Name: Evaluación de la inmunológicamente relevantes características dinámicas estructurales Terciario de la pandemia del VIH-1 secuencia de bucle V3 R2 Corona Ab initio Plegable (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprende a evaluar las preferencias estructurales dinámicas del bucle V3 de HIV-1 mediante plegamiento ab initio. Este método computacional correlaciona la conformación beta rígida con la sensibilidad a la neutralización de la cepa R2.

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El trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Bill y Melinda Gates Foundation (# 38 631) y los NIH, incluyendo DP2 OD004631 y AI084119 R01.

1. Metodología <ol><li> El primer paso del protocolo es para seleccionar la secuencia de la corona V3 deseas retirarte in silico. Para la cepa R2, la secuencia de este fragmento es KSIPMGPGRAFYT. </li><li> La estructura atómica en 3D del péptido correspondiente a esta secuencia debe ser construido en el espacio virtual de la computadora. El comando de ICM para esto es: buildpep "KSIPMGPGRAFYT" o Archivo: Nuevo: péptidos se pueden seleccionar en el menú desplegable </li><li> Varios parámetros del procedimiento A continuación se establecen, incluyendo el número de pasos de búsqueda (la longitud de la búsqueda), la temperatura de la simulación, los parámetros de la estrategia de búsqueda incluido el control variable de sesgo de la búsqueda hacia las zonas razonable, términos de energía, selección de diferentes métodos de cálculo de la energía, y los parámetros que indican cómo la búsqueda se registrarán como si para grabar una película y el número de conformaciones intermedias de puntuación deben ser registrados. Todos estos parámetros han sido optimizados por publicaciones anteriores (ver www.molsoft.com). </li><li> El plegado se inició a continuación con el comando: montecarlo o Archivo: Nuevo: péptidos se pueden seleccionar en el menú desplegable de Mecánica Molecular: Minimizar: Global En el primer caso, los parámetros del paso 3 se debe establecer uno por uno en la línea de comandos. En este último caso, casillas de verificación de los parámetros más comúnmente elegido se proporcionan en un panel antes de que el comando es ejecutado. Para mayor comodidad, el mismo guión de plegado ICM utilizada para este experimento y los experimentos publicados anteriormente se muestra aquí: <img src="/files/ftp_upload/2118/2118output.jpg" alt="Producción" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Salida"> Este script se puede guardar en un archivo de texto y se ejecuta desde la línea de la computadora de comandos del sistema operativo (generalmente Linux) rápidamente con el comando: icm _foldingscript </li></ol> 2. Secretos para el Éxito <ol><li> El V3 es una constante 35 aminoácidos de longitud en casi todas las cepas conocidas, por lo que las posiciones de aminoácidos se numeran desde 1 hasta 35 a partir del disulfuro de origen en condiciones de servidumbre de cistina en 1 y terminando con el disulfuro de cistina en condiciones de servidumbre correspondientes a los 35. Ya que es parte de un circuito, los límites de la corona de la V3 deben ser elegidos cuidadosamente. Si es demasiado grande es un fragmento elegido, es poco probable que se comporte como un segmento libremente flexibles, como si se tratara de un péptido libre, por lo que la simulación de plegado presenta problemas para evaluar la estructura. Si es demasiado pequeño fragmento que se elija, la estructura terciaria de carácter informativo no se puede formar en la simulación. Nuestro estudio anterior mostró que el fragmento de la posición 10 a la posición 22 correlacionado con anticuerpo unido conformaciones cristalográfica, por lo que este es el fragmento de un V3 que se debe elegir para el plegado. </li><li> A pesar de los menús usando la interfaz gráfica de usuario y pull-down es fácil de usar, el trabajo previo con éxito en el plegamiento de péptidos en general con ICM y V3 loop corona plegable, en particular, utiliza el programa anterior, simplemente modificando la secuencia en la línea de buildpep y ejecución de la secuencia de comandos desde la línea de comandos, se recomienda. </li></ol> 3. Resultados representante Los resultados para el plegado R2 son representativos de los resultados de cualquier lazo V3. Para evaluar los resultados, el archivo de proyecto (que se llamará "newProject1.icb" de la secuencia de comandos) deben ser abiertos y "Mecánica Molecular, Pila, Ver" elegido. Una tabla de las conformaciones de la pila aparecerá. Las conformaciones de pila se puede visualizar gráficamente haciendo clic en el icono de la Parcela / Histograma. "Mecánica Molecular, Pila, Play" hará una película de la pila de apreciar visualmente las preferencias conformacionales descubierto por el plegamiento. Para la secuencia de R2, la conformación es beta-horquilla-como era de esperar, como para los bucles V3 2 - sobre todo en el fragmento en las posiciones 12 a 14, donde se ve una clara preferencia de β-cadena a través de la pila, y conformaciones helicoidales alfa-muy pocos se ven. Por otra parte, una brecha de energía de casi 3 unidades se ve entre la conformación de energía más bajo y el segundo más bajo de conformación de la energía. Desde el punto de vista energético, lo que significa que la única estructura que parpadea de la conformación de energía más bajo a menos de un uno por ciento del tiempo: los resultados de plegado por lo tanto, sugieren que el V3 R2 corona es una rígida, en lugar de estructura flexible,. Puede haber más características estructurales importantes en el conjunto de conformaciones, pero son difíciles de apreciar de manera sistemática. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> JRFL </td><td> SF162_V3JRFL </td><td> SF162_V3R2 </td></tr><tr><td> 447-52D GMT 50 </td><td> 15 </td><td> 0,00061 </td><td> 0,00078 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: neutralización relativa de JRFL y V3 R2 bucles en entornos máscara o sin máscara. Los datos se informó anteriormente en Cardozo T., et al. ARHR (2008) y Pinter, A., et. al J. Virol (2004). En pocas palabras, la actividad neutralizante se determinó con un ensayo de infectividad de un solo ciclo de uso de vibradores genera con el env-defectuoso luciferasa que expresan pNL4-3.Luc.RE plásmido pseudotyped con la Env JRFL o el SF162 V3 variantes descritas anteriormente: SF162_V3JRFL contiene el JRFL V3 secuencia de bucle en lugar de la secuencia de bucle SF162 V3. SF162_V3R2 contiene la secuencia de bucle V3 R2 en lugar de la secuencia de bucle SF162 V3. El PSV se incubaron con diluciones seriadas del mAb 447-52D de 1,5 horas a 37 ° C, y luego agregó a CD4 + CCR5 + U87 células diana se sembraron en placas de 96 pocillos en presencia de polibreno (10 mg = ml). Después de 24 horas, las células fueron realimentado con medio RPMI con 10% de SFB y 10 mg = polibreno ml, seguido de un adicional de 24 a 48 h de incubación. La actividad luciferasa se determinó después de la infección 48-72 h con un luminómetro microplaca (HARTA, Inc.), utilizando reactivos de análisis de los títulos de Promega, Inc. media geométrica para el 50% de neutralización (GMT50) por 447-52D se determinarán por interpolación de las curvas de neutralización y son los promedios de al menos tres ensayos independientes.

