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 JoVE Neuroscience

ऑटोलॉगस रक्त चूहे में स्वतःस्फूर्त intracerebral नकसीर मॉडल इंजेक्शन

1,2,3, 2, 1, 2, 4, 4

1Department of Neurology, University of Connecticut Health Center, 2Department of Neurology, School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Neurosurgery, Hartford Hospital, 4Department of Neurosurgery, School of Medicine, University of Pennsylvania

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    Summary

    इस प्रोटोकॉल में वर्णित चूहों में intracerebral नकसीर के ऑटोलॉगस रक्त इंजेक्शन मॉडल डबल इंजेक्शन तकनीक का उपयोग करता है सुई ट्रैक के ऊपर रक्त भाटा, पम्पिंग प्रणाली में कोई anticoagulants के जोखिम को कम है, और सभी मृत अंतरिक्ष और व्यवस्था में विस्तार योग्य टयूबिंग समाप्त.

    Date Published: 8/24/2011, Issue 54; doi: 10.3791/2618

    Cite this Article

    Sansing, L. H., Kasner, S. E., McCullough, L., Agarwal, P., Welsh, F. A., Kariko, K. Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice. J. Vis. Exp. (54), e2618, doi:10.3791/2618 (2011).

    Protocol

    1. उपकरणों की तैयारी

    1. नीचे stereotaxic फ्रेम और 75% इथेनॉल के साथ पंप पोछो बैक्टीरियल संदूषण को कम करने के लिए.
    2. हैमिल्टन सिरिंज और जुड़े सिलिका सुई जीवाणुरहित.
      नोट: यदि रासायनिक बंध्याकरण प्रयोग किया जाता है, कई बार उपयोग करने से पहले बाँझ पानी में कुल्ला करने के लिए सुनिश्चित हो.
    3. पैराफिन मोम कागज की सतह 75% इथेनॉल के साथ पोछो और सूखी अनुमति देते हैं.

    2. माउस के इंजेक्शन के लिए तैयार

    नोट: अपने जानवर की सुविधा के लिए दिया सर्जरी से पहले कम से कम 7 दिनों के लिए उन्हें नए वातावरण के लिए acclimate करने के लिए और तनाव को कम करने की अनुमति चूहों लो.

    1. पूर्व ऑपरेटिव आधारभूत के लिए माउस वजन.
    2. 30% ऑक्सीजन, 70% नाइट्रोजनवाला ऑक्साइड, और 4% तक पूंछ चुटकी करने के लिए अनुत्तरदायी Isoflurane साथ संज्ञाहरण प्रेरित
    3. Buprenorphine 0.1mg/kg intraperitoneally के साथ पोस्ट ऑपरेटिव analgesia के लिए माउस को इंजेक्षन
    4. खोपड़ी दाढ़ी
    5. बाँझ पेट्रोलियम जेली के साथ कोट आँखें
    6. Betadine एक्स 3 पोंछे के साथ खोपड़ी तैयार है, तो खोपड़ी शुष्क करने की अनुमति
    7. 1 सेमी खोपड़ी के midline बाण के समान चीरा बाँझ शल्य चिकित्सा स्केलपेल का उपयोग करें
      नोट: एक उदार चीरा खोपड़ी स्थलों की पूरी जोखिम की अनुमति देगा.
    8. पूंछ के आधार से 1 सेमी शुरुआत उदर की सतह के 1 सेमी दाढ़ी और betadine के साथ एक्स 3 पोंछे तैयार
    9. Stereotaxic फ्रेम पर माउस प्लेस
      नोट: करने के लिए सुनिश्चित करें के लिए माउस फ्रेम के आधार के साथ समानांतर खोपड़ी की सतह के साथ फ्रेम में सुरक्षित bregma के उत्कृष्ट प्रदर्शन और bregma के अधिकार के लिए कम से कम 3 मिमी के साथ है, यह महत्वपूर्ण है.

    3. Intracerebral नकसीर सर्जरी

    नोट: पूरे शल्य चिकित्सा के दौरान 30% ऑक्सीजन, 70% नाइट्रोजनवाला ऑक्साइड, और 1-3% Isoflurane, लगातार 37 पर बनाए रखा के साथ माउस anesthetized है ± ° 0.5 सी एक thermistor नियंत्रित हीटिंग पैड का उपयोग कर और गुदा थर्मामीटर द्वारा निगरानी की.

