Kännetecknar Bakteriell Flyktiga använda Sekundär elektrospray Spectrometry jonisation (Sesi-MS)

Bean, H. D., Zhu, J., Hill, J. E. Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS). J. Vis. Exp. (52), e2664, doi:10.3791/2664 (2011).

Sekundär elektrospray jonisering masspektrometri (Sesi-MS) är en metod utvecklad för snabb upptäckt av flyktiga ämnen, utan behov av prov förbehandling. Metoden beskrevs först av Fenn och kollegor ¹ och har tillämpats med upptäckt av illegala droger ² och sprängämnen ^3-4, karakterisering av huden flyktiga ^5, och analysen av andan ^6-7.

Sesi jonisering sker genom reaktioner proton transfer mellan elektrospray lösningen och de flyktiga analyt och är därför lämplig för analys av hetero-organiska molekyler, precis som i traditionell elektrospray jonisation (ESI). Men till skillnad från vanliga ESI sker protonen överföringen av Sesi i gasfasen snarare än i lösning (bild 1), och därför Sesi passar bäst för att upptäcka organiska flyktiga ämnen och aerosoler.

Vi utökar användningen av Sesi-MS med upptäckt av bakteriella flyktiga ämnen som en metod för bakteriell identifiering och karakterisering ^8. Vi har visat att Sesi-MS flyktiga fingeravtryck, kombinerat med en statistisk analys metod kan användas för att skilja bakteriella släkten, arter, och blandade kulturer i en mängd olika tillväxt medier. ⁸ Här ger vi de steg för att fÃ¥ bakteriell flyktiga fingeravtryck med hjälp Sesi -medlemsstater, inklusive de instrumentella parametrar som bör optimeras för att säkerställa robust bakteriell identifiering och karakterisering.

Figur 1. Schematisk för Sesi-MS-analys av bakterie-flyktiga ämnen. Den headspace av bakteriekultur är förskjuten av CO ₂ (1) i Sesi reaktionskammaren (2). Som flyktiga korsa Sesi reaktionskammaren de passerar genom elektrospray molnet och blir joniserade (3). När joniserade, är de flyktiga ämnen dras in i masspektrometer för analys (4). Överskott bärgas och oreagerade bakteriell flyktiga passerar genom ett 0,22 ìm filter (5), som en extra skyddsÃ¥tgärd, och ventileras för att en kemisk huva. Infälld: Den Sesi elektrospray nÃ¥l är en kvarts kapillär (40 ìm ID) med en vass nÃ¥l spets.

Som en demonstration av användningen av Sesi-MS för karakterisering av bakteriell flyktiga ämnen, E. coli K12 och P. aeruginosa PAO1 odlas aerobt i 24 timmar i 50 ml LB-Lennox vid 37 ° C och Sesi-MS spektra av headspace flyktiga samlas i 2 minuter. Koldioxid (99,99%) vid ett flöde på 2 l / min används som bärgas vid flyktiga leverans till reaktionskammaren. Den Sesi reaktionskammaren var specialbyggda och monterade på ett API-3000 (SCIEX), som ersätter den ursprungliga källan elektrospray jon. De spektra som samlas upp i en positiv jon-läge med 0,1% myrsyra, 5,0% metanol och 94,9% vatten (v / v) som elektrospray lösningen levereras vid 5 NL / s via en icke-ledande kvarts kapillär med en vass nålspetsen (40 ìm ID). Den pålagda spänningen är 2,5 kV. Analytiker 1.4.2 programvara (Applied Biosystems) används för insamling av data med följande parametrar: 20 - 500 Da, MCA-läge, 40 genomsökningar, 3 s / skanning och 2 min totala analysen tid.

1. Odling systemet

1. Välj lämpliga fartyg för att odla din kulturer, med tanke på tillväxten krav arterna i experimentet (t.ex. luftning, ljus, temperatur, etc.), samt ett effektivt tillhandahållande av flyktiga ämnen till masspektrometer. Kulturen flaskor vi väljer att använda är standard 100 ml Pyrex media flaskor försedda med gängade lock som har minst två luer portar. En vik rad skall införas genom en luer-port för bärgas leverans till provet flaskan och ett utlopp rad införas genom en annan port för VOC leverans till instrumentet (Figur 1). Eventuella ytterligare portar är pluggade.
2. Före odling av prover, press på fartyg och nedsänkas i vatten för att leta efter läckor. Gasläckor är en primär orsak till atypiska resultat i form av svag eller obefintlig flyktiga jon signaler.