<ol><li>Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Zolla-Pazner, S. &amp, Cardozo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+characterization+of+the+V3+loop+crown%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Therapy%22%5BJournal%5D)">Dynamic characterization of the V3 loop crown.</a> Antiviral Therapy. 12, 13-31 (2007).</li>
<li>Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Swetnam, J., Zolla-Pazner, S., Cardozo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+conservation+predominates+over+sequence+variability+in+the+crown+of+HIV+type+1%27s+V3+loop%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Structural conservation predominates over sequence variability in the crown of HIV type 1's V3 loop.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 26, (2010).</li>
<li>Abagyan, R., Totrov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+probability+Monte+Carlo+conformational+searches+and+electrostatic+calculations+for+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins.</a> J Mol Biol. 235, 983-1002 (1994).</li>
<li>Quinnan, G. V., Zhang, P. F., Fu, D. W., Dong, M., Alter, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+HIV+type+1+envelope+protein+associated+with+a+broadly+reactive+neutralizing+antibody+response%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of HIV type 1 envelope protein associated with a broadly reactive neutralizing antibody response.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 15, 561-5670 (1999).</li>
<li>Zhang, P. F., Bouma, P., Park, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variable+region+3+%28V3%29+mutation+determines+a+global+neutralization+phenotype+and+CD4-independent+infectivity+of+a+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+associated+with+a+broadly+cross-reactive%2C+primary+virus-neutralizing+antibody+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A variable region 3 (V3) mutation determines a global neutralization phenotype and CD4-independent infectivity of a human immunodeficiency virus type 1 envelope associated with a broadly cross-reactive, primary virus-neutralizing antibody response.</a> J Virol. 76, 644-655 (2002).</li>
</ol>

