Name: 免疫相关动态三级的HIV - 1 V3环冠R2的序列结构特点的评估从头折叠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 了解HIV-1 R2毒株V3环冠肽序列的动态结构偏好，采用从头折叠算法进行计算模拟。该方法通过分析构象能量分布揭示其刚性β折叠特征，为疫苗设计提供结构生物学依据。

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本研究由比尔和梅琳达·盖茨基金会（#38631）以及美国国立卫生研究院（NIH）的资助支持，包括DP2 OD004631和R01 AI084119项目。

1. 方法
<ol>
	<li>本方案的第一步是选择您希望在计算机中进行折叠的 V3 冠状序列。对于 R2 菌株，该片段的序列为 KSIPMGPGRAFYT。</li>
	<li>应在计算机的虚拟空间中构建对应于此序列的肽段三维原子结构。实现此操作的 ICM 命令为： buildpep "KSIPMGPGRAFYT" 或者可在下拉菜单中选择 文件:新建:肽段</li>
	<li>随后需设置该过程的多个参数，包括搜索步数（搜索长度）、模拟温度、搜索策略参数（如可变约束以引导搜索趋向合理区域）、能量项、不同能量计算方法的选择，以及指示搜索记录方式的参数（例如是否记录动画，以及应记录多少个中间评分构象）。这些参数均已通过先前发表的研究优化（参见 www.molsoft.com）。</li>
	<li>然后使用以下命令启动折叠过程： montecarlo 或者可在下拉菜单中选择 分子力学:最小化:全局 在前一种情况下，第 3 步中的参数需在命令行中逐一设置；在后一种情况下，系统会在执行命令前的面板中提供最常用参数的复选框。为方便起见，本实验及先前发表实验所使用的相同折叠 ICM 脚本如下所示： <img src="/files/ftp_upload/2118/2118output.jpg" alt="显示变量设置的蛋白质折叠脚本；采用蒙特卡洛方法进行结构预测。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="输出"> 该脚本可保存为文本文件，并通过操作系统命令行（通常为 LINUX）使用以下命令快速运行： icm _foldingscript </li>
</ol>
2. 成功的秘诀
<ol>
	<li>几乎所有已知毒株的V3环长度恒定为35个氨基酸，因此氨基酸位置从1到35编号，起始于第1位由二硫键连接的半胱氨酸，终止于第35位对应的二硫键连接的半胱氨酸。由于V3环属于环状结构，其V3环冠部边界的选取应谨慎。若选取的片段过大，则该片段在模拟中难以像游离肽段一样自由灵活，导致折叠模拟无法准确评估其结构；若选取的片段过小，则可能无法在模拟中形成具有信息意义的三级结构。我们先前的研究表明，第10至第22位的片段与抗体结合晶体结构的构象高度相关，因此任何V3环折叠模拟均应选择该区段。</li>
	<li>尽管使用图形用户界面和下拉菜单操作较为友好，但以往在ICM中进行肽段折叠（特别是V3环冠部折叠）的成功研究均采用上述脚本方式，因此建议直接修改buildpep行中的序列，并通过命令行运行上述脚本。</li>
</ol>
3. 代表性结果
R2折叠的结果具有任何V3环结果的代表性。为评估结果，应打开项目文件（根据上述脚本，文件名为“newProject1.icb”），并选择“分子力学，构象堆栈，查看”。此时将出现一个包含构象堆栈的表格。通过点击“绘图/直方图”图标，可图形化地可视化堆栈中的构象。选择“分子力学，构象堆栈，播放”可生成构象堆栈的动画，从而直观地观察折叠所揭示的构象偏好。对于R2序列，其构象呈β-发夹样，这与V3环的预期一致2——尤其在第12至14位的片段中，整个堆栈均显示出清晰的β-链偏好，而α-螺旋构象极少出现。此外，最低能量构象与第二低能量构象之间存在近3个单位的能量差。从能量角度看，这意味着该结构在低于百分之一的时间内才会短暂偏离最低能量构象：因此，折叠结果表明R2 V3冠区是一种刚性而非柔性的结构。在构象集合中可能存在其他重要的结构特征，但它们难以被系统性地识别。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>JRFL</td>
			<td>SF162_V3JRFL</td>
			<td>SF162_V3R2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>447-52D GMT50</td>
			<td>15</td>
			<td>0.00061</td>
			<td>0.00078</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1： JRFL 和 R2 V3 环在屏蔽与非屏蔽条件下的相对中和作用。数据先前发表于 Cardozo T.，等，ARHR (2008) 以及 Pinter A.，等，J. Virol (2004)。简言之，中和活性通过单周期感染性实验测定，所用假病毒（psVs）由携带 env 缺陷型荧光素酶表达质粒 pNL4-3.Luc.R-E- 并假型化为 JRFL Env 或上述 SF162 V3 变体构建而成：SF162_V3JRFL 是将 JRFL 的 V3 环序列替换 SF162 的 V3 环序列；SF162_V3R2 是将 R2 的 V3 环序列替换 SF162 的 V3 环序列。将 psVs 与 447-52D 单克隆抗体进行系列稀释后，在 37°C 下孵育 1.5 小时，随后加入含聚凝胺（10 mg/mL）的 96 孔板中培养的 CD4+CCR5+ U87 靶细胞。24 小时后，更换为含 10% 胎牛血清和 10 mg/mL 聚凝胺的 RPMI 培养基，继续孵育 24–48 小时。感染后 48–72 小时，使用 Promega 公司的检测试剂，通过微孔板发光仪（HARTA, Inc.）测定荧光素酶活性。447-52D 抗体介导的 50% 中和的几何平均滴度（GMT50）通过中和曲线插值法确定，结果为至少三次独立实验的平均值。