2. Biologiska experiment: uppsättning och säkerhetsaspekter

1. Odla dina kulturer i anpassade till din hypotes. Det rekommenderas att minst två biologiska replikat med vardera två tekniska replikat, används för varje variabel.
2. Förbered en tomt för varje kultur villkor (medium, antibiotika etc.) och inkubera det tomma på samma villkor som dina prover.
3. Anställ säkerhetsåtgärder som är lämpliga för den biologiska ämnen du använder, med hänsyn till biosäkerhetsnivån (er) av arten.
4. För att förhindra kontamination av ditt instrument och gasledningarna överföring med fungerande biologiska ämnen, installera filter av lämplig porstorlek i bärgas linjen. Filtren kommer inte att störa överföringen av flyktiga ämnen till Sesi reaktionskammaren, men kan lätt pÃ¥verka effektiviteten i aerosol överföring. ⁶
5. Använd andra inneslutning eller en biosäkerhet skåp när du sätter på locket gasen överföring till din kultur flaskan för att säkerställa ett korrekt inneslutningen i händelse av spill biologiska ämnen.
6. Initiera och avsluta flöde bärgasen till ditt prov flaska på ett sätt som inte kommer att bygga tryck inuti flaskan.

3. Instrument optimering

OBS: Sesi-MS är speciellt utformad för att prov flyktiga ämnen, så begränsa användningen av doftande hygienartiklar objekt (t.ex. parfymer, munvatten, lotion, sköljmedel), tuggummi, cigaretter, osv innan du använder instrumentet. Tätt cap alla flyktiga kemikalier i labbet, och kontroll luft drag så mycket som möjligt under testningen.

Följande instrumentella parametrar, som alla påverkar signalstyrka och stabilitet, kommer att behöva vara optimerad för ditt instrument och experiment.

1. Elektrospray lösning och flöde: Välj lämplig elektrospray lösningen för den klass av molekyler du vill rikta, med hänsyn till polariteten operativa instrumentet (positiva eller negativa-jon-läge) och molekylära karaktär målet föreningar. I det här experimentet elektrospray lösningen är 0,1% myrsyra, 5,0% metanol, 94,9% vatten (v / v), som förbättrar signalstyrkan i mindre polära molekyler while som ger bra signal stabilitet. Lösningen levereras med en flödeshastighet av 5 NL / s.
2. Carrier Gasflödet: Transportören Gasflödet kan pÃ¥verka elektrospray stabilitet och signalstyrka. CO ₂ (≥ 99,99%) vid ett flöde pÃ¥ 2 l / min används här.
3. Nål form och position: nålspetsen form och position påverkar starkt signalen intensitet och stabilitet. När du installerar en ny nål, måste ställning nålen vara optimerad för att skapa en balans mellan låg bakgrund och hög analyt signalstyrka och signal stabilitet. För att återge Sesi spektra efter en nål förändring, är det nödvändigt att regelbundet samla in spektra när du justerar nålen position tills du har möjlighet att matcha de observerade spektrum till din bokföring. Avståndet från elektrospray kanylspetsen till massa spec öppning kommer att vara 1 - 5 mm.
4. Tillämpad spänning: den spänning som används i systemet påverkar intensiteten signalen jon och stabiliteten i elektrospray Taylor konen. Dessutom är den optimala spänningen beroende på din elektrospray lösning och nålspetsen form. I början av din serie experiment, bestämma den spänning som ger den optimala spektrumet och signal stabilitet för ditt system och sedan använda denna spänning för alla efterföljande experiment. För vårt system, tillämpad spänningar från 2,0 till 5,0 kV ger optimal signalstyrka och elektrospray stabilitet. För det här experimentet 2,5 kV.

4. Sätta på och tuning Sesi-MS för analys

1. Börja med att se till att strömförsörjningen är avstängd och att systemet töms av el. Gör detta genom att 1) ​​säkerställa att indikatorn lyser om strömförsörjningen är avstängda, 2) se till spänningen på multimetern är noll, och 3) grundstötning den elektriska leder.
2. Installera lämplig elektrospray lösningen för experimentet.
3. Slå på bärgas och ställ in flödet till som är lämplig för experimentet.
4. Utöva påtryckningar på elektrospray reservoaren att inleda leverans av elektrospray lösningen på reaktionskammaren.
5. Slå på spänning och justera spänningen till ett lämpligt värde för ditt experiment.

OBS: Vid denna punkt metallytor av jonisering källan kan leverera en farlig stöt. Iaktta stor försiktighet vid arbete runt instrumentet när strömförsörjningen är påslagen.

