Bewertung von immunologisch relevanten dynamischen tertiären strukturellen Merkmale der HIV-1 V3-Loop Crown R2 Sequence durch Ab initio Folding

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die dynamischen strukturellen Präferenzen der V-Drei-Kronen-Peptidsequenz des R-2-Stammes von HIV über AR-Faltung zu evaluieren und die Ergebnisse mit den bekannten Neutralisationssensitivitäten des R-2-Stammes zu korrelieren. Dies wird durch die Auswahl eines geeigneten Fragments der R zwei V Drei-Schlaufen-Krone zum Falten von AR bonni erreicht. In einem zweiten Schritt wird die Simulation der Faltung durchgeführt, die alle möglichen Bestätigungen des R zwei Kronenfragments und Datensätze, die wahrscheinlichsten Bestätigungen in einer Stapeldatei, durchsucht.

Als nächstes werden die aufgezeichneten Bestätigungen analysiert, um die dynamische strukturelle Präferenz der R zwei V drei Kronen zu bestimmen, die ihre Neutralisationsempfindlichkeit erklären könnte. Es werden Ergebnisse erhalten, die eine Präferenz für einen starren Beta-Strang an den Positionen 12 bis 14 der V-Drei-Schleife teilen, basierend auf der Sekundärstruktur, der Präferenz und der Energieverteilung des Stapels der gesuchten Bestätigungen. Hallo, ich bin Timothy Cardozo und spreche zu Ihnen aus meinem Labor in der Abteilung für Pharmakologie an der New York University School of Medicine.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Abio-Proteinfaltung einer flexiblen Schleife auf einem immunogenen HIV-Virusprotein, bekannt als GP one 20. Die flexible Schleife ist als V-Drei-Schleife dieses Oberflächenhüllen-Glykoproteins des HIV-Eins-Virus bekannt, und ihre Spitze ist als Krone der V-Drei-Schleife bekannt. Dies ist die Region, die wir falten werden.

Wir nutzen dieses Verfahren in unserem Labor, um produktive Wege für erfolgreiche HIV-Impfstoffe zu identifizieren. Also lasst uns loslegen. Um diesen Vorgang zu starten, wählen Sie die V-Drei-Kronen-Sequenz aus, die in Silikon gefaltet werden soll.

Frühere Studien aus diesem Labor deuten darauf hin, dass die Positionen 10 bis 22 einer V-Drei-Schleifen-Sequenz die besten Ergebnisse liefern. Führen Sie die Armenio-Faltungsexperimente mit den benutzerfreundlichen Pulldown-Menüs in der grafischen Benutzeroberfläche oder GUI der ICM Pro Molecular Modeling-Software durch. Zunächst muss die dreidimensionale atomare Struktur des Peptids, die dieser Sequenz entspricht, in den virtuellen Weltraum ace des Computers eingebaut werden. Um die dreidimensionale atomare Struktur zu erstellen, gehen Sie unter das Dateimenü und wählen Sie Neu.

Dadurch wird ein Bildschirm mit mehreren Registerkarten angezeigt. Wählen Sie die Registerkarte Peptid aus und fügen Sie die Sequenz in das Textfeld ein oder geben Sie sie ein. Klicken Sie auf OK, um die dreidimensionale Struktur des Peptids zu erstellen.

Die Struktur wird im grafischen Fenster des ICM angezeigt. Sobald die dreidimensionale Struktur erstellt wurde, gehen Sie zum Menü für Molekularmechanik und wählen Sie Minimieren, das als Seitenmenü angezeigt wird. Wählen Sie im Seitenmenü Global aus.

Daraufhin wird ein Bildschirm mit mehreren Eingabefeldern und Kontrollkästchen angezeigt, die bereits als Standardparameter ausgewählt sind. Ändern Sie bei Bedarf die Auswahl, um das zu faltende Peptid auszuwählen. Passen Sie die Länge und Genauigkeit der Simulation an, indem Sie die Anzahl der globalen Verschiebungen bzw. die Anzahl der lokalen Minutenaufrufe ändern.

Wählen Sie alle für die gesamte Atomfaltung des Peptids. Wählen Sie dann Film speichern, um eine Filmdatei des Faltens zu erstellen. Klicken Sie abschließend auf Übernehmen, um das Falten im grafischen Fenster zu starten.

Der Algorithmus beginnt, das Peptid in verschiedene Bestätigungen zu falten und berechnet und zeichnet die Peptidenergie für jede Bestätigung auf. Nach Abschluss werden die energetisch stabilste Bestätigung des Peptids sowie alternative Bestätigungen mit nahezu gleicher Energie identifiziert und auf dem Computer visualisiert. Die Verwendung des Gooey zeigt, wie die Faltung aussieht, ermöglicht jedoch nicht die ideale Parameterauswahl für die Faltung der V-Krone mit drei Schlaufen.

Zu diesem Zweck ist es am besten, das Falten von der nicht-grafischen Befehlszeile aus durchzuführen. Mit einem Skript ist ein Skript einfach eine Reihe von Textbefehlen, die Zeile für Zeile in ein Dokument oder eine Textdatei gespeichert werden, die automatisch in das ICM-Programm eingespeist und nacheinander ausgeführt werden, um die V-Drei-Schleife mit Hilfe eines Skripts von Befehlszeilen zu falten. Schreiben Sie zunächst eine Textdatei, die auf der Festplatte des Computers in einem lokalen Verzeichnis gespeichert werden soll. Beginnen Sie wie zuvor damit, das Peptid im virtuellen Raum des Computers aufzubauen.

Geben Sie dann der Simulation einen Namen und legen Sie die Anzahl der freien Variablen fest, d. h. die chemischen Bindungen im Peptid, die sich bei der Faltung frei drehen können. Geben Sie als Nächstes an, wie lange die Simulation für eine optimale Faltung der V-Drei-Schleife ausgeführt werden soll. Dies hängt von der Anzahl der freien Variablen ab, die im vorherigen Schritt identifiziert wurden. Um die Genauigkeit der Bestätigungssuche im Experiment zu bestimmen, legen Sie die Anzahl der Suchschritte fest, die in jedem lokalen Minimum ausgeführt werden sollen.

Legen Sie dann andere Parameter fest, die auf der Grundlage früherer Forschungen für die Simulation optimiert wurden, einschließlich der Temperaturminimierung, des Gradienten und der Wahrscheinlichkeitsverteilung. Geben Sie nach dem Einstellen der experimentellen Parameter an, welche Energieberechnungen während der Faltung verwendet werden. Hier wird die Energie von Vander Vi durch das VW-interne Peptid angezeigt.

Die Energie wird durch 14 angegeben, die Wasserstoffbrückenbindungsenergie wird durch HB elektrostatisch angegeben. Energie wird durch El Salvation angezeigt. Energie wird mit SF und Entropie mit EN bezeichnet. Legen Sie die endgültigen Einstellungen fest, einschließlich der bevorzugten zu durchsuchenden Backbone- und Side-Chain-Winkel und der Startbestätigung.

Schreiben Sie abschließend den auszuführenden Befehl und speichern Sie die Berechnung. Nachdem das Skript geschrieben und als Textdatei gespeichert wurde, führen Sie es über die Leih-Eingabeaufforderung des Betriebssystems des Computers aus. Wie bisher werden die energetisch stabilste Bestätigung des Peptids sowie alternative Bestätigungen mit vergleichbarer Energie identifiziert und in der Projektdatei zur Visualisierung am Computer gespeichert.

Sobald die Berechnung abgeschlossen ist, öffnen Sie die Datei, indem Sie Datei öffnen aus dem Pulldown-Menü EE auswählen. Zeigen Sie das Molekül an, indem Sie auf das Kontrollkästchen daneben im Arbeitsbereichsfenster klicken und die Stapelansicht der Molekularmechanik auswählen. Um den Energie-Ranking-Stack der Top-Peptid-Bestätigungen aus der Faltung anzuzeigen, klicken Sie auf das Plottwerkzeug in der unteren rechten Ecke des Stack-Panels, um die Ergebnisse darzustellen.

Klicken Sie zuerst im daraufhin angezeigten Fenster auf OK und dann auf die mittlere Registerkarte des Diagramms mit dem Namen best confo. Klicken Sie dann auf die erste Zeile der Stapeltabelle mit den Ergebnissen, die die niedrigste Bestätigung ist, die in der Suche gefunden wurde. Die Peptidstruktur ordnet sich in ihrer niedrigsten Energiebestätigung im grafischen Fenster neu an.

Analysieren Sie diese Bestätigung auf beta-strangartige oder alpha-helikale Eigenschaften, insbesondere in den ersten fünf Positionen des Peptids. Indem Sie diesen Bereich in der Sequenz auswählen und auf das Stick-Symbol oben links auf dem Bildschirm klicken, um alle Atome anzuzeigen. Als nächstes muss der Stapel der Energieergebnisse analysiert werden, um die besten Bestätigungen zu erhalten.

Wenn die Bestätigung mit der niedrigsten Energie durch einen signifikanten Abstand zu den anderen Bestätigungen getrennt ist, deutet dies auf eine Tendenz zu einer starren Struktur hin. Um die Ergebnisse auszuwerten, öffnen Sie das Projektfläschchen und wählen Sie Molekularmechanik Stack View, eine Tabelle mit den Stack-Bestätigungen wird angezeigt. Visualisieren Sie die Stapelbestätigungen, indem Sie auf das Symbol für das Plothistogramm klicken.

Klicken Sie abschließend auf Molekularmechanik-Stapelwiedergabe, um einen Film am Stapel zu erstellen und die Bestätigungspräferenzen zu visualisieren, die durch die Faltung hier aufgedeckt werden. Die Ergebnisse für die R zweifache Faltung sind dargestellt. Die Bestätigung ist nicht alpha-helikal und handelt sich um eine zufällige Spule, wie sie für V-Kronen mit drei Schleifen erwartet wird, insbesondere im Fragment an den Resten 12 bis 14.

In der V-Drei-Schleife ist eine klare Beta-Strang-Bestätigungspräferenz im gesamten Stack zu sehen und es werden nur sehr wenige Alpha-Helix-Bestätigungen beobachtet. Eine lokale Bestätigung des Beta-Strangs ist an seiner ausgedehnten linearen Form zu erkennen. Dies ist der Ort der ungewöhnlichen Isoleucin-Prolin-Methionin-Sequenz des R-2-Stammes, einer seltenen Sequenz in HIV-Stämmen an dieser Position, von der angenommen wurde, dass sie für die ungewöhnlichen Merkmale von R zwei verantwortlich ist.

Darüber hinaus wird eine Energielücke von fast drei Einheiten zwischen der Bestätigung der niedrigsten und der Bestätigung der zweitniedrigsten Energie gesehen. Somit flackert die Struktur nur in weniger als 1 % der Fälle die Bestätigung mit der niedrigsten Energie aus, was darauf hindeutet, dass die R zwei V drei Kronen und ihre lokale Beta-Dehnungsbestätigung an den Positionen 12 bis 14 eine steifere Struktur haben, anstatt von Natur aus völlig flexibel zu sein. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie eine V-Drei-Schleifen-Kronensequenz mit dem in der ICM-Software implementierten Abio-Algorithmus falten können, und wir haben Ihnen gezeigt, wie Sie die Ergebnisse mit dem R-2-Stamm des HIV-Virus analysieren können.

Beispiel ist es bei diesem Verfahren wichtig, die Identität des Faltungspeptids, das einem Fragment der V-Dreikrone entspricht, sorgfältig auszuwählen, und es ist auch wichtig, die Ergebnisse im Hinblick auf die Bestätigungspräferenz und die Energie mit Hilfe eines Expertenberaters zu interpretieren. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.