Evaluación de la inmunológicamente relevantes características dinámicas estructurales Terciario de la pandemia del VIH-1 secuencia de bucle V3 R2 Corona Ab initio Plegable

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar las preferencias estructurales dinámicas de la secuencia de péptidos V tres coronas de la cepa R dos del VIH a través del plegamiento AR, y correlacionar los resultados con las sensibilidades de neutralización conocidas de la cepa R dos. Esto se logra seleccionando un fragmento apropiado de la corona R dos V de tres bucles para plegar AR bonni. Como segundo paso, se realiza la simulación del plegamiento, que busca todas las confirmaciones posibles del fragmento y los registros de la corona R dos, las confirmaciones más probables en un archivo de pila.

A continuación, se analizan las confirmaciones registradas para determinar la preferencia estructural dinámica de la corona R dos V tres que podría explicar su sensibilidad a la neutralización. Se obtienen resultados que comparten una preferencia por una hebra beta rígida en las posiciones 12 a 14 del bucle V tres en función de la estructura secundaria, la preferencia y la distribución de energía de la pila de confirmaciones buscadas. Hola, soy Timothy Cardozo y les hablo desde mi laboratorio en el Departamento de Farmacología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York.

Hoy le mostraremos un procedimiento para el plegamiento de la proteína abio de un bucle flexible en una proteína viral inmunogénica del VIH uno conocida como GP one 20. El bucle flexible se conoce como el bucle V tres de esta glicoproteína de la envoltura superficial del virus VIH uno y su punta se conoce como la corona del bucle V tres. Esta es la región que vamos a plegar.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para ayudarnos a identificar vías productivas hacia diseños exitosos de vacunas contra el VIH. Así que comencemos. Para comenzar este procedimiento, seleccione la secuencia de tres coronas en V que se doblará en silico.

Estudios previos de este laboratorio indican que las posiciones 10 a 22 de cualquier secuencia de tres bucles en V, dan los mejores resultados, ejecutan los experimentos de plegado de armenio con los menús desplegables fáciles de usar en la interfaz gráfica de usuario o GUI del software de modelado ICM Pro Molecular. En primer lugar, la estructura atómica tridimensional del péptido correspondiente a esta secuencia debe incorporarse al espacio virtual de la computadora. Para construir la estructura atómica tridimensional, vaya al menú de archivos y seleccione nuevo.

Esto revelará una pantalla con varias pestañas. Seleccione la pestaña de péptidos y pegue o escriba la secuencia en el cuadro de texto. Haga clic en Aceptar para construir la estructura tridimensional del péptido.

La estructura aparecerá en la ventana gráfica de ICM. Una vez que se haya construido la estructura tridimensional, vaya al menú de mecánica molecular y seleccione minimizar, que aparecerá como un menú lateral. En el menú lateral, elija global.

Esto revelará una pantalla con varios campos de entrada y casillas de verificación ya seleccionadas para los parámetros predeterminados. Si es necesario, cambie la selección para elegir el péptido que se va a plegar. Ajuste la longitud y la precisión de la simulación cambiando el número de movimientos globales y el número de llamadas mínimas locales, respectivamente.

Seleccione todo para todo el plegamiento de átomos del péptido. A continuación, seleccione Guardar película para crear un archivo de película del plegado. Finalmente, haga clic en aplicar para iniciar el plegado en la ventana gráfica.

El algoritmo comienza a plegar el péptido en diferentes confirmaciones, calculando y registrando la energía peptídica para cada confirmación. Una vez completado, la confirmación energéticamente más estable del péptido, así como las confirmaciones alternativas con casi la misma energía, se identificarán y visualizarán en la computadora para realizar el plegamiento del péptido. El uso de la sustancia pegajosa demuestra cómo se ve el plegado, pero no permite la selección de parámetros ideales para el plegado de la corona de tres bucles en V.

Para este propósito, es mejor realizar el plegado desde la línea de comandos no gráfica Usando un script, Un script es simplemente una serie de comandos de texto guardados línea por línea en un documento o archivo de texto que se introducen automáticamente en el programa ICM y se ejecutan uno tras otro para plegar el bucle V tres usando un script de líneas de comandos. Primero, escriba un archivo de texto para guardarlo en el disco duro de la computadora en un directorio local. Al igual que antes, comience construyendo el péptido en el espacio virtual de la computadora.

A continuación, asigne un nombre a la simulación y establezca el número de variables libres, que son los enlaces químicos del péptido que quedan libres para rotar en el plegamiento. A continuación, especifique cuánto tiempo se ejecutará la simulación para un plegado óptimo del bucle V tres. Esto dependerá del número de variables libres identificadas en el paso anterior para determinar la precisión de la búsqueda confirmacional en el experimento, establezca el número de pasos de búsqueda a realizar en cada mínimo local.