<ol><li>Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Zolla-Pazner, S. &amp, Cardozo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+characterization+of+the+V3+loop+crown%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Therapy%22%5BJournal%5D)">Dynamic characterization of the V3 loop crown.</a> Antiviral Therapy. 12, 13-31 (2007).</li>
<li>Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Swetnam, J., Zolla-Pazner, S., Cardozo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+conservation+predominates+over+sequence+variability+in+the+crown+of+HIV+type+1%27s+V3+loop%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Structural conservation predominates over sequence variability in the crown of HIV type 1's V3 loop.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 26, (2010).</li>
<li>Abagyan, R., Totrov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+probability+Monte+Carlo+conformational+searches+and+electrostatic+calculations+for+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins.</a> J Mol Biol. 235, 983-1002 (1994).</li>
<li>Quinnan, G. V., Zhang, P. F., Fu, D. W., Dong, M., Alter, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+HIV+type+1+envelope+protein+associated+with+a+broadly+reactive+neutralizing+antibody+response%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of HIV type 1 envelope protein associated with a broadly reactive neutralizing antibody response.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 15, 561-5670 (1999).</li>
<li>Zhang, P. F., Bouma, P., Park, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variable+region+3+%28V3%29+mutation+determines+a+global+neutralization+phenotype+and+CD4-independent+infectivity+of+a+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+associated+with+a+broadly+cross-reactive%2C+primary+virus-neutralizing+antibody+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A variable region 3 (V3) mutation determines a global neutralization phenotype and CD4-independent infectivity of a human immunodeficiency virus type 1 envelope associated with a broadly cross-reactive, primary virus-neutralizing antibody response.</a> J Virol. 76, 644-655 (2002).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

从头折叠能够揭示蛋白质的三级结构特性，而这些特性仅通过逐个研究氨基酸序列可能无法显现。通过折叠模拟，揭示了R2 V3环冠 previously obscure 的若干结构特性。这些观察到的结构倾向可能与R2毒株的已知功能特性相关，即对中和作用的敏感性以及高感染性5。
首先，在R2 V3冠状区N端一半的第12至14位位置观察到明显的β-链倾向。该位置正是R2毒株特有的异亮氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸（IPM）序列所在区域。根据447-52D、2219、Be48、2557、2558和537-D等抗V3环抗体与V3环肽结合的晶体结构显示，这些抗体结合于V3环的第12至14位；在结合状态下，该片段呈现局部β-链构象。因此，折叠模拟结果表明，R2 V3环冠状区在第12至14位倾向于形成一种与已知抗V3环中和抗体互补的构象。这种构象偏好可能解释了该毒株对中和作用的敏感性。
其次，模拟结果显示，最低能量构象与第二低能量构象之间存在3个能量单位的差距，表明该结构较为刚性。HIV-1的gp120是一种高度动...

