Avaliação da dinâmica imunologicamente relevantes Terciário características estruturais do HIV 1-V3 loop Sequence R2 Crown por Ab initio Folding

1. Metodologia

1. A primeira etapa do protocolo é para selecionar a seqüência coroa V3 você deseja passar in silico. Para a cepa R2, a seqüência para este fragmento é KSIPMGPGRAFYT.
2. A estrutura 3D atômicas do peptídeo correspondente a esta seqüência deve ser construída no espaço virtual do computador. O comando ICM para isso é:
   buildpep "KSIPMGPGRAFYT"
   ou Arquivo: Novo: Peptide podem ser seleccionados no âmbito do menu suspenso
3. Vários parâmetros do procedimento são, então, definido, incluindo o número de etapas de pesquisa (duração da pesquisa), a temperatura da simulação, os parâmetros de busca estratégia, incluindo restrições ao viés de variável a busca para áreas razoáveis, termos de energia, a seleção de diferentes métodos de cálculo de energia, e parâmetros indicando como a pesquisa será registrada como se para gravar um filme e quantas conformações pontuação intermédio devem ser registados. Todos estes parâmetros foram otimizados por publicações anteriores (ver www.molsoft.com).
4. O dobramento é, então, iniciado com o comando:
   montecarlo
   ou Arquivo: Novo: Peptide podem ser seleccionados no âmbito do pull down menu de Mecânica Molecular: Minimize: Global
   
   No primeiro caso, os parâmetros a partir do passo 3 deve ser definido um por um na linha de comando. Neste último caso, caixas de seleção para os parâmetros mais comumente escolhidos são fornecidos em um painel antes do comando é executado. Por conveniência, o mesmo roteiro utilizado para dobrar ICM esta experiência e experimentos publicados anteriormente é mostrado aqui:
   
   Este script pode ser salvo em um arquivo de texto e rodar na linha de comando do computador do sistema operacional (geralmente LINUX) rapidamente usando o comando:
   icm _foldingscript
   

2. Segredos para o Sucesso

1. O laço V3 é uma constante 35 aminoácidos de comprimento em quase todos os estirpe conhecida, então as posições de aminoácidos estão numerados de 1-35 a partir do dissulfeto cistina originário ligados a 1 e encerra com o dissulfeto correspondente ligados cistina a 35. Uma vez que é parte de um loop, os limites da coroa de V3 deve ser cuidadosamente escolhido. Se for demasiado grande fragmento de um for escolhido, é improvável que se comportam como um segmento flexível livremente como se fosse um peptídeo livre, assim que a simulação de dobramento não avaliar corretamente a estrutura. Se for muito pequeno fragmento de um for escolhido, a estrutura informativa terciário não podem formar-se a simulação. Nosso estudo anterior mostrou que o fragmento da posição 10 para a posição 22 correlacionado com anticorpo ligado conformações cristalográficas, de modo que este é o fragmento de qualquer loop V3, que deve ser escolhido para dobrar.
2. Apesar de menus usando a interface gráfica do usuário e pull-down é user-friendly, o trabalho prévio de sucesso em dobrar peptídeo em geral usando ICM e V3 loop de coroa dobrar utilizados, em especial o script acima, simplesmente modificando a seqüência na linha buildpep e executando o script acima da linha de comando é recomendado.

3. Resultados representante

Os resultados para a dobradura R2 são representativos dos resultados para qualquer loop V3. Para avaliar os resultados, o arquivo de projeto (que será chamado "newProject1.icb" a partir do script acima) devem ser abertos e "Mecânica Molecular, Stack, View" escolhido. A mesa do conformações pilha irá aparecer. As conformações pilha pode ser visualizada graficamente, clicando no ícone Plot / Histograma. "Molecular Mecânica, Stack Play," fará um filme da pilha para apreciar o visual preferências conformacionais descobertos pela dobradura. Para a sequência R2, a conformação é beta-hairpin-like como o esperado para V3 loops ² - especialmente no fragmento em posições 12-14 em que uma preferência vertente β-claro é visto em toda a pilha, e muito poucos alfa-helicoidal conformações são vistos. Além disso, um gap de energia de quase 3 unidades é visto entre a conformação de menor energia ea conformação de energia mais baixo segundo. Do ponto de vista energético, isso significa que a única estrutura treme fora da conformação de energia mais baixo menos de um por cento do tempo: os resultados dobrar, portanto, sugerem que o R2 V3 coroa é uma superfície rígida, e não a estrutura, flexível. Pode haver mais importantes características estruturais no conjunto de conformações, mas eles são difíceis de apreciar sistematicamente.

Tabela 1: neutralização relativa de JRFL V3 e R2 loops em ambientes mascarados e desmascarado. Os dados foram previamente relatados em Cardozo T., et al. ARHR (2008) e Pinter, A., et. al J. Virol (2004). Resumidamente, a actividade neutralizante foi determinada com um ensaio de infectividade de ciclo único com PSVs gerado com o env-defeito-luciferase expressar pNL4-3.Luc.RE-plasmídeo pseudotyped com o Env JRFL ou o SF162 variantes V3 descrito acima: SF162_V3JRFL contém o JRFL V3 seqüência de loop no lugar da seqüência de loop SF162 V3. SF162_V3R2 contém a sequência R2 V3 loop no lugar da seqüência de loop SF162 V3. As PSVs foram incubadas com diluições de série do mAb 447-52D por 1,5 h a 37 ° C, e então adicionado ao CD4 + CCR5 + U87 células-alvo banhado em placas de 96 poços na presença de polibrene (10 mg = mL). Após 24 horas, as células foram realimentadas com meio RPMI contendo 10% FBS e 10 mg = mL polibrene, seguido de um h 24-48 adicionais de incubação. Atividade de luciferase foi determinada 48-72 postinfection h com um luminómetro placa de microtitulação (Harta, Inc.), utilizando os reagentes do ensaio da Promega, Inc. títulos médios geométricos para a neutralização de 50% (GMT50) por 447-52D foram determinados por interpolação de curvas de neutralização e são médias de pelo menos três ensaios independentes.