    1. 1 फ्रेम पर सीसी सिरिंज पर बाँझ 27 ग्राम सुई संलग्न.
    2. Stereotaxic हाथ समायोजित करें जब तक सुई bregma अधिक ठीक है.
    3. हाथ समायोजित ताकि सुई 2.5 मिमी bregma पार्श्व और खोपड़ी की सतह को कम पर है.
    4. मैन्युअल सिरिंज बारी बारी से खोपड़ी की सतह पर गड़गड़ाहट छेद बनाने के समय फ्रेम लेने की देखभाल की कोमल नीचे आंदोलन को लागू करने के लिए खोपड़ी पूरी तरह से नहीं छेदना.
    5. / सिरिंज सुई के साथ सुई और पूरा गड़गड़ाहट छेद मैन्युअल रूप से निकालें
      नोट: हाथ से गड़गड़ाहट छेद पूरा तत्काल मान्यता के लिए अनुमति देता है जब आप छेदा खोपड़ी और अनजाने मस्तिष्क parenchyma में सुई धकेलने के कम से कम जोखिम के भीतर टेबल है.
    6. पूंछ के ventral सतह बाँझ सर्जिकल ब्लेड का उपयोग कर पर अनुप्रस्थ चीरा और धमनियों से रक्त के 2-3 बड़े बूँदें पैराफिन मोम कागज पर गिर करने के लिए अनुमति देते हैं. तो जल्दी से बाँझ धुंध का उपयोग करते हुए दबाव के साथ खून बह रहा बंद करो.
    7. हैमिल्टन और पंप पर जगह सिरिंज सिरिंज में 17 μL रक्त वापस ले लें.
    8. 5 बिंदु stereotaxic हाथ समायोजित ° medially अनुलंब अक्ष के सापेक्ष.
    9. ध्यान stereotaxic हाथ को समायोजित इतना है कि सुई की टिप खोपड़ी में गड़गड़ाहट छेद पर और फिर कम सुई 3.5 मिमी है.
    10. रुको 2 मिनट तो सुई 0.5 मिमी वापस लेने (ताकि टिप 3 गहरी मिमी)
    11. 5 मिनट रुको मस्तिष्क सुई के आसपास फिर से विस्तार और इंजेक्शन के दौरान सुई प्रविष्टि ट्रैक refluxing रक्त के जोखिम को कम करने की अनुमति.
    12. 7.5 μL के लिए रक्त μL 1 / मिनट इंजेक्षन.
    13. 5 मिनट रुको प्रारंभिक रक्त के थक्के की अनुमति है और ऊतकों के बदलाव के लिए intracranial दबाव में उन्नयन कम से कम होते हैं.
    14. ΜL 1 / मिनट पर शेष 7.5 μL इंजेक्षन
    15. सुई जगह में 25 मिनट के लिए रहने के लिए रक्त के थक्के के लिए अनुमति दें
      नोट: के लिए रक्त के थक्के रक्त सुई प्रविष्टि साइट refluxing में परिणाम होगा इंतजार जब सुई वापस लेने में विफलता
    16. धीरे धीरे सुई वापस लेने और तुरंत गर्म पानी से कुल्ला के थक्के से सुई में किसी भी अवशिष्ट खून रोकने के लिए और सुई के reusability सुनिश्चित.
    17. फ्रेम से माउस निकालें और पूंछ और पशु चिकित्सा सर्जिकल गोंद के साथ खोपड़ी चीरों बंद.
    18. संज्ञाहरण मुड़ें.
    19. माउस करने की अनुमति दें जगाने जबकि लगातार मुक्त भोजन सिक्त उपयोग के साथ गरम किया जा रहा है.
    20. जब पूरी तरह से जाग littermates के साथ माउस को पिंजरे में वापसी. पिंजरे के तल पर गीला भोजन गोली प्लेस के भोजन के लिए उपयोग में पशुओं मदद.

    4. प्रतिनिधि परिणाम:

    चित्रा 1
    चित्रा 1 15 मिनट आईसीएच सर्जरी के बाद माउस मस्तिष्क के कोरोनल अनुभाग. तुरंत बाद बलिदान मस्तिष्क आईसीएच सुई प्रविष्टि साइट पर एक राज्याभिषेक अनुभाग के सकल निरीक्षण के आधार पर सफलता के लिए निरीक्षण किया गया था. हेमोरेज है कि मस्तिष्क के आधार पर पिछले महासंयोजिका, या ventricles में सुई ट्रैक के ऊपर नीचे, ट्रैक किए गए असफल समझा रहे थे और माउस है कि सभी विश्लेषण से हटा दिया गया. कुल मिलाकर आईसीएच succeएस एस दर 0% मृत्यु दर के साथ 50 चूहों में 75-85% थे.