<table><tbody><tr><td>ICM-Pro</td><td>Molsoft LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过免疫学相关动态三级结构特征评估hiv-1 v3环冠状r2序列 从头算 折叠

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

HIV-1 的抗原多样性长期以来一直是疫苗设计的障碍，这种变异性在病毒表面包膜糖蛋白的 V3 环区域尤为显著。我们此前提出，尽管 V3 环的顶端结构具有动态性和序列可变性，但在所有流行的 HIV-1 病毒中，其顶端被限制为一种具有免疫学意义的 β-发夹三级结构。重要的是，在目前流行的 HIV-1 病毒中存在数千种不同的 V3 环顶端序列，这使得通过晶体学或核磁共振（NMR）方法对病毒多样性中的结构趋势进行三维结构表征变得困难甚至不可能。我们此前关于 V3 顶端折叠的成功研究1, 2采用了 ICM-Pro 分子建模软件包（Molsoft LLC, La Jolla, CA）中可访问的ab initio算法3，结果表明，V3 环的顶端（特别是第 10 至 22 位氨基酸）由于其侧翼茎区具有足够的灵活性和长度，在很大程度上表现得如同溶液中自由折叠的无约束肽段。因此，对 60,000 多种流行 HIV-1 毒株中任意一种毒株的 V3 环这一区域进行快速ab initio折叠，均可提供有价值的信息。在此，我们对 R2 毒株的 V3 环进行了折叠，以深入了解其独特性质的结构基础。R2 毒株携带一种罕见的 V3 环序列，被认为与其对患者血清和单克隆抗体中和作用的高度敏感性有关4, 5。该毒株可介导 CD4 非依赖性感染，并似乎能够诱导广谱中和抗体。我们展示了如何通过评估折叠结果，将折叠过程中观察到的结构与 R2 毒株所表现出的免疫学活性相关联。

在许多情况下，可以通过使用先进的从头折叠（ab initio）折叠算法对HIV-1表面包膜糖蛋白（gp120）V3环第10至22位氨基酸进行计算机模拟折叠，从而在结构上表征不同V3环序列的冠状区域。本文中，我们展示了HIV-1 R2株V3环该区域的折叠与评估，R2株是一种具有独特中和敏感性且功能特性令人困惑的毒株。