6. Inrätta en sökmetod för att övervaka Sesi-MS spektrat samtidigt finjusteras justeringar av spänningen. Använd förvärvet parametrar som du har optimerat för ditt system och dina experiment. Rensa Multiple Channel Acquisition (MCA) kryssrutan (om tillämpligt) så att varje skanning ger en oberoende spektrum, som förvärvet tiden till 10 - 15 min, och börja förvärvet. Spectra för bärargasen bakgrunden bör nu följas.
7. Gör finjusteras justeringar av spänningen för att erhÃ¥lla en stabil total jon kromatogram (TIC) och reproducerbara skannar som matchar CO ₂ söker efter dina tidigare experiment. När spänningen justeringar har gjorts, fortsätta att samla in spektra och en TIC i fem minuter för att säkerställa att instrumentet har stabiliserats.
8. När instrumentala stabilitet säkerställs, ställa in förvärvsmetoden som är lämpligt för dina prover, justera förvärvet tid, dataområdet och MCA val som behövs. Samla bärare spektrum gas bakgrund för din bokföring.

5. Skaffa en flyktig fingeravtryck av din bakteriekultur

1. Att samla ett tomt spektrum, direkt flödet bärgas genom bypass linjer, och sedan bifoga blankprov (ventiler stängda) till gasledningar överföring av instrumentet.
2. Öppna ventilerna till provet flaskan, och stänga ventilerna i bypass linjer.
3. Låt systemet nå jämvikt i 30 sekunder, under vilken tid fuktigheten i reaktionskammaren håller på att stabiliseras. Denna period av jämvikt är en förutsättning för att erhålla reproducerbara spektra. För att säkerställa att systemet är jämvikt, kanske du vill kontrollera TIC, som kommer att förändras under jämviktsprocessen perioden och stabiliseras därefter.
4. När systemet är jämvikt, initiera spektrum samling.
5. När spektrumet samlas in, ta bort provet flaskan genom att först öppna transportören gasledningar förbi, sedan stänga provet ventiler, och slutligen ta bort provet flaskan. Spola systemet med bärgas för 2 - 4 min, ta bort fukt och adsorberade flyktiga ämnen från transportband, förebygga prov till prov överföring.
6. Upprepa steg frÃ¥n 5,2 till 5,5 för varje bakterie prov, intermittent samla in ytterligare tomt spektra att säkerställa grundlig tomt subtraktion. Ofullständig tomt subtraktion kommer att leda tillutseende toppar kemiska bakgrunden i din bearbetat spektrum som är gemensamma för atmosfäriska tekniker tryck jonisering (t.ex. ftalater, silikoner etc.). ⁹
7. När du hämtar din spektra, se till att jon signalerna inte överskrider den linjära detektionsgränser ditt instrument, som bestäms av TIC och den maximala intensiteten för enskilda toppar. Joner som överstiger de övre gränserna för din instrumentets detektor kan generera artefakt toppar som inte är representativa för ditt prov.

6. Representativa resultat

Som ett exempel på Sesi-MS spektra som kan erhållas för bakteriell flyktiga ämnen, det positiva jon-läget flyktiga fingeravtryck för E. coli och P. aeruginosa vuxit aerobt i LB-Lennox i 24 timmar vid 37 ° C visas (Fig. 2). E. coli flyktiga spektrum domineras av indol på m / z = 118, vilket ger E. coli kulturer deras karakteristiska lukt, medan spektrum av P. aeruginosa innehåller en större mängd protonatable toppar.

Observera att relativa intensiteterna av topparna i den volatila spektrumet är beroende av instrumentella parametrar som beskrivs i avsnitt 3. Dessa parametrar måste vara hårt styrda från experiment till experiment för att få reproducerbara spektra.

Figur 2 Blank-korrigerad positiv jon-läget Sesi-MS spektra (20 - 150 m / z). Av E. coli K12 och P. aeruginosa PAO1 flyktiga ämnen efter 24 timmar aerob tillväxt i LB-Lennox vid 37 ° C. För mer information om de toppar som observerats i Sesi spektra, se Zhu et al. ^8.

Bakterier producerar olika kombinationer av flyktiga ämnen, som kan användas för bakteriell identifiering ^10-12 och bedömning av metaboliska status. Den Sesi-MS-metod som beskrivs här ger en möjlighet att snabbt karakterisera bakteriell flyktiga ämnen (i tvÃ¥ minuter eller mindre) utan provberedning, genererar en bakteriell "fingeravtryck" för identifiering av arten. ⁸ Under de senaste decennierna andra atmosfärstryck jonisering MS-tekniker har använts för karakterisering av flyktiga ämnen, inklusive selektiva jon flöde röret (SIFT) och proton transfer reaktion (PTR) masspektrometri. Den distinkta fördelen att Sesi ger över dessa andra jonisering metoder är att det är möjligt att fragmentera vissa toppar (förutsatt att lämplig typ av masspektrometer har anpassats för Sesi), vilket är ett viktigt verktyg för sammansatta identifiering. Vi tog inte upp topp fragmenteringen i protokollet anges ovan, men för exempel pÃ¥ hur fragmenteringen information kan användas vid karakterisering av bakteriell flyktiga ämnen, se Zhu et al. ⁸