    चित्रा 2
    चित्रा 2 सिलेंडर परीक्षण सही बेसल ganglia आईसीएच के बाद छोड़ दिया hemiparesis को दर्शाता है . (ए) आईसीएच सर्जरी के बाद नमूना माउस पीछे. सिलेंडर की दीवार पर ही सही forelimb के बाईं बेसल ganglia आईसीएच के बाद नियुक्ति ध्यान दें. (बी) सिलेंडर परीक्षण का ग्राफ़ चूहों के बाद पलटन से परिणाम 1 आईसीएच सर्जरी (n = 5) नकली करने के लिए तुलना में (n = 4) . शाम चूहों रक्त इंजेक्शन (सुई मस्तिष्क में डाला गया था) को छोड़कर सभी प्रक्रियाओं था. प्रत्येक माउस 12 सेमी की एक व्यास स्पष्ट गिलास सिलेंडर में रखा गया था और 20 rears के लिए मनाया. रियर प्रति सिलेंडर की दीवार पर forelimbs के प्रारंभिक स्थान रन था. बाद आंदोलनों (जैसे पार्श्व अन्वेषण) जब तक माउस जमीन को लौट गया और अगले पीछे रन नहीं बने थे. laterality सूचकांक के रूप में गणना की थी (# सिलेंडर के किनारे पर सही forelimb प्लेसमेंट - forelimb प्लेसमेंट # छोड़ दिया है) / (# + # दाएं से बाएं + दोनों #), जहाँ 0 संकेत नहीं forelimb वरीयता और 1 संकेत केवल सही forelimb इस्तेमाल किया गया था .

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    Discussion

    सहज बेसल ganglia रक्तस्राव के एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल में ऑटोलॉगस पूंछ धमनी रक्त के परिणाम का उपयोग चूहों में intracerebral रक्तस्राव के इस शल्य चिकित्सा मॉडल है. चूहों में एक आईसीएच मॉडल ट्रांसजेनिक pathophysiology जांच पशुओं की उपलब्धता का लाभ प्रदान करता है, तथापि, उनके छोटे आकार neurosurgical प्रक्रियाओं को और अधिक तकनीकी रूप से बड़े जानवरों में से मुश्किल बनाता है.

    collagenase मॉडल और ऑटोलॉगस रक्त इंजेक्शन मॉडल प्रयोगात्मक आईसीएच के दो अच्छी तरह से स्थापित मॉडल हैं. जबकि collagenase मॉडल एक आसान प्रक्रिया और एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य 2 नकसीर प्रदान करता है, बैक्टीरियल तहखाने झिल्ली नीचा करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटीन संभावित जन्मजात भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के किसी भी जांच के प्रभाव सकता है. इसके अलावा, collagenase बाधित BBB अस्वाभाविक औषधीय प्रयोगों (जैसे, neuroprotection) के दौरान मस्तिष्क के लिए दवा का उपयोग की सुविधा सकता है. एक warfarin जुड़े आईसीएच मॉडल भी हाल ही में 3 विकसित किया गया है, जो मरीजों के इस सबसेट के लिए नकसीर विस्तार की जांच की अनुमति देता है. ऑटोलॉगस रक्त इंजेक्शन मॉडल के लाभ यांत्रिक क्षति बड़े पैमाने पर प्रभाव के साथ जुड़े, exogenous प्रोटीन के बिना एक बाँझ प्रणाली, एंटिकोगुलेशन खत्म करने के क्रम में सहज रक्तस्राव के बाद प्राकृतिक जमावट और सूजन के रास्ते की जांच करने की क्षमता, और आकार से अधिक उत्तम नियंत्रण की उपस्थिति शामिल रक्तस्राव के. चूंकि सभी चूहों ही नकसीर आकार है, दोनों ऊतक और कार्यात्मक परिणाम पर उपचारात्मक उपायों के प्रभाव अपेक्षाकृत छोटा सा नमूना आकार के साथ परिशुद्धता के साथ अध्ययन किया जा सकता है.

