 सुक्ष्ममापी की दूरी पर puffer खोलने स्थिति, superfusion सिस्टम बंद और विंदुक overpressure मोड़ पर 10 सेकंड के लिए डाई समाधान कश;
    14. Overpressure बंद मुड़ें और, पिपेट चलते बिना 30 सेकंड के लिए प्रतीक्षा;
    15. पर superfusion मुड़ें और ADVASEP-7 समाधान में 5 मिनट के लिए स्नान कक्ष. इस बीच में, स्नान से puffer विंदुक निकालने;
    16. 5 मिनट के बाद, कम 2 + घंटी Ca स्विच और 25-30 मिनट के लिए चैम्बर perfuse अतिरिक्त डाई को हटाने की अनुमति.

    भाग 3: पैच Clamping और TIRFM इमेजिंग

    1. जबकि तैयारी बाहर धोने है, मोटी दीवारों borosilicate ग्लास (B150, Sutter साधन कंपनी, Novato, CA-86-10) पैच pipettes से खींच. पैच विंदुक resistances MΩ 8-10 रेंज में हैं;
    2. बाद बाहर धो पूरा हो गया है, देखने के क्षेत्र के केंद्र में टर्मिनल अक्षतंतु जगह;
    3. आंतरिक समाधान के 7μL के साथ एक पैच विंदुक भरें, पिपेट नल हवाई बुलबुले, कोट, पिघला हुआ दंत मोम (स्टिकी वैक्स, Kerr निगम, ऑरेंज, CA) के साथ विंदुक से छुटकारा पाने के लिए और यह micromanipulator में माउंट;
    4. विंदुक पर overpressure मुड़ें और विंदुक तैयारी पर धीरे धीरे कम. प्रवर्धक में पिपेट प्रतिरोध और सही विंदुक ऑफसेट और संबंधित प्रवर्धक नियंत्रण के साथ समाई की जाँच करें;
    5. Superfusion स्विच करने के लिए घंटी नियंत्रण. विंदुक और सेल के बीच एक gigaseal बनाने के लिए, थोड़ा सेल शरीर के खिलाफ इलेक्ट्रोड की टिप स्पर्श और विंदुक overpressure बंद जबकि धीरे इलेक्ट्रोड के लिए नकारात्मक दबाव लागू करने;
    6. जबकि सील, एम्पलीफायर में "पूरे सेल" मोड का चयन और सेल -60 एम वी के लिए संभावित पकड़े सेट;
    7. इमेजिंग सॉफ्टवेयर है कि पूरे अक्षतंतु टर्मिनल शामिल हैं के साथ ब्याज की एक क्षेत्र चुनें, उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश बंद और, संक्षेप में उजागर (30 ms) 488 एनएम लेजर करने के लिए टर्मिनल, TIRF इमेजिंग के लिए सही नाभीय विमान को खोजने के;
    8. एम्पलीफायर के जैप "कमांड का उपयोग करते हुए थोड़ा नकारात्मक विंदुक के लिए दबाव लागू करने के द्वारा सेल में तोड़;
    9. सेल समाई और श्रृंखला प्रतिरोध के लिए सही है, और तब, जबकि ब्याज की वोल्टेज प्रोटोकॉल लागू इमेजिंग synaptic vesicles के आंदोलन. यह इस स्तर पर महत्वपूर्ण है वोल्टेज प्रोटोकॉल कैमरा फ्रेम दर के साथ सिंक्रनाइज़. हमारे मामले में, प्रत्येक फ्रेम 30 एमएस लंबा है, तो वोल्टेज परिवर्तन इस मूल्य (यानी, हर 300 एमएस या 10 फ्रेम) के गुणकों में पाए जाते हैं;
    10. वसूली के लिए अनुमति देने के परीक्षण के बीच कम से कम 40 सेकंड रुको;
    11. Synaptic रिबन की स्थिति की जांच करने के लिए, चित्र ले जबकि पर 561 एनएम लेजर मोड़.

    1 आंकड़ा
    चित्रा 1: प्रायोगिक सेटअप. एक 488 एनएम लेजर (नीला) उद्देश्य के पीछे फोकल हवाई जहाज़ की परिधि के लिए ध्यान केंद्रित है और कुल आंतरिक प्रतिबिंब ग्रस्त है जब यह गिलास जलीय माध्यम इंटरफ़ेस तक पहुँचता है. परिलक्षित बीम द्वारा उत्पन्न विद्युत क्षेत्र synaptic bott के लिए निकटतम vesicles में लोड fluorophore उत्तेजितकांच के चैम्बर के ओम, जो तब प्रतिदीप्ति (हरा). फ्लोरोसेंट रोशनी तो पर्यवेक्षक की आंख (चित्रित) या एक सीसीडी कैमरे के लिए निर्देशित है. imaged कोशिकाओं की झिल्ली क्षमता और साथ ही उन्हें पैच - clamping के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. इस दृष्टिकोण आने वाले संकेतों (झिल्ली वोल्टेज) और neuronal उत्पादन (exocytosis) के बीच के रिश्ते के अध्ययन की अनुमति देता है.