Sesi-MS har direkt tillämpning på in situ upptäckt av bakteriella infektioner i lungorna via andetag analys, men kan också tillämpas på alla miljö där flyktiga provtagning är möjlig. Till exempel, analyser av flyktiga ämnen i urin, blod och andning, som är relevanta för diagnos av metabola sjukdomar är gastroenteric sjukdom, cancer och miljöexponering, väl lämpad för Sesi-MS. ^13,14 Sesi-MS har också ett brett spektrum av icke-kliniska VOC fingeravtryck tillämpningar, inklusive en snabb analys av livsmedel för de karakteristiska flyktiga ämnen i samband med mogna, åldrande eller förstör. ^15-18

Inga intressekonflikter deklareras.

Detta arbete finansieras av NIH bevilja P20 RR021905-01, CF RPD bevilja STANTO07R0, och NASA bevilja NNH09ZNE002C.

1. Fuerstenau, S., Kiselev, P. & Fenn, J. B. ESI-MS in the analysis of trace species in gases, in: Proceedings of the 47th ASMS Conference on Mass Spectrometry Allied Topics, Dallas, TX (1999).
2. Wu, C., Siems, W. F. & Hill, H. H. Secondary electrospray ionization ion mobility spectrometry/mass spectrometry of illicit drugs. Anal. Chem. 72, 396-403 (2000).
3. Tam, M. & Hill, H. H. Secondary electrospray ionization-ion mobility spectrometry for explosive vapor detection. Anal. Chem. 76, 2741-2747 (2004).
4. Martinez-Lozano, P., Rus, J., de la Mora, G. F., Hernandez, M. & de la Mora, J. F. Secondary electrospray ionization (SESI) of ambient vapors for explosive detection at concentrations below parts per trillion. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 287-294 (2009).
5. Martinez-Lozano, P. & de la Mora, J. F. On-line detection of human skin vapors. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1060-1063 (2009).
6. Martinez-Lozano, P. & de la Mora, J. F. Electrospray ionization of volatiles in breath. Int. J. Mass Spectrom. 265, 68-72 (2007).
7. Martinez-Lozano, P. & de la Mora, J. F. Direct analysis of fatty acid vapors in breath by electrospray ionization and atmospheric pressure ionization-mass spectrometry. Anal. Chem. 80, 8210-8215 (2008)
8. Zhu, J., Bean, H. D., Kuo, Y.-M. & Hill, J. E. Fast detection of volatile organic compounds from bacterial cultures by SESI-MS. J. Clin. Microbiol. 48, 4426-4431 (2010).
9. Guo, X. H., Bruins, A. P. & Covey, T. R. Characterization of typical chemical background interferences in atmospheric pressure ionization liquid chromatography-mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3145-3150 (2006).
10. Rudzinski, C. M., Herzig-Marx, R., Lin, J., Szpiro, A. & Johnson, B. Pathogen detection using headspace analysis. Department of the Air Force, Nov 15, 2004, 16 pp.
11. Lechner, M., Fille, M., Hausdorfer, J., Dierich, M. & Rieder, J. Diagnosis of bacteria in vitro by mass spectrometric fingerprinting: A pilot study. Curr. Microbiol. 51, 267-269 (2005).
12. Schulz, S. & Dickschat, J. S. Bacterial volatiles: The smell of small organisms. Nat. Prod. Rep. 24, 814-842 (2007).
13. Ligor, T. Analytical methods for breath investigation. Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 2-12 (2009).
14. Cao, W. Q. & Duan, Y. X. Breath analysis: Potential for clinical diagnosis and exposure assessment. Clin. Chem. 52, 800-811 (2006).
15. Law, W. S. et al. Rapid characterization of complex viscous liquids at the molecular level. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 8277-8280 (2009).
16. Wu, Z. et al. Sampling analytes from cheese products for fast detection using neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1549-1556 (2010).
17. Fleming-Jones, M. E. & Smith, R. E. Volatile organic compounds in foods: A five year study. J. Agric. Food Chem. 51, 8120-8127 (2003).
18. Calkins, C. R. & Hodgen, J. M. A fresh look at meat flavor. Meat Sci. 77, 63-80 (2007).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.