    शल्य प्रक्रिया यहाँ वर्णित प्रकाशित अन्य मॉडल ऑटोलॉगस रक्त इंजेक्शन (4-7) का उपयोग करने के लिए इसी तरह की है, और हमारे प्रोटोकॉल में कई कदम इन प्रकाशित प्रोटोकॉल पर आधारित थे. इस तकनीक में उल्लेखनीय सुधार सभी विस्तार योग्य टयूबिंग और सिस्टम में मृत अंतरिक्ष के उन्मूलन है, जो संभवतः अन्य मॉडलों की तुलना में गैर रक्त इंजेक्शन, सभी anticoagulants के उन्मूलन, और एक मामूली बड़े नकसीर मात्रा की मात्रा का सही माप के साथ हस्तक्षेप कर सकता है शामिल - anticoagulated खून. औसतन 450 उल मस्तिष्क की मात्रा के 3% के लिए वयस्क माउस मस्तिष्क खातों में 15 उल आईसीएच. यह मोटे तौर पर आदमी में एक 40 एमएल आईसीएच करने के लिए तुलनीय है, संभालने सामान्य औसत वयस्क मस्तिष्क की मात्रा 1400 एमएल है. औसत दर्जे का न्यूरोलॉजिकल घाटा है कि वसूली के अध्ययन के लिए दो सप्ताह से अधिक जारी रहती है, जबकि शून्य मृत्यु दर, जो व्यावहारिक महत्व का है जब महंगी ट्रांसजेनिक जानवर का उपयोग कर बनाए रखने में इस आईसीएच मात्रा का परिणाम है.

    इस सर्जरी के प्रत्यक्ष दृश्य नकल के आराम में आम गलतियों और सहायता को खत्म करना चाहिए. उम्मीद है कि इस चोट के तंत्र में आगे की जांच पड़ताल करने के लिए अनुवाद और संभावित चिकित्सा विज्ञान के विकास में तेजी लाने के.

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    Disclosures

    ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

    Acknowledgements

    काम translational चिकित्सा और चिकित्सा विज्ञान के लिए संस्थान से एक फैलोशिप, और चिकित्सा और इंजीनियरिंग (T32HL007954) के लिए संस्थान से एक पेन्सिलवेनिया विश्वविद्यालय और मार्लिन एल कोहेन और जेरोम एच. FLEISCH विद्वान अनुदान में प्रशिक्षण अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था कनेक्टिकट विश्वविद्यालय स्वास्थ्य केंद्र (LHS) और एन एस 029,331 NIH (FAW).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Stereotaxic frame for mouse neurosurgery (St–lting, 51925)
    Microinfusion pump and processor (UMP-3 and Micro4, World Precision Instruments, Sarasota, FL)
    Mouse warmer (St–lting, 50300)
    Inhalational mouse anesthesia (Braintree Scientific, EZ-AF9000)
    25 μL gastight borosilicate Hamilton syringe with coated plunger and no needle
    (Hamilton company, Reno, NV, 1702RN syringe: 765401, ferrule: 30949, spacer: 30946)
    fused silica needle cut to 2 cm length (Hamilton, 17739) note Hamilton syringe and fused silica needle may be reused for multiple surgeries if sterilized prior to each surgery. These materials are crucial to avoid blood clotting.
    Sterile surgical gloves
    Surgical gown, bonnet and mask
    Betadine
    75% ethanol
    sterile 27 g needle (single use)
    sterile 1 cc syringe (single use)
    sterile surgical blade
    Cidex
    sterile water
    buprenorphine and isoflurane
    sterile gauze
    paraffin wax paper squares
    Veterinary surgical glue (Vetbond, 3M, St. Paul, MN)

    References

    1. Hua, Y., Schallert, T., Keep, R.F., Wu, J., Hoff, J.T., & Xi, G. Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat. Stroke. 33, 2478-2484 (2002).
    2. James, M., Warner, D., & Laskowitz, D. Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective. Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).
    3. Foerch, C., Arai, K., Jin, G., Park, K.-P., Pallast, S., van Leyen, K., & Lo, E.H. Experimental Model of Warfarin-Associated Intracerebral Hemorrhage. Stroke. 39, 3397-3404 (2008).
    4. Nakamura, T., Xi, G., Hua, Y., Schallert, T., Hoff, J.T., & Keep, R.F. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 487-494 (2004).
    5. Rynkowski, M.A., Kim, G.H., Komotar, R.J., Otten, M.L., Ducruet, A.F., Zacharia, B.E., Kellner, C.P., Hahn, D.K., Merkow, M.B., Garrett, M.C., et al. A mouse model of intracerebral hemorrhage using autologous blood infusion. Nat. Protocols. 3, 122-128 (2008).
    6. Wang, J., Fields, J., & Doré, S. The development of an improved preclinical mouse model of intracerebral hemorrhage using double infusion of autologous whole blood. Brain Research. 1222, 214-221 (2008).
    7. Zhao, X., Sun, G., Zhang, J., Strong, R., Song, W., Gonzales, N., Grotta, J.C., & Aronowski, J. Hematoma resolution as a target for intracerebral hemorrhage treatment: Role for peroxisome proliferator-activated receptor γ in microglia/macrophages. Annals of Neurology. 61, 352-362 (2007).

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