Ab initio dobrar revela terciário propriedades estruturais, cujos efeitos podem não ser evidentes de estudar aminoácidos individuais seqüencialmente. Vários anteriormente obscuro propriedades estruturais do V3 loop de coroa R2 são revelados pela simulação de dobradura. Estas preferências observadas estruturais pode se correlacionar com propriedades funcionais observado da linhagem R2, ou seja, sensibilidade à neutralização e hyperinfectivity ^5.

Primeiro, uma tendência β vertente clara na metade N-terminal da coroa V3 R2 em posições 12-14 é observado. Este é o local da cepa R2 é incomum isoleucina-prolina-metionina seqüência (IPM). A partir de estruturas cristalográficas do 447-52D, 2219, Be48, 2557, 2558 e 537-D anticorpos anti-V3 circuito ligado a peptídeos de loop V3, posições 12-14 do loop V3 estão vinculados por estes anticorpos, e, quando ligado, o segmento adota uma conformação β-costa local. A simulação dobrando, assim, sugere que o R2 V3 loop de coroa prefere uma conformação em posições 12-14, que é complementar à conhecida anticorpos anti-V3 loop de neutralização. Essa preferência pode explicar a sensibilidade observada para a neutralização desta estirpe.

Em segundo lugar, a simulação mostra uma diferença de 3 unidades de energia entre a conformação de menor energia ea conformação de energia mais baixa segundo, sugerindo uma estrutura rígida. Gp120 do HIV-1 é uma molécula extremamente dinâmico, exigindo uma grande mudança conformacional de sua desacoplado, imunologicamente protegidas (unliganded) formam ao seu receptor humano amarrado e imunologicamente expostos (liganded) formulário. Flexibilidade do loop V3 pode ser necessária para efetuar essa transição cooperativa, e as rígidas R2 estrutura de loop V3 observado aqui pode resistir a mudança de forma liganded, assim como um bloco rígido pode ser mais difícil de arrumar em um espaço pequeno em comparação com uma suave bloco flexível. Esta resistência à adopção do formulário unliganded pode expor laço V3, o site CD4 vinculativa e CD4 induzida epítopos de neutralização, os quais são caracteristicamente expostos na forma liganded de gp120. Assim, a rigidez observada também pode ser conceitualmente ligado à sensibilidade de neutralização observado da linhagem R2.

Desde o co-receptor interagindo forma de loop V3 também é provável que seja um β-hairpin como as formas alvo de anticorpos neutralizantes, os resultados sugerem que o R2 coroa V3 está bloqueado para a co-receptor e forma de anticorpos neutralizantes complementares, que por sua vez, pode promover a gp120 inteiro em sua forma liganded, tornando a variante altamente infecciosa. Assim, a preferência conformacional observada e rigidez ambos também pode ser conceitualmente associados hyperinfectivity R2.

Este arranjo de uma rígida, mas expostas conformação co-receptor e anticorpos complementares do loop V3 é diferente da de um programa flexível, mas soterrado ou mascarado V3 loop que é típico de cepas de HIV. Folding da cepa JRFL (que exibe o consenso do subtipo B do HIV-1 seqüência de loop V3) também mostra uma preferência β-fio, mas muitos intimamente distribuída conformações de menor energia sugestivos de V3 flexibilidade coroa (dados não mostrados). A previsão seria que esta seqüência de loop V3 seria altamente sensível à neutralização por um anticorpo apropriado como 447-52D se fosse exposta, em vez de enterradas. Como esperado, as seqüências JRFL e R2 são igualmente sensíveis quando se apresenta em um cenário exposto dentro de um pseudovirus SF162 quimérico em que o laço V3 é substituído pelo JRFL ou V3 R2 loops (Tabela 1), mas o loop V3 mesmo JRFL é absolutamente insensível para neutralização, quando apresentados em seu contexto nativo JRFL.

Estes resultados sugerem que a seqüência IPM incomuns da cepa R2 confere uma superfície rígida, anticorpos de ligação local compatível, co-receptor local de ligação de forma compatível na região da coroa chave do loop V3. A rigidez é a hipótese de obstruir a flexibilidade conformacional da gp120, uma vez que as transições entre as formas e liganded unliganded, trancando-os em grande parte em sua forma liganded onde a forma ideal de anticorpos, co-receptor-ideal da coroa V3 é exposta e disponível. O resultado é a sensibilidade à neutralização e hyperinfectivity da linhagem R2. Desta forma, a ab initio dobrar experimento descrito neste protocolo é informativa para a pesquisa da vacina contra o HIV: os resultados observados para dobrar R2 aqui pode ser importante para HIV-1 projeto imunógeno vacina como uma pista de como bloquear gp120 baseado em imunógenos preferido , neutralização conformações sensíveis.