Valutazione della immunologicamente rilevanti dinamiche Caratteristiche strutturali del terziario di HIV-1 sequenza R2 Loop Corona V3 da Ab initio Pieghevole

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di valutare le preferenze strutturali dinamiche della sequenza peptidica V three crown del ceppo R two di HIV tramite AR folding, e di correlare i risultati con le sensibilità di neutralizzazione note del ceppo R two. Ciò si ottiene selezionando un frammento appropriato della corona R due V a tre anelli per piegare AR bonni. Come secondo passo, viene eseguita la simulazione della piegatura, che cerca tutte le possibili conferme del frammento di corona R two e registra le conferme più probabili in un file di stack.

Successivamente, le conferme registrate vengono analizzate per determinare la preferenza strutturale dinamica della corona R due V tre che potrebbe spiegare la sua sensibilità alla neutralizzazione. Si ottengono risultati che condividono una preferenza per un filamento beta rigido che posiziona da 12 a 14 del tre loop V in base alla struttura secondaria, alla preferenza e alla distribuzione dell'energia dello stack di conferme ricercate. Ciao, sono Timothy Cardozo e vi parlo dal mio laboratorio nel Dipartimento di Farmacologia della New York University School of Medicine.

Oggi vi mostreremo una procedura per il ripiegamento della proteina abio di un ansa flessibile su una proteina virale immunogenica dell'HIV nota come GP one 20. L'ansa flessibile è nota come l'ansa V tre di questa glicoproteina dell'involucro superficiale del virus HIV one e la sua punta è nota come la corona dell'ansa V tre. Questa è la regione che piegheremo.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per aiutarci a identificare percorsi produttivi verso la progettazione di vaccini contro l'HIV di successo. Quindi iniziamo. Per iniziare questa procedura, selezionare la sequenza delle tre corone a V da piegare in silico.

Studi precedenti di questo laboratorio indicano che le posizioni da 10 a 22 di qualsiasi sequenza a tre loop V, danno i migliori risultati, eseguono gli esperimenti di ripiegamento armenio con i menu a discesa di facile utilizzo nell'interfaccia utente grafica o nella GUI del software di modellazione molecolare ICM Pro. In primo luogo, la struttura atomica tridimensionale del peptide corrispondente a questa sequenza deve essere incorporata nell'asso spaziale virtuale del computer. Per costruire la struttura atomica tridimensionale, vai nel menu file e seleziona nuovo.

Questo rivelerà una schermata con diverse schede. Seleziona la scheda peptide e incolla o digita la sequenza nella casella di testo. Fare clic su OK per costruire la struttura tridimensionale del peptide.

La struttura apparirà nella finestra grafica di ICM. Una volta costruita la struttura tridimensionale, vai al menu di meccanica molecolare e seleziona Riduci a icona, che apparirà come menu laterale. Dal menu laterale, scegli globale.

Verrà visualizzata una schermata con diversi campi di immissione e caselle di controllo già selezionate per i parametri predefiniti. Se necessario, modificare la selezione per scegliere il peptide da piegare. Regola la lunghezza e la precisione della simulazione modificando rispettivamente il numero di mosse globali e il numero di chiamate minime locali.

Seleziona tutto per il ripiegamento dell'atomo del peptide. Quindi seleziona salva filmato per creare un file filmato della piegatura. Infine, fare clic su applica per avviare la piegatura nella finestra grafica.

L'algoritmo inizia a piegare il peptide in diverse conferme, calcolando e registrando l'energia del peptide per ogni conferma. Una volta completata, la conferma energeticamente più stabile del peptide e le conferme alternative con quasi la stessa energia saranno identificate e visualizzate sul computer Eseguendo il ripiegamento del peptide. L'uso del gooey dimostra l'aspetto della piegatura, ma non consente la selezione ideale dei parametri per la piegatura della corona a tre anelli a V.

A questo scopo, è meglio eseguire il ripiegamento dalla riga di comando non grafica Utilizzando uno script, uno script è semplicemente una serie di comandi di testo salvati riga per riga in un documento o in un file di testo che vengono inseriti automaticamente nel programma ICM ed eseguiti uno dopo l'altro per piegare il ciclo V tre utilizzando uno script di righe di comando. Per prima cosa, scrivi un file di testo da salvare sul disco rigido del computer in una directory locale. Come prima, inizia costruendo il peptide nello spazio virtuale del computer.

Quindi dai un nome alla simulazione e imposta il numero di variabili libere, che sono i legami chimici nel peptide lasciato libero di ruotare nel ripiegamento. Quindi, specificare per quanto tempo verrà eseguita la simulazione per una piegatura ottimale del ciclo a tre V. Ciò dipenderà dal numero di variabili libere identificate nel passaggio precedente: per determinare la precisione della ricerca di conferma nell'esperimento, impostare il numero di passaggi di ricerca da eseguire in ciascun minimo locale.

Quindi imposta altri parametri che sono stati ottimizzati per la simulazione in base a ricerche precedenti, tra cui la minimizzazione della temperatura, il gradiente e la distribuzione di probabilità. Dopo l'impostazione dei parametri sperimentali, indicare quali calcoli energetici verranno utilizzati durante la piegatura. Qui, l'energia di Vander Vi è indicata dal peptide interno di VW.

L'energia è indicata da 14, l'energia di legame idrogeno è indicata da HB elettrostatico. L'energia è indicata da El Salvation. L'energia è indicata con SF e l'entropia è indicata con EN. Specificare le impostazioni finali, inclusi gli angoli preferiti della dorsale e della catena laterale da cercare e la conferma di avvio.

Infine scrivi il comando per eseguire e salva il calcolo. Una volta che lo script è stato scritto e salvato come file di testo, eseguirlo dal prompt dei comandi di prestito del sistema operativo del computer. Come in precedenza, la conferma energeticamente più stabile del peptide, così come le conferme alternative con energia comparabile, saranno identificate e salvate nel file di progetto per la visualizzazione sul computer.

Una volta completato il calcolo, aprire il file selezionando file apri dal menu a discesa EE. Visualizza la molecola facendo clic sulla casella di controllo accanto ad essa nel pannello dell'area di lavoro, seleziona la vista stack di meccanica molecolare. Per visualizzare la pila classificata in termini di energia delle conferme dei peptidi superiori dalla piegatura, fare clic sullo strumento di tracciatura nell'angolo in basso a destra del pannello della pila per tracciare i risultati.

Per prima cosa fai clic su OK nella finestra risultante, quindi fai clic sulla scheda centrale del grafico chiamata miglior confo. Quindi fai clic sulla prima riga della tabella dei risultati dello stack, che è la conferma di energia più bassa trovata nella ricerca. La struttura del peptide si riorganizzerà nella sua conferma di energia più bassa nella finestra grafica.

Analizza questa conferma per le caratteristiche di tipo beta o alfa elicoidale, specialmente nelle prime cinque posizioni del peptide. Selezionando questa regione nella sequenza e facendo clic sull'icona della levetta in alto a sinistra dello schermo per visualizzare tutti gli atomi. Successivamente, la pila di risultati energetici deve essere analizzata per tracciare le migliori conferme.

Se la conferma a più bassa energia è separata da un divario significativo dalle altre conferme, indica una tendenza verso una struttura rigida. Per valutare i risultati, aprire la fiala del progetto e scegliere la visualizzazione dello stack di meccanica molecolare, apparirà una tabella delle conferme dello stack. Visualizza le conferme della pila facendo clic sull'icona dell'istogramma del grafico.

Infine, fai clic su Riproduzione stack di meccanica molecolare per creare un filmato nella pila e visualizzare le preferenze di conferma scoperte dalla piegatura qui. Vengono visualizzati i risultati per la piegatura R two. La conferma non è alfa elicoidale ed è una bobina casuale come previsto per le corone a tre anelli a V, in particolare nel frammento ai residui da 12 a 14.

Nell'anello V tre, si osserva una chiara preferenza di conferma del filamento beta in tutta la pila e si osservano pochissime conferme alfa elicoidali. La conferma di un filamento beta locale è riconosciuta dalla sua forma lineare estesa. Questa è la posizione dell'insolita sequenza isoleucina prolina metionina del ceppo R due, una sequenza rara nei ceppi di HIV in questa posizione, e che è stata ipotizzata essere responsabile delle caratteristiche insolite di R due.

Inoltre, si osserva un divario energetico di quasi tre unità tra la conferma energetica più bassa e la seconda conferma energetica più bassa. Pertanto, la struttura emette solo la conferma dell'energia più bassa meno dell'1% delle volte, suggerendo che la corona R due V tre e la sua conferma di deformazione beta locale nelle posizioni da 12 a 14 hanno una struttura più rigida piuttosto che essere completamente flessibili in natura. Ti abbiamo appena mostrato come piegare una sequenza di corone a tre anelli a V utilizzando l'algoritmo abio implementato nel software ICM e ti abbiamo mostrato come analizzare i risultati utilizzando il ceppo R due del virus HIV.

Ad esempio, quando si esegue questa procedura, è importante scegliere attentamente l'identità del peptide di ripiegamento corrispondente a un frammento della corona V tre, ed è anche importante interpretare i risultati per quanto riguarda la preferenza di conferma e l'energia utilizzando la consulenza di un esperto di un modellista molecolare. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.