A continuación, establezca otros parámetros que se hayan optimizado para la simulación en función de investigaciones anteriores, como la minimización de la temperatura, el gradiente y la distribución de probabilidad. A continuación, el ajuste de los parámetros experimentales indica qué cálculos de energía se utilizarán durante el plegado. Aquí, la energía de Vander Vi está indicada por el péptido interno de VW.

La energía se indica mediante 14 enlaces de hidrógeno, la energía se indica mediante la electrostática HB. La energía está indicada por El Salvación. La energía se denota por SF y la entropía se denota por EN. Especifique los ajustes finales, incluidos los ángulos preferidos de la columna vertebral y la cadena lateral que se buscarán y la confirmación de inicio.

Finalmente, escriba el comando para ejecutar y guarde el cálculo. Una vez que el script se haya escrito y guardado como un archivo de texto, ejecútelo desde el símbolo del sistema operativo de la computadora. Al igual que antes, la confirmación energéticamente más estable del péptido, así como las confirmaciones alternativas con energía comparable, se identificarán y guardarán en el archivo del proyecto para su visualización en el ordenador.

Una vez que se haya completado el cálculo, abra el archivo seleccionando archivo abierto en el menú desplegable EE. Muestre la molécula haciendo clic en la casilla de verificación junto a ella en el panel del espacio de trabajo, seleccione la vista de pila de mecánica molecular. Para ver la pila clasificada de energía de las confirmaciones de péptidos superiores desde el plegado, haga clic en la herramienta de trazado en la esquina inferior derecha del panel de pila para trazar los resultados.

Primero haga clic en aceptar en la ventana resultante y luego haga clic en la pestaña central de la gráfica llamada mejor confo. A continuación, haga clic en la primera fila de la tabla de resultados de la pila, que es la confirmación de energía más baja encontrada en la búsqueda. La estructura peptídica se reorganizará en su confirmación de energía más baja en la ventana gráfica.

Analice esta confirmación para las características de hebra beta o alfa helicoidal, especialmente en las primeras cinco posiciones del péptido. Seleccionando esta región en la secuencia y haciendo clic en el icono del palo en la parte superior izquierda de la pantalla para mostrar todos los átomos. A continuación, se debe analizar la pila de resultados energéticos para trazar las mejores confirmaciones.

Si la confirmación de energía más baja está separada por una brecha significativa de las otras confirmaciones, indica una tendencia hacia una estructura rígida. Para evaluar los resultados, abra el vial del proyecto y elija la vista de pila de mecánica molecular, aparecerá una tabla de las confirmaciones de la pila. Visualice las confirmaciones de la pila haciendo clic en el icono del histograma de trazado.

Finalmente, haga clic en el juego de pila de mecánica molecular para hacer una película en la pila y visualizar las preferencias de confirmación descubiertas por el plegado aquí. Se muestran los resultados para el plegado R two. La confirmación no es alfa helicoidal y es una bobina aleatoria como se esperaba para V coronas de tres bucles, especialmente en el fragmento en el residuo 12 a 14.

En el bucle V tres, se observa una clara preferencia de confirmación de la hebra beta en toda la pila y se observan muy pocas confirmaciones alfa helicoidales. La confirmación de una hebra beta local se reconoce por su forma lineal extendida. Esta es la ubicación de la secuencia inusual de isoleucina prolina metionina de la cepa R dos, una secuencia rara en las cepas de VIH en esta posición, y que se ha hipotetizado que es responsable de las características inusuales de R dos.

Además, se observa una brecha de energía de casi tres unidades entre la confirmación de energía más baja y la segunda confirmación de energía más baja. Por lo tanto, la estructura solo parpadea con la confirmación de energía más baja menos del 1% del tiempo, lo que sugiere que la corona R dos V tres y su confirmación de deformación beta local en las posiciones 12 a 14 tiene una estructura más rígida en lugar de ser completamente flexible por naturaleza. Acabamos de mostrarle cómo plegar una secuencia de corona de tres bucles en V utilizando el algoritmo abio implementado en el software ICM, y le hemos mostrado cómo analizar los resultados utilizando la cepa R dos del virus del VIH.

Por ejemplo, al realizar este procedimiento, es importante elegir cuidadosamente la identidad del péptido de plegamiento correspondiente a un fragmento de la corona V tres, y también es importante interpretar los resultados con respecto a la preferencia de confirmación y la energía utilizando la consulta experta de un modelador molecular. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.