通过免疫学相关动态三级结构特征评估HIV-1 V3环冠状R2序列 从头算 折叠

HIV-1 的抗原多样性长期以来一直是疫苗设计的障碍，这种变异性在病毒的 V3 环区域尤为显著。

以下实验的总体目标是通过 AR 折叠来评估 HIV R2 毒株 V3 冠状肽序列的动态结构偏好，并将结果与已知的 R2 毒株中和敏感性相关联。为此，首先选择 R2 毒株 V3 环冠状区的一个合适片段用于折叠 AR bonni。第二步是进行折叠模拟，该过程将搜索 R2 冠状片段所有可能的构象，并将最可能的构象记录在堆叠文件中。接下来，通过分析记录的构象，确定R二V三冠状结构的动态构象偏好，这可能解释其对中和作用的敏感性。根据二级结构偏好以及搜索到的构象堆叠的能量分布，结果显示出对V三环第12至14位刚性β链结构的偏好。您好，我是蒂莫西·卡多佐（Timothy Cardozo），来自纽约大学医学院药理学系实验室，正在向您介绍本研究。今天，我们将向您展示一种针对免疫原性HIV-1病毒蛋白GP120上柔性环区进行从头蛋白质折叠的实验方法。该柔性环区被称为HIV-1病毒表面包膜糖蛋白的V3环，其顶端部分称为V3环冠部。该区域即为我们将要进行折叠的目标区域。我们在实验室中采用此方法，以帮助确定通向成功 HIV 疫苗设计的有效途径。现在让我们开始。首先，选择待在计算机中进行折叠的 V3 冠状序列。本实验室先前的研究表明，任何 V3 环序列的第 10 至 22 位可获得最佳结果。请在 ICM Pro 分子建模软件的图形用户界面（GUI）中，使用便捷的下拉菜单运行 Armenio 折叠实验。首先，必须将对应于该序列的肽段三维原子结构构建到计算机的虚拟空间中。要构建三维原子结构，请进入文件菜单并选择新建。这将显示一个包含多个选项卡的界面。选择肽段选项卡，并将序列粘贴或输入到文本框中。点击确定以构建该肽段的三维结构。结构将显示在ICM的图形窗口中。三维结构构建完成后，进入分子力学菜单并选择“minimize”，该选项将弹出为侧边菜单。在侧边菜单中，选择“global”。这将显示一个包含多个输入字段和复选框的界面，其中已预先选择默认参数。如有需要，可更改选择以指定要折叠的肽链。通过分别调整全局移动次数和局部极小值调用次数，来调节模拟的长度和精度。选择所有以进行肽链的全原子折叠。然后选择保存动画，以生成折叠过程的动画文件。最后，单击应用，在图形窗口中开始折叠过程。该算法开始将肽链折叠成不同的构象，计算并记录每种构象下的肽链能量。完成后，计算机将识别出能量最稳定的肽链构象，以及能量相近的其他可能构象，并进行可视化展示。通过使用图形界面演示肽链折叠过程，可以直观了解折叠的形态，但无法为V3环冠肽的折叠选择理想的参数。为此，最好通过非图形化命令行使用脚本执行折叠操作。脚本仅仅是按行保存到计算机本地目录中文本文件的一系列文本命令，这些命令会自动输入ICM程序并依次执行，以通过命令行脚本折叠V3环。首先，在计算机硬盘的本地目录中创建并保存一个文本文件。与之前相同，首先在计算机的虚拟空间中构建肽链。然后为模拟命名，并设置自由变量的数量，这些自由变量是指在折叠过程中允许自由旋转的肽链中的化学键。接下来，指定模拟运行的时间，以实现V区三个环的最佳折叠。该时间取决于上一步中确定的自由变量数量，以确定实验中构象搜索的精度，并设置在每个局部极小值中执行的搜索步数。然后根据先前的研究设置已为模拟优化的其他参数，包括温度最小化、梯度和概率分布。在设定实验参数后，需指明在折叠过程中将采用的能量计算方法。此处，Vander Vi 能量由 VW 内部肽段表示。能量由14个氢键表示，氢键能量由HB静电表示。能量由El Salvation表示。能量用SF表示，熵用EN表示。指定最终设置，包括要搜索的优选主链和侧链角度以及起始构象。最后编写运行并保存计算的命令。将脚本编写完成后，保存为文本文件，并从计算机操作系统的命令行提示符中运行该脚本。与之前类似，系统将识别出该肽最具有能量稳定性的构象，以及能量相近的其他可能构象，并将其保存在项目文件中，以便在计算机上进行可视化观察。计算完成后，从 EE 下拉菜单中选择“文件打开”以打开文件。在工作区面板中，点击分子旁边的复选框以显示该分子，并选择分子力学堆叠视图。要查看折叠后最佳肽段构象按能量排序的堆叠结果，请点击堆叠面板右下角的绘图工具以绘制结果图表。首先在弹出的窗口中点击“确定”，然后点击图表中名为“best confo”的中间选项卡。接着点击结果堆叠表格中的第一行，该行为搜索中找到的最低能量构象。肽链结构将在图形窗口中重排为其最低能量构象。分析该构象中是否存在类似β折叠或α螺旋的特征，尤其关注肽段的前五个位置。通过在序列中选择该区域，并点击屏幕左上角的“stick”图标以显示所有原子。接下来，必须分析能量结果的排序，以绘制出最优的构象。如果最低能量构象与其他构象之间存在显著的能量差距，则表明该分子倾向于形成刚性结构。为了评估结果，打开项目小瓶，选择分子力学堆叠视图，此时将显示构象堆叠的表格。通过点击直方图图标来可视化堆叠构象。最后，单击分子力学堆栈播放按钮，以生成该堆栈的动画，直观展示此处折叠所揭示的构象偏好。结果显示了R2折叠的结果。其构象并非α螺旋，而是呈现随机卷曲，这与V3环冠区域在残基12至14片段中的预期特征一致。在 V3 环中，整个结构域堆叠区域均呈现出明显的β折叠构象偏好，而观察到的α螺旋构象极少。局部的β折叠构象可通过其伸展的线性形态加以识别。此处为 R2 毒株特有的异亮氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸序列所在位置，该序列在 HIV 毒株的这一位点极为罕见，且已被假说认为是导致 R2 毒株异常特性的原因。此外，在最低能量构象与第二低能量构象之间存在近三个单位的能量差。因此，该结构仅有不到1%的时间短暂偏离最低能量构象，表明R2V3冠状结构及其在第12至14位点的局部β应变构象具有较为刚性的结构，而非完全柔性的性质。我们刚刚向您展示了如何在ICM软件中使用abio算法折叠V3环冠状序列，并向您展示了如何利用HIV病毒的R2应变来分析结果。例如，在进行此操作时，重要的是要仔细选择对应于 V 三冠结构域片段的折叠肽序列，同时在解释有关构象偏好和能量的结果时，应咨询分子建模专家的意见。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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