Plegables ab initio revela terciario propiedades estructurales, cuyos efectos pueden no ser evidentes a partir del estudio de aminoácidos individuales de forma secuencial. Varias propiedades estructurales anteriormente oscuro de la V3 R2 bucle corona son reveladas por la simulación de plegado. Estas preferencias estructurales observadas se pueden correlacionar con observaron las propiedades funcionales de la cepa de R2, es decir, la sensibilidad a la neutralización y hyperinfectivity 5. <p class=...

<table><tbody><tr><td>ICM-Pro</td><td>Molsoft LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la inmunológicamente relevantes características dinámicas estructurales terciario de la pandemia del vih-1 secuencia de bucle v3 r2 corona ab initio plegable

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

La diversidad antigénica del VIH-1 ha sido durante mucho tiempo un obstáculo para el diseño de vacunas, y esta variabilidad es especialmente pronunciada en el bucle V3 de la glicoproteína del virus sobre la superficie. Nos habíamos propuesto que la corona de la V3, aunque variable dinámica y la secuencia, se ve limitada en toda la población del virus VIH-1 a un inmunológicamente relevantes β-horquilla estructura terciaria. Es importante destacar que existen miles de diferentes secuencias V3 corona bucle en la circulación de virus VIH-1, por lo que la caracterización estructural en 3D de las tendencias a través de la diversidad de los virus de difícil o imposible por la cristalografía o RMN. Nuestros estudios anteriores con éxito con el plegado de la corona V3 1, 2 utiliza el algoritmo ab initio 3 accesibles en el ICM-Pro paquete de software de modelado molecular (Molsoft LLC, La Jolla, CA) y sugirió que la corona de la V3, específicamente de las posiciones 10 a 22, los beneficios de la flexibilidad suficiente y la longitud de los tallos que flanquean a comportarse en gran medida, como si se tratara de un péptido sin restricciones libremente plegable en la solución. Como plegables, y rápido ab initio de sólo esta porción del lazo V3 de cualquier cepa individual de los 60.000 que circulan cepas VIH-1 pueden ser informativas. En este sentido, dobló el bucle V3 de la cepa de R2 para conocer mejor las bases estructurales de sus propiedades únicas. R2 tiene una secuencia de bucle V3 raro que se cree responsable de la exquisita sensibilidad de esta cepa a la neutralización por el suero de los pacientes y los anticuerpos monoclonales 4, 5. La media tensión CD4 independiente de la infección y parece inducir anticuerpos ampliamente neutralizantes. Se demuestra cómo la evaluación de los resultados de las plegables pueden ser informativas para la asociación de las estructuras observadas en el plegamiento de las actividades inmunológicas observadas para R2.

La región de la corona de las diferentes secuencias V3 bucle de la glicoproteína de superficie (gp120) del VIH-1 puede ser caracterizado estructuralmente en muchos casos en el plegamiento in silico de las posiciones 10 a 22 del ciclo con un estado de la técnica<em&gt; Ab initio</em&gt; Plegables algoritmo. Aquí se demuestra el plegado y la evaluación de esta región del bucle V3 de la cepa R2 del VIH-1, una cepa de neutralización únicamente sensible con desconcertantes propiedades funcionales.

Evaluación de la inmunológicamente relevantes características dinámicas estructurales Terciario de la pandemia del VIH-1 secuencia de bucle V3 R2 Corona Ab initio Plegable

La diversidad antigénica del VIH-1 ha sido durante mucho tiempo un obstáculo para el diseño de vacunas, y esta variabilidad es especialmente pronunciada en el bucle V3 del virus...

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar las preferencias estructurales dinámicas de la secuencia del bucle V tres de la cepa R dos del VIH mediante el plegamiento AR, y correlacionar los resultados con las sensibilidades conocidas a la neutralización de la cepa R dos. Esto se logra seleccionando un fragmento adecuado del bucle V tres de la cepa R dos para plegarlo mediante AR bonni. Como segundo paso, se realiza la simulación del plegamiento, que explora todas las posibles conformaciones del fragmento del bucle de la cepa R dos y registra las conformaciones más probables en un archivo pila.A continuación, se analizan las conformaciones registradas para determinar la preferencia estructural dinámica de la corona R dos V tres, que podría explicar su sensibilidad a la neutralización. Se obtienen resultados que muestran una preferencia por un segmento beta rígido en las posiciones 12 a 14 del bucle V tres, basada en la estructura secundaria, la preferencia y la distribución de energía del conjunto de conformaciones buscadas. Hola, soy Timothy Cardozo, hablándoles desde mi laboratorio en el Departamento de Farmacología de la Escuela de Medicina de la Universidad de Nueva York.Hoy les mostraremos un procedimiento para el plegamiento ab initio de un bucle flexible en una proteína viral inmunogénica del VIH-1 conocida como GP120. El bucle flexible se conoce como el bucle V3 de esta glucoproteína de envoltura superficial del virus del VIH-1, y su extremo se conoce como la corona del bucle V3. Esta es la región que plegaremos.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para ayudarnos a identificar vías productivas hacia diseños exitosos de vacunas contra el VIH. Así que comencemos. Para iniciar este procedimiento, seleccione la secuencia de la corona V3 que se plegará in silico.Estudios previos de este laboratorio indican que las posiciones 10 a 22 de cualquier secuencia del bucle V tres proporcionan los mejores resultados; realice los experimentos de plegamiento armenio utilizando los menús desplegables fáciles de usar en la interfaz gráfica de usuario o GUI del software de modelado molecular ICM Pro. Primero, debe construirse en el espacio virtual del ordenador la estructura atómica tridimensional del péptido correspondiente a esta secuencia. Para construir la estructura atómica tridimensional, vaya al menú archivo y seleccione nuevo.Esto mostrará una pantalla con varias pestañas. Seleccione la pestaña de péptido y pegue o escriba la secuencia en el cuadro de texto. Haga clic en aceptar para generar la estructura tridimensional del péptido.La estructura aparecerá en la ventana gráfica de ICM. Una vez que se haya construido la estructura tridimensional, vaya al menú de mecánica molecular y seleccione minimizar, lo cual mostrará un menú lateral. En el menú lateral, elija global.Esto mostrará una pantalla con varios campos de entrada y casillas de verificación ya seleccionadas con los parámetros predeterminados. Si es necesario, cambie la selección para elegir el péptido que se va a plegar. Ajuste la longitud y la precisión de la simulación modificando respectivamente el número de movimientos globales y el número de llamadas a mínimos locales.Seleccione todo para el plegamiento de todos los átomos del péptido. Luego, seleccione guardar película para crear un archivo de video del plegamiento. Finalmente, haga clic en aplicar para iniciar el plegamiento en la ventana gráfica.El algoritmo comienza a plegar el péptido en diferentes conformaciones, calculando y registrando la energía del péptido para cada conformación. Una vez finalizado, se identificará y visualizará en la computadora la conformación más estable energéticamente del péptido, así como conformaciones alternativas con energía casi idéntica. Realizando el plegamiento de péptidos. Usar la interfaz gráfica muestra cómo se ve el plegamiento, pero no permite la selección ideal de parámetros para el plegamiento de la corona del bucle V tres.Para este propósito, lo mejor es realizar el plegamiento desde la línea de comandos no gráfica utilizando un guion. Un guion es simplemente una serie de comandos de texto guardados línea por línea en un documento o archivo de texto, que se introducen automáticamente en el programa ICM y se ejecutan uno tras otro para plegar el bucle V tres mediante un guion de líneas de comandos. Primero, escriba un archivo de texto que se guardará en el disco duro del ordenador en un directorio local. Como antes, comience construyendo el péptido en el espacio virtual del ordenador.Luego, asigne un nombre a la simulación y establezca el número de variables libres, que son los enlaces químicos en el péptido que quedan libres para rotar durante el plegamiento. A continuación, especifique cuánto tiempo durará la simulación para lograr el plegamiento óptimo del bucle V tres. Esto dependerá del número de variables libres identificadas en el paso anterior para determinar la precisión de la búsqueda conformacional en el experimento; establezca el número de pasos de búsqueda que se realizarán en cada mínimo local.Luego, configure otros parámetros que han sido optimizados para la simulación según investigaciones previas, incluyendo la minimización de temperatura, el gradiente y la distribución de probabilidad. Tras la configuración de los parámetros experimentales, indique qué cálculos de energía se utilizarán durante el plegamiento. Aquí, la energía de Vander Vi se indica mediante el péptido interno VW.La energía se indica mediante 14 energías de enlace de hidrógeno indicadas por HB electrostática. La energía se indica por El Salvation. La energía se denota mediante SF y la entropía se denota mediante EN. Especifique los ajustes finales, incluyendo los ángulos preferidos de la cadena principal y de la cadena lateral que se van a buscar y la confirmación inicial.Finalmente, escriba el comando para ejecutar y guardar el cálculo. Una vez que el script se haya escrito y guardado como un archivo de texto, ejecútelo desde el símbolo del sistema del sistema operativo de la computadora. Como antes, se identificará la conformación del péptido más estable energéticamente, así como otras conformaciones alternativas con energía comparable, y se guardarán en el archivo del proyecto para su visualización en la computadora.Una vez que el cálculo haya finalizado, abra el archivo seleccionando «abrir archivo» en el menú desplegable de EE. Muestre la molécula haciendo clic en la casilla junto a ella en el panel de trabajo y seleccione la vista de pila de mecánica molecular. Para ver la pila de conformaciones peptídicas superiores clasificadas por energía obtenidas del plegamiento, haga clic en la herramienta de trazado en la esquina inferior derecha del panel de pila para graficar los resultados.Primero haga clic en aceptar en la ventana resultante y luego haga clic en la pestaña central del gráfico llamada mejor conformación. A continuación, haga clic en la primera fila de la tabla de resultados, que es la conformación de energía más baja encontrada en la búsqueda. La estructura del péptido se reorganizará en su conformación de energía más baja en la ventana gráfica.Analice esta conformación en busca de características típicas de hoja beta o de hélice alfa, especialmente en las primeras cinco posiciones del péptido. Seleccione esta región en la secuencia y haga clic en el icono de estructura de bastones en la parte superior izquierda de la pantalla para mostrar todos los átomos. A continuación, se debe analizar la serie de resultados de energía para trazar las mejores conformaciones.Si la confirmación de menor energía está separada por una brecha significativa de las otras confirmaciones, indica una tendencia hacia una estructura rígida. Para evaluar los resultados, abra el frasco del proyecto y seleccione la vista de pila de mecánica molecular; aparecerá una tabla con las confirmaciones de la pila. Visualice las confirmaciones de la pila haciendo clic en el icono del histograma.Finalmente, haga clic en la opción "reproducción de la pila de mecánica molecular" para crear una animación en la pila y visualizar las preferencias conformacionales reveladas por el plegamiento aquí. Se muestran los resultados del plegamiento de R dos. La conformación no es alfa helicoidal y corresponde a una espiral aleatoria, como se esperaba para las coronas del bucle V tres, notablemente en el fragmento del residuo 12 al 14.En el bucle V tres, se observa una clara preferencia conformacional de hebra beta a lo largo de toda la pila, y se observan muy pocas conformaciones alfa helicoidales. Una conformación local de hebra beta se reconoce por su forma lineal extendida. Esta es la ubicación de la inusual secuencia isoleucina prolina metionina de la cepa R dos, una secuencia rara en cepas de VIH en esta posición, y que se ha hipotetizado como responsable de las características inusuales de R dos.Además, se observa un intervalo energético de casi tres unidades entre la conformación de energía más baja y la segunda conformación de energía más baja. Por lo tanto, la estructura abandona momentáneamente la conformación de energía más baja menos del 1 % del tiempo, lo que sugiere que la corona R dos V tres y su conformación local con tensión beta en las posiciones 12 a 14 poseen una estructura más rígida en lugar de ser completamente flexible en naturaleza. Acabamos de mostrarle cómo plegar una secuencia de corona en bucle V tres utilizando el algoritmo abio implementado en el software ICM, y le hemos mostrado cómo analizar los resultados utilizando la tensión R dos del virus del VIH.Como ejemplo, al realizar este procedimiento, es importante elegir cuidadosamente la identidad del péptido plegado correspondiente a un fragmento de la corona V tres, y también es fundamental interpretar los resultados con respecto a la preferencia conformacional y la energía mediante la consulta con un experto modelador molecular. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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