    चित्रा 2
    चित्रा 2: विशिष्ट परिणाम. वाम: एक पृथक सुनहरीमछली द्विध्रुवी सेल के उज्ज्वल क्षेत्र छवि. ऊपरी सही: द्विध्रुवी सेल अक्षतंतु टर्मिनल में synaptic vesicles के TIRF छवि 1-43 एफएम के साथ भरी हुई ® और 488 एनएम लेजर (एफएम डाई) के साथ imaged. नीचे सही: पट्टी और 561 एनएम लेजर के साथ अक्षतंतु टर्मिनल इमेजिंग सेल के बाद ही टर्मिनल की छवि. Synaptic रिबन rhodamine आधारित ribeye बाध्यकारी पेप्टाइड (Rpep_rhod) द्वारा चिह्नित कर रहे हैं.

    तालिका 1: विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरण.


    नाम
    टाइप निर्माता सूची टिप्पणी
    - एयर तालिका न्यूपोर्ट निगम - -
    IX70 उल्टे माइक्रोस्कोप ओलिंप - उज्ज्वल क्षेत्र के लिए एक टंगस्टन दीपक और TIRF के लिए एक पार्श्व खोलने बंदरगाह से लैस
    TH4 - 100 दीपक शक्ति स्रोत ओलिंप - -
    FF498_581 - Di01 Dichroic फ़िल्टर Semrock - -
    NF01-405_488_568 उत्सर्जन फ़िल्टर Semrock - -
    ए पी ओ x100 हे मानव संसाधन लक्ष्य ओलिंप - 1.65 NA
    RG630 लाल ग्लास फ़िल्टर Schott - -
    - 488 एनएम लेजर सुसंगत - न्यूनतम सत्ता में प्रयोग
    - शटर Uniblitz - -
    VMM-D1 शटर चालक Uniblitz - -
    - 561 एनएम लेजर Melles Griot - -
    - शटर Uniblitz - -
    VMM डी 3 शटर चालक Uniblitz - -
    छिड़काव दबाव किट Superfusion सिस्टम वैज्ञानिक स्वचालित 09-04 -
    छिड़काव पेन Superfusion सिस्टम वैज्ञानिक स्वचालित - -
    8 Valvelink Superfusion प्रणाली नियंत्रक वैज्ञानिक स्वचालित - -
    झरना 512B EM सीसीडी कैमरा नट वैज्ञानिक - -
    7.1 Metamorph इमेजिंग सॉफ्टवेयर आण्विक डिवाइसेज - -
    ईपीसी - 9 पैच दबाना प्रवर्धक HEKA Elektronik - -
    नाड़ी एम्पलीफायर सॉफ्टवेयर HEKA Elektronik - -
    सांसद 285 Micromanipulator Sutter साधन - -
    - इलेक्ट्रोड धारक HEKA Elektronik - 1.5 मिमी आयुध डिपो गिलास, 2 इकाइयों के लिए
    ® Kwik-Fil TW150-3 Borosilicate केशिका ग्लास थोक मूल्य सूचकांक - फिलामेंट के बिना
    B150 86-10 Borosilicate केशिका ग्लास Sutter साधन - फिलामेंट के साथ
    P-97 Microelectrode डांड़ी Sutter साधन - 3x3 बॉक्स रेशा और पर्यावरण चैम्बर से लैस
    - दबाव वैक्यूम एयर पम्प थॉमस वैज्ञानिक 7893B05 वैक्यूम बनाता चैम्बर और pipettes लिए overpressure से तरल पदार्थ को हटाने
    MatLab R2008a विश्लेषण सॉफ्टवेयर Mathworks - -
    353001 35 मिमी प्लास्टिक संस्कृति व्यंजन बाज़ - -
    - उच्च अपवर्तक सूचकांक ग्लास PlanOptik - अपवर्तक सूचकांक 488 1.78 = एनएम
    श्रृंखला एम उच्च अपवर्तक सूचकांक लिक्विड Cargille लैब्स - अपवर्तक सूचकांक = 1.78
    184 Sylgard सिलिकॉन Elastomer किट डॉव Corning - -
    Glutathione त्रिपेपटाइड ईएमडी रसायन मुफ्त radicaमैं मेहतर
    Hyaluronidase एनजाइम सिग्मा H6254 टाइप V
    एल - सिस्टीन एमिनो एसिड Fluka 30090 Papain सक्रिय
    Papain एनजाइम Fluka 76220 Carica पपीता से
    Trolox ® घुलनशील विटामिन ई सिग्मा 56510 मुफ्त कट्टरपंथी मेहतर
    ADVASEP - 7 Sulfonated
    बी - Cyclodextrin व्युत्पन्न
    सिग्मा A3723 1-43 एफएम कम कर देता ® पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति
    एफएम 1-43 ® प्रतिदीप्त डाई Invitrogen T35356 "विशेष पैकेजिंग"
    स्टिकी वैक्स पिपेट कोटिंग एजेंट Kerr निगम - विंदुक समाई घट जाती है

    तालिका 2: शारीरिक इस अध्ययन में इस्तेमाल समाधान.


    पदार्थ
    निम्न 2 + घंटी Ca नियंत्रण घंटी उच्च + K घंटी है आंतरिक समाधान
    NaCl 120 मिमी 120 मिमी 97.5 मिमी -
    KCl 2.5 मिमी 2.5 मिमी 25 मिमी -
    2 MgCl 1 मिमी 1 मिमी 1 मिमी 4 मिमी
    2 CaCl 0.5 मिमी 2.5 मिमी 2.5 मिमी -
    HEPES 10 मिमी 10 मिमी 10 मिमी 10 मिमी
    EGTA 0.75 मिमी - - 0.5 मिमी
    ग्लूकोज़ 10 मिमी 10 मिमी - -
    Glutathione 2 मिमी 2 मिमी - 1 मिमी
    CH 3 सीएसओ एस 3 * - - - 100 मिमी
    TEACl - - - 10 मिमी
    एटीपी मिलीग्राम - - - 10 मिमी
    GTP-ली - - - 1 मिमी
    Rpep - rhod ** - - - 5 मिमी
    आयतन 200 एमएल 100 एमएल 5 μL 100 μL

    * सीज़ियम methanesulfonate.
    ** Ribeye बाध्यकारी पेप्टाइड: rhodamine + EQTVPVDLSVARDR COOH (1997.75 मेगावाट).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    उद्देश्य प्रकार TIRF माइक्रोस्कोपी के लाभ कर रहे हैं कि एक) यह उद्देश्य के फोकल हवाई जहाज़ के भीतर एक संकीर्ण क्षेत्र में उत्तेजना प्रकाश सीमित द्वारा उत्कृष्ट ऑप्टिकल सेक्शनिंग प्रदान करता है, जिससे बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश कम से कम, 2) के बाद से प्रकाश दूरी के साथ तेजी से बूँदें , एक ऊर्ध्वाधर दिशा में आंदोलन प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन के रूप में नजर रखी जा सकता है, 3) उच्च संख्यात्मक एपर्चर 1,5 उद्देश्य के माध्यम से कुशल प्रकाश संग्रह.

    तकनीक के मुख्य दोष यह है कि यह इमेजिंग कोशिका की सतह है, जो मोटे तौर पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में एक ultrathin अनुभाग के बराबर है 100 एनएम और के भीतर हो रहा घटनाओं तक सीमित है. इसलिए, इन घटनाओं के दृश्य जा रहा है दृढ़ता से कांच का पालन synaptic कांच का पालन झिल्ली के पैच करीब रिबन की उपस्थिति पर और vesicles के सफल लोड हो रहा है पर कोशिकाओं, पर निर्भर करता है. हमारी प्रोटोकॉल द्विध्रुवी सेल synaptic 2,6 टर्मिनल vesicles भीतर की कुल संख्या के केवल 1-2% की लोडिंग के लिए सक्षम बनाता है. साथ ही कहा, यह स्पष्ट है कि वहाँ हैं हम छवि के लिए कर रहे हैं की तुलना में कोशिका की सतह पर बहुत अधिक हो रहा घटनाओं रहे हैं.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Acknowledgements

    यह काम NIH अनुदान EY 14990 के द्वारा समर्थित किया गया था.

    References

    1. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
    2. Zenisek, D., Steyer, J.A., & Almers, W. Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones. Nature 406, 849-854 (2000).
    3. Zenisek, D. Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).
    4. Zenisek, D., Horst, N.K., Merrifield,C., Sterling, P., & Matthews, G. Visualizing synaptic ribbons in the living cell. J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).
    5. Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
    6. Rouze, N.C., & Schwartz, E.A. Